STW-264

摘要聚山梨酯（PS）是通常添加在生物制剂中的表面活性剂，可以保护蛋白质免受变性和聚集。然而，在一些单克隆抗体制剂中观察到聚山梨酯20（PS20）含量的降低，导致可见和/或亚可见颗粒的形成，最终损害治疗性蛋白质产品的质量和稳定性。确定颗粒主要由游离脂肪酸组成，表明PS的酶水解是PS降解的原因。通过免疫沉淀和鸟枪蛋白质组学富集宿主细胞蛋白（HCP）已被用于鉴定可以水解PS20的HCP。一种HCP，唾液酸O-乙酰酯酶（SIAE），即使在低浓度（<5ppm水平）下，对PS20降解也表现出很强的酶活性。重组SIAE与PS20的孵育产生了一种独特的降解模式，其中观察到短脂肪酸链单酯（C12、C14）的水解，但没有观察到长脂肪酸链（C16、C18）单酯或高阶酯的水解。在几种配制的单克隆抗体中检测并定量了SIAE，SIAE的量与这些单克隆抗体在孵育过程中PS20的降解呈正相关。其他实验还表明，当SIAE耗尽时，PS20降解减少，表明SIAE和PS20降解之间存在因果关系。SIAE的脂肪酶活性对PS20具有特异性，但对PS 80（PS80）没有特异性，PS 80含有长链脂肪酸单酯（C18）和高级酯。SIAE在PS20上的特异性酯酶活性表明，使用PS80而不是PS20来消除mAb产品中表面活性剂的降解是一种可能的解决方案。简介聚山梨酯20（PS20）和聚山梨酯80（PS80）是生物制药蛋白质制剂中最常用的表面活性剂，可提高蛋白质稳定性，保护蛋白质产品免受聚集和变性。聚山梨酯是不同脂肪酸酯的混合物，因山梨糖醇酐头和脂肪酸侧链而异，PS20的主要成分是单月桂酸酯（C12:0），PS80的主要成分为单油酸酯。药品制剂中典型的PS浓度在0.001%至0.1%（w/v）之间，以在保质期内保持蛋白质的稳定性。PS容易降解，这可能会导致制剂中不希望的颗粒形成。众所周知，PS主要通过两种途径降解：自氧化和水解。由于不饱和脂肪酸酯取代基含量高，发现PS80更有可能发生自氧化，而PS20中的氧化（不经常观察到）据信发生在聚氧乙烯链中的醚键上。此外，PS还可以通过破坏脂肪酸酯键进行水解。多篇出版物显示了酶介导的PS.6−10水解的证据。之前已经鉴定并报道了不同的宿主细胞蛋白与药物共纯化并催化PS的水解。据报道，脂蛋白脂酶（LPL）是与PS20和PS80降解相关的宿主细胞蛋白质之一，其中LPL敲除的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞显示PS降解显著降低。第十五组溶酶体磷脂酶A2异构体X1（LPLA2）证明了在小于1ppm的浓度下降解PS20和PS 80的能力。据报道，在5°C的条件下，小于10ppm的肝酯酶在一天内完全降解mAb药物产品中的PS80单酯。最近，一系列羧酸酯酶水解酶，包括洋葱假单胞菌脂肪酶（PCL）、南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）、蓝脓杆菌脂肪酶（TLL）、兔肝酯酶（RLE）和猪胰脂肪酶II型（PPL）选择分别含有99%月桂酸酯和98%油酸酯的两种独特PS20和PS80进行水解研究。不同的羧酸酯酶水解酶表现出独特的降解模式，表明降解模式可用于区分水解PS的酶。在开发一种由CHO细胞产生的单克隆抗体药物的过程中，观察到PS20降解，导致形成由游离脂肪酸组成的可见颗粒。PS20降解具有独特的模式，与文献中发表的其他PS20降解曲线不同。随后的调查揭示了根本原因是唾液酸O-乙酰酯酶（SIAE），这是一种HCP，当原料药中的含量低于5ppm时，具有降解PS20的脂肪酶活性。本文报道了这种脂肪酶的发现、其定量及其与PS20降解活性的相关性，以及其对未来单克隆抗体制剂开发的影响。SIAE（唾液酸乙酰酯酶）蛋白是一种酶，通过催化去除母体唾液酸 N-乙酰神经氨酸的 9 位 O-乙酰酯基团，在唾液酸代谢中发挥至关重要的作用。这种酶活性对于调节唾液酸的结构修饰非常重要，唾液酸是糖蛋白和糖脂的重要组成部分。结果2D-LC-CAD/MS检测单克隆抗体制剂中的PS如前所述，使用保留所有形式的聚氧化乙烯（POE）酯的梯度，通过2D-LC-CAD/MS分离、检测和鉴定配制的单克隆抗体中的PS。图1-II和1-IV分别显示了PS20和PS80的代表性CAD色谱。酯按单酯、二酯、三酯和四酯的顺序洗脱。根据聚合物的化学式和源内裂解产生的二氧戊环鎓离子，通过质谱法阐明了每种酯的结构。图1-III是PS20的代表性总离子电流（TIC）曲线，主峰编号，其中含有脱水山梨糖醇单酯、异山梨醇单酯和具有各种脂肪酸链的二酯。图1-V是PS80的代表性总离子电流（TIC）曲线，并标注了主峰。通过CAD色谱分析测定PS的定量。筛选具有脂肪酶活性的HCP单克隆抗体表明SIAE具有降解PS20的酶活性药物产品、鉴定、定量和确认具有酶活性的痕量HCP在分析上可能具有挑战性。为了规避这些挑战，我们开发了一种不同的策略，用于鉴定和确认具有脂肪酶活性的极低水平HCP，如本文所述。使用CHO HCP ELISA试剂盒F550（Cygnus，Southport，NC）通过免疫沉淀独立富集来自七种mAb候选药物（mAb-1-7）的第一批HCP，然后进行霰弹枪蛋白质组学分析。通过这些分析，我们确定了大约30名具有高置信度的HCP。在这30种HCP中，一些具有潜在酶和/或脂肪酶活性的蛋白质在CHO细胞中过表达并纯化。然后，通过在45°C下与PS20一起孵育，对这些纯化的重组CHO蛋白进行PS20降解活性测定。在这些蛋白质中，唾液酸-O-乙酰化酶（SIAE）在降解PS20方面表现出很强的活性。因此，我们通过SIAE进一步研究了PS20的降解模式。唾液酸乙酰酯酶（SIAE）对PS20降解模式与配制的单克隆抗体中PS20的降解模式相匹配如材料和方法部分所述，监测重组SIAE诱导的PS 20降解。浓度范围为1至10mg/mL的重组SIAE与0.1%的PS20一起孵育10天（图2）。当SIAE浓度为2.5mg/mL时，在10天的孵育过程中观察到PS20的显著降解。仔细观察PS20的色谱图表明，减少仅发生在27.5至33分钟之间的早期洗脱峰上。这些POE酯是含短脂肪酸链的单酯，包括POE山梨糖醇酐单月桂酸酯、POE异山梨酯单月桂酸酯和POE异山梨醇酯单肉豆蔻酸酯。然而，具有较长脂肪酸链的POE酯，包括POE单棕榈酸酯、POE单硬脂酸酯和具有高阶酯的POE山梨糖醇酐，在孵育过程中没有显示出明显的变化，表明酶优先靶向具有短脂肪酸链单酯。这种降解模式在之前对制造的单克隆抗体进行的其他脂肪酶研究中没有报道。然而，McShan等人最近进行的一项研究表明，当PS20与羧酸酯水解酶（纯化的胰脂肪酶II型）一起孵育时，也有类似的模式。根据基因本体论（GO）祖先图，唾液酸O-乙酰酯酶活性（GO:0001681）可以追溯到短链羧酸酯水解酶活性（GO:0034338），这与观察到的独特PS20降解模式一致，其中优选短脂肪酸链的酯键断裂。由于在配制的单克隆抗体中检测到了SIAE，我们还研究了含有SIAE的单克隆抗体样品的PS20降解模式。配制的mAb-1的PS20降解时间过程实验的代表性色谱图（图3下图）与重组SIAE的色谱图一起显示（图3上图）。这两种色谱图几乎完全相同，表明SIAE可能是单克隆抗体中PS20水解的潜在根本原因。测试了三种不同pH值的缓冲液，以评估pH值对SIAE诱导的PS20降解的影响。三种缓冲溶液分别为Tris缓冲液pH 8.0、组氨酸缓冲液pH 6.0和醋酸盐缓冲液pH 5.3（图4）。与分别与PS20一起孵育的mAb-1在pH 8.0和5.3时相比，在pH 6.0时观察到PS20损失的百分比更高。当重组SIAE与PS20在不同pH的缓冲液中孵育时，观察到对pH的类似反应，在pH 6.0时降解最大。配制mAb中SIAE的量与PS20随时间的损失呈正相关SIAE已被证明可以水解PS20；然而，其他脂肪酶/酯酶也可能参与这种降解过程。为了排除其他酯酶样酶活性的可能性，建立酶活性与SIAE内源性水平之间的相关性非常重要；如果SIAE水平与具有SIAE型水解模式的mAb样品的脂肪酶活性呈正相关，则SIAE很可能是唯一负责PS20水解的酶。否则，可能会涉及另一种活性酶。选择两种SIAE肽（LLSLTYDQK[3.2分钟]和ELAVAAAYQSVR[3.6分钟]），使用多反应监测（MRM）质谱法定量配制的单克隆抗体中的SIAE。使用掺入mAb样品中的SIAE来生成校准曲线。为每种肽生成了系数分别为0.998和0.995的标准曲线（0.1-10ppm）（图5，左图），并通过插值获得了每种单克隆抗体样品中SIAE的浓度。总共有10种单克隆抗体进行了SIAE定量。这10个单克隆抗体样本包括7种配制药物（mAb-0至mAb-6）和3个mAb-3的过程中样品（mAb-3过程-1、过程-2和过程-3）。测定10mAb样品中SIAE的浓度在0.2至4ppm之间。在浓缩和缓冲液交换到pH 6.0的10mM组氨酸缓冲液后，测量相同的10mAb的PS20降解。将剩余PS20的百分比与SIAE浓度绘制成图，并计算相关系数（R2）以评估两个变量的线性相关性（图5右侧面板）。计算出的Pearson相关系数为0.9201，呈下坡线性关系，表明这两个变量之间存在很强的负相关，表明原料药中的SIAE浓度与孵化过程中PS20的损失呈正相关。在10个mAb样本中，其中3个分别是来自三个连续纯化步骤（过程-1、过程-2、过程-3）的mAb-3过程中样本（图5右侧面板中填充的方形标记）。过程1是去除大多数HCP的第一个主要步骤。经过这一步骤后，SIAE浓度仍高达4ppm，导致酶活性很高，仅剩约22%的PS20。SIAE的耗尽导致PS20降解水平降低为了进一步检查PS20降解是否是由这些配制的单克隆抗体中SIAE的存在引起的，进行了SIAE耗竭实验。其基本原理是，如果PS20降解是由SIAE引起的，那么它的耗尽将导致PS20降解减少，降解程度将取决于SIAE被去除的量。图6显示了单克隆抗体样品的SIAE耗尽方案。人抗SIAE抗体与Dynabeads共价偶联，以消除mAb中的SIAE。一种替代抗体（不与SIAE结合）也与Dynabeads共价偶联作为阴性对照。我们首先通过蛋白质印迹分析验证了抗SIAE能够特异性结合CHO SIAE。如图7-I所示，当100 ng负载有或没有mAb存在时，蛋白质印迹可以检测到SIAE。应当注意，当加载量低于100ng SIAE（例如，10ng和50ng）时，使用这种抗SIAE抗体的蛋白质印迹未能检测到任何CHO SIAE。本实验中使用的抗体是针对人SIAE的。鉴于只有约70%的序列同源性，这种抗体不能以非常高的亲和力与CHO-SIAE结合也就不足为奇了。因此，当样品中存在大量CHO-SIAE时，抗人SIAE可能无法完全去除它。对于mAb-4，在SIAE耗尽之前，SIAE在45°C下活性降解约26%的PS20 5天。SIAE耗竭后，酯酶活性可忽略不计，表明SIAE是mAb-4中PS20降解的根本原因。这种去除是针对抗SIAE抗体的，因为阴性对照（一种非结合性抗体）根本没有改变酯酶活性（图7-II）。然而，对于mAb-5，尽管观察到酯酶活性显著降低（剩余PS20的41%-77%），但在耗尽后仍观察到约23%的PS20损失（图7-III）。由于抗SIAE是一种非CHO抗体，在使用CHO制备的mAb中对SIAE的亲和力较低，因此预计会有这种剩余的活性。很可能是耗尽没有完成，在mAb溶液中留下了痕量的SIAE。为了确认耗尽后剩余溶液中存在残留的SIAE，我们对样品进行了IP-MRM-MS。IP-MRM-MS结果被添加到10个数据点集（之前如图5所示）中，作为图7-IV中填充菱形的标记。在耗尽之前，SIAE浓度为1.8ppm，耗尽后降至0.97ppm。剩余的SIAE与Pearson相关曲线非常吻合，表明这是剩余的SIAE，而不是导致PS20降解的另一种HCP。讨论唾液酸O-乙酰酯酶（SIAE）是一种属于SGNH水解酶家族的酶，有7000多个成员，在各种生物事件中起着重要作用。Lse是从大多数组织中检测到的亚型。SIAE最著名的功能是其酯酶活性，作用于唾液酸9和4位的羟基以去除乙酰基。然而，SIAE生物学的几个方面仍然不清楚。SIAE蛋白的计算机表征和3D结构建模表明，SIAE是高度糖基化的，糖基化会影响酶的生物活性。16唾液酸和聚山梨酯POE头基之间的结构相似性表明SIAE可以降解PS。由于每种PS组分可以以不同的效率水解，因此在配制的mAb中观察到的PS20降解模式可以用作指纹，以鉴定和验证负责PS20水解的酶。在这项工作中研究的配制的单克隆抗体中观察到的PS20降解曲线表明，单酯比高阶酯具有特异性裂解。还发现酯酶活性针对链长较短的含尾基（脂肪酸）的单酯（C12、C14）。大多数对PS具有活性的脂肪酶都可以靶向单酯和HOE，例如，洋葱假单胞菌可以降解除山梨糖醇酐单月桂酸酯外的所有PS20 POE酯，而兔肝酯酶可以降解所有PS20 POE酯。与单酯相比，XV族溶酶体磷脂酶A2异构体X1（LPLA2）产生的PS20降解模式显示HOE的下降速度要快得多。SIAE的独特降解模式也可以帮助我们评估这种HCP存在的风险。最近，Doshi等人研究了酯分布对游离脂肪酸溶解度的影响，发现HOE可以溶解比单酯多得多的游离脂肪酸。因此，与许多其他脂肪酶/酯酶相比，含有微量SIAE的药品形成颗粒的风险较低，因为它优先降解PS20的单酯。此外，与在正常储存条件（5℃）或应激条件（37℃）下可以降解亚ppm水平PS的其他脂肪酶相比，如LPL 2，肝羧酸酯酶1样蛋白或肝羧酸酯酶B-1样蛋白，SIAE在低于1 ppm时没有表现出很强的PS降解活性，特别是在正常储存状态下。这表明SIAE降解PS的酶活性相对低于LPLA2和肝羧酯酶。同样有趣的是，SIAE的酯酶活性对PS20是特异性的，但对PS80不是。从结构上讲，PS80与PS20不同，PS20含有不饱和长链脂肪酸单酯（C18:1/C18:2）和高级酯（图1-I）。SIAE更喜欢用短脂肪酸链切割单酯上的位点。如图8所示，在45°C下与SIAE一起孵育5天后，PS80没有显示出任何降解。进一步的结构和生化研究可能有助于了解SIAE的独特切割模式，这可能与疏水性POE酯部分的体积有关。SIAE对PS20的特异性酯酶活性表明，在mAb制剂中使用PS80可能比PS20更具优势，尽管在使用PS80时可能需要考虑氧化问题。除了使用PS80作为替代表面活性剂外，创建SIAE敲除CHO细胞系以消除SIAE表达是有利的，从而减少PS降解，同时保持CHO衍生mAb的常规纯化过程。鉴于CHO细胞的遗传异质性，完全去除特定的HCP表达可能很费力。具有类似酶活性的其他HCP的表达变化也可能上调，导致类似的PS20降解。然而，这一领域的努力可能会进一步深入了解PS降解机制，以及将其最小化的解决方案。重要的是要注意，除了本研究中描述的PS20退化曲线外，在所研究的其他配制的mAb中还发现了不同的PS20分解曲线。这种不同的降解模式表明，单克隆抗体药物中还存在其他宿主细胞蛋白。结论除了使用PS80作为替代表面活性剂外，创建SIAE敲除CHO细胞系以消除SIAE表达是有利的，从而减少PS降解，同时保持CHO衍生mAb的常规纯化过程。鉴于CHO细胞的遗传异质性，完全去除特定的HCP表达可能很费力。具有类似酶活性的其他HCP的表达变化也可能上调，导致类似的PS20降解。然而，这一领域的努力可能会进一步深入了解PS降解机制，以及将其最小化的解决方案。重要的是要注意，除了本研究中描述的PS20退化曲线外，在所研究的其他配制的mAb中还发现了不同的PS20分解曲线。这种不同的降解模式表明，单克隆抗体药物中还存在其他宿主细胞蛋白。