ABI-1179

“ 点击蓝字 关注我们 杨鹏 沈阳药科大学教授，博士生导师。2011年起，作为药物化学学科引进人才到沈阳药科大学工作，目前就职于无涯创新学院，任课题组组长。近年来主持了国家自然科学基金、辽宁省自然科学基金、辽宁省高校杰出青年学者成长计划、辽宁省首批博士后集聚工程以及沈阳药科大学科研专项基金等项目。从事化学、生物学和药学交叉学科研究，在Angew Chem Int Ed, Anal Chem, Chem Commun, Org Chem Front, Chem-Eur J, J Org Chem, Sens Actuators B, Eur JPharm Biopharm, Int J Nanomed, Bioorgan Med Chem等化学和药学国际刊物上发表学术论文30余篇。申请中国专利10余件，获授权5件；PCT国际专利2件。 蒋翔锐 中科环渤海（烟台） 药物高等研究院烟台新药创制山东省实验室课题组组长、研究员。作为骨干人员参与了多个1.1类创新药物的研究与开发。负责多项国家自然科学基金面上项目以及“新药创制”国家重大专项、中科院先导专项和药物创新研究院自主部署项目。在STTT，Cell Mol Immunol，J Med Chem，Eur J Med Chem 等期刊上发表文章20余篇。 疱疹病毒解旋酶-引物酶复合物抑制剂的研究进展 PPS  柳彬 1，3，张岩 2，杨鹏 1*，蒋翔锐 2** （1. 沈阳药科大学无涯创新学院，辽宁 沈阳 110016；2. 中科环渤海（烟台）药物高等研究院烟台新药创制山东省实验室，山东 烟台264117；3. 南通长三角药物高等研究院，江苏 南通 226133） [摘要] 疱疹病毒（herpesviruse ，HV）是一类具有双链DNA结构的高传染性病原体，可引发多种人类临床疾病，涵盖水痘-带状疱疹、单纯疱疹、爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus 、EBV）相关淋巴增殖性疾病及巨细胞病毒感染等。解旋酶-引物酶（helicase- primase ，HP）复合物在HV的DNA复制过程中起着关键作用，是抗HV的关键靶点。近年来，针对该复合物的抑制剂研发取得了突破性进展。通过对HV生命周期、DNA复制过程和HP复合物功能进行综述，以及介绍解旋酶-引物酶复合物抑制剂（helicase-primase complex inhibitor ，HPI）的研究进展，其中包括部分抑制剂的结构优化过程，并讨论了未来HPI的研究重点，为抗HV药物的研发提供参考。 疱疹病毒（herpesviruse ，HV）具有典型的双链DNA病毒结构特征，其结构如图1所示。双链DNA被由162个多聚体组成的核衣壳包围[1-3]。在核衣壳与最外层包膜之间，存在一层由病毒蛋白构成的被膜基质。最外层的包膜由脂质双分子层与糖蛋白复合物共同构成，将被膜包埋在内，糖蛋白复合物通过介导病毒与宿主细胞受体的特异性识别，在病毒吸附、膜融合及细胞入侵过程中发挥关键作用[4-5]。 HV的宿主范围广泛，可感染包括哺乳类、鸟类、鱼类、两栖动物及爬行动物在内的多种脊椎动物[4]。人类疱疹病毒（human herpes virus ， HHV）分为3个亚科，即α、β、γ-疱疹病毒[1-2,6]。其中，α-疱疹病毒包括水痘-带状疱疹病毒（varicella- zoster virus ， VZV）、单纯疱疹病毒1（herpes simplex virus 1 ，HSV-1）、HSV-2；β-疱疹病毒包括HHV-6a、HHV-6b，HHV-7和人巨细胞病毒（human cytomegalovirus ，HCMV）；γ-疱疹病毒包括卡波西肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi sarcoma- associated herpesvirus ，KHSV）和爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus ，EBV）[7-9]。 HV各亚科在人类感染中表现出独特的临床症状。α-疱疹病毒中，HSV-1的感染主要表现为发热和咽痛，常伴随口咽和面部疱疹、疱疹性角膜结膜炎等。HSV-2的感染以生殖器水疱-溃疡性病变为特征。VZV感染引起带状疱疹，表现为带状红斑和簇集性水疱，还能引发肺炎、肝炎及脑脊髓炎等严重并发症[9]。 β-疱疹病毒中，HCMV感染可导致肝脾肿大、黄疸及继发于血小板减少症的点状皮疹[10]。HHV-6、HHV-7的原发感染表现为婴儿玫瑰疹，特征为突发高热；复发感染则表现为发热、皮疹，严重者可并发肺炎、肝炎及脑炎等[11]。 γ-疱疹病毒中，KHSV感染引发原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma ，PEL）和多中心卡斯特莱曼病（multicentric castleman disease， MCD），其中以卡波西肉瘤（Kaposi sarcoma ，KS）最为典型。EBV感染可导致传染性单核细胞增多症、肝炎等急性感染，也可引起鼻咽癌、伯基特淋巴瘤等恶性病变[7,11]。 1 HV的生命周期 1.1 病毒的生命周期 HV感染历程包括潜伏期和裂解期[12]。病毒维持最低限度的基因表达时，仅转录与维持潜伏相关的基因，不产生完整的病毒颗粒。当受到特定外界刺激时，潜伏的病毒可被重新激活，进入裂解复制周期。在裂解期，病毒感染过程始于病毒包膜糖蛋白与宿主细胞表面特异性受体的识别和结合（见图2），随后通过膜融合机制进入宿主细胞[3,13-14]。病毒颗粒进入细胞后，被膜从核衣壳上解离下来，核衣壳通过微管运输到细胞核附近，并通过核孔复合体将病毒基因组DNA释放到细胞核内[5]。在细胞核中，病毒启动基因组DNA的复制和病毒蛋白的表达程序，随后将新合成的基因组包装入新的核衣壳内[15]。完成组装的核衣壳以核膜出芽的方式进入细胞质并获得被膜蛋白，随后经过二次囊膜化进一步成熟，获得包膜[16-17]。最终，成熟的病毒颗粒通过细胞膜出芽或胞吐作用释放到细胞外环境，继续其感染循环的过程[8,14,18]。 1.2 DNA的复制 在复制起始阶段，UL9基因编码的起源结合蛋白与复制起点特异性结合[19-20]，随后，DNA解螺旋形成复制叉，双链DNA被分离成2条互补的单链[21]，单链DNA（single-stranded DNA ， ssDNA）结合蛋白（ICP8编码蛋白）与ssDNA结合，有效防止单链模板的退火。在DNA复制的过程中，由UL5，UL8和UL52基因编码蛋白组成的解旋酶-引物酶（helicase-primase ，HP）复合物在复制叉处形成功能性异源二聚体结构，负责双链DNA的解旋和RNA引物的合成。DNA聚合酶（UL30编码蛋白）和其辅助蛋白（UL42编码蛋白）结合到每条互补单链上，以RNA引物为起始合成互补DNA，前导链中可沿着5'，3'的方向连续合成DNA链，而在滞后链上则需要通过多个RNA引物起始合成不连续的冈崎片段（见图3）。DNA聚合酶同时还具有内源性核糖核酸酶H（ribonuclease H，RNase H）活性，可特异性降解滞后链中由RNA引物-冈崎片段和模板DNA复合物形成的RNA/DNA异源双链，从而去除RNA引物。最终，通过DNA连接酶的作用，将不连续的DNA片段连接成完整的子代双链DNA分子[11]。 2 解旋酶-引物酶复合物 2.1 解旋酶-引物酶的编码基因 HP复合物是由解旋酶、引物酶、非催化亚基3个部分组成的异源三聚体[22]。编码复合物不同组分的基因在病毒家族成员之间相对保守，HSV的UL5、UL52和UL8分别与VZV的ORF55、ORF6和ORF52以及HCMV的UL105、UL70和UL102，HHV-6,7的U77、U43和U44，EBV的BBLF4、BSLF1和BBLF2/3，KHSV的ORF44、ORF56、ORF40/41基因具有同源性。其中，UL5、ORF55、UL105、U77、BBLF4和ORF44基因负责编码解旋酶，UL52、ORF6、UL70、U43、BSLF1和ORF56基因负责编码引物酶，UL8、ORF52、UL102、U44、BBLF2/3和ORF40/41基因负责编码非催化亚基[7]。 2.2 HP复合物的作用与功能 解旋酶是一种腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate ，ATP）依赖的马达蛋白，具有将双链DNA在复制叉处分离成2条单链的作用，使参与DNA复制过程的其他蛋白可以与单链区域结合。解旋酶还可能在DNA上定位HP复合物，并与引物酶一起为ATP酶提供必要的结构域。 引物酶是一种DNA依赖的RNA聚合酶，在复制的过程中，合成DNA聚合起始所需要的RNA引物，引物能提供DNA聚合酶所需的3'羟基游离的核苷酸，从而合成DNA的互补链[3-4]。引物酶可以将解旋酶装载并定位在DNA上的合适位置，进而调节异源三聚体的解旋酶和ATP酶活性，并在ssDNA上合成RNA引物，也可以通过蛋白质-蛋白质相互作用将DNA聚合酶招募到复制叉上，然后由聚合酶通过脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy- ribonucleoside triphosphate ， dNTP）聚合延长DNA片段，解旋酶-引物酶复合物抑制剂（helicase- primase complex inhibitor ，HPI）很可能干扰了HV中的这种相互作用。 非催化亚基不显示任何酶的活性，并且也不调节HP复合物与DNA的结合，但能整合解旋酶和引物酶，形成HP复合物并且激活解旋酶和引物酶的活性，提高引物起始率[15,23]并且非催化亚基可以与其他HV复制蛋白（起源结合蛋白、聚合酶、ssDNA结合蛋白等）一起，在复制叉的蛋白质-蛋白质相互作用中扮演重要的角色[19]。 HP复合物同时具有5'，3'解旋酶活性、依赖ssDNA的ATP酶活性和引物酶活性[15]。在复制初始阶段，这3种蛋白质作为引物体的一部分共同作用[24]，当与复制叉结合时，2个HP复合物可能形成二聚体结构，其中一个为DNA合成准备滞后链，另一个准备前导链。 3 抗疱疹病毒的药物 目前临床批准用于治疗HV感染的药物主要靶向DNA聚合酶。根据化学结构和作用机制，这些药物可分为两大类：鸟苷类似物和非鸟苷类似物抑制剂。 鸟苷类似物类药物包括阿昔洛韦（acyclovir）、喷昔洛韦（penciclovir）、更昔洛韦（ganciclovir）、伐昔洛韦（valaciclovir）、泛昔洛韦（famciclovir）和缬更昔洛韦（valganciclovir）等。这类药物的作用机制是：首先由病毒激酶催化形成单磷酸盐，随后经宿主细胞激酶进一步磷酸化为具有生物活性的三磷酸形式。活性代谢产物能竞争性抑制病毒DNA聚合酶，并作为链终止剂掺入病毒DNA，从而阻断病毒基因组复制[8]。 非鸟苷类似物药物包括溴夫定（brivudine）、西多福韦（cidofovir）和膦甲酸（foscarnet），它们通过不同的机制抑制病毒DNA聚合酶。Brivudine作为三磷酸酯前体药物，首先通过病毒胸苷激酶催化形成单磷酸中间体，随后在宿主细胞激酶作用下进一步转化为具有活性的三磷酸形式[25-26]。Cidofovir分子结构中已预先整合单磷酸基团，仅需宿主激酶完成二次磷酸化即可形成活性二磷酸产物。该药物既可竞争性抑制DNA聚合酶，又可作为链终止剂掺入病毒DNA[27]。Foscarnet作为膦酸衍生物，它无需经历磷酸化过程，直接通过可逆性结合病毒DNA聚合酶的焦磷酸结合域，从而抑制DNA链的延伸[28]。 在核苷类抗HV药物的临床应用中存在交叉耐药性和显著的不良反应。Foscarnet和cidofovir均需通过静脉途径给药，且具有明显的剂量限制性毒性和肾毒性，另外，Cidofovir还可能引起骨髓抑制等严重不良反应[29]。 4 抗HV的HPIs活性及研究进展 4.1T-157602 Spector等[30]通过高通量筛选发现了2-氨基噻唑化合物T-157602（1），该化合物可逆地抑制HSV-1中HP复合物中的解旋酶（IC50=5μmol·L-1）和引物酶活性（IC50=20μmol·L-1），抑制HSV-1复制的EC90为3μmol·L-1。当浓度为25~50μmol·L-1时，T-157602能完全抑制病毒复制且无明显的细胞毒性。进一步研究表明，T157602的靶点是HP复合物中的解旋酶。 4.2 普瑞利韦（pritelivir） Pritelivir（2）（见图4）是一种高活性抗HSV的HPI，其最高研发阶段为Ⅲ期临床，可强效抑制HSV-1和HSV-2的复制，并且对核苷类药物耐药病毒株有效，但抑制VZV复制的活性弱。 早期，Kleymann团队通过荧光高通量筛选（high-throughput screening ，HTS）技术对化合物库进行筛选，发现了噻唑脲类苗头化合物BAY38-9489（3）[31]，随后经过计算机活性预测、化合物合成和生物活性测试，得到了具有体内活性的先导化合物BAY44-5138（4），然后经过多轮成药性优化，得到了临床前候选化合物pritelivir用于临床前研究。 在BAY 44-5138的磺酰胺N-去甲基化基础上，研究者将吗啉基替换为亲脂性的苯环，发现了化合物BAY 51-3295（5），这是首个体内药效强于valaciclovir的化合物。将脲结构片段中的NH电子等排为CH2得到BAY 54-6322（6），其在体内表现出更强的抗病毒药效，在此基础上将甲基磺胺替换为磺胺，得到了BAY 56-1655（7），其体外抗HSV-1和HSV-2的IC50均小于0.01μmol·L-1，体内半数有效量（median effective dose，ED50）分别为0.5mg·kg-1（HSV-1）和1.1mg·kg-1（HSV-2）。然而，BAY 51-3295和BAY 56-1655的溶解度低，将端位苯环替换为吡啶环提高了溶解度，其得到了pritelivir，抗HSV-1和HSV-2的EC50分别为20和16nmol·L-1[32]。 为了阐明作用机制，对化合物复制周期的影响进行分析。逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction ， RT-PCR）实验显示，在pritelivir干预的情况下，病毒能感染细胞，并启动病毒即刻早期基因的表达，而早期和晚期基因表达减少、抑制或不启动。用从耐药病毒中获得的PCR片段转染细胞，随后在抑制剂存在的情况下细胞感染野生型病毒，只有转染突变型UL5、UL52基因或突变型UL5、UL52与野生型UL5、UL8和UL52基因的混合基因时才能检测到病毒斑块，而转染野生型UL5、UL8或UL52基因时则没有检测到病毒斑块。从这些互补实验中得出结论，HP复合物是噻唑脲及其相应酰胺的靶标[31]。 Birkmann团队研究了pritelivir的药代动力学性质，发现其在人体内的代谢主要通过非酶解产生吡啶苯乙酸（8）和氨基噻唑磺胺（9）[33]。Pritelivir具有较好的口服生物利用度（73%），在大鼠、猴子和人体内的消除半衰期分别为5~10、30和60~70h，而acyclovir的消除半衰期分别为1、1.3~1.5和2.7~3.6h。但是，pritelivir具有碳酸酐酶（carbonic anhydrase ，CA）抑制活性，影响了后期研发，而此活性与其结构中的磺酰胺基团密切相关[34-35]。 4.3 IM-250和HN0037 为了获得选择性更好、靶组织暴露量更高的HPI，Gege等[35]对pritelivir的结构进行优化，发现了候选药物IM-250（10）（见图5）。2023年，化合物10开始了Ⅰ期临床试验[36]。 用氟化苯基片段取代pritelivir结构中的2-吡啶基，可以提高化合物的抗HSV活性。引入二氟苯基片段降低了分子整体的拓扑极性表面积（topological polar surface area ，TPSA），这提高了化合物在脑中和血浆中的浓度比。随后，用甲基亚磺酰亚胺基团取代磺酰胺药效团，得到化合物10，其不具有CA的抑制活性[35]。 与核苷类化合物相比，IM-250具有优越的抗病毒活性，抗HSV-1和HSV-2的EC50分别为19和28nmol·L-1，并且在已知的HPI中具有良好的靶组织暴露（脑/血浆比值为1.5~2.4），较长的半衰期（14~41h）和良好的口服生物利用度（77%~89%）。这些优点使IM-250在HSV感染的动物模型中表现出了良好的抗病毒药效[37]。 用茚满片段取代pritelivir中的苯环，降低了分子的柔性，引入了一个手性中心[38]，得到R-构型异构体HN0037（11），其抑制HSV-1复制的EC50为7nmol·L-1，比S-构型强140倍，在人体内半衰期长达50~61h，目前处于Ⅰ期临床研究阶段[39]。 4.4 ABI-1179 Gege等[40]保留了化合物10中的2,5-二氟苯基与HN0037中的茚满片段，考察2位取代基立体构型、磺酰胺基和甲基亚磺酰亚胺基团对活性的影响。这类分子结构中用2,5-二氟苯基取代了2-吡啶基，使得分子整体的TPSA降低，有利于提高化合物在神经组织中的暴露量。实验证明，这些化合物的立体构型决定了其对HSV的抑制活性：S异构体1a（12）（见图6）的活性较弱（EC50=2 000nmol·L-1），而R异构体1b（13）对HSV-1和HSV-2的抑制活性很强，EC50分别为0.5和16nmol·L-1，与pritelivir和IM-250相当。虽然1b的活性比HN0037强，但是2,5-二氟苯基的引入造成了化合物溶解度差的问题。与甲基亚磺酰亚胺基团相比，磺酰胺对活性更有利。 Gege等[41]用甲基亚磺酰亚胺取代磺酰胺时，发现活性下降为原来的4~8倍。吲哚啉5位氟取代后的化合物抗HSV-2的活性增强4倍，在2位引入氟甲基后得到的化合物ABI-1179（14）活性更强（EC50=11.1nmol·L-1），并且CA结合活性也更弱。化合物14与CAⅠ、聂结合的IC50分别为大于100和6.6μmol·L-1，而pritelivir的IC50则分别为0.45和1.8μmol·L-1。化合物14在人肝细胞中的清除率低至0.062L·h-1·kg-1，表明其体外代谢性质稳定。 4.5 阿莫奈韦（amenamevir） Amenamevir（15）于2017年在日本获批用于治疗HSV与VZV引起的感染，是目前唯一上市的用于治疗HV感染的HPI。Chono等[42]的实验结果表明，amenamevir能够抑制HP复合物的ssDNA依赖性ATP酶、解旋酶和引物酶活性。抗病毒实验显示，amenamevir对VZV、HSV-1和HSV-2具有同等的抑制活性，EC50分别为0.047、0.036和0.028μmol·L-1。重要的是，amenamevir没有明显的细胞毒作用（CC50＞30μmol·L-1）。Amenamevir的活性强于acyclovir，对不同VZV毒株复制的EC50分别为0.038~0.10和1.3~5.9μmol·L-1，并且对acyclovir耐药的病毒株也有活性，EC50为0.082μmol·L-1。 根据日本风险管理计划，amenamevir在日本上市后监测报告了具有重大潜在风险的副作用，包括血小板减少症、牙龈出血和心悸等[21]，因此继续开发选择性强、活性好、副作用少的HP复合物抑制剂依然具有重要意义。 4.6 其他抑制剂 Crute等[43]使用高通量筛选，发现了一系列2-氨基噻唑苯基衍生物。首先被报道的是先导化合物BILS-179-BS（16），其抗HSV-1和HSV-2的EC50均为100nmol·L-1，但对其他HV无活性。随后发现了BILS-45-BS（17），其抗HSV-1的EC50为0.15μmol·L-1[44-45]，在小鼠体内的口服生物利用度达到49%。用环己基替换BILS-45-BS上的吡啶基团，得到了类似物BILS-22-BS（18），其抗HSV-1的EC50和CC50分别为6和47μmol·L-1[46]。 5 结语与展望 相比，HPIs具有抗病毒活性强、对acyclovir耐药株与靶向DNA聚合酶的核苷类抗疱疹病毒药物有效、口服生物利用度高等优点。已在日本上市的此类药物amenamevir对VZV、HSV-1和HSV-2具有广谱抑制活性，但是可引起血小板减少和牙龈出血等不良反应，而进入III期临床试验的pritelivir选择性不高，可以抑制CA。因此，继续研究能广谱抑制不同亚型HV的HP复合物抑制剂，以及选择性高、副作用小的HPI，可以为抗HV药物研发提供重要的基础。 研究人员正在应用人工智能（artificial intelligence ，AI）技术以加快广谱、高效、低毒的抗HV药物的研发速度。在研究构效关系时，可以通过深度学习和分子动力学模拟，预测分子对HP复合物的抑制活性。利用AI工具可以预测HPI的分子活性、溶解度、渗透性、代谢稳定性等多重性质，还可以评估分子合成路径的复杂度和成本并进行逆合成预测，进而加速成药性优化的过程。同时，可以使用多模态数据融合方法，整合基因表达、化学结构和病理数据，并通过AlphaFold-Multimer等技术预测HPI与脱靶作用蛋白结合的可能性，提前警示候选化合物的潜在不良反应，有助于降低临床试验失败的风险。 参考文献： [1] Sharma D，Sharma S, Akojwar N, et al. 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