A Phase II, Single-center STudy on the vAlue of Non-invasive Dual-Pet（18F-FES PET and 68Ga-HER2-Affibody PET）InformatiOn IN Subtype of Metastatic Breast Cancer(MBC)

Study on the Value of Non-invasive Dual-Pet(18F-FES PET and 68Ga-HER2-Affibody PET) Information in Subtype of Metastatic Breast Cancer

开始日期2020-12-31

申办/合作机构

复旦大学

EUCTR2017-002115-34-SE / Unknown status临床2/3期IIT

A multicenter phase II/III-study of 68Ga-ABY-025 PET for non-invasive quantification of HER2-expression in advanced breast cancer - Affibody-3

开始日期2018-06-14

申办/合作机构-

NCT01858116 / Completed临床1/2期

An Exploratory Study to Evaluate [68Ga]ABY-025 for PET Imaging of HER2 Expression in Subjects With Metastatic Breast Cancer

The study will evaluate [68Ga]ABY-025 for PET imaging of HER2 expression in subjects with HER2-positive or HER2-negative breast cancer.

开始日期2013-04-01

申办/合作机构

Affibody AB

[+1]

100 项与 Tezatabep Matraxetan 相关的临床结果

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147

项与 Tezatabep Matraxetan 相关的文献（医药）

2024-11-01·International Journal of Biological Macromolecules

A novel format of TNF-α binding affibody molecule ameliorate coronary artery endothelial injury in a mouse model of Kawasaki disease

Article

作者: Shuai, Dujuan ; Jia, Chang ; Yu, Huan ; Rong, Xing ; Zhu, Jinshun ; Ni, Chao ; Zhang, Lifang ; Chu, Maoping ; Xie, Longzhi ; Chen, Yufei ; Huang, Zhixian

Kawasaki disease (KD) is a disease characterized by systemic immune vasculitis that often involves coronary arteries and can result in long-term cardiovascular sequelae. Different strategies for treatment of KD-and KD-induced coronary artery lesions are currently under investigation, including passive immunization with anti-TNFα monoclonal antibodies (mAbs). Herein, we examine the potential therapeutic capabilities of a novel type of TNFα-targeting agent based on an affibody molecule possessing fundamentally different properties than mAbs. Using phage display technology, we successfully screened and obtained three TNF-α binding affibody molecules and confirmed their high binding affinity and specificity for recombinant and native TNF-α by surface plasmon resonance (SPR), confocal double immunofluorescence and coimmunoprecipitation assays. Moreover, by binding to TNF-α, the affibody molecules could effectively neutralize TNFα-induced L929 cytotoxicity. To increase the targeting properties and serum half-life, one preferred affibody molecule Z_TNF-α263 was redesigned to assemble drugs with bivalent TNFα binding with added specificity for serum albumin (Z_TNF-α263-ABD₀₃₅-Z_TNF-α263, hereinafter denoted ZTAT). We further determined its binding ability, TNF-α signal blocking and neutralizing capacity, serum half-life and immunogenicity. Most importantly, our study provides strong evidence that the engineered ZTAT protein was therapeutically effective against KD induced-endothelial injury, as judged by both in vitro and in vivo assessments. These data suggested that because of the flexibility inherent, low-molecular weight anti-TNFα affibody construct ZTAT, can be developed into a potent therapeutic agent that can be produced and purified cost-effectively.

2024-10-11·ACS Pharmacology & Translational Science

Affibody-Drug Conjugates Targeting the Human Epidermal Growth Factor Receptor-3 Demonstrate Therapeutic Efficacy in Mice Bearing Low Expressing Xenografts

Article

作者: Löfblom, John ; Yin, Wen ; Björklund, Elvira ; Rinne, Sara S. ; Zhang, Jie ; Leitao, Charles Dahlsson ; Gräslund, Torbjörn ; Ståhl, Stefan ; Abouzayed, Ayman ; Vorobyeva, Anzhelika ; Orlova, Anna

The outcome of clinical trials evaluating drugs targeting the human epidermal growth factor receptor 3 (HER3) has been poor, with primary concerns related to lack of efficacy. HER3 is considered a difficult target since its overexpression on tumors is relatively low and there is normal expression in many different organs. However, a significant number of patients across different cancer indications have overexpression of HER3 and the development of novel modalities targeting HER3 is therefore warranted. Here, we have investigated the properties of affibody-based drug conjugates targeting HER3. The HER3-targeting affibody molecule Z_HER3 was fused in a mono- and bivalent format to an engineered albumin-binding domain (ABD) for in vivo half-life extension and was coupled to the cytotoxic drug DM1 via a non-cleavable maleimidocaproyl (mc) linker. In vivo, a moderate uptake was observed for [^99mTc]Tc-labeled Z_HER3-ABD-Z_HER3-mcDM1 in HER3 expressing BxPC3 tumors (3.5 ± 0.3%IA/g) at 24 h after injection, and clearance was predominately renal-mediated. Treatment of mice with BxPC3 human pancreatic cancer xenografts showed that a combination of Z_HER3-ABD-Z_HER3-mcDM1 and its cytostatic analog Z_HER3-ABD-Z_HER3 was efficacious and superior to treatment with only Z_HER3-ABD-Z_HER3, providing tumor growth inhibition and longer median survival (90 d) in comparison to monotherapy (68 d) and vehicle control (49 d). Z_HER3-ABD-Z_HER3-mcDM1 was found to be a potent drug conjugate for the treatment of HER3-expressing tumors in mice.

2024-08-28·Journal of the American Chemical Society

Integrating Dynamic Network Analysis with AI for Enhanced Epitope Prediction in PD-L1:Affibody Interactions

Article

作者: Nash, Michael A. ; Vanella, Rosario ; Yang, Byeongseon ; Bernardi, Rafael C. ; Gomes, Diego E. B.

Understanding binding epitopes involved in protein-protein interactions and accurately determining their structure are long-standing goals with broad applicability in industry and biomedicine. Although various experimental methods for binding epitope determination exist, these approaches are typically low throughput and cost-intensive. Computational methods have potential to accelerate epitope predictions; however, recently developed artificial intelligence (AI)-based methods frequently fail to predict epitopes of synthetic binding domains with few natural homologues. Here we have developed an integrated method employing generalized-correlation-based dynamic network analysis on multiple molecular dynamics (MD) trajectories, initiated from AlphaFold2Multimer structures, to unravel the structure and binding epitope of the therapeutic PD-L1:Affibody complex. Both AlphaFold2 and conventional molecular dynamics trajectory analysis were ineffective in distinguishing between two proposed binding models, parallel and perpendicular. However, our integrated approach, utilizing dynamic network analysis, demonstrated that the perpendicular mode was significantly more stable. These predictions were validated using a suite of experimental epitope mapping protocols, including cross-linking mass spectrometry and next-generation sequencing-based deep mutational scanning. Conversely, AlphaFold3 failed to predict a structure bound in the perpendicular pose, highlighting the necessity for exploratory research in the search for binding epitopes and challenging the notion that AI-generated protein structures can be accepted without scrutiny. Our research underscores the potential of employing dynamic network analysis to enhance AI-based structure predictions for more accurate identification of protein-protein interaction interfaces.

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2024-05-13

·生物制品圈

吸入性生物制剂在哮喘疾病中的开发进展及前景

摘要：全球超过3亿人饱受哮喘困扰，且发病率逐年增加，作为最常见的慢性疾病之一，哮喘激发机制复杂，异质性强，是一类免疫介导的炎症疾病。随着基于生理、病理等机制深入研究，陆续推出的治疗性小分子和激素药物已实现对大多数患者的控制和治疗，但仍有5%~10%的患者为难控制、难治疗性哮喘，即重度哮喘。近十年来，得益于生物医药的迅猛发展，蛋白、抗体类药物凭借高有效性、高特异性、高安全性成为关键的重度哮喘治疗药物，然而由于生物制剂通常经注射给药，不可无创、快速地递送药物直接入肺迅速吸收起效，故而临床中亟需起效快、便捷、经济、安全的吸入式生物制剂。本综述通过对哮喘发病机制的阐释，概括现行的小分子、激素类和生物类治疗药物，并总结吸入式哮喘生物制剂的研发历程，对其未来前景进行分析，旨在加深对大分子吸入药物研究方向的认知，更新该领域前沿动态，以期为更多吸入式生物制剂的开发提供参考。关键词：哮喘；给药途径；吸入给药；生物制剂_正文_支气管哮喘简称哮喘，以呼吸急促、咳嗽和胸闷等多种症状为特征，与慢性气道炎症，广泛、可逆性呼气性气流阻塞和气道高反应性等症状有关[1]。全球超过3亿人饱受哮喘困扰，且发病率逐年增加。根据全球哮喘指南全球哮喘防治创议（global initiative for asthma，GINA）建议，需对患者采用阶梯式治疗方案，尤其推荐个性化治疗方案。随着生物制剂的发展，抗体类生物制剂已成功应用至哮喘治疗，为中重度哮喘患者带来了更有效、更安全的药物选择，但其注射的给药方式，缓慢的起效速度，频繁的入院用药、高昂的用药成本在很大程度上限制了药物的推广，故而吸入式抗体药物的临床呼声日益高涨。本综述对哮喘机制、现有治疗药物及吸入抗体药物的开发历程进行了调查研究，以期加深对哮喘发病机制及治疗药物的全面认识，同时对吸入式抗体药物的开发必要性、开发难度、研发现状进行汇总更新。1哮喘发病机制哮喘传统上被分为两类，外源性哮喘和内源性哮喘，外源性哮喘又被称为过敏性哮喘，由过敏原引起，主要归因于异常的辅助性T细胞（helper T lymphocyte，Th）2型炎症。内源性哮喘是由多种因素引发的，如阿司匹林、肺部感染、运动、寒冷、压力、肥胖等[2]。根据Th2炎症的状态，哮喘疾病又被分为高Th2和低Th2哮喘[3]。高Th2哮喘的特征是嗜酸性气道炎症，这与血液中嗜酸性粒细胞数目的增加或呼出一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）分数升高有关，而低Th2哮喘包括中性粒细胞哮喘和寡粒细胞性哮喘。哮喘的病理机制是复杂的，新研究表明，哮喘的发病机制也可不依赖于非免疫应答/炎症发生，但相关研究有限[4]。2哮喘标志物由于丰富的异质性外源、内源表型特征，哮喘非常适合精准治疗方案，因而非侵入性生物标志物的鉴别将有助于其诊断和治疗。Th2和2型固有淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILC2）通路的激活是2型炎症哮喘发生的核心，Th2型细胞因子主要有一系列白介素（interleukin，IL），如IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-31，而ILC2s产生的2型细胞因子主要有IL-5、IL-9和IL-13，上述因子均为哮喘有效标志物。嗜酸性粒（eosinophil，EOS）细胞、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E、表达ILC2s的循环趋化因子受体（cyclic chemokine receptor，CCR）10、血浆CCL（CC chemokine ligand）27水平和Fe-NO是哮喘诊断和预后的常见生物标志物。此外，如图1所示，IgE、IgG亚族，血清IgE抑制活性，嗜碱性粒细胞活化，趋化因子和细胞因子，调节性T（regulatory T，Treg）细胞，调节性B（regulatory B，Breg）细胞和树突状细胞等标记物已被推荐作为跟踪过敏原耐受诱导治疗的生物标记物[5]。3哮喘现有小分子、激素治疗药物GINA指南推荐使用药物种类包括糖皮质激素、β2-受体激动剂、胆碱能受体阻断药物、茶碱类药物、白三烯受体拮抗剂和生物靶向制剂[6]。除上述药物外，基于创新机制的新型小分子药物研发处于临床研究不同阶段，如正大天晴的前列腺素D2受体拮抗剂（又称为CRTH2拮抗剂）TQC3564正在中国临床I期研究阶段；针对磷酸二酯酶4（PDE4）抑制剂的NCT04108377正处于临床I期患者招募阶段。此外，基于蛋白激酶抑制剂（NCT00676572）、选择性糖皮质激素受体调节剂（AZD7594）、他汀类药物（NCT02433535）均以控制哮喘为目标并处于临床开发中[7]。新型小分子哮喘治疗药物的有效开发离不开对哮喘机制以及哮喘的不同表型和内型的理解，但从临床效果上看，针对中重度哮喘，生物制剂展现出更加明确的应用前景，因此在另一方向上，生物靶向药物的发展也在高歌猛进，力求在新维度上实现哮喘疾病的控制及治疗。4哮喘现有靶向治疗药物随着病情严重，在以糖皮质激素为基础治疗后仍会出现控制不佳、反复重症发作等情况，此时患者即可被认定是重度患者，高达10%的成人和2.5%的儿童哮喘群体患有重度哮喘，因固定气流受限、病情恶化、常年就医、住院和死亡风险的增加等因素致使生活质量严重下降。因此，在整个哮喘患者谱系中，重症哮喘患者是临床中最迫切的未满足医疗需求群体，目前推荐的有效控制方案是生物制剂添加疗法。目前共6款针对Th2通路的哮喘治疗性单克隆抗体获批，包括靶向IgE的奥马珠单抗（omali-zumab）、靶向IL-5的瑞替珠单抗（reslizumab）、IL-5受体药物贝那利珠单抗（benralizumab）、针对IL-4Rα的度普利尤单抗（dupilumab）以及靶向TSLP的特泽鲁单抗（tezepelumab）。目前针对低Th2型、中性粒细胞为主的重度哮喘发病机制相关分子靶点的试验性药物非常稀缺，因此，针对不同表型基础生物学机制的深入研究将对临床有关重度哮喘治疗方案的开发起到关键性驱动作用[8]。抗体类生物制剂的获批为重度哮喘病人带来了更新、更安全、更有效的治疗方式，表1对Th2通路相关靶点哮喘治疗药物关键信息进行统计，以期对哮喘生物制品有更为系统的理解。上述靶向药物已在临床试验及疾病用药过程中验证了有效性和安全性，多种潜在疾病治疗靶点药物研发正在进展中，包括细胞因子、膜分子和细胞内信号通路，如IL-37、IL-11，基质相互作用分子1（STIM1），CD200R、OX40L和CD30L、HMGB等[9]。5吸入式大分子哮喘治疗药物发展现状5.1 药物通过吸入途径递送的优势吸入给药（肺给药）可快速、无创地输送至呼吸道并传导至肺部，肺内巨大的表面积和广泛的血管分布能使药物快速吸收并发挥治疗效果，其剂量对身体其他部位的暴露量较低，可最大限度地减少全身性不良反应。吸入给药是一种无创的局部和全身给药方式，在治疗多种疾病方面具有巨大的潜力，已应用于包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、呼吸道病毒感染和糖尿病、囊性纤维化等多种疾病领域[10]。吸入给药作为治疗呼吸系统疾病优选的给药方案，可满足如下几项对给药方式的特殊需求[11]：（1）药物通过系统性给药在肺内很难达到有效富集的药物浓度，生物利用度低，而吸入给药具有肺内高浓度的优势。（2）当以达到肺部有效治疗浓度为目标给药时，药物剂量通常较大并呈现全身性毒性，吸入给药用药量低，规避胃肠降解作用和肝脏首过效应，安全性更好。（3）需要快速起效的肺部疾病治疗药物，吸入给药可快速实现肺部药物沉降，并由于肺部表面积大、血管化丰富、组织通透性好，药物可以快速吸收并起效。（4）在确保肺部疾病治疗药物药效的同时，若对用药成本关注，亦通过吸入给药的方式改进。5.2 吸入制剂的临床应用吸入型产品可分为雾化溶液吸入、干粉吸入和软雾吸入三大种类，吸入制剂被广泛应用于多种呼吸系统疾病领域[11]：如（1）糖皮质激素、β2受体激动剂、毒蕈碱乙酰胆碱受体拮抗剂等激素和小分子类吸入制剂（组合）用于哮喘和慢性阻塞性肺疾病治疗。（2）妥布霉素、氨曲南赖氨酸盐、左氧氟沙星、阿米卡星、多粘菌素、神经氨酸酶抑制剂、利巴韦林、喷他脒等吸入制剂在抗感染领域的应用。（3）吸入重组人脱氧核糖核酸酶在囊性纤维化适应症的治疗应用。（4）吸入甘露醇在气道黏液清除、囊性纤维化及支气管扩张中的应用。（5）吸入前列腺环素发挥血管扩张机制用于肺动脉高压的治疗。（6）吸入肺表面活性剂用于呼吸窘迫综合征的治疗。（7）吸入核酸药物如重组新型冠状疫苗在抗病毒感染领域的开发应用。吸入制剂主要应用在呼吸系统疾病领域，但从口鼻吸入通过呼吸道将药物递送至肺部并交换进入体循环，也为系统性疾病的治疗提供了创新性的方案[11]。在中枢神经系统领域，尼古丁吸入剂（器）已在尼古丁替代疗法中得到成功应用以减轻或摆脱尼古丁依赖。全球首款左旋多巴吸入粉雾剂INBRIJA®已在美国和欧盟获批上市用于帕金森的吸入治疗。糖尿病领域，辉瑞与Mannkind曾先后获批两种吸入胰岛素药物Exu-bera®与Afrezza®，为糖尿病治疗提供了新的治疗选择。5.3 吸入大分子药物在哮喘治疗领域的开发现状抗体具有高特异性、高亲和力和高安全性等优势，已被广泛用于治疗肺部疾病，如肺癌和严重哮喘。目前共有6款针对重度哮喘的单克隆抗体上市，并取得了优异的临床治疗效果。然而，已上市产品均以皮下注射或静脉输注方式递送，其局限性包括侵入性、系统毒性（如细胞因子风暴），需专业医师操作等因素使得大量患者难以院外治疗。因此，吸入给药凭借直接呼吸道给药，无创、局部效应增强、全身暴露最小和易于自我给药等优点，已在多个吸入性单克隆抗体及其衍生物在临床试验中得到治疗潜力的评估[12]，表2汇总了吸入式生物制剂在哮喘领域的简要总结。5.3.1 吸入单克隆抗体/片段诺和诺德及诺华曾在轻度过敏性哮喘患者中开展了奥马珠单抗自我雾化给药疗效研究，虽然33名受试者在分别连续雾化用药2周和8周后血清中均检测到奥马珠单抗，但血清IgE水平无明显变化，变应原诱导的气道反应不受抑制，推测无效的原因是肺组织中覆盖IgE效应细胞的奥马珠单抗浓度不足，无法中和肺部产生的IgE。此外，一名受试者产生了抗奥马珠单抗抗体，这也令人担心吸入单抗可能比注射给药免疫原性更强[13]。2014年，来自比利时的研究团队发表了关于雾化吸入抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）在哮喘小鼠模型（NMRI）中的研究结果[14]，该研究通过聚乙二醇化延长了IL-17A Fab2和IL-13Fab双抗在呼吸道局部停留时间，肺内聚乙二醇化抗体含量在给药后4h达到平台期，而未成功偶联聚乙二醇的抗体则入肺后就开始清除，研究阐释了聚乙二醇化修饰对治疗性蛋白局部递送到肺部后的长效具有显著效果。此后，该团队又相继针对不同分子量聚乙二醇分别对IL-17A Fab和IL-13Fab长效后肺部沉积进行了探索，上述研究主要聚焦肺部药物长效化机制研究，并未对抗体靶点组合的药效及成效性进行深入探索，但初步论证了吸入抗体给药途径的可行性。比利时布鲁塞尔的优时比制药（UCB Pharma）在食蟹猴过敏性哮喘模型中布局了针对雾化吸入IL-13靶点Fab抗体CDP7766的研究，该研究发现通过振动网筛雾化器产生的气溶胶仍保持优异的分子活性及纯度，没有明显的降解和聚体产生，并且在动物模型中表现出良好的耐受性，未观察到局部刺激相关的不良反应，并显著抑制了肺泡灌洗液中过敏原诱导的细胞因子和趋化因子的上调，临床上可快速持久地抑制FeNO，健康和哮喘受试者均表现出良好的耐受性（NCT02473939），证明了吸入性抗IL-13抗体片段药物治疗过敏性哮喘的潜力[15]。Faghihi等通过喷雾干燥将肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）单克隆抗体Infliximab开发成干燥粉剂，用于局部炎症性哮喘治疗，探讨通过吸入给药途径抑制肺部分泌TNFα的可行性，但其粉剂分子与TNFα结合降低了21%，在卵清蛋白刺激小鼠哮喘模型中表现出的TNFα分子抑制活性相对于单抗降低了2个数量级，虽然抗体干粉开发成功与否主要取决于喷雾干燥条件、配方成分及抗体雾化稳定性，但该研究初步提示了单克隆抗体并不合适用于吸入制剂开发[16]。CSJ117是诺华布局的一款针对TSLP靶点的Fab拮抗剂（Ecleralimab），CSJ117采用粉雾剂药物开发方式用以治疗成人轻度特应性哮喘，在其I期临床研究（NCT03138811）中，CSJ117耐受性良好，并减轻过敏原激发后的支气管收缩[17]。2020年诺华启动了一项II期试验，目的是研究CSJ117治疗未得到控制的重度哮喘的药效和安全性研究（NCT04410523），II期临床研究已完成，但暂未数据揭盲，并且由于诺华产业战略调整，该项目暂停了后续开发，正在积极寻求合作转让。安进及阿斯利康在携手成功推出TSLP单克隆抗体Tez-epelumab商业化上市后，快速对上市药物分子进行工程化改造将单克隆抗体皮下注射液开发成为Fab干粉吸入剂型，项目代码为AMG104/AZD8630，该项目已于2022年启动临床I期研究，以评估安全性、耐受性和药代动力学（NCT05110976）。5.3.2 吸入纳米抗体除了单克隆抗体及抗体片段外，诸如Nanobodies®、Anticalin®、Affibody®等新型蛋白骨架类型在基于蛋白质的吸入治疗领域引起了轰动。与全长单克隆抗体相比，新型蛋白骨架体积较小、结构简单，更容易结合隐蔽结合位点、组织渗透面积更大、药物聚集更方便、热稳定性更强[18]。纳米抗体是由驼科动物体内重链抗体（95kDa）可变区扩增而来的单域抗体，又称为VHH抗体（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），从属于基因工程抗体范畴。纳米抗体晶体尺寸直径2.5nm，长4nm，是目前可与抗原结合的最小片段。2018年，首创的Nano-body®caplacizumab（Cablivi®）获得欧洲药品管理局的首个上市许可，用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜，虽然caplacizumab是肠外用药，但吸入型Nanobody®平台及产品一直在临床开发中。吸入型抗合胞病毒纳米抗体药物ALX-0171的安全性和耐受性已在一项首次婴儿I/IIa期临床试验中得到证实，并观察到抗病毒活性[19]。尽管IIb期剂量范围研究已经完成（NCT02979431），但在下呼吸道感染和炎症发生的基础上，继续雾化ALX-0171并不能改善临床治疗结果，所以该项目未达预期而被搁置研究，但该研究表明ALX-0171在早期的使用干预可产生重要的临床抗病毒作用。随着新冠疫情爆发，许多纳米抗体也被开发成吸入制剂以对抗SARS-CoV-2感染，如洛启生物的Nb11-59表现出强效的体外真病毒中和活性[20]。在哮喘类领域，目前有两款来自洛启生物的纳米抗体吸入产品处于中国临床I期开发阶段，洛启生物靶向IL-4Rα的LQ036产品适应症为嗜酸性粒细胞哮喘，LQ043H靶向TSLP，其适应症为非嗜酸性粒细胞哮喘。LQ036与LQ043H是目前全球推进速度最快的同靶点吸入纳米抗体产品。LQ036及LQ043H均具有优异的体外阻断活性，并按照吸入制剂开发标准进行了完整的空气动力学研究，具有雾化后粒径均匀、生物活性完整保留、药物纯度稳定等优势，同时两款产品均采用毕赤酵母生产系统表达，产量高，工艺简单，药物成本优势明显。LQ036已完成针对安全性、耐受性、免疫原性和药代动力学的澳洲临床I期研究（NCT04993443），安全性、耐受性优异，无药物相关免疫原性发生；目前该项目正处于中国临床I期开发阶段，评价雾化经口吸入LQ036在中国健康受试者体内的耐受性、安全性、免疫原性和药代动力学（CTR20223011）。洛启LQ043H项目同期处于中国临床I期研究阶段，评价LQ043H单域抗体雾化液在中国健康受试者中单次给药后的耐受性、安全性、药代动力学和免疫原性（CTR20230092）。此外，LQ036的慢性阻塞性肺疾病适应症IND申请获得国家药监局药品审评中心（CDE）受理（受理号：CXSL2300435）。LQ036和LQ043H的顺利推进将为纳米抗体在吸入给药方向上的临床应用提供有力支持，并创新性地为哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者提供更有效、更安全、更便捷、更经济的治疗方案。5.3.3 吸入类抗体骨架蛋白Anticalin®是Astra Zeneca与Pieris公司蛋白研发平台推出的一类基于丰富血浆及体液来源脂质运载蛋白骨架修饰开发而成的工程化蛋白，通过对脂质运载蛋白1进行定向蛋白质突变，经过系统性修饰推出了Elarekibep项目（PRS-060），Elarekibep是一款靶向IL-4Rα的高亲和力、缓慢解离、长效拮抗剂，用于治疗中度至重度哮喘。Elarekibep的小尺寸和稳定性使其可以被直接吸入肺部，其临床I期以雾化液方式开展，试验显示轻度哮喘患者的FeNO水平显著降低（NCT03384290，NCT03574805）。在其干粉吸入制剂临床II期向3mg及1mg更低剂量组进行药效探索时，其非人类灵长类动物长期毒性研究出现了非药物剂量依赖的炎症介导的肺组织损伤，随即其合作方阿斯利康终止了该项目后续临床开发（NCT04643158）。该项目的失败原因更多指向于Anticalin®平台分子自身结构毒性问题，这一结论为类抗体支架蛋白Anticalin®的未来研发应用蒙上了阴影[21]。Affibody®是Affibody公司推出的一类新型抗体模拟物，该类药物是由58个氨基酸残基组成的新型亲和配体，相对分子质量约为6500，由3个螺旋结构组成，功能与抗体相似，但具备相对分子质量小、折叠速度快、选择性和亲和力高、结构稳定等优势。Affibody最近宣布接受Chiesi投资，使用Affibody专有技术布局开发呼吸系统疾病吸入性创新疗法，根据公司最新官网更新，ABY-062作为一种靶向TSLP的候选药物，很有可能是按照吸入式治疗药物方向开发，这也意味着吸入大分子药物开发行列迎来了新抗体骨架Affibody®的加入，我们期待其在吸入性创新疗法上的表现。5.3.4 吸入重组蛋白除吸入抗体类药物之外，重组蛋白也曾尝试开发成吸入制剂。拜耳医药曾尝试过IL-4蛋白突变体雾化吸入开发方向，Pitrakinra（AER-001，BAY-16-9996）是IL-4蛋白的变体，具有2个氨基酸变化，使其能够结合IL-4Rα链并抑制IL-4Rα与γC或IL-13Rα1的相互作用。在Pitrakinra的一项II期临床研究中，吸入Pitrakinra可减弱过敏原激发后哮喘受试者的晚期哮喘反应和气道炎症，但对哮喘患者应对过敏原挑战的肺功能没有显著影响[22]。虽然在一项药物遗传学研究中，在携带IL-4Rα基因特异性单核苷酸多态性的患者中，Pitrakinra显著降低哮喘急性发作的频率，但最终其临床III期不明原因并未继续推进。Altrakincept是一款通过雾化给药开发的竞争性重组人可溶性IL-4Rα蛋白，已在临床试验中进行了测试，并证明可预防中重度哮喘患者因停用皮质类固醇而导致的肺功能恶化，但进一步的长期研究结果令人失望，该项目也未再进一步推进[23]。6小结在过去的15年里，生物制剂的开发和临床应用显著扩大，但这些药物的给药途径仍主要以局部或系统性注射为主，吸入抗体是一种明显的无创替代方案，为多种疾病的局部治疗提供了机会，尤其对于呼吸系统疾病治疗，同时也尝试应用于系统性疾病的治疗。但由于抗体三维结构复杂，三级结构是其作用的核心，在吸入给药过程中遭受各种应力下容易产生降解和聚体，这种结构的破坏严重影响产品有效性和安全性等性能的评估，所以维持其结构完整性和生物活性对于成功开发吸入性生物制剂至关重要，这无疑对分子特性、配方设计、辅料选择、加工工艺和吸入装置等方面提出了系统性挑战。后续基础研究对上皮细胞转运机制的理解，辅助抗体稳定性、吸收和雾化性能的相容性赋形剂的开发，适配性更高、便携性更好、操作更便捷吸入装置的开发等都会对吸入抗体药物的开发提供更坚实的开发基础。并且随着纳米抗体、抗体片段、抗体骨架等新形式生物制剂的诞生为更多创新药物的开发提供了保障，未来我们期待更多吸入相关创新技术的诞生。总而言之，吸入型生物制剂的开发是一个系统过程，需要全面、充分考虑发病机理、患者群体、药物分子类型选择及其与肺内生物屏障的相互作用等因素，并合理地选择制剂、赋形剂和装置，同时也涉及上述学科和领域的共同发展。我们希望未来会有治疗效果更佳、安全数据更好、自行用药更便捷、药物价格更低廉的吸入生物制剂产品的诞生以满足日渐复杂、日益壮大的临床未满足需求。参考文献详见《中国临床药理学与治疗学》 2024 Apr; 29(4)识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2024-04-02

·今日头条

保肠护关节：高分研究揭示抵御关节炎的肠道因子

04月02日的《热心肠日报》，我们解读了 15 篇文献，关注：关节炎，FMT，IBD，流行病学，乳糜泻，致病菌，肠道免疫细胞，昆虫，LISCure，Affibody，瀚科迈博，加科思，飞鹤。该篇日报由R·AI辅助创作生成，人工审核校对。肠上皮细胞坏死是肠道和关节炎发展之间的关键联系 Annals of the Rheumatic Diseases——[27.4] ① 这项研究确定了肠上皮细胞（IEC）坏死是肠道和关节炎发展之间的关键联系；② 关节炎发作时，IEC经历凋亡和坏死，导致肠道屏障功能受损；③ 在关节炎发作期间，HIF1α被确定为IEC中上调基因之一，在IEC中删除Hif1a增强了IEC坏死，引发肠道炎症并加重了关节炎；④ HIF1α是坏死诱导因子RIPK3的关键转录抑制因子，且在新发病风湿性关节炎患者的肠上皮中也发现了增强的RIPK3表达，表明肠上皮细胞发生坏死；⑤ 通过治疗性稳定HIF1α以及基于小分子的RIPK3抑制剂，在体外和体内拯救了肠道坏死，并抑制了关节炎的发展。【原文信息】 Expression of HIF1α in intestinal epithelium restricts arthritis inflammation by inhibiting RIPK3-induced cell death machinery 2024-03-19 , doi: 10.1136/ard-2023-224491 Nature子刊：粪菌移植治疗溃疡性结肠炎的临床反应与GBP5有关 Nature Communications——[16.6] ① 分析粪菌移植（FMT）在溃疡性结肠炎（UC）患者身上的分子反应，探索FMT如何影响人类结肠黏膜的基因表达；② 相较于安慰剂干预，FMT改变了患者结肠黏膜转录组（受影响的基因数量：3 vs 75），包括对结构、代谢和炎症通路的调节；③ 在疾病缓解的患者中，调节的途径包括紧密连接、钙信号和异物代谢；④ GBP5和IRF4的下调与疾病缓解相关，而GBP5基因缺失的雌性小鼠比野生型同胞更能抵抗结肠炎，表现出更高的结肠IRF4磷酸化水平；⑤ 本研究表明GBP5可能在结肠炎的发展中起到负面作用，而FMT后的结肠粘膜反应能够区分UC患者是否实现缓解。【原文信息】 Profiling the colonic mucosal response to fecal microbiota transplantation identifies a role for GBP5 in colitis in humans and mice 2024-03-26 , doi: 10.1038/s41467-024-46983-5 过去20年IBD的演变与变化 EClinicalMedicine——[15.1] ① 这项跨国多中心研究揭示了过去二十年间炎症性肠病（IBD）表现模式的变化，为改善患者的诊断、管理和预后提供了重要见解；② 共纳入6个国家1430名IBD患者（84.5%溃疡性结肠炎和14.3%克罗恩病），根据首次诊断时间分为3组：超过15年（A组）、5-15年（B组）和近5年（C组）；③ 与C组相比，A组和B组的肠外症状更为普遍、食物敏感率更高；④ 在C组中，左侧结肠炎成为溃疡性结肠炎最常见的亚型，且腹痛和腹胀的发生率增加，而腹泻的频率有所下降；⑤ 在C组中，克罗恩病患者上消化道症状更为普遍，无病发作的患者相对比例增加，表明IBD的管理和治疗可能有所改善。【原文信息】 Inflammatory bowel disease evolution in the past two decades: a chronological multinational study 2024-03-15 , doi: 10.1016/j.eclinm.2024.102542 华北理工：IBD不会独立增加癌症风险 BMC Medicine——[9.3] ① 华北理工大学王友信团队探究了炎症性肠病（IBD）与癌症风险之间的关联，未发现两者之间因果关系的可靠遗传学证据，暴露于IBD可能并不独立地增加癌症风险；② 在东亚或欧洲人群中，IBD、克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC）与癌症之间没有显著的遗传相关性；③ 东亚人群中未观察到IBD与癌症之间的显著因果关系，欧洲人群中CD与卵巢癌之间以及UC与非黑色素瘤皮肤癌之间存在显著关联；④ 多变量孟德尔随机化分析未发现以上任何显著关联；⑤ 使用共定位分析，在东亚或欧洲人群中，没有共享的因果变异体可以证明IBD、CD或UC与癌症之间的关联。【原文信息】 Association between inflammatory bowel disease and cancer risk: evidence triangulation from genetic correlation, Mendelian randomization, and colocalization analyses across East Asian and European populations 2024-03-25 , doi: 10.1186/s12916-024-03352-9 麦醇溶蛋白肽寡聚化或可增加肠道通透性 Angewandte Chemie International Edition——[16.6] ① 本研究揭示了33-mer去酰胺化麦醇溶蛋白肽（DGP）在乳糜泻中的新作用机制；② 33-mer DGP是一种代谢修饰的小麦麸质抗原，可自发地组装成直径为24纳米的寡聚体；③ 33-mer DGP寡聚体主要呈现两种次级结构：主要的多脯氨酸II螺旋和次要的β-折叠结构；④ 33-mer DGP刺激下会导致肠上皮细胞模型Caco-2的通透性显著增加，伴随着紧密连接蛋白zonula occludens-1（ZO-1）的重新分布；⑤ 本研究为33-mer DGP对乳糜泻的影响进行了深入探究，并提示麦醇溶蛋白肽寡聚化与乳糜泻的相关性。【原文信息】 The Celiac-Disease Superantigen Oligomerizes and Increases Permeability in an Enterocyte Cell Model 2024-03-18 , doi: 10.1002/anie.202317552 山一大团队：沙门氏菌操纵巨噬细胞，突破肠-血管屏障 EMBO Journal——[11.4] ① 肠道病原体沙门氏菌在侵袭肠道上皮细胞后迅速进入血液循环，山东第一医科大学的李冰清和陈启鑫团队发表文章，揭示了沙门氏菌在早期感染时通过操控CX3CR1+巨噬细胞迁移来穿透肠-血管屏障，进入血液循环；② 沙门氏菌依赖于宿主细胞的肌动蛋白和病原体效应蛋白SteC来诱导巨噬细胞的迁移/侵袭特性；③ SteC招募宿主肌球蛋白轻链蛋白Myl12a并磷酸化其Ser19和Thr20残基，Myl12a的磷酸化导致肌动蛋白重排，增强了巨噬细胞的迁移和侵袭能力；④ SteC能够利用多种NTPs，而不仅仅是ATP，对Myl12a进行磷酸化；⑤ 解析了SteC的晶体结构，揭示了其非典型的二聚体介导的催化机制，并证实了SteC介导的细胞骨架操控对沙门氏菌穿透肠血管屏障和扩散至靶器官至关重要。【原文信息】 Salmonella manipulates macrophage migration via SteC-mediated myosin light chain activation to penetrate the gut-vascular barrier 2024-03-25 , doi: 10.1038/s44318-024-00076-7 CD4+CD8αα+肠道上皮内淋巴细胞发育的途径和机制（综述） Trends in Immunology——[16.8] ① CD4+CD8αα+T细胞是由成熟的CD4+ T细胞通过转录因子重编程分化而来，在小肠上皮中具有独特的发育途径；② 微生物代谢产物、细胞因子、MHC-II及其他细胞表面分子的共同作用促进了CD4+ T细胞向CD4+CD8αα+ T细胞的表型和功能转变；③ CD4+CD8αα+ T细胞兼具CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞的标志物和分子，并具有广泛的免疫调节功能，从肠上皮细胞的细胞溶解到肠黏膜的免疫抑制，其功能可能取决于不同的环境条件，有待进一步研究。【原文信息】 Pathways and mechanisms of CD4+CD8αα+ intraepithelial T cell development 2024-03-20 , doi: 10.1016/j.it.2024.02.006 中性粒细胞促进结直肠癌中血管生成 Journal of Clinical Investigation——[15.9] ① 这项研究揭示了中性粒细胞（PMN）在结直肠癌（CRC）中的组织特异性重编程，导致其促进肿瘤的血管生成；② 通过对血液和组织中性粒细胞的转录组分析，发现定位于外周血液、炎症性结肠和肿瘤的PMN三者的转录程序有明显差别；③ 肿瘤相关中性粒细胞（TANs）独特地富集血管生成和血管发育途径，且体外培养、结肠炎诱导的小鼠CRC和患者来源的异种移植模型等功能研究证明TANs在促进肿瘤血管化中具有关键作用；④ Spp1和Mmp14在TANs中高度诱导，对内皮细胞趋化和分支有关键调控作用；⑤ TCGA数据集和临床标本证实了SPP1和MMP14在高级别CRC患者中的富集，但在UC患者中并不富集；⑥ 使用药理学抑制TANs迁移或MMP14活性有效减少肿瘤血管密度，导致结直肠癌消退。【原文信息】 Tissue-specific reprogramming leads to angiogenic neutrophil specialization and tumor vascularization in colorectal cancer 2024-02-08 , doi: 10.1172/JCI174545 Cell子刊：衰老细胞与巨噬细胞合作促进果蝇肠道转化 Developmental Cell——[11.8] ① 本研究探索体内如何整合多种诱导衰老信号来驱动仅少数细胞的衰老机制；② 在果蝇肠道转化模型中，AKT、JNK和DNA损伤信号同时激活导致部分细胞表现出多种衰老特征；③ 通过遗传手段或使用衰老细胞清除剂消除衰老细胞，可减少组织过度生长并提高存活率；④ 衰老细胞通过招募果蝇巨噬细胞到转化组织中，导致JNK信号的非自主激活，从而促进肿瘤发生；⑤ 本研究揭示了在果蝇肠道转化模型中，衰老细胞通过与巨噬细胞的相互作用，通过多激酶信号网络促进肠道转化的新机制。【原文信息】 Senescent cells and macrophages cooperate through a multi-kinase signaling network to promote intestinal transformation in Drosophila 2024-01-31 , doi: 10.1016/j.devcel.2024.01.009 土壤细菌定植昆虫肠道激活免疫系统的奇妙之旅 PNAS——[11.1] ① 昆虫缺乏获得性免疫，也曾被认为没有免疫记忆，但最近的研究报道了“免疫印记”现象，即低剂量的病原体或非病原微生物刺激免疫并预防病菌感染，但其潜在机制尚不清楚；② PNAS发表的研究性论文揭示了摄入特定的土壤细菌Burkholderia能够穿透豆虫Riptortus pedestris的前肠道上皮细胞，迁移到体液中，从而激活系统性免疫，包括体液和细胞免疫反应；③ 这种激活的免疫反应不仅不会对宿主的健康产生负面影响，反而能够保护昆虫免受后续的病原细菌感染；④ 研究还发现，一旦中断了Burkholderia菌株与肠道上皮细胞的接触，宿主的免疫力会回落到感染前的水平，使昆虫更容易受到微生物感染，说明持续获取环境细菌对于维持有效免疫至关重要。【原文信息】 Ingested soil bacteria breach gut epithelia and prime systemic immunity in an insect 2024-03-04 , doi: 10.1073/pnas.2315540121 LISCure活菌药LB-P8治疗PSC获FDA快速通道资格认定 ① 3月29日，LISCure Biosciences公司宣布，旗下治疗原发性硬化性胆管炎（PSC）活菌药LB-P8获得FDA快速通道资格认定；② LB-P8是目前在治疗PSC上唯一报告进入临床开发阶段的活菌药产品；③ LB-P8已在2022年获得治疗PSC的孤儿药资格认定，目前正处于2期临床研究阶段；④ LISCure Biosciences公司计划在美国和欧洲多个医疗机构开展该临床研究，并预计在2025年初获得初步结果。【原文信息】 LISCure Biosciences receives U.S. FDA Fast Track designation for LB-P8 for the treatment of primary sclerosing cholangitis (PSC) 2024-03-29 , CISION Affibody PET显像剂ABY-025 2期临床首例胃食管癌患者入组 ① 3月26日，Affibody AB公司宣布，旗下PET/CT显像剂ABY-025，其2期临床试验的首例胃食管癌患者完成入组；② 胃食管癌早期诊断和治疗仍然是医学界面临的难题之一，患者HER2基因表达水平是衡量患者能否从靶向治疗中获益的重要标志；③ 使用ABY-025进行PET/CT成像，可以在注射后3-4小时确认肿瘤HER2基因表达水平的高低，从而预测靶向药物治疗效果；④ 研究还将比较PET/CT成像与组织活检获得的HER2表达水平数据，从而评估这一靶向检测手段能否带来新的治疗契机。【原文信息】 FIRST GASTROESOPHAGEAL CANCER PATIENTS ENROLLED IN PHASE 2 BASKET TRIAL USING AFFIBODY’S PET IMAGING AGENT ABY-025 2024-03-28 , Affibody 瀚科迈博创新药HuA21 1b/2期临床完成首例患者入组 ① 3月29日，瀚科迈博自主研发的1类创新药HuA21注射液，其1b/2期临床试验完成首例受试者入组；② 该研究旨在评估HuA21注射液联合曲妥珠单抗化疗，治疗HER2阳性胃癌患者的安全性、耐受性和有效性；③ 该研究由复旦大学附属中山医院刘天舒教授和安徽医科大学第一附属医院孙倍成教授共同牵头；④ HuA21在1期临床试验中展现了优异的抗肿瘤活性，有望成为改变现阶段治疗方案的新药，瀚科迈博具有完全自主知识产权。【原文信息】瀚科迈博创新药HuA21注射液 Ib/II 期临床研究完成首例受试者入组 2024-03-29 , 安科生物加科思JAB-30355片临床试验申请获CDE受理 ① 3月28日，北京加科思新药研发有限公司宣布其1类新药JAB-30355片的临床试验申请获国家药品审评中心（CDE）受理；② JAB-30355片是一款针对P53 Y220C的激活剂，用于治疗局部晚期或转移性实体瘤；③ 研究表明，JAB-30355片在多种肿瘤模型中实现了肿瘤消退，包括胃癌、乳腺癌和肺癌等；④ 该药物在美国已获批新药研究申请（IND），将开展针对晚期实体瘤的1/2a期临床试验；⑤ 此外，加科思布局了KRAS G12C抑制剂、SHP2抑制剂、BET抑制剂、GUE抑制剂等多款在研项目。【原文信息】加科思「P53 Y220C激活剂」在华申报临床 2024-03-29 , 药智新闻飞鹤取得加拿大首张婴幼儿配方奶粉生产执照 ① 近日，飞鹤旗下加拿大皇家妙克公司获得加拿大食品检验局（CFIA）批准生产婴幼儿配方奶粉许可；② 该公司计划今年夏天将产品推向加拿大当地零售分销渠道；③ 飞鹤在加拿大的奶粉生产工厂是当地第一家婴幼儿配方奶粉生产企业，且在投产后也是加拿大当地生产、销售的第一个奶粉品牌；④ 2016年年底，飞鹤与加拿大金斯顿市签约，拟在该市投资建厂，该厂于2017年6月份开建，2019年调试完成。【原文信息】飞鹤取得加拿大首张婴幼儿配方奶粉生产执照 2024-03-29 , FoodTalks 感谢本期日报的审核者：章台柳，九卿臣，RZN，注册营养师陈彬林，圆圈儿，好雨，Richard，Alex Zhang 点击阅读过去10天的日报： 0401 | 3月，最值得关注的35篇肠道健康要闻！ 0331 | 聚焦特殊人群：老年人和孕妈妈的饮食新知 0330 | Akk菌或是免疫性肾病帮凶？Science子刊揭示机制 0329 | 33页综述纵论：超加工食品健康转型的新策略 0328 | Science子刊：锁定肠道中让病毒逃脱免疫的"避风港" 0327 | 10文聚焦菌群-肠-脑轴研究新进展 0326 | 100分综述详解：IBD细胞因子疗法最前沿 0325 | 大肠癌患病为何年轻化？遗传与生活方式的双重影响 0324 | 大型临床试验：补钙补D如何影响老年女性长期健康？ 0323 | Lancet+JAMA领衔，聚焦炎症性肠病诊断与治疗

临床研究

2023-05-11

·生物制品圈

全面梳理 | 双载荷ADC及其类似物的构建策略

抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)结合了单克隆抗体的肿瘤靶向特异性和细胞毒性药物(Warhead/Payload)的强效细胞杀伤活性，通过精心设计的化学接头(Linker)将二者偶联在一起，在实现精确定位的同时展现出强大的抗肿瘤活性，以改善Warhead的治疗窗口[1]。基于ADC药物的临床成功[2]，研究人员对设计新样式的ADC的兴趣激增。除了ISAC[3]、IM-ADC[4]、PROTAB[5]、LYTAC[6]等外，双载荷ADC药物的构建也在不断取得进步。双载荷ADC通过不同的构建方法对其药抗比(Drug-Antibody Ratio, DAR)进行灵活调整，可以根据疾病类型及治疗目的微调ADC的理化特性、功效和毒性特征，充分利用ADC双药递送的优势，提高ADC活性；同时，在原子经济学的角度上可以减少所需试剂的摩尔用量构建具有高度同质性的双载荷ADC药物，在提高疗效的同时降低生产成本。目前，用于构建双载荷ADC的方法还是主要集中于第二代偶联技术[1]：工程化的反应性半胱氨酸残基、链间二硫键重塑技术、非天然氨基酸介导的点击化学、酶辅助连接、糖型重塑和糖缀合等[7]。文献报道的双载荷ADC的构建多是上述偶联方法的组合，对DAR值进行调整，接下来小编将简单介绍2016-2023年部分文献报道的双载荷ADC及其类似物的构建。 01 Engineered reactive cysteine residue & Disulfide re-bridging由于半胱氨酸(Cysteine，Cys)侧链基团的特殊性-巯基基团(-SH)，其与含有马来酰亚胺基团(-Mal)的Payloads偶联以实现对抗体的位点选择性修饰，二者的迈克尔加成反应选择性高、快速，同时条件也较为温和[8]。目前，利用Cys构建ADC的方法主要包括工程化的反应性Cys残基(Engineered reactive cysteine residue)和抗体自身链间二硫键重塑(Disulfide re-bridging)技术。工程化的反应性Cys的引入早见于Genentech公司的ThioMab™技术，通过还原-氧化-偶联三步反应构建DAR值为2的ADC药物(实际DAR值1.7~1.9)[9]，该方法目前有较多公司在其基础上进行优化，例如Zymeworks[10]，Byondis[11]等。二硫键重塑技术主要是利用TCEP/DTT还原IgG的链间二硫键，暴露出可用于偶联反应的Cys-SH。为了充分利用有限的结合位点，西雅图遗传学公司Peter D. Senter课题组[12]利用双Cys多路载体(Dual Cysteine multiplexing carrier)引入两个被保护的半胱氨酸基团[Cys (SiPr)+Cys (Acm)]，结合不同的脱保护反应构建双载荷ADC；同时该载体还包含PEG24片段，可在不伴随疏水性诱导的ADC聚集的情况下实现高载药量(DAR: 8+8)；用该方法构建的cAC10-(2+3)在小鼠异种移植模型(DEL-BVR细胞系)中展现出良好的抗肿瘤活性(图1)。图1. 双载荷ADC的构建及其抗肿瘤活性评价上述方法利用线性Linker引入双载荷ADC，MedImmune Inc.则利用支链Linker引入双载荷(图2)[13]。偶联所需Cys插入到Trastuzumab/NIP228 (Ctrl Ab)的239位，引入含有炔基和酮基的Linker构建Ab-Linker平台，使其与NH2-O-vc-PAB-MMAE、N3-PEG8-PBD dimer (SG3457)反应得到双载荷ADC，其针对HER2+的乳腺癌细胞系展示出良好的细胞毒性。图2. 利用支链Linker构建双载荷ADC剑桥大学David R. Spring课题组[14]利用二硫键重塑技术进行双载荷ADC的构建，以带有特定反应集团和FITC的二乙烯基嘧啶(divinylpyrimidine, dfDVP)衍生物与Trastuzumab的链间二硫键进行反应，再经铜催化的叠氮炔基环加成反应[Copper (I)-catalyzed Azide Alkyne Cycloaddition，CuAAC]得到DAR值为3 (针对MMAE而言)的Tras-FITC-MMAE(图3左)，对SK-BR3 (HER2+)细胞表现出剂量依赖性细胞毒性。尽管筛选了其他的几种反应条件，但仍然无法获得DAR>3的Tras-FITC-MMAE，该课题组认为所连接的接头大小仅允许在每个抗体的铰链区连接一个药物分子，由于已经结合的大尺寸连接子-有效载荷产生空间位阻，使得MMAE仅有一个与目的基团进行偶联。图3. dfDVP用于双载荷ADC的构建(左)及其优化(右)在上述研究的基础上，该课题组对dfDVP Linker进行优化(图3右)，引入可以发生逆电子需求D-A反应(Inverse electron-demand Diels–Alder reaction, IEDDA[15])的甲基环丙烯基团(蓝色部分)和可以发生环张力驱动叠氮炔基环加成反应(Strain-Promoted Alkyne-Azide Cyclo-additions, SPAAC[16])的双环[6,1,0]壬炔(-BCN，绿色部分)，重塑抗体二硫键后，将产物与MMAE-PEG4-N3和TAMRA-PEG4-Bn-Tetrazine反应，构建新型双载荷ADC[17]；同样，该种ADC的活性也是在SK-BR3 (HER2+)细胞中进行验证，IC50为40 pM，其对HER2阴性的MCF7细胞无明显的细胞毒活性。类似于dfDVP衍生物，荣昌生物采用三丙烯基三嗪类(Triallyl triazines)构建单载荷ADC，在其研发管线中也得到应用[18, 19]。此外，针对TCEP或DDT还原的非选择性，Byondis公司利用其专有的ByonShieLD®[20]和ByonFoLD®[11]技术平台对工程化的Cys和链间二硫键进行选择性还原，然后与含有-Mal的细胞毒性药物反应得到双载荷ADC (图4)，但对其DAR值的明确还值得进一步研究。图4. Byondis公司双载荷ADC的制备模式图(作者根据专利自行绘制)针对抗体的链间二硫键的改造，除dfDVP类似物外，还有二溴哒嗪二酮(dibromo- pyridazinedione, diBrPD)衍生物。伦敦大学Vijay Chudasama课题组利用diBrPD-PhN3(-Tz)作为桥接试剂构建含有不同载荷和DAR值的ADC药物，利用该方法可获得同质性高、多样化的ADC (图5)；同时，该方法具有一定的普适性，除对全长抗体进行偶联外，还可以应用到Fab’、Fc-偶联物的开发[21]。diBrPD衍生物较早见于ThioLogics公司，也是用于构建双载荷ADC，但其仅用于mAbs的偶联，未对应用范围做更多的扩展[22]。图5. diBrPD衍生物由于单/双载荷ADC的构建与Cys类似，由丝氨酸转化而成的硒代半胱氨酸(Selenocysteine，Se-Cys)也可作为偶联位点进行ADC的构建[23]。美国国立卫生研究院国家癌症研究所及合作团队以Trastuzumab为模板，通过分子生物学技术在其特定位置引入工程化的Cys (HC A114C)和Se-Cys (HC S396U)构建Thio-selenomab，使引入的Se-Cys与PNU-159682-EDA-Gly3-IAM(Iodoacetamide，碘乙酰胺)偶联[24]，然后再将产物与MMAF-nc-MSODA偶联[25]得到双载荷ADC，经质谱表征，DARPNU-159682为1.9，DARMMAF为1.5 (图6左上)；该双载荷ADC对HER2+的细胞系表现出选择性和有效的细胞毒性(图6左下)，并表现出与偶联药物一致的双重作用机制：PNU-159682由于其DNA损伤活性导致S期细胞周期停滞，而MMAF同时抑制微管蛋白聚合并导致G2/M期细胞周期停滞(图6右)。尽管体外细胞毒性结果表明PNU-159682和MMAF的组合不会单独增强PNU-159682的效力，但ADC的双重机制特性可能在高度异质的体内肿瘤环境中仍具有治疗效用。图6. 利用Cys和Se-Cys构建双载荷ADC及其活性、机制的研究除工程化的Cys、Se-Cys以及链间二硫键外，法国分子生物物理中心Vincent Aucagne课题组以化学合成的第三代抗HER2亲和体(Affibody)的N-端Cys为反应位点，经过两步反应一次纯化可以在温和条件下(无离液剂，中性pH值)构建双载荷ADC，引入DM1和MMAE；与两种单偶联物的组合相比，双载荷ADC对HER2+的细胞系表现出更强的细胞毒性，表明具有强大的协同作用(图7)[26]。图7. 双载荷亲合体(Affibody)的构建及其活性评价 02 Unnatural Amino Acids (UAA)除了对Cys进行修饰外，抗体的位点特异性偶联还可以通过基因密码子扩增技术引入非天然氨基酸(Unnatural Amino Acids, UAA)来实现，利用不同的正交对[正交氨酰-tRNA合成酶(aaRS) / tRNA]引入UAA，再与目的分子偶联构建ADC，该种偶联是可控和定量的，可生成具有均一DAR值、高效、稳定性和安全性高的ADC[27]。波士顿学院Abhishek Chatterjee课题组利用大肠杆菌色氨酸对(EcTrp)作为TGA密码子抑制剂，与其他已有的正交对相结合，开发出双UAA引入的三种新途径，利用该方法可以极佳的效率将两种不同的UAA特异性地引入到抗体中，随后用两种不同的细胞毒性有效载荷对其进行偶联[28]。利用EcTrp+EcLeu (TAG)[29]系统分别将5-HTP和LCA引入到Trastuzumab重链的121和198位，然后经一锅法将两种不同的细胞毒药物(Diazo-MMAF +DBCO-PNU-159682[30])偶联到抗体上(CRACR[31]+SPAAC，图8. A+B)；分别用该方法构建的ADC对NCI-N87 (HER2受体高表达)和NCI-H520 (HER2受体低表达)细胞系进行初步细胞毒性研究，对NCI-N87的细胞毒性明显更高，证明其HER2依赖性的细胞杀伤；与MMAF相比，用PNU标记的ADC显示出显着更高的毒性(图8. C)。图8. 利用基因密码子扩增技术构建双载荷ADC及其活性评价为了能够减少正交对(aaRS/tRNA对)的使用，北京大学刘涛研究院课题组开发了新型UAA-pTAF和mTAF，在一个UAA引入两种正交反应基团(-N3 + -Tetrazine)，可实现一锅化反应引入荧光基团、放射性同位素、细胞毒性药物等[32]。利用含有pTAF的HER2-scFv构建的scFv-MMAE-PEG40K，其在HER2+肿瘤模型(HCC1954)中对肿瘤生长表现出明显的抑制作用，而在scFv-MMAE处理组和PBS处理组中未观察到肿瘤生长抑制；在实验结束时切除肿瘤并称重，该结果也证明scFv-MMAE与PEG40K偶联后表现出优越的治疗效果(图9)；此外，经scFv-MMAE-PEG40K治疗后没有观察到体重和肝功能的显着变化，表明其具有良好的生物相容性。虽然该方法构建的双载荷偶联物并没有完全消除肿瘤，但作者认为可以通过调整剂量和注射频率来改善抗肿瘤活性。图9. 基于UAA-p/mTAF构建双载荷ADC类似物及其抗肿瘤活性的研究除了单纯的利用UAA外，上海有机所王文远教授课题组通过组合的方法对工程化的Cys和对乙酰基苯丙氨酸(p-Acetyl-Phenylalanine)进行一锅法、连续反应构建双载荷ADC (图10)[33]。该策略使Trastuzumab通过不同的反应顺序与两种机制不同的细胞毒性药物结合，使新设计的ADC具有功能多样性，并有可能克服耐药性、提高治疗活性。该方法反应条件较为剧烈(pH 4，羟胺与羰基成肟)，在实际生产中可能存在一定的问题。图10. 双策略(Cys+UAA)构建双载荷ADC类似物UAA虽然能实现定点均一的偶联，但由于其外源性的特征可能会使抗体诱导免疫原性[34]；UAA的疏水性也会增加抗体聚集的风险[35]。 03 Glycan remodeling and glycoconjugation & Enzyme-assisted ligation糖基化是抗体最重要的翻译后修饰之一，利用糖基化位点进行位点选择性修饰也是目前ADC构建的常用方法[36]。上海药物所黄蔚教授课题组开发了两种策略构建位点特异性的ADC，一种是通过endo-S2催化的一步糖工程合成糖基特异性ADC的化学酶法，另一种是通过配体导向的基于硫酯的酰基转移试剂的化学方法以无痕方式合成K248位点特异性ADC[37-39]。目前，该课题组利用上述技术优势，通过三种不同路线在糖基化位点(N297)和K248位点组装同质双载荷ADC (图11)[40]。A)首先通过endo-S2催化在糖基化位点引入MMAE/ MMAF，然后在存在FcBP接头-药物复合物的情况下在抗体的K248处偶联另一个载荷；B)首先在K248处偶联有效载荷，然后在糖基化位点进行偶联，但实验结果表明K248处的有效载荷在某种程度上影响endo-S2介导的转糖基活性，影响偶联；C)通过简单地将所有材料添加到反应混合物中，以一锅法同时在糖基化和K248位点组装两种不同的有效载荷，该条件下endo-S2的水解和转糖基活性被完全抑制，有效载荷在K248处的偶联效率也受到影响。最终，选择以路线A进行双载荷ADC的制备，所得ADC在稳定性及抗肿瘤活性方面有优秀的表现。图11. 双载荷ADC构建路线的优化除N297位聚糖进行截短修饰外，酶辅助连接也是一种有效的位点特异性偶联策略。通过基因工程，人工诱导特定氨基酸序列在抗体中表达，这些序列可被某些酶识别，随后特定的氨基酸残基被酶修饰，以实现位点特异性结合。利用PNGase F (Peptide-N-Glycosidase F)对抗体进行去糖基化处理，使其暴露出295位谷氨酰胺(Q295)，其可被微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase，MTG)催化与含有氨基的底物反应，用于位点特异性的抗体修饰。辉瑞Edmund Graziani课题组利用含有Q295和工程化Cys的抗体分步构建含有BODIPY和Cy5.5的荧光抗体；此外，该课题组利用Trastuzumab A114C经木瓜蛋白酶切割得到含有工程化Cys的Fab，经过初次还原氧化使引入的Cys暴露出来，与mcVC-PABC_Aur-0101偶联，其产物再次还原打开Fab间的二硫键，暴露出的巯基与mc_Aur-0131偶联，该产物在体外N87细胞中的IC50为37−43 ng/mL，表现出优异的细胞毒性[41]。上述方法构建双载荷ADC类似物使用不同的偶联位点，康奈尔大学Christopher A. Alabi课题组仅利用抗体中的Q295作为反应位点，经MTG酶催化将含有-N3和-Tetrazine的双功能底物引入Trastuzumab中，通过正交反应一锅法引入MMAE和聚乙二醇(PEG)侧链，该类型的双载荷ADC药物在SKOV3细胞中表现出强大的体外活性(图12)[42]。图12. MTG酶催化一锅法制备双载荷ADC类似物如何利用抗体Q295位点构建真正意义上的双载荷ADC成为目前研究的难点，德克萨斯大学休斯顿健康科学中心Kyoji Tsuchikama课题组通过引入含有点击化学反应基团的三臂Linker，构建含有MMAE+MMAF (4+2, DAR值)的双载荷ADC (图13. a)，同时也构建了DAR值为2+2、2+4的双载荷ADC，该类型的双载荷ADC的体内抗肿瘤活性要比单药联用效果好(图13. b-e)，可能对难治性、复发性乳腺癌或其他肿瘤有一定的治疗优势[43]。图13. 利用三臂Linker构建双载荷ADC及其活性评价同样利用酶辅助偶联的方法，比勒费尔德大学Kristian M. Müller课题组及其合作者利用甲酰甘氨酸生成酶(Formylglycine-Generating Enzyme, FGE[44])在scFv425-Fc上引入醛基，将含有双反应基团的Linker引入到scFv中，经后续反应得到含有PEGylation修饰和MMAE的双载荷ADC类似物，其在人鳞癌来源的A431细胞中展现出亚纳摩尔细胞毒性(图14左)[45]；弗罗茨瓦夫大学Jacek Otlewski课题组利用人成纤维细胞生长因子2 (human fibroblast growth factor 2, FGF2)作为靶向蛋白进行偶联，而不是对抗体进行改造；利用分选酶-A (Sortase-A)介导的连接反应在FGF2上引入MMAE和α-鹅膏菌素(α-AMTN)，该种双载荷偶联物比单载荷偶联物对成纤维细胞生长因子受体阳性细胞系表现出更高的细胞毒效力(图14右)[46]。图14. 酶辅助偶联方法构建双载荷ADC类似物总结起来，双载荷ADC及其类似物的构建：一种是利用两个反应位点分步进行构建；另一种就是利用单一反应位点引入分支Linker，再通过点击化学组装细胞毒性药物。虽然双载荷ADC构建方法目前已经较为成熟，但其药动药代方面的方面任重道远。免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表个人立场，亦不代表个人支持或反对文中观点。本文并非治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。主要参考文献 1. Fu, Z., et al., Antibody drug conjugate: the "biological missile" for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther, 2022. 7(1): p. 93.2. Mair, M.J., et al., Understanding the activity of antibody-drug conjugates in primary and secondary brain tumours. Nat Rev Clin Oncol, 2023.3. 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转移性乳腺癌	申请上市	瑞典	Affibody AB	2013-04-01
胃食管交界处癌	临床2期	瑞典	Affibody Medical AB	2022-08-25
HER2阳性乳腺癌	临床2期	瑞典	Affibody Medical AB	2022-08-25
非小细胞肺癌	临床2期	瑞典	Affibody Medical AB	2022-08-25