UB-VV400

体内（In vivo）CAR细胞疗法正在经历从传统体外制造向原位细胞编辑的变革性转变，旨在通过靶向载体递送，直接在患者体内生成功能性的CAR工程化免疫细胞，从而显著提高治疗的可及性和适用性。尽管在病毒（慢病毒和腺相关病毒载体）和非病毒（脂质纳米颗粒）递送平台以及效应细胞谱系（包括CAR-T、CAR-NK和CAR-M）的扩展方面取得了快速进展，但关键的转化瓶颈仍然存在，包括递送精度不足、细胞持久性有限、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的抵抗以及安全可控性方面的挑战。 《Molecular Biomedicine》近日发表综述，系统地审视了当前用于体内基因转移的递送平台的工作机制和局限性，全面比较了CAR-T、CAR-NK和CAR-M平台如何采用不同但互补的策略来应对肿瘤异质性、实体瘤的物理和免疫屏障以及原位编辑的特异性限制。此外还重点介绍了新兴的前沿领域，如人工智能指导的个性化治疗设计、智能递送系统（逻辑门控CAR、环状RNA载体）以及多细胞协同“合成免疫系统”的开发。通过整合多学科视角，本综述不仅提供了连接基础机制与临床转化的全面路线图，也为推进下一代安全、精准、有效的体内CAR疗法奠定了理论和技术基础。 点击文字下载原文In vivo CAR-cell therapy：current challenges and emerging therapeutic advances.pdf 引言 基因工程免疫细胞疗法（特别是CAR-T细胞）已经彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗，并开启了癌症免疫治疗的新时代。这种成功的核心是体外范式，即从患者或供体中获取免疫细胞，经过基因工程改造、扩增后重新回输以发挥治疗效果。然而这种模式固有的局限性——包括复杂的制造过程、漫长的周期、高昂的成本以及对患者特定细胞质量的依赖——严重限制了其广泛应用和可及性。 为了克服这些障碍，免疫治疗领域正在经历一场深刻的转变，从“细胞作为药物”转向“患者身体作为生物反应器”，从而催生了体内CAR细胞疗法，其核心目标是通过体内靶向递送基因载体，直接在患者体内重编程内源性免疫细胞（T细胞、NK细胞、巨噬细胞），使其获得短暂或持久的肿瘤靶向能力。通过将复杂的细胞制造简化为一次或多次精准的体内给药，该策略有望简化流程、降低成本，并将治疗适应症扩展到实体瘤、自身免疫性疾病甚至传染病。 然而，这一前景广阔的愿景带来了前所未有的科学和转化挑战。首先，递送平台是准确、高效、安全地进行原位编辑的基石。传统的病毒载体（慢病毒、腺相关病毒）和非病毒系统（脂质纳米颗粒、聚合物载体）在转导效率、持久性、免疫原性和靶向特异性方面各有优劣。主要的挑战在于根据不同免疫细胞类型（T细胞、NK细胞和巨噬细胞）的生物学特性来定制这些平台，以实现有效的体内编程。其次，体内生成的CAR细胞面临着严峻的生存和功能障碍：它们缺乏外源性细胞因子支持，受制于宿主的病理状态和免疫抑制性肿瘤微环境，并且容易发生功能耗竭。因此，它们的扩增能力和持久性通常不如体外制备的对应物。此外，安全风险更为复杂，包括由肿瘤异质性和抗原混杂性引起的““on-target, off-tumor”毒性、体内不可预测的扩增导致的细胞因子释放综合征（CRS），以及与病毒载体整合诱变或基因编辑脱靶相关的长期风险。 目前该领域正处于概念验证和临床转化之间的关键阶段。早期试验已开始验证各种方法的可行性，同时也揭示了核心瓶颈，如递送效率不一致和细胞持久性有限。未来的突破将依赖于更深层次的跨学科融合和智能技术进步。关键方向包括：开发下一代智能递送系统（逻辑门控、微环境响应性载体）；构建多细胞协同的“合成免疫系统”（CAR-T/CAR-NK/CAR-M）以克服实体瘤屏障；以及利用生物标志物和人工智能实现精准的患者分层和个性化治疗设计。 本综述旨在系统概述体内CAR细胞疗法的最新进展、核心挑战和未来方向。作者首先分析和比较了主要递送平台（病毒和非病毒）的技术原理和应用前景。接着探讨了限制体内CAR细胞功能的关键生物学屏障（包括细胞存活、耗竭和微环境抑制）并讨论了应对这些挑战的新兴策略。然后，总结了早期临床转化的现状和见解。最后，展望了通过个性化分层、人工智能辅助设计和跨学科创新实现智能治疗演进的路径。通过这一全面的讨论，可为体内CAR细胞疗法从技术探索向临床现实迈进提供一个连贯的图景和前瞻性的路线图。 递送系统：介导体内基因转导的载体 病毒载体：稳定表达的基石 CAR免疫细胞疗法的核心在于利用基因工程将编码CAR的人工基因序列高效、稳定地递送到效应细胞中。这一过程赋予细胞新的靶向和杀伤肿瘤的能力。为了实现这一目标，特别是确保持久的CAR分子表达以实现长期疗效，基因整合型病毒载体已成为当前CAR细胞制造无可争议的基石，尤其是慢病毒载体（LVs） 和γ-逆转录病毒载体。这两个载体平台是几乎所有已获批CAR-T产品）和绝大多数进入临床研究的CAR细胞疗法的生产标准。 逆转录病毒 作为一个开创性的整合型载体平台，γ-逆转录病毒通过其独特的生物学机制开启了基因治疗的大门。当病毒颗粒与靶细胞膜融合后，单链RNA基因组经逆转录产生的双链DNA在细胞有丝分裂期间（特别是核膜破裂时）进入细胞核，并通过病毒整合酶稳定地整合到宿主基因组中。这种基因整合能力使CAR分子得以持久表达，使基因工程改造的免疫细胞能够通过细胞分裂稳定地传递转基因。 临床上，逆转录病毒载体实现了从实验室到病床边的关键飞跃。Kochenderfer等人首次使用该平台生成了抗CD19 CAR-T细胞，并在B细胞淋巴瘤患者中实现了完全缓解，标志着基因重编程T细胞能够在体内消除恶性肿瘤的首次证明。随后，Savoldo等人通过比较性临床试验证明，逆转录病毒载体介导的CD28共刺激结构域共表达显著增强了CAR-T细胞在患者体内的持久性和扩增能力，从而定义了现代第二代CAR设计的核心架构。 然而对于体内转导，Poorebrahim等人]强调了一个主要的生物学限制：逆转录病毒整合复合物无法穿过完整的核膜，必须依赖宿主细胞有丝分裂（核膜破裂）才能进入基因组。因此，在体内基本处于静止状态的静息T细胞很难被转导。实验数据显示，静息T细胞的转导效率通常低于5%，远低于活化T细胞可达到的50%-80%。这一瓶颈严重限制了直接体内重编程的效率，并推动了研究重点向慢病毒载体转移。 慢病毒 与逆转录病毒不同，慢病毒载体具有主动入核能力，使其能够有效感染非分裂细胞。当载体颗粒与靶细胞相互作用时，它们将含有CAR基因的RNA基因组递送到细胞质中。逆转录成DNA后，病毒整合酶以随机或半随机的方式介导其整合到宿主基因组中。这种整合特性确保了CAR分子在细胞分裂过程中的稳定传递，为CAR-T、CAR-NK和CAR-M等多种效应细胞提供了长期、可靠的“武装”。 随着技术的演进，递送平台已从体外工程化转向体内工程化，该转变的核心是开发能够选择性靶向特定免疫细胞亚群的病毒载体。在探索T淋巴细胞特异性转导方面，Pfeiffer等人首先在人源化小鼠模型中证明了使用CD8靶向慢病毒（CD8-LV）的可行性。随后，Frank等人和Michels等人通过将抗CD3抗体片段偶联到病毒表面，实现了高达40%的体内转导率，进一步证实了表面工程化策略在精准激活和转导静息T细胞方面的高效性。 与此同时，这种体内工程化范式正在扩展到先天免疫谱系。在Hayal等人增强NK细胞慢病毒转导效率和Klichinsky等人验证了巨噬细胞靶向修饰的基础上，直接原位生成具有更强实体瘤浸润能力的CAR-NK和CAR-M细胞，正成为继CAR-T技术之后的关键研究焦点。 腺相关病毒（AAV） 在非整合型载体中，AAV因其低免疫原性和良好的安全性而成为体内基因递送的重要候选者。与逆转录病毒或慢病毒等整合型载体不同，AAV基因组进入细胞核后主要以附加体形式存在，随机整合的频率非常低。这种非整合特性使得转基因表达不改变宿主基因组，从而大大降低了插入诱变的风险。然而，AAV在原位T细胞转导方面面临固有的生物学障碍。首先，T细胞缺乏常见AAV血清型（如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）的高亲和力受体。其次，作为一种外源性单链DNA病毒，AAV容易触发T细胞的内在抗病毒防御，导致转录前基因组降解，导致初始转导效率非常低，通常低于1%。 尽管存在这些障碍，衣壳工程化仍取得显著进展。Nawaz等人通过系统优化血清型选择，并通过单次静脉输注高感染性的AAV-DJ变体，实现了约10%的体内CAR基因转导效率，相较于传统血清型通常低于1%的效率有显著提升。这项研究凸显了AAV在原位生成功能性CAR-T细胞方面的临床潜力。 这三种载体平台用于体内编辑的适用性差异显著。逆转录病毒载体严格依赖细胞分裂，限制了它们转导静息淋巴细胞的能力，从而限制了它们在体内治疗中的应用。相比之下，慢病毒载体能够有效转导非分裂细胞，并且易于进行表面工程化，已被Hunter等人确立为持久体内重编程的领先平台。尽管AAV的载货能力有限，但其非整合特性和低免疫原性使其成为一种避免插入诱变风险的安全替代方案。 非病毒载体系统：安全与灵活的前沿 尽管病毒载体在体外CAR细胞制造中确立了“金标准”，但当直接应用于体内基因编辑时，其固有的免疫原性、有限的载货能力以及不可避免的插入诱变风险构成了重大的转化障碍。在此背景下，非病毒载体系统——特别是脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物纳米颗粒和无机纳米颗粒——因其良好的生物安全性、低免疫原性和可规模化生产的优势，正在重塑免疫细胞基因治疗的格局（图1）。 图1. 病毒/非病毒载体的体内CAR细胞疗法机制。 该图展示了用于体内CAR细胞疗法生产的两种主要基因递送策略。细胞工程工作流程分为两条不同的路径： a 病毒载体方法： 使用慢病毒或逆转录病毒载体将CAR转基因递送至宿主细胞核。经过逆转录后，遗传物质发生基因组整合，从而实现CAR蛋白的长期稳定表达。 b 非病毒载体方法： 体外转录的mRNA作为基因有效载荷，通过电穿孔等物理方法直接导入细胞质，随后mRNA被翻译产生CAR蛋白。该方法避免了基因组整合，可实现CAR构建体的瞬时但高水平表达，之后mRNA在细胞内被自然降解。 体内T细胞重编程 在T细胞体内重编程领域，LNP已成为临床上最先进的非病毒递送平台。为了解决静息T细胞转导效率低下的天然屏障，当前研究集中于优化脂质化学结构以增强细胞类型特异性和摄取能力。Billingsley等人通过高通量筛选构建了专有的可电离脂质库，并调整LNP的pKa，开发出具有肝外趋向性的配方。与传统的基于MC3的LNP相比，这种优化使脾脏和淋巴组织中的mRNA表达增强了十倍以上，从而实现了高效的体内T细胞转导。 此外，为了简化复杂的抗体偶联过程并适应体内环境的异质性，仿生设计策略也被引入。Zhang等人开发了一种基于心磷脂的LNP，利用内源性细胞机制进行T细胞转染，无需抗体修饰。与传统的脂质配方相比，该系统在脾脏T细胞中实现了约五倍更高的转导效率，并显著提高了体内基因递送的稳健性。 巨噬细胞修饰 除了T细胞，非病毒载体在修饰先天免疫细胞方面也表现出高度的细胞类型特异性适应性。对于巨噬细胞（CAR-M），利用其天然的强大吞噬能力是提高递送效率的关键策略，同时兼顾TME的免疫重塑。Han等人设计了一种共递送策略，使用LNP同时包装CAR mRNA和免疫激动剂，不仅高效转染了巨噬细胞，还将肿瘤微环境中M1抑瘤表型的比例从不足20%显著提高到75%以上，同时实现了免疫重塑。类似的策略也已应用于非肿瘤疾病。Du等人使用LNP重编程巨噬细胞以治疗心肌缺血再灌注损伤，并显著减少了受损小鼠的梗死面积。此外，Argueta等人的研究进一步证实，通过特定脂质配方优化的LNP能够将CAR基因特异性递送至髓系细胞，并在实体瘤模型中实现了肿瘤消退，克服了传统载体对髓系细胞转导效率低下的问题。 NK细胞递送 相比之下，NK细胞天然抗拒脂质转染且易受细胞毒性影响，这促使载体开发转向非脂质材料。聚合物系统因其结构可控性和可调节的电荷密度而成为理想的替代方案。Gharatape等人证明，基于聚β-氨基酯（PBAEs）的阳离子聚合物可以通过静电凝聚DNA质粒形成稳定的纳米复合物。这些复合物通过一种独特的内吞途径进入NK细胞，将质粒DNA的转染效率从传统脂质体的极低水平提高到40%以上，从而克服了脂质递送的一个关键瓶颈。 此外，为了提高靶向精度，环境响应型“智能”载体已成为研究焦点。Jain等人和Wang等人开发了能够响应局部肿瘤条件（如低pH或升高的酶活性）的纳米系统，显著提高了CAR-NK和CAR-T细胞在靶点的生物利用度和安全性。 总的来说，非病毒载体系统以其高灵活性、安全性和可扩展性，正在克服病毒载体固有的许多局限性，成为从基础研究通往下一代临床可行CAR细胞疗法的关键桥梁。 递送平台的比较分析 持久性与可控性：基于疾病模型的临床获益权衡 持久性与可控性的平衡是载体选择的核心考量。Bot等人强调，病毒载体的基因组整合能力为治疗难治性血液恶性肿瘤提供了不可替代的价值，单次给药即可建立长寿命的CAR细胞群，提供持续的免疫监视。然而这种持久性也带来了长期毒性管理的挑战。例如，靶向B细胞抗原可能导致永久性B细胞再生障碍，需要终身补充免疫球蛋白。此外，在实体瘤环境中，如果靶点在健康组织中也有低水平表达，持久的CAR表达可能导致不可逆的““on-target, off-tumor”毒性。 正是在这种背景下，非病毒系统（特别是mRNA/LNP平台）作为“安全开关”策略凸显了其互补价值，它们的瞬时和可逆表达特性为克服病毒载体的局限性提供了一种独特的策略。首先，在实体瘤治疗中，瞬时表达的CAR细胞在消除肿瘤后会自然衰减，从而最大限度地降低长期脱瘤毒性的风险。其次，这种“hit-and-run”模式在非肿瘤应用中尤其有利——例如治疗心肌纤维化或清除传染性病原体——其目标是短期清除病理靶点，而非建立终身免疫。在这里，瞬时CAR-T或CAR-M细胞可以在完成任务后迅速被清除，显著降低CRS等急性毒性风险，并避免长期破坏免疫稳态。 此外，在抗感染应用中（例如通过肽修饰的LNP体内生成CAR-M细胞以清除金黄色葡萄球菌），瞬时表达在急性感染环境中展现出快速响应性、安全性和可控性。这种可调的持久性将CAR疗法的治疗范围从肿瘤学扩展到自身免疫性疾病、纤维化疾病和传染病。 转化障碍与产业化前景：从GMP制造到标准化合成 从制造和临床转化的角度来看，不同递送平台的技术壁垒和成本效益差异显著。病毒载体（特别是临床级别的慢病毒载体）涉及复杂的生产过程、漫长的周期、高昂的成本以及确保批次间一致性的挑战，这些都限制了它们的广泛采用。相比之下，非病毒系统（尤其是化学合成的LNP）在标准化生产、易于放大和相对较低的成本方面具有优势，使其对临床转化越来越有吸引力。 此外，基于mRNA的平台提供了非凡的灵活性。序列设计和合成快速且模块化，允许对CAR构建体进行快速迭代优化或切换靶点。尽管如此，非病毒和mRNA平台也面临独特的挑战：在某些细胞类型中体内递送效率仍不理想，并且仍然可能触发对载体组分或外源mRNA的先天免疫反应。 总之，体内CAR细胞疗法的未来进步将依赖于对这些多样化递送平台（表1）的更深入理解和战略整合。通过采用量身定制的、情境驱动的选择策略，该领域可以朝着更个性化、更精准、更安全的治疗结果迈进。 体内治疗瓶颈的核心挑战 CAR细胞疗法前景广阔，但也面临多重生物学和工程学挑战。尽管CAR-T、CAR-NK和CAR-M疗法共享靶点介导激活的核心逻辑，但它们独特的细胞生物学特性在应对关键治疗瓶颈时赋予了它们不同的优势和局限性。本节将围绕四个核心挑战（细胞持久性与存活、肿瘤异质性与在靶安全性、实体瘤的物理和免疫屏障、以及体内编辑的精度），系统分析各细胞平台的应对策略。通过整合它们的互补优势，旨在勾勒出通往下一代智能、体内工程化免疫疗法的汇聚策略和未来路径。 扩增、存活与耗竭挑战 体内CAR细胞疗法正从体外制备的精准制造范式转向新的原位合成模型，即在患者体内直接工程化免疫细胞。这一转变虽然前景广阔，但也凸显了一个关键瓶颈：通过体内递送生成的CAR细胞与体外制造后回输的对应物相比，其存活和持久性明显较差。根本性挑战在于，要在复杂、动态且往往 hostile的体内微环境中，复制仅在精确控制的体外条件下才能实现的高质量细胞产品。这一限制直接损害了治疗的长期抗肿瘤疗效，并增加了肿瘤复发的风险。其根本原因复杂且相互关联，主要可归因于以下三个层面。 信号强度与持久性之间的矛盾 基于mRNA的CAR表达平台因其瞬时蛋白表达能力和相关的安全性优势，已成为非病毒基因递送和体内CAR细胞疗法的一种有前景的策略。然而该策略的临床转化受到一个核心挑战的限制：传统线性mRNA在细胞内的固有不稳定性——典型降解速率常数kdeg_trans估计为 0.037h-1，导致CAR蛋白表达迅速下降，通常在单次给药后几天内显著减弱。这种瞬时表达特性难以提供CAR细胞在体内长期功能持久性所需的持续共刺激和细胞因子信号（CD28, 4-1BB, IL-2）。因此，当前的线性mRNA平台通常面临信号强度与表达持久性之间的固有权衡，这可能导致CAR细胞激活不足或过早耗竭，从而限制其体内抗肿瘤疗效。 缺乏细胞因子和共刺激信号 体外培养系统可以模拟最佳的免疫反应环境，通过高浓度的细胞因子（IL-2, IL-7, IL-15）和优化的共刺激信号，为免疫细胞的扩增、记忆表型诱导和延迟功能耗竭提供关键的“营养支持”。相比之下，通过体内递送系统生成的CAR细胞通常无法获得同样支持性的微环境。在生理条件下，身体通常无法维持CAR细胞长期激活、增殖和存活所需的高水平细胞因子和共刺激信号。 此外，CAR细胞被引入的局部或全身环境通常受病理状态影响，这会损害CAR细胞的功能。在TME中，抑制性分子（PD-L1，腺苷）和调节性免疫细胞主动抑制CAR细胞活性并加速其耗竭。在自身免疫性疾病环境中，虽然不存在典型的肿瘤样免疫抑制，但高水平的抑制性细胞因子（TGF-β, IL-10）、促凋亡因子（如Fas配体）和失调的免疫调节网络同样会阻碍CAR细胞扩增、促进凋亡并加速功能衰退。 因此，体内生成的CAR细胞面临着双重挑战：一方面缺乏体外可用的外源性细胞因子和共刺激支持，另一方面同时承受来自病理微环境（无论是肿瘤相关还是自身免疫驱动）的抑制压力。这些因素共同导致CAR细胞扩增受限、存活率降低、记忆亚群形成不足、抵抗耗竭的能力受损，最终影响治疗的持久性和疗效。 恶劣土壤中的劣质种子 患者在经历多线治疗后，常出现免疫细胞减少症和全身性免疫抑制。T细胞耗竭的特征为抑制性受体（PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3）高表达，削弱了细胞因子的分泌和增殖能力。同样，耗竭的NK细胞也表现出抑制性受体（PD-1, TIGIT, TIM-3, NKG2A）表达升高，同时激活性受体（NKG2D, DNAM-1）下调。此外，M2极化巨噬细胞不仅通过分泌IL-10、TGF-β和VEGF促进肿瘤生长、血管生成、免疫抑制和组织修复，还直接抑制T细胞和NK细胞的功能。这些情况共同导致可用的CAR细胞“种子”库在数量上不足、质量上受损。不利的基础宿主状态和相互抑制的微环境共同构成了一道必须跨越的“生存之墙”，这是实现体内生成CAR细胞持久功能性存活的重大障碍。 肿瘤异质性、脱靶与过度激活挑战 在克服传统异体输注局限性的同时，体内CAR细胞疗法面临着一个更复杂的靶向悖论。时空肿瘤异质性、多样的抗原表达谱以及微环境中免疫细胞和基质细胞的不同组成，共同构成了一个动态且危险的“雷区”。这一挑战不仅直接影响治疗效果（抗原逃逸），也影响安全性（脱靶毒性）和可控性（过度激活）。核心困境在于，原位生成的CAR细胞必须在没有体外质量检查和剂量校准的情况下，准确识别并消除移动的、不断演变的目标——包括那些与健康组织共享抗原的目标。当这种精确性失败时，后果可能从治疗无效到危及生命的不良事件。这一挑战体现在两个相互关联的层面。 异质性驱动的双重失效风险 空间转录组学和单细胞测序的进展已系统揭示了肿瘤抗原高度复杂且动态的时空异质性，这种异质性对体内CAR细胞疗法提出了重大挑战。首先，抗原表达表现出显著的解剖学和功能变异性。不同组织间，甚至在同一肿瘤内部（例如在缺氧/坏死核心、代谢活跃的侵袭前沿和免疫细胞富集区域）抗原谱各不相同，这要求CAR细胞能够适应局部微环境并精准靶向具有不同抗原特征的肿瘤亚群。其次，肿瘤抗原并非静态，而是在治疗压力下不断演化。预先存在的靶抗原表达低或不存在的亚克隆可能在CAR介导的抗原阳性细胞清除后扩增，通过表观遗传调控、抗原丢失或修饰导致抗原逃逸，并最终导致疾病复发。此外，时空异质性也增加了脱靶风险。许多肿瘤相关抗原（TAAs）在正常组织中也有低水平或以特定时空模式表达，可能导致肿瘤攻击和健康组织损伤同时发生。 对于CAR-T细胞而言，这种动态可能驱动“清除抗原阳性细胞——选择性扩增抗原阴性克隆”的免疫编辑过程，最终导致复发。例如，在CD19 CAR-T治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中出现的抗原丢失或下调，以及在CD19 CAR-T压力下向单核/巨噬细胞样表型的谱系转换。在多发性骨髓瘤的BCMA CAR-T治疗中，高水平的可溶性BCMA或邻近膜蛋白（CD55, CD59）可能造成空间位阻，导致表位掩蔽或修饰。关键的是，理想的肿瘤特异性抗原（TSAs）在实体瘤中很少见；CAR通常靶向在部分正常组织中生理性低表达的TAAs。尽管体内生成的CAR-T细胞可能表现出比体外对应物更弱的扩增和持久性，但其系统性分布仍然存在严重甚至致命的“在靶，脱瘤”毒性风险——例如肝毒性和肺上皮损伤。 CAR-M疗法面临不同的挑战。虽然巨噬细胞天然能浸润肿瘤，但TME中包含从抗肿瘤M1到促肿瘤M2的一系列巨噬细胞表型。尽管CAR-M可以增强吞噬作用和抗原呈递，但TME中不均匀的抗原表达可能限制其重编程所有肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的能力。局部因素甚至可能导致CAR-M恢复促肿瘤表型。脱靶风险仍然严重：诸如HER2、EGFR和PSMA等抗原也在维持稳态的组织驻留巨噬细胞（肺泡巨噬细胞、枯否细胞）上表达。靶向这些抗原可能会损害关键的防御和修复功能——例如，靶向HER2的CAR-M可能会攻击肺泡巨噬细胞和低表达HER2的心肌细胞。 CAR-NK细胞通过多种激活性（NKG2D, CD16）和抑制性受体（KIRs, NKG2A）拥有内在的自我识别机制，理论上比CAR-T细胞的脱靶风险更低。然而肿瘤异质性可能通过不同的机制损害疗效：NK细胞的活性受信号平衡调控。如果肿瘤细胞下调激活性配体（MICA/B）并上调抑制性配体（HLA-E, PD-L1），即使CAR信号也可能无法完全激活CAR-NK的细胞毒性，导致对异质性肿瘤的清除不完全。 体内“过度激活”的系统性风险 在体外CAR细胞疗法中，输注的细胞剂量可以部分控制。而体内CAR疗法中的活性细胞剂量取决于原位生成和扩增，受到递送效率、宿主免疫状态和抗原负荷等变量的影响，难以预测或精确调控。 对于CAR-T细胞，过度激活主要表现为CRS和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。例如，在CD19 CAR-T治疗急性淋巴细胞白血病中，过高的肿瘤负荷曾引发爆炸性的CAR-T扩增，导致严重的CRS并引发致命性脑水肿。同样，在多发性骨髓瘤的BCMA CAR-T治疗中，骨髓内的持续激活诱导了严重的ICANS，包括癫痫发作和意识障碍。值得注意的是，一项关于体内生成CAR-T的临床前研究观察到，重复高剂量静脉注射靶向纳米颗粒（5×3×10 11 颗粒）使血清IL-6水平升高了2.5倍——即使是在递送非特异性对照CAR基因。这表明，如果递送系统导致免疫细胞中广泛的CAR基因修饰，或者淋巴组织中的靶抗原表达过高，载体本身的免疫原性可能会放大CAR-T的过度激活并加剧全身毒性。 CAR-M过度激活表现出不同的毒性特征，主要集中在慢性组织损伤和纤维化风险上。临床前研究表明，靶向HER2的CAR-M可诱发心肌炎症并上调促纤维化的TGF-β。在肺纤维化模型中，过继转移活化的巨噬细胞会显著增加胶原蛋白沉积。此外，作为专业的抗原呈递细胞，CAR-M在吞噬健康组织后可能通过表位扩展触发自身免疫，类似于在CD19靶向CAR-T治疗中观察到的与抗MOG抗体相关的脱髓鞘病变。因此，CAR-M的过度激活需要特别关注慢性炎症损伤、纤维化和自身免疫后遗症。 与CAR-T和CAR-M相比，CAR-NK细胞因其独特且更为有限的细胞因子分泌谱，发生严重CRS的风险较低，然而过度激活的CAR-NK仍可通过大量释放IFN-γ引起全身性副作用，如发热和肝酶升高。一个独特的风险在于，它们攻击低水平表达靶抗原且缺乏HLA I类分子（通常是NK抑制信号的来源）的健康细胞的潜力增强。 总之，肿瘤异质性、脱靶毒性和过度激活共同构成了体内CAR疗法安全有效应用必须跨越的三大障碍。应对这些挑战需要下一代智能编程策略，包括逻辑门控CAR（“AND门”设计以提高特异性）、微环境响应性启动子（缺氧诱导因子-1α）以及集成安全模块，如杀伤开关或分子刹车（iCAS9）。同时，将基于多组学的患者分层用于个性化靶点选择与局部放疗或免疫调节剂相结合，以重塑肿瘤微环境并均质化抗原表达，将是克服这些障碍、释放体内CAR细胞疗法全部潜力的关键。 实体瘤的物理屏障与免疫抑制微环境 实体瘤物理屏障 实体瘤的物理屏障是CAR细胞疗法有效递送和浸润的主要障碍。这些屏障由致密的细胞外基质（ECM）、异常的肿瘤血管系统和升高的间质液压组成，共同构成了一个限制性的微环境。 对于CAR-T细胞，它们较大的尺寸和对趋化因子引导的迁移（CXCL9/10/11-CXCR3轴）的依赖限制了它们穿透致密基质和均匀浸润肿瘤核心的能力，常常将治疗活性限制在肿瘤周边区域。CAR-M具有更强的组织浸润能力，并可通过分泌基质金属蛋白酶（MMPs）重塑ECM。然而，过度激活可能导致非选择性基质降解（通过MMP9），这可能无意中为肿瘤播散创造通道，从而增加转移风险。 CAR-NK细胞相对较小，理论上更具穿透性。然而Wolf等人观察到，肿瘤浸润性NK细胞与循环NK细胞相比，表现出更大且更不规则的形态，这表明在组织进入过程中存在物理适应——也可能是抵抗。此外，CAR-NK细胞仍然受到肿瘤缺氧核心区不规则灌注和缺氧/营养供应不足的限制。重要的是，物理屏障不仅阻碍细胞进入，也阻碍了关键效应分子如细胞因子（IL-2, IFN-γ）和趋化因子（CXCL12）的扩散，进一步削弱了抗肿瘤反应。 为了克服这些基本限制，体内CAR细胞疗法提供了一个有前景的替代方案：将基因编辑载体（慢病毒/腺相关病毒载体或靶向mRNA-LNP）直接递送至已被募集到肿瘤部位或微环境的内源性免疫细胞——如肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞或NK细胞。这种方法绕开了体外扩增和全身输注的需要，而是原位重编程驻留的免疫细胞，使其从肿瘤内部发起即时的、局部化的攻击。理论上，这种策略可以更有效地克服物理屏障并增强治疗渗透性。 免疫抑制微环境 实体瘤的免疫抑制性TME是实现CAR细胞疗法持久抗肿瘤活性的核心障碍。该环境富含免疫抑制细胞——如调节性T细胞（Tregs）和TAMs（主要为M2极化型）——并以高水平的抑制因子（TGFβ, IL-10）和免疫检查点分子（PD-L1/PD-1, CTLA-4）高表达为特征，形成了一个多层次的抑制网络。 对于CAR-T细胞，在TME中持续暴露于TCR和PD-1信号传导很容易诱导功能耗竭，伴随着耗竭相关转录因子（如TOX）的上调和表观遗传重编程。即使CAR-T细胞成功浸润肿瘤，其增殖能力和效应功能也常常迅速减弱。虽然CAR-T细胞可以在血液系统恶性肿瘤中建立持久的记忆反应，但实体瘤的抑制性微环境（TGF-β和IL-10）严重损害了这种记忆的形成和维持。 与CAR-T细胞通过穿孔素和颗粒酶B诱导快速凋亡的机制不同，CAR-M在此环境中表现出独特的功能特征。它们的核心机制涉及吞噬溶酶体降解途径：识别靶点后，激活的Syk激酶信号驱动细胞骨架重排形成吞噬杯，从而吞噬整个肿瘤细胞，随后在酸性吞噬溶酶体中完全降解。这个过程不仅能物理清除肿瘤细胞，还能产生丰富的抗原片段，使CAR-M成为高效的抗原呈递细胞，能够刺激多克隆T细胞反应，产生强大的原位疫苗效应。 同时，CAR-NK细胞的独特价值也日益得到认可。CAR-NK的一个关键优势在于其非MHC依赖的、多模式的细胞毒性：除了通过穿孔素/颗粒酶B和死亡受体配体（FasL, TRAIL）诱导凋亡外，活化的CAR-NK细胞还分泌IFN-γ和GM-CSF等细胞因子，直接调节免疫微环境。重要的是，这种非MHC依赖性使得CAR-NK细胞能够有效靶向那些通过下调或丢失MHC I类分子来逃避T细胞识别的肿瘤细胞，直接对抗一种主要的免疫逃逸机制。这种能力补充了CAR-T的活性，并为对抗肿瘤异质性提供了关键防线。 在这个框架内，不同的CAR细胞平台共同形成了一个功能协同的“合成免疫系统”（图2）：CAR-M充当TME重塑者和免疫反应启动者，打破免疫抑制并触发广泛的免疫激活。CAR-T充当精准的细胞毒性效应器和记忆形成群体，在重塑后的微环境中实现靶向清除和持续免疫监视。CAR-NK作为一个非MHC依赖的快速反应单元，提供即时细胞毒性并填补免疫识别的空白。它们共同提供了一种分层且适应性强的策略，以克服实体瘤的多方面障碍。 图2. CAR-T、CAR-M 和 CAR-NK 细胞在抗肿瘤免疫中的比较作用机制。 该图说明了过继转移的 CAR-T、CAR-M 和 CAR-NK 细胞在肿瘤微环境中介导肿瘤细胞杀伤的互补机制。 a CAR-M 细胞通过三个关键机制发挥抗肿瘤活性：直接吞噬和 ROS 介导的针对肿瘤细胞的细胞毒性；增强抗原呈递，促进 T 细胞活化；通过分泌 IL-6、IL-12、TNF-α 和 IFN-γ 等细胞因子进行免疫微环境重塑，这些细胞因子可激活 T 细胞和 NK 细胞，并将巨噬细胞极化为促炎性 M1 表型。 b CAR-T 细胞通过多种协同机制发挥抗肿瘤效应。它们通过释放穿孔素和颗粒酶 B，直接诱导表达抗原的肿瘤细胞凋亡。此外，CAR-T 细胞分泌 IFN-γ 等细胞因子，同时激活自身以及肿瘤微环境中的旁观 T 淋巴细胞，从而放大局部免疫反应。此外，通过 Fas/FasL 信号通路，CAR-T 细胞还可以清除缺乏靶抗原的肿瘤细胞，有助于克服肿瘤异质性带来的挑战。 c CAR-NK 细胞通过其嵌合抗原受体（CAR）进行抗原特异性识别来结合肿瘤细胞。同时，天然的激活性受体 CD16（FcγRIII）与结合在肿瘤上的 IgG 抗体的 Fc 部分结合，启动抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。一旦激活，CAR-NK 细胞通过释放穿孔素和颗粒酶 B 发挥直接的细胞毒性作用，诱导靶肿瘤细胞凋亡。 体内编辑的精准靶向与安全性 体内编辑技术的出现标志着CAR细胞疗法的范式转变，从“细胞作为药物”模式转向“患者作为生物反应器”框架。这种革命性方法的核心挑战在于确保基因编辑指令精准、高效、安全地递送至预期的免疫细胞群体，同时减轻脱靶编辑、载体相关毒性和不受控免疫激活等风险。应对这一挑战超越了技术可行性；它将从根本上决定不同免疫细胞类型作为未来治疗开发“理想编辑底物”的评估。 靶向递送、编辑效率与特异性 靶向递送和细胞类型特异性编辑效率仍然是实现精准体内重编程的主要障碍，成功与否在很大程度上取决于递送载体对特定免疫细胞的趋向性及其在细胞内递送的效率。 目前，髓系细胞（如巨噬细胞）显示出明显的优势。单核细胞和巨噬细胞是专业的吞噬细胞，具有强大的内化纳米颗粒并长期保留的内在能力。例如，研究表明，模型巨噬细胞摄取二氧化硅纳米颗粒的速率高达每细胞每小时7.9×104个颗粒，并且内化后48小时仍有约80%的颗粒保留在细胞内。通过调整脂质组成、表面电荷和配体展示，LNP的制剂工程能够实现体内对髓系细胞的高效靶向，静脉给药的LNP优先在肝脏、脾脏、肺和肿瘤内的巨噬细胞中积累就证明了这一点。这种内在亲和力使得体内生成CAR-M在技术上更为直接。 相比之下，编辑循环T细胞和NK细胞则更具挑战性。作为非吞噬性淋巴细胞，T细胞极难用非病毒载体转染。当前的策略依赖于将针对T细胞表面标志物（CD3, CD4, CD5, CD8）的抗体或配体偶联到LNP上。然而，T细胞亚群（幼稚 vs. 效应T细胞）之间及其在不同分化阶段的功能和表型异质性，使得均匀编辑变得复杂，并引发了对破坏正常T细胞稳态的担忧。 另一方面，NK细胞作为编辑底物显示出显著潜力。虽然也在血液中循环，但它们表达独特的表面标志物（NKG2D, CD56），可用于特异性靶向。此外，某些NK细胞亚群（CD56bright）表现出适度的内吞活性，可能有利于LNP的摄取。它们固有的安全性特征（包括较低的细胞因子释放综合征风险）意味着编辑效率的变异性或轻微的脱靶效应在临床上可能比基于T细胞的方法更易于管理。 细胞底物的差异耐受性 与体内编辑相关的安全风险在不同免疫细胞类型之间存在显著差异，这直接影响它们作为编辑底物的适用性，并定义了可接受的临床风险的上限。 其中靶向巨噬细胞存在显著的载体免疫原性风险。作为炎症反应的核心介质，巨噬细胞可以放大由LNP-mRNA递送触发的先天免疫反应，可能导致意外的局部或全身性炎症。相比之下，T细胞和NK细胞对类似刺激的反应尚不明确，但预计其效应谱会有所不同。 在更基础的层面上，脱靶基因组编辑的风险在T细胞中最为严重，因为它们具有恶性转化的潜力以及随之而来的继发性恶性肿瘤风险。对于NK细胞，其有限的寿命和增殖能力大大降低了因编辑错误导致长期克隆扩增的可能性。虽然终末分化的巨噬细胞携带的致癌风险极低，但这些细胞中的脱靶编辑可能会破坏其吞噬功能、极化或分泌活性，从而损害组织稳态并可能促进纤维化途径。 这些细胞类型特异性的行为风险构成了评估“理想编辑底物”的关键框架。对于体内生成的CAR-T细胞，需要严格控制以防止由持续激活驱动的CRS和ICANS。CAR-NK细胞因其固有的良好安全性特征而提供了更宽的治疗窗口，而CAR-M则需要精确校准激活阈值以避免过度炎症和组织损伤。 总之，从安全性耐受角度来看，NK细胞展现出显著优势。它们更高的安全阈值为体内编辑平台提供了更强健的风险缓冲，使其成为一种特别有前景的底物。 纳入是理想的“体内编辑底物”？ 综合评估靶向可行性、安全性特征和治疗潜力，可以揭示三大免疫细胞类型作为未来体内编辑底物的不同发展轨迹。巨噬细胞凭借其固有的吞噬活性、高效的纳米颗粒摄取和低致癌风险，与现有的LNP递送平台最为兼容，代表了近期最可行的转化路径。核心挑战在于精确调控其强大的效应功能，以避免过度炎症和组织损伤。NK细胞在可靶向性、编辑安全性和治疗功能之间取得了有利的平衡。它们的“即插即用”特性（包括不依赖复杂的共刺激、多模式细胞毒性和固有良好的安全性特征）使其成为中期、广泛适用的体内治疗的一个理想平台，能够以相对简单的工程化手段产生安全有效的“战士”。T细胞尽管面临巨大的靶向障碍和更高的致癌风险，但由于其无与伦比的克隆扩增能力和长期免疫记忆，仍然是最终的治疗追求；克服其编辑瓶颈将需要颠覆性的技术进步，这一努力的成功将标志着体内细胞工程领域的巅峰成就。 体内编辑路线图：协同增强CAR细胞效力的策略及涉及的临床挑战 多维度协作突破细胞存活与持久性瓶颈 面对体内CAR细胞疗法在扩增、存活和抗耗竭方面的多重挑战，当前的研发工作正在整合精准基因工程和先进递送技术，为效应细胞配备在复杂病理环境中生存的竞争优势（表2）。这种技术演进的核心在于建立一个“三合一”的多维协同框架。首先，配体引导的捕获和时空靶向使得编辑工具能够在特定的免疫亚群中预先富集。其次，核酸载体设计和表达架构的创新支持高效且持久的转基因生产，为持久活性提供分子基础。最后，重塑关键信号通路以增强效应细胞功能和表型适应性，赋予细胞抵抗免疫抑制微环境的内源性能力。 靶向递送策略 体内细胞特异性编辑的核心挑战在于，在复杂的生理环境中准确识别目标免疫亚群，同时避免被网状内皮系统（RES）非特异性清除和健康组织中的脱靶摄取。Shi等人强调，从“广撒网”向“精确制导”递送范式的演进（通过优化配体架构和偶联化学）对于实现特异性受体结合和提高治疗指数至关重要。 在T细胞重编程领域，载体表面工程化已达到成熟阶段。Frank等人开发了一种展示抗CD3 scFv的慢病毒载体（CD3-LV），在体内实现了高达40%的静息T细胞转导率。随后的工作建立了生成CD4+或CD8+特异性CAR-T细胞亚群的方案。例如，Agarwal等人使用CD4靶向慢病毒产生了在体内持续存在的Th1/Th2极化CAR-T细胞，而Winter等人]设计了一个模块化的适配体-慢病毒系统以实现灵活靶向。在非病毒方面，Liu等人采用CD3靶向的LNP递送CAR mRNA，并成功修复了受损的心肌组织。 对于先天免疫细胞，Yang等人工程化了可吸附血浆蛋白以选择性靶向肝脏驻留巨噬细胞的LNP。Xiao等人开发了展示抗CD206 scFv的可吸入性外泌体（sEVs），以重编程肺部M2巨噬细胞并抑制肺转移。与之类似，Tang等人使用肽修饰的LNP原位生成了靶向金黄色葡萄球菌的CAR-M细胞。在NK细胞领域，Diwanji等人利用天然的受体通路实现了体内特异性激活，Repellin等人提出了“NK细胞生物工厂”概念，即局部工程化的NK细胞持续分泌治疗性蛋白质以克服其有限的持久性。展望未来，Li等人强调，将环境响应性连接子与靶向配体相结合将是提高细胞类型特异性的关键。 创新的递送载体和表达元件 为了解决瞬时转基因表达的瓶颈，当前的研发焦点正从短效表达转向持续递送。这一转变中的一个关键突破是使用环状RNA（circRNA）替代传统的线性mRNA。circRNA共价闭合、抗核酸外切酶的结构使其在免疫细胞中的蛋白表达时间显著延长，通常比线性mRNA长数倍，为CAR细胞提供了更稳定、更持久的分子“弹药库”。 该策略已显示出有希望的结果。Jing等人利用circRNA编码了IL-2R-TLR4嵌合信号受体（CSR）以及靶向CA9的CAR，有效激活了T细胞免疫反应。在另一项研究中，Zhang等人使用PL40配制的脂质纳米颗粒递送circRNA编码的CAR，实现了持久性T细胞重编程，转染效率高达99%，并且与线性RNA对应物相比，对衰老细胞的清除效果更优。circRNA增强的稳定性成功克服了线性mRNA固有的短效表达限制，为基于瞬时基因递送开发持久的体内CAR疗法奠定了实践基础。 工程化细胞内在特性 除了递送系统的进步，改善体内细胞工程化的第三个维度涉及修饰免疫细胞的内在特性，以增强它们在复杂微环境中的生存和功能。一种方法是通过共表达关键分子直接补充关键的生存和增殖信号。例如，工程化CAR细胞使其共表达IL-7和IL-15等细胞因子或其同源受体，能够通过自分泌信号维持其扩增和持久性。类似地，过表达趋化因子受体CXCR4可以促进CAR-NK细胞归巢至骨髓等保护性生态位，充当“生存庇护所”。 相比之下，主动破坏抑制性通路可以为细胞配备“抗耗竭盔甲”。策略包括表达显性负性FAS受体（ΔFAS）以阻断凋亡，或使用CRISPR/Cas9敲除PD-1，使CAR-T细胞对肿瘤微环境中的抑制信号脱敏。对于CAR-NK细胞，在干细胞阶段敲除自身抗原CD7可以防止自相残杀，并保留功能性细胞池。 总之，当前的主动策略形成了一个多层次、协同作用的框架：递送技术创新解决目标识别问题，载体设计突破提高转导效率，而内在细胞工程化增强了细胞的适应性和功能。这些互补的方法共同加速了体内CAR细胞疗法向以强健持久疗效为特征的下一代临床现实发展。 早期临床试验数据与挑战 随着临床前证据的积累，多种体内CAR疗法已进入早期临床验证阶段，揭示了它们在人体中的安全性、可行性和独特挑战。目前多个CAR-T产品已获批用于血液恶性肿瘤，但其在实体瘤中的体内应用仍处于早期探索阶段。CAR-NK和CAR-M疗法的临床试验才刚刚开始，使得相关数据尤为宝贵。尽管靶向细胞类型不同，体内CAR疗法的核心转化挑战在于将这些工程化免疫细胞有效且安全地递送给患者，使其在复杂的生理环境中发挥持久的抗肿瘤活性。 新一代CAR-T疗法正从体外制备向体内生成迈进。早期临床试验已初步验证了其可行性，同时也暴露了核心瓶颈（表3）。 在操作层面，多项研究通过简化流程实现了快速效应：NCT07075185和NCT06791681将慢病毒转导简化为“单次输注”程序，在外周血中检测到CAR-T细胞峰值的时间为6天内——比传统周期至少缩短7天。NCT06917742使用mRNA-LNP进行体内翻译，进一步缩短了达峰时间，并消除了病毒插入诱变的风险。部分方案还整合了药物响应元件（UB-VV400, UB-VV111），以实现可调控的体内扩增，在保持疗效的同时降低了≥3级CRS/ICANS的发生率。然而，挑战也同样凸显：mRNA-LNP在肝脏和脾脏的首过效应导致CAR-T峰值水平存在十倍的个体差异；多靶点组合（CD22-CD19和BCMA-CD19）虽可扩大抗原覆盖范围，但可能加速T细胞耗竭；在NCT06743503和NCT06528301中，外周血CAR-T在90天时的留存率低于1%。早期项目MY-M11和TAK-103的终止表明，单细胞或单靶点方法因持久性不足或微环境抑制而容易失败，表明未来需要整合CAR-M和溶瘤病毒等协同方式。总之，虽然新一代CAR-T在剂量探索和安全性监测方面已建立了初步范式，但细胞持久性、精准递送和联合策略优化仍是其广泛临床应用中必须克服的三大挑战。 随着CAR-NK疗法从“体外定制”向“体内制造”转变，一个关键挑战是如何通过体内递送，在人体内瞬时构建一支精准、安全且可重复获得的自然杀伤细胞大军。近期几项体外临床试验提供了重要见解（表4）。 NCT06539338首次将“体内工厂”概念引入CAR-NK领域：单次输注携带CD20-CAR的整合缺陷型慢病毒，在外周同时生成了CAR-T和CAR-NK细胞。28天内CAR20+ NK细胞的峰值水平与B细胞清除率呈线性相关，证实了“单药、双细胞”策略的可行性。NCT06010472[224]使用脐带血来源的CD19-CAR-NK治疗难治性系统性红斑狼疮（SLE）。36名患者均未出现≥3级CRS/ICANS，证明异基因NK细胞可在无需预处理淋巴细胞清除的情况下，在自身免疫性疾病中快速发挥作用。实体瘤试验NCT05410717采用四靶点CAR-NK进行“靶点匹配、即用型”治疗。CAR-NK细胞在外周血的半衰期约为10-14天，而瘤内CAR信号持续长达4周，提示重复给药可维持局部效应。NCT04623944进一步揭示了“细胞动力学-疗效”关系：NKX101在AML/MDS患者中28天内客观缓解率达42%，其外周衰减半衰期（7天）与首次复发时间相关，表明“扩增窗口期”可能是限制疗效的关键速率步骤。 未来的体内CAR-NK研究必须克服三个关键挑战：第一，载体趋向性问题，需要逻辑门控或局部递送技术以避免肝脾首过效应，从而减少转导效率的个体差异；第二，瞬时表达与重复给药之间的矛盾，需要设计可重复的给药方案，同时避免抗载体免疫反应；第三，功能适应性问题——如何通过自分泌开关或联合体内小分子递送，实现有效延长NK细胞存活而不引发全身性炎症的细胞因子信号传导，仍是剂量优化阶段的核心科学问题。 随着CAR-M疗法从体外制备向体内生成转变，治疗实体瘤的一个关键瓶颈是如何高效转导单核-巨噬细胞并维持其抗肿瘤功能。近期的体外临床试验提供了重要参考（表5）。 NCT04660929首次将体外构建的HER2-CAR-M推进到临床实践，验证了其“吞噬-免疫”双机制的安全性和可行性，ORR为24%，无≥3级CRS。NCT06224738进一步探索了局部腹腔灌注治疗腹膜转移，旨在肿瘤内建立M1主导的微环境。然而，体外制备面临周期长、冻融敏感性和依赖冷链等局限性。更关键的是，早期项目数据显示，CAR-M在输注后功能迅速下降，外周存活时间不足7天，难以建立持续的免疫监视。这些体外经验为体内发展明确了清晰的工程边界：CAR-M的有效剂量可以压缩到10⁴拷贝/μg DNA，局部给药比全身给药更能放大疗效；同时，共递送细胞因子信号可显著延长功能持久性。这表明，从“体外工厂”向“体内快照”的转变并非简单替代，而是需要将制造挑战转化为递送系统在靶向性、表达性和可控性层面的工程问题[232]。只有在CAR构建体、极化信号和安全开关之间实现精准、协同的递送，体内CAR-M才能真正确立其在实体瘤治疗中的潜力。 早期临床试验数据正逐步验证不同体内CAR策略的可行性和独特价值。CAR-T拥有最广泛的临床经验，但其在实体瘤中的成功仍需克服递送和微环境障碍。CAR-M的首批临床数据已验证了其安全性和免疫重塑机制。CAR-NK已展现出优异的短期安全性。未来的转化成功将依赖于基于这些早期见解，对递送平台、细胞工程策略和联合方案进行持续的迭代和优化。 结论与展望 随着体内CAR疗法从概念验证向临床转化迈进，肿瘤-宿主相互作用的时空异质性和宿主免疫基线差异已成为制约疗效和安全性的核心因素。为了克服这些障碍，治疗策略正朝着精准分层和智能化设计的方向演进。本节将系统阐述生物标志物指导的患者分层和人工智能（AI）赋能治疗设计如何推动体内CAR疗法进入一个真正个性化和可预测治疗的新时代。 生物标志物驱动的患者分层 肿瘤-宿主相互作用的时空异质性是限制体内CAR疗法疗效的核心瓶颈[239]。因此，建立一个经过前瞻性验证的、生物标志物驱动的分层系统，对于提高反应率和避免无效毒性至关重要。精确绘制肿瘤抗原图谱构成了患者分层的第一个层面。传统的免疫组织化学或流式细胞术仅能提供平均表达水平，而先进的空间分析技术——如多重免疫荧光（mxIF）、成像质谱流式（IMC）和空间转录组学——能够在单细胞分辨率下量化抗原密度、克隆异质性以及与免疫抑制细胞或癌症相关成纤维细胞的空间关系。空间蛋白质组学（IMC, CODEX）的应用为免疫治疗的患者分层提供了一个可扩展的框架。例如，Qiu等人通过对401个肝细胞癌样本进行高分辨率空间蛋白质图谱分析，定义了不同的细胞邻域，成功将患者分层为具有显著预后差异的微环境模式。这种方法有助于识别最可能从特定CAR疗法中获益的患者亚型。最近一项关于瘤周microRNA-CAR的研究进一步表明，抗原富集区与免疫细胞缺陷区的比值（A/I比）相比传统的H-评分，是预测客观缓解的更好指标。此外，对循环肿瘤DNA（ctDNA）进行深度测序可以动态追踪抗原丢失突变或剪接变体，提供提前6-8周的免疫逃逸预警，并为设计序贯策略（如双靶点CAR或表位漂移疫苗）提供信息。 在定义了靶抗原的时空分布之后，肿瘤免疫微环境（TME）的功能异质性成为决定治疗反应的下一个关键因素。经典的免疫-炎症/排斥/沙漠分类法不足以预测疗效。需要在单细胞分辨率下进行功能图谱分析。整合成像质谱流式和空间转录组学分析揭示，CD8+ T细胞密度应进一步细分为干细胞样TCF1+前体耗竭（Tpex）和终末耗竭（Tex）亚群。Tpex细胞的丰度与体内CAR-T细胞的峰值扩增呈强正相关（ρ=0.82，P<0.001）。对于CAR-M疗法，M2极化TAM中的CD163+/iNOS-比率以及CD47-SIRPa轴的活性是决定吞噬效率的关键决定因素。空间分析表明，当CD47平均荧光强度超过150 AU且胶原屏障厚度大于20 μm时，单药CAR-M的客观缓解率降至10%以下，这表明需要联合CD47阻断或显性负性TGF-βR2受体来重塑TME。对于CAR-NK细胞，抑制性分子（包括HLA-E, PD-L1和TIGIT配体）的表达谱应指导治疗决策。它们的表达水平可以指导是通过基因编辑敲除NKG2A受体（KLRC1），还是共表达免疫调节分子（如PD-L1）以增强通用型CAR-NK设计的持久性。靶向TIGIT等抑制性轴的阻断策略仍有待进一步探索。 除了肿瘤内在和微环境特征外，宿主全身性免疫基线也是限制体内CAR转导效率、扩增动力学和持久性的关键变量。结合外周免疫谱、代谢-炎症状态、共生微生物组和遗传背景的全面评估可以完善个体化分层。最近一项针对大B细胞淋巴瘤的研究发现，治疗前C反应蛋白（CRP）≥4 mg/dL和血清铁蛋白≥400 ng/mL是预测CAR-T治疗后严重毒性和无进展生存期差的独立风险因素，从而将易于获取的炎症标志物整合到风险分层中。预先存在的中和抗体（NAbs）对病毒载体也构成递送障碍。对于抗AAV2 NAb滴度高的患者，应考虑使用工程化衣壳（逃逸突变体）或非病毒mRNA-LNP平台以维持足够的转导效率。重要的是，宿主种系遗传变异深刻影响TME的细胞组成并调节治疗反应。Cai等人通过对23种癌症类型、超过7700个样本的分析，系统鉴定了近3500个调节TME中54种免疫细胞丰度的免疫调节数量性状位点（immunQTLs），为临床观察结果（如HLA-DRB104:01等位基因与抗鼠scFv抗体产生之间的关联）提供了遗传基础。 展望未来，整合多维数据（涵盖肿瘤多组学和宿主免疫参数）将能够构建基于机器学习的模型来预测治疗反应。这类模型将为临床医生提供一个定量的决策支持工具，用于决定是否为特定患者、何时以及如何使用特定的体内CAR载体。最终，一个稳健的预测框架必须同时包含肿瘤内在特征、局部TME状态和全身免疫基线，以实现对每位患者的精准、多尺度画像。 人工智能在治疗设计与优化中的作用 人工智能在体内CAR疗法中的智能化应用目前主要集中在构建从“靶点发现到预后监测”的闭环系统的初始阶段。其潜在价值开始在三个关键领域显现。 在靶点发现阶段，整合多组学数据与图神经网络已有初步迹象表明，TIM-3/GAL-9信号通路和cDC1缺陷可能与CAR-T耗竭相关。基于这些见解设计的NOT门控CAR在体外显示出增加的杀伤活性。类似地，通过涉及超过5万个样本的大规模血浆蛋白质组模型，已识别出CDH17和FAP等候选新抗原，为扩展实体瘤CAR的靶点库提供了经过验证的候选靶点[282-284]。 在预后监测方面，初步研究表明，结合组织病理学图像、ctDNA动态和细胞因子谱的多模态深度学习模型（C-指数≈0.70）可以提前数周预测≥3级CRS的风险。这种预测能力可能支持对雷帕霉素调控的ON-switch CAR疗法进行剂量调整。 此外，像“nextNEOpi”这样的自动化流程使用机器学习来持续对经典和非经典新抗原进行排序。当与上述预后评分系统连接时，这些工具可以启用一个“靶点更新、早期风险预警和剂量修正”的迭代框架[286]。尽管这些方法仍需在前瞻性研究中进行验证，但它们勾勒出了一条通向可扩展的、智能化驱动的体内CAR疗法的可测试技术路径。 未来方向与跨学科整合 在细胞免疫治疗领域，体内CAR疗法正在经历一场深刻的范式转变——从“体外制造和回输”转向“体内原位编程”。其目标是将复杂的生产过程简化为精准的体内递送，从而显著提高治疗的可及性。在递送平台、效应细胞谱系扩展和早期临床验证方面取得的进展，为其更广泛的应用奠定了初步基础。然而转化的道路上仍然面临几个核心瓶颈：递送精度不足导致肝/脾截留和脱靶风险；持久性有限、扩增窗口期窄且易耗竭限制了工程化细胞的功能寿命；以及实体瘤致密的物理结构和免疫抑制微环境仍然是普遍存在的障碍。 展望未来，克服这些挑战将依赖于两个并行方向的协同演进：整合与智能化。首先，下一代智能递送系统必须整合逻辑门控靶向、微环境响应性激活、长效表达元件（环状RNA）和可逆安全开关，以实现更精准、持久和可控的体内编程。其次，治疗方案将越来越多地采用多细胞协同和基于组合的免疫重塑——构建多兵种“合成免疫系统”，将CAR-M的微环境重塑能力、CAR-T的精准杀伤和记忆功能以及CAR-NK的快速响应和非MHC限制性识别相结合，以分层、协同的方式攻克实体瘤屏障。最后，建立一个数据驱动的智能迭代闭环，利用AI整合空间多组学、液体活检和临床参数，构建“患者分层-靶点选择-剂量优化-预后监测”的端到端优化系统，将是推动体内CAR疗法从个性化艺术走向可推广的科学工程的必然选择。