TriMixDC

摘要：90年代早期，首创性使用mRNA疫苗作为治疗工具。在接下来的几十年里，对mRNA药理学有了进一步了解，同时在免疫学方面的新见解，使得mRNA相关技术成为新一代疫苗候选者。本文概述了mRNA疫苗的历史和现状，同时从免疫学角度评价了mRNA疫苗的开发。本文中我们强调了疫苗设计、检测和管理方面的挑战以及mRNA相关疫苗设计中的关键因素和将mRNA包装在纳米疫苗中所带来的新机遇。最后，我们讨论了mRNA自佐剂效应，其作为一个关键的两面性参数，决定了诱发免疫反应的安全性、有效性和强度。介绍：mRNA疫苗开发的第一步利用mRNA作为新型治疗药物的概念产生于1989年，位于San Diego的Vical公司宣布了其成功。他们表明将mRNA包裹入脂纳米颗粒可以成功将mRNA转移至各种真核细胞。几个月以后，Wolff等指出其实验中裸mRNA可以直接注射入小鼠肌肉。其实，这原本是作为脂质递送实验的对照进行的。裸mRNA肌肉注射几天后可检测到编码蛋白表达。该实验第一次证实了活体组织中通过体外转录mRNA方式可以将遗传信息用于制造蛋白质。重要的是，该过程无需病毒或非病毒载体，这与mRNA体内稳定性的假说大相径庭。这使得mRNA可成为质粒DNA有价值且安全的替代者。因为，mRNA只有成为胞质溶胶才能在核糖体上进行翻译，这避免了其整合入宿主基因组的风险。mRNA除了具有暂时性取代错误蛋白的治疗性用途外，20世纪90年代初期提出mRNA可提呈抗原信息至抗原提呈细胞。Martinon第一次展示了包含mRNA的脂质体可编码流感病毒核蛋白诱导病毒特异性细胞毒T细胞反应。除了细胞免疫，Conry表明体液免疫也被激活，其表明编码癌胚抗原的mRNA预防类疫苗最终诱导抗肿瘤抗体反应产生。经过30年研究，mRNA疫苗已迎来新局面，很多候选疫苗已进入临床试验阶段。本综述中，我们将列出最重要的基础内容以便于我们理解mRNA疫苗是如何制备和递送的。我们将对不同mRNA疫苗平台间免疫结果进行讨论，可能会为诱导更有效、安全免疫反应带来帮助。mRNA疫苗的免疫观点1973年Ralph Steinman和Zanvil Cohn发现树突细胞（DC）不久，该细胞就被鉴定为启动T细胞反应的辅助细胞。DC专职化摄入、处理、提呈蛋白抗原至淋巴细胞，连接固有和适应性免疫。DC中的抗原信号可源于胞质，包括MHC I提呈的抗原多肽或来自溶酶体被装载在MHC II经内化、吞噬而来的隐藏抗原。这些MHC复合物，包括装载胞内抗原的MHC I和胞外抗原的MHC II，随后可分别被CD8+T细胞或CD4+T细胞的T细胞受体识别。除了这些抗原信号，DC还为抗原特异性T细胞活化提供了必要的共刺激信号。最终，活化的CD8+CTL能够选择性清除表达外来抗原的细胞，如被病毒感染的宿主细胞，表达异常蛋白的肿瘤细胞。CD4+辅助T细胞可以协同促进CTL活性。为了实现体液免疫，B细胞需要通过BCR识别体外抗原以及通过与活化辅助性T细胞（MHC II途径）的相互作用产生多功能、高亲和力抗体。树突状细胞是如何根据抗原的来源和细胞内部位置，通过特异性募集不同的效应细胞来引发免疫反应，这一知识促进了使用不同类型抗原开发(癌症)疫苗的研究。mRNA是一种吸引人的抗原使用抗原编码mRNA的一个关键优点是其提供了诱发MHC I提呈和诱导CTL反应的简单方式。与病毒感染类似，反转录mRNA在胞质中形成选择抗原的瞬间表达和积累。随后其被充分处理为多肽，进入MHC I途径。至此，胞质内少量mRNA分子能确保进一步抗原提呈至CTL，而蛋白只能依赖于低效的交联提呈途径。有趣的是，mRNA抗原也可以靶向MHC II途径。这发生在mRNA表达蛋白分泌和再循环后，或者直接通过抗原从胞质至溶酶体的转移。如在mRNA结构中设计溶酶体靶向序列。通过对比蛋白质相关疫苗，通过mRNA可持续获得抗原，这在抗体广度和亲和力方面具有显著作用，从而带来更持久的保护。mRNA具有编码抗原决定簇种类和数量非常丰富的优点。mRNA能编码全长蛋白质，因此可避免病人MHC半抗原限制。同时，通过串联结构设计可以将多种抗原表型组装在一条mRNA链中。通过这个方法，BioNTech AG公司开发了个性化mRNA癌症疫苗。该疫苗可识别单个和免疫原肿瘤突变，在指定mRNA疫苗上装备这些新抗原。首个人体试验证明了该方法在晚期黑色素瘤上的临床可行性和安全性。所有免疫病人产生了针对所选抗原的CD4+T和CD8+T细胞，还有一部分病人展现出实质抗肿瘤反应。为一种特定疾病定制一种新的mRNA结构可以简单而快速的完成，使得mRNA成为诱导免疫抵抗感染性疾病的理想候选者。这些趋于快速突变的疾病需要弹性而迅速的制备合适疫苗与循环系统中病毒株相匹配。这种背景下，预防性mRNA疫苗已在I期临床试验中被认为在应对感染性疾病时安全有效，如流感和狂犬。在大、小动物模型中，mRNA疫苗能够诱导针对新发感染的免疫反应，如寨卡、埃博拉、HIV。而且，通过细胞内蛋白质原位表达，mRNA能够收获合适折叠的产物和糖基化抗原，为挑战性产物和蛋白抗原有限稳定性提供解决方案。现代治疗制备了一种编码CMV五聚体五种不同亚基的mRNA疫苗。与mRNA序列针对CMV糖蛋白gB不同，这种多抗原mRNA疫苗在免疫小鼠和非人灵长类中可诱导更强而持久的中和抗体。mRNA作为危险信号自从mRNA在疫苗学中出现以来，最初的免疫识别模型认为T细胞和B细胞对“非自我”蛋白质产生反应，同时诱导对“自我”蛋白质的耐受，这种理论是建立在克隆选择理论的基础上的，但却被认为是不够的。1989年，Charles Janeway提出抗原提呈细胞(APCs)除了提供一个适合的抗原决定簇外，还能提供一个激活淋巴细胞的第二个共刺激信号。他指出，入侵的微生物是非自我的，不是因为外源抗原的存在，而是通过胚系编码的模式识别受体(PRRs)来识别感染性或微生物成分，其被称为病原体相关的分子模式(PAMPs)。几年后，Polly Matzinger详细阐述了这个概念，并指出APC不仅对外源微生物信号作出反应，而且还会被来自受损细胞的危险或警报信号所激活，如热激蛋白和胞外核酸。支持这种传染性非自我模型和危险理论的第一个真正证据出现在1996年，Jules Hoffmann在果蝇对致病微生物的作用中提出 Toll-like 受体(TLR)的参与。有趣的是，这些TLRs在哺乳动物中，在结构和功能方面有显著的进化保守性。两年后，Beutler团队确认TLR4是识别小鼠体内细菌性脂多糖(LPS)的PRR，更加丰富了该理论。再加上Ralph Steinman在DC 生物学上的开创性工作，这些发现彻底改变了我们对免疫反应是如何产生和调节的认识。虽然人们早就知道外源mRNA诱导I型干扰素(IFN)的产生，特别是IFN-α和IFN-β，但是 mRNA内在免疫学机制仍不清楚。在2000年早期，mRNA递送被证明可以触发DCs的抗病毒活性，这涉及到通过位于内体的 TLR7和TLR 8对单链RNA的识别。通过形成二级RNA结构，或在IVT mRNA产生过程中引入双链RNA片段，可通过内体TLR3途径触发免疫激活。除了TLRs，dsRNA还可以激活胞内RNA敏感器视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素分化相关蛋白5(MDA5)。mRNA与这些危险传感器的结合通过特定的接头分子导致下游信号传递(即MyD88对TLR7/8，TRIF对TLR3)，最终产生I型干扰素和其他促炎细胞因子(如IL-6和TNF-α)。反过来，I型IFNs结合自分泌或旁分泌受体，激活Janus激酶信号传导转录活化途径(JAK-STAT)，该通路调节数百种参与抗病毒免疫的蛋白质的基因表达。因此，这些信号通路协调激活和促进不同的固有和适应性免疫反应，被称为mRNA的“自我佐剂效应”。mRNA疫苗开发的范例近几年出现很多mRNA疫苗平台。IVT mRNA的基本结构与“成熟”真核mRNA非常相似，由(i)一个蛋白编码的开放阅读框(ORF)组成，两侧分别有(ii)5’和3’非翻译区（UTRs），末端为(iii)7-甲基鸟苷5’帽结构和(iv)3’poly(A)尾。这些非编码结构特征在mRNA的药理学中起着重要作用，可以通过个体优化来调节mRNA的稳定性、翻译效率和免疫原性。2004年，kariko和他的同事观察到，体外人树突状细胞在接触不同来源的mRNA时，可以耐受哺乳动物的mRNA，而对细菌、坏死的哺乳动物细胞和IVT mRNA具有强烈的炎症细胞因子反应。有趣的是，他们发现内源性mRNA免疫调节能力的强烈降低可能是由于mRNA结构中存在修饰核苷酸，如甲基化核苷或假尿苷。因此，确定了自然发生的翻译后mRNA 核苷修饰，使得内源性mRNA免于免疫检测，这使得细胞能够区分病理性的或入侵性的 mRNA。这为mRNA的开发提供了新的机会: 通过结合修饰核苷，被称为“核苷修饰mRNA”的mRNA可减少免疫刺激活性，从而提高安全性。此外，修饰核苷使得设计mRNA疫苗稳定性和翻译能力增强，因为它们可以避免I型干扰素诱导的直接抗病毒途径，并且可以程序化降解和抑制入侵的mRNA。例如，在IVT mRNA中发现以假尿嘧啶核苷取代尿苷，可以降低2’5’寡腺苷酸合成酶的活性，该酶可以调节RNaseI切割mRNA，此外，还测定了蛋白激酶R的低活性，该酶可抑制mRNA的翻译过程。在一次治疗中，Kormann 等人，证明了核苷修饰的mRNA编码促红细胞生成素(Epo) ，其中添加25% 的硫尿嘧啶核苷和25% 的5- 甲基胞嘧啶核苷，肌肉注射2周后，免疫小鼠Epo水平是对照小鼠的5倍，相反，未修饰的 mRNA没有显著变化，只引起了实质免疫反应。除了加入修饰的核苷酸外，其他方法也被证实可以提高mRNA的翻译能力和稳定性。一个例子是开发序列设计mRNA。通过mRNA ORF和UTRs优化mRNA的表达可以增加，例如通过丰富GC成分，或者通过选择天然长存活mRNA分子的UTRs。另一种方法是设计“自我扩增mRNA”结构。其大部分来源于甲病毒，其ORF由一个感兴趣的抗原以及一个编码病毒复制酶的ORF组成。后者驱动细胞内mRNA复制，因此能显著地增加抗原表达能力。早在1995年，Johanning 等人就发现，肌肉注射来自 Sindbis 病毒的自我扩增mRNA，导致蛋白质表达水平较非扩增mRNA增加了10倍，这种蛋白质表达水平可以维持更长的时间(从2天到10天)。同时对mRNA末端结构也做了一些修改。抗逆转帽子(ARCA)修饰可以确保正确的帽子定位在5’端的方向，这意味着最完整的mRNA片段可有效结合核糖体。其他帽子修饰，比如硫代磷酸酯帽子类似物，可以进一步提高其对真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)的亲和力，增强其对mRNA脱帽复合体的抵抗力。研究发现mRNA polyA尾部的延伸与表达时间相关，3 ‘UTR的特异性修饰可以减缓脱烯化作用对polyA尾部的降解。此外，还有一些更奇特的方法被提出，比如生成能够抵抗核酸外切酶降解作用的环状RNAs。近年来，人工合成的多胺复合物与 mRNA和 eIF4E蛋白预组装后，其表达效率明显高于单独的mRNA，这可能是由于这些复合物具有较高的稳定性以及对核糖体更高的募集作用。相反地，通过改变其结构，mRNA触发先天免疫反应的效力可以进一步提高，但是会损害翻译能力。CureVac AG公司发现，通过硫代磷酸酯骨架稳定mRNA，或者通过阳离子蛋白鱼精蛋白进行沉淀，虽然抗原表达量减少，但是可以获得更强的免疫刺激能力。这促进了鱼精蛋白复合物mRNA分子的发展，使其既可以单独作为多肽和蛋白质为基础的疫苗的免疫佐剂(即RNA佐剂) ，也可以在一个由抗原编码mRNA和鱼精蛋白mRNA复合物组成的双组分mRNA平台中发挥作用，以提高疫苗的免疫原性(即RNA活性)。 综合起来，将这些发现作为mRNA疫苗配方设计的原则。一种策略是使用完全优化以收获强的佐剂效应的mRNA，另一种策略是利用修饰mRNA获得高翻译能力，从而提高抗原的生物可利用性。考虑到接种目的，我们应该注意这些修饰既要有利于mRNA翻译，又要部分或完全减少mRNA分子和一个或多个病毒特异性PRRs的相互租用。因为这些可能会削弱mRNA疫苗的佐剂效果。毕竟，两种结果都受到I型IFN诱导基因的反向调节。人们通常优先考虑mRNA的翻译能力，以提高抗原的可利用性。然而，从免疫学的角度来看，先天免疫对mRNA更加敏感，其可引起表型免疫反应和细胞因子的产生，至少这同等重要。事实上，这些先天性免疫信号将触发和指导效应反应的选择，这对疫苗的治疗价值至关重要。尽管如此，这种 mRNA自我佐剂效应的效力必须与其固有的任何不良反应的风险权衡，包括炎症反应和自身免疫事件。这个挑战的关键是在mRNA疫苗的翻译能力和佐剂性能之间找到一个良好的平衡，以获得足够的，但是安全的免疫原性，这些将在后文讨论。mRNA疫苗递送体内方式第一个评估mRNA递送的人类实验使用的是体外方式，使用编码抗原mRNA转化单核来源DC，再作为细胞疫苗回输入病人体内。关于mRNA基础DC疫苗的优秀综述随处可见。近几年，热点开始指向直接给入mRNA。一般来说，体内直接将mRNA靶向APCs比体外得到DC疫苗有更多优势。首先，体外分离和培养病人特异性DC的步骤可以省略，从而降低人力物力成本。其次，体内递送mRNA更接近于自然病毒感染，有利于提高疫苗效果。多种免疫细胞和非免疫细胞在自然环境下直接转化，这样可以立即激活固有免疫，并顺次将信号传递给适应性免疫。而且，关键免疫事件，如炎症细胞因子和化学因子释放，在转染后几个小时内达到峰值，这在制备体外DC疫苗时是无法实现的。 尽管mRNA疫苗原位靶向APCs方面有很多优势，但是还有很多技术难题需要克服，才能成功地将mRNA传递到目标细胞。与给药途径无关，一些被设计的进化障碍用来防止外来核酸的入侵，限制外源性 mRNA的传递。给药早期，mRNA应该能抵抗组织和血液中RNA酶的降解。由于 mRNAs 是大型多阴离子分子，它们不能被动扩散通过细胞膜，因此 mRNA分子依赖于主动的细胞内摄取机制。这意味着，即使完整的mRNAs被APCs摄取，几乎所有的mRNA分子最终都会被内含-溶酶体区域包裹并降解。此外，抗病毒宿主防御机制通过RNA免疫识别诱导，增加破坏mRNA酶活性并抑制其进一步的细胞翻译。裸露、无保护mRNA疫苗的局部递送尽管存在各种递送障碍，裸露、无保护mRNA在通过不同注射方式给药后仍能诱导蛋白表达。早期研究发现，肌肉、皮下和皮内注射在注射部位可检测到蛋白表达，从而引发获得性免疫。然而，人们却很少知道其工作机理。2007年，Probst等证明真皮体细胞，如肌肉细胞、成纤维细胞和角化细胞能够通过离子依赖方式持续摄入β-半乳糖苷酶编码mRNA。Lorenz等揭露了mRNA摄取的更多细节，其使用成纤维细胞系证明mRNA首先被scavenger受体识别，然后通过caveolae和脂筏摄取机制内化，进入胞内后，mRNA分子通过内吞途径大部分进入溶酶体，只有很少部分进入胞内。仅仅几年后，参与摄入未修饰mRNA的免疫细胞就得到确定: 小鼠体内皮肤驻扎树突状细胞能够通过大胞吞噬引入裸mRNA，并引发T细胞反应。通过RNActive（RNA活性）疫苗技术，确定了不同类型的细胞参与了mRNA疫苗的摄取。皮内注射，所有疫苗组分，包括编码 mRNA和鱼精蛋白复合mRNA，都被免疫细胞和非免疫细胞摄取，在巨噬细胞，树突状细胞和中性粒细胞中检测到频率最高。这与驻地APCs活化标志物表达的增加以及不同细胞因子和趋化因子的短暂产生相吻合，表明该制剂的自佐剂效果。除了这些局部诱导的作用，两个独立的研究分别测试RNActive或编码序列mRNA（裸mRNA），表明活化的免疫细胞迁移到淋巴结(LNs) ，能够检测到固有免疫信号以及引流淋巴结中的mRNA编码抗原。近些年来明确了注射路线对mRNA接触的细胞类型和诱发的免疫反应起着重要的作用。因此，直接将mRNA注射至淋巴结成为确保运送到APC的最佳途径。Kreiter及其同事强调了这一点，他们指出未经修饰的裸mRNA疫苗，通过淋巴结注射比通过皮肤注射诱导T细胞免疫能力提高。他们证明，在淋巴结中，裸mRNA主要由驻留DC (和巨噬细胞)通过胞吞作用摄取。此外，随着免疫细胞广泛浸润到各种肿瘤类型的认识不断增加，也促进了裸 mRNA在瘤内应用的研究。事实上，在不同小鼠皮下肿瘤模型中，肿瘤浸润CD8a + 交叉表达DCs 主要负责注射后mRNA的摄入，导致mRNA表达超过5天。值得注意的是，自我扩增mRNA情况不同。首先发现自扩增mRNA不能直接转染APCs，自扩增mRNA长度明显延长(10kb,而非扩增mRNA只有2-3kb)。尽管如此，这种不能直接转染APCs的现象，并没有在肌肉注射后终止引发CTLs。为了阐明潜在的机制，Lazzaro 等人研究了(转染)肌肉细胞和(未转染)专职APCs各自对CTL引发的贡献。他们的结论是，APCs可以吸收被转染肌肉细胞加工的抗原，交叉呈递肌细胞表达的抗原是诱导CTL反应的机制。因此，转染心肌细胞等体细胞可能会影响抗原的丰度和持续时间，而这些细胞中TLR和胞浆RNA传感器的激活可导致局部炎症和树突状细胞的浸润。为了进一步提高固有免疫活性，抗原编码mRNA与免疫激活剂（蛋白质）或免疫刺激剂（mRNA转录子）结合用来检测。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)皮内注射有助于单核细胞的浸润，有助于mRNA转染的成熟DCs向淋巴结迁移。免疫佐剂聚肌苷酸和脂多糖的共同递送可使APCs快速成熟，使细胞摄取mRNA的能力减弱。因此，这些佐剂可以降低mRNA转运中的毒性，从而使 T细胞的抗原生物可用性发生改变。另外，VanLint等通过给予编码一个抗原的4个裸 mRNA和3个额外的免疫调节分子（CD40配体、组成型活化物TLR4和CD70，申请专利TriMix mRNA技术）的混合物，注册RNA免疫疗法。TriMix技术目前正在用于治疗黑色素瘤和乳腺癌的mRNA免疫疗法临床研究，其中未经修饰的裸 mRNA序列的混合物，分别被淋巴结注入或直接注入可接触的肿瘤病变。最近，一项针对 HIV-1感染的剂量升级临床研究表明，淋巴结注入TriMix mRNA疫苗是安全和耐受的，同时在高剂量下获得中等强度的HIV特异性 T细胞反应(总mRNA剂量为1.2mg)。mRNA递送系统的发展纳米颗粒开启新通道尽管裸mRNA的研究取得了成功，但是对于纳米载体的研究已经开始。这背后的基本原理是，mRNA纳米药物可以作为多功能药物，扩大疫苗递送的选择范围。首先，由于纳米 mRNA能更好地防止酶促破坏，新的传递途径，如静脉注射成为可能。此外，通过将mRNA制成纳米颗粒，可以改变其生物分布，细胞靶向性和细胞摄取机制，从而促进mRNA和疫苗的传递。尽管目前已经清楚的知道，纳米颗粒的选择和优化是成功转染mRNA的关键。但是有必要认识到，许多研究表明，在培养细胞中的转染实验可能不能可靠地预测mRNA制剂在体内的行为。Bhosle 等人进一步证明了体外和体内 mRNA传递之间的明显差异，他们观察到体外和体内存在完全不同的细胞摄取通路，裸mRNA和脂纳米颗粒mRNA均如此。此外，使用高通量系统，Paunovska 等人能够测试数百个脂纳米颗粒（其用于静脉注射后，将核酸递送给巨噬细胞或内皮细胞），发现其体外和体内效果几乎没有相关性。这些研究提出了这样一个问题: 是否可以合理地设计出纳米颗粒基质，以充分发挥其作为mRNA疫苗增强剂的多功能作用? 在以下章节中，我们将讨论设计mRNA疫苗纳米颗粒时的一些关键考虑，特别是针对mRNA LNPs，因为这些已经进入了(早期)临床试验阶段。对于读者来说，包括但不限于，鱼精蛋白、脂质或聚合物，以及杂交制剂在内的各种不同化学特性的纳米片段的广泛总结可以在其他地方找到。用于mRNA递送的脂纳米颗粒的设计和制备经过测试用于mRNA递送的脂质形式通常由阳离子/离子化脂质和其他“辅助”脂质组成，如磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇(PEG)。阳离子化脂质和带负电荷的mRNA分子通过静电作用形成复合物，并且可以根据氨基团的 pKa 再细分为(i)“永久带电脂质”，如 DOTMA，DOTAP和DC-胆固醇，或(ii)“ pH依赖性离子化脂质” ，如D-Lin-MC3-DMA和类脂分子 C12-200。这些可离子化的脂质(pKa < 7),最初是为 siRNA传递而优化的，在生理 pH条件下具有中性至轻度的阳离子电荷。这比永久性带电的脂质有益处，其中最重要的是可离子化的脂质与减少毒性和延长血液循环寿命有关。其他脂质成分被认为是“辅助脂质” ，因为它们具有独特的功能特性，可能影响复合mRNA LNPs的结构排列，从而提高其稳定性或促进mRNA的胞内摄取和胞浆进入。影响整体转染效率的关键障碍之一，是吞噬mRNA LNPs的内涵体降解。因此，我们努力修饰和优化mRNA LNPs，以促进内涵体到胞浆的转化。内涵体mRNA释放的机制依赖于LNP的质子化（离子化）和内涵体膜的阴性磷脂形成脂质混合物。这些脂质之间的离子对形成会引发膜融合和膜失稳，这反过来又加强了分子从内涵体逃逸。此外，这种脂质交换被认为可以诱导非双层结构转换(即层状结构转换为倒置的六方形) ，这将使LNPs解离，并使内涵体膜去稳定性。研究已经将mRNA和脂质成分的结构组织与最终的转染效率联系起来。指出 mRNA LNPs的物理化学和结构特征将取决于脂质组成，mRNA与阳离子脂质总量的比值，以及LNP的合成。将mRNA与含有永久带电脂质的单层脂质体混合制备 mRNA LNPs时，假定脂质体重排形成多层板层结构，其中mRNA分子被夹杂在同心脂质双层中。添加饱和磷脂，如DPPC和 DSPC，增加了阳离子脂质体的相变温度，并支持了这种脂双层结构的形成。相比之下，不饱和磷脂（DOPE）有助于形成非板层状脂相(即倒六角相) ，这被发现有助于内涵体逃逸。然而，后者只有在体外条件下才适用。在临床前试验中，DOPE与血清诱导的阳离子(DNA)LNPs的崩解增加有关，因此体内转染效率较低。另一种mRNA LNPs的制备方法是乙醇稀释法，这是一种适合制备含有可离子脂质的，更先进的LNPs的方法。在这里，单个脂质溶解在乙醇中，然后在酸性水溶液中与mRNA迅速混合。通过稀释乙醇相，脂质经历一个浓缩过程，形成LNPs，同时有效地包裹mRNA。然后在中和缓冲溶液中透析去除乙醇并中和pH。Kulkarni 和他的同事们最近阐明了这些离子化 LNP系统(具有不同的核酸有效载荷)的形成机理。他们提出，在酸性条件下的快速混合阶段，(“空”)小型脂质体结构和(“负载”)更大的电子密度粒子形成。接下来，在透析过程中，pH被中和，这些粒子趋于融合，最终形成LNP系统。此外，他们证明了PEG-脂成分通过在粒子表面施加排斥力，限制了进一步的融合，从而决定了最终的LNP大小。在另一项研究中，Yanez Arteta 等人指出，基于D-Lin-MC3-DMA，DSPC，胆固醇和PEG-脂的mRNA LNPs的结构重排呈现出一个无序的逆六方相，包含D-Lin-MC3-DMA，胆固醇，水和mRNA。这个核心由一个脂质单分子层包围，主要含有DSPC和DMPE-PEG2000成分，以及一小部分D-Lin-MC3-DMA和胆固醇。有趣的是，通过调整不同脂质的摩尔比，作者可以制备出不同表面特性的mRNA LNPs。他们发现有利于D-Lin-MC3-DMA脂质从内核部分分离到外表面的LNP成分，与提高转染效率相关。与此相反，表面富含DSPC的mRNA LNPs转染能力较弱(接近DSPC单层)。此外，作者认为，胆固醇的富集可能与LNP表面形成纳米晶体有关。虽然这项研究没有进一步研究，但之前的报道已经将胆固醇纳米晶体的出现与转染效率的提高联系起来。值得注意的是，台式微流体混合装置可用于通过乙醇稀释原理生产无载脂质体或mRNA LNPs，规模可扩大到临床应用或工业用途。这些微流体设备制备LNPs具有可控制，高通量优点，必然推动了新型LNPs基因传递的临床翻译。除了促进生产过程，新型脂质文库的筛选还有助于不断优化脂质组成。此外，这也支持了新的铅离子化脂质的发现，大大提高了 mRNA转染的效力和安全性。除了在LNP设计和生产上的进展，在体内转染细胞的作用模式上的创新是进一步发展的关键。虽然膜融合理论已经存在了十多年，但是LNP促进胞质递送mRNA的机制不能仅仅局限于此。最近的研究表明，mRNA LNPs的内源性转运是一个动态过程，涉及到影响胞质进入和mRNA翻译的循环通路和信号通路。例如，反式转运蛋白 Niemann-Pick 型C-1，位于晚期内溶酶体，发现负责大部分内化(si)RNA LNPs 的胞吐，因此强烈减少细胞溶出。相比之下，雷帕霉素复合物1对溶酶体膜的机械性靶向是触发递送mRNA翻译的关键。mRNA进入细胞和胞内转运机制间的关系虽然研究很少，但是同等重要。通过将 mRNA LNPs靶向到DCs 表达的选择性表面受体上，这些颗粒可能会进入细胞内的运输通路，这些通路对mRNA载物降解较少。因此，(mRNA)纳米疫苗已经靶向C型凝集素DEC-205，CLEC9A和甘露糖受体，它们也参与有利于吸收、内吞保护和交叉呈递死亡细胞抗原的途径。Fig. 5. Administration routes for mRNA vaccine delivery. Figure shows mRNA delivery options for both naked mRNA formats and nanoparticle-based strategies.mRNA LNPs的注入另一个关键参数是mRNA LNPs给药途径的选择，它将决定mRNA LNPs的有效性和安全性。重要的是，根据给药途径的不同，可能会遇到特定的细胞外屏障，从而导致特定粒子的优化。皮肤是一个非常方便的途径，它可以通过两种不同的机制导致免疫反应: 或者是通过mRNA LNPs局部转染和激活APCs，APC随后迁移到淋巴管，或者是通过淋巴系统被动地排出，从而直接将mRNA载荷传递给淋巴驻留APCs和T细胞。在一项对恒河猴的详细研究中，Liang 等人调查了肌肉或皮内注射可离子化LNP佐剂核酸修饰mRNA疫苗免疫细胞浸润、疫苗摄取、免疫激活和 mRNA翻译情况。在两种给药途径中，均可见中性粒细胞、单核细胞和不同的DC亚群快速聚集到注射部位(皮肤或肌肉)。虽然所有这些类型的细胞都能内化mRNA LNPs，但只有单核细胞和髓样DCs 的 mRNA翻译水平较高。此外，他们还能检测到成熟的，转基因的APCs 在引流淋巴结中。结合免疫反应，他们皮内注射导致皮肤DCs 的早期激活和更有效的迁移至引流淋巴结，以及注射部位抗原的长期可用性。总的来说，这导致了比肌肉注射更好的免疫原性，因为皮内注射导致了最高的抗体效价和CD4 + T细胞的激活。根据以前的报道，粒子大小是获得纳米粒子有效淋巴转运的关键因素。报告表明，200纳米以下的纳米颗粒能够进入淋巴细胞，而较大的颗粒在注射部位被截留。聚乙二醇化加速了(脂质)纳米粒子流入淋巴系统，而靶向配体如甘露糖和针对选择性DC受体的抗体可增加进入引流淋巴结的脂质体捕获。此外，研究表明，聚乙二醇化需要防止颗粒在皮肤的细胞外基质(ECM)中完全固定，这可以解释为ECM组分，如糖胺聚糖，可以抑制注射部位非聚乙二醇化淋巴液的分布和细胞摄取。为了给出一个优化的mRNA LNPs淋巴细胞转运的例子，Wang 等人产生了一个由 mRNA和磷酸钙预浓缩核心组成的纳米粒子系统，经DOPA稳定化，并由 DOTAP和 DSPE-PEG的脂质外壳包裹。这些mRNA纳米颗粒的粒径相对较小(< 50纳米) ，外表面没有带电荷，外表面聚乙二醇化程度很高。因此，这个系统被发现可以有效地进入淋巴组织，经皮内注射后4小时，就可以在引流淋巴结中检测到 mRNA的存在，从而可以直接将(几乎完整剂量的) mRNA传递给驻留的巨噬细胞和树突细胞。对于特定的癌症免疫治疗，引发抗肿瘤全身免疫反应非常重要，这使得静脉注射成为基于mRNA癌症疫苗非常有吸引力的给药途径。毫无疑问，一旦mRNA LNPs进入血液，粒子的大小，表面形态，结构构造等特征就会发生巨大的变化。事实上，(mrna)纳米粒子与生物体液的相互作用，引起内源性蛋白质和其他生物分子在特定表面的吸附，导致生物分子或蛋白质电晕的形成。这可能会降低mRNA LNPs的胶体稳定性，随之而来的是粒子的聚集和mRNA提前成熟释放。因此，利用荧光单粒子跟踪(fSPT)和荧光相关光谱(FCS)等先进的显微技术，测定未稀释生物介质中LNPs的大小、稳定性和mRNA包装率是一个很好的实践方法。也可以通过改变辅助脂质的组成来调整血清的稳定性。例如，胆固醇通常用于增加 LNPs的刚性(即降低脂膜的通透性) ，因此有助于提高LNP在血清中的稳定性和完整性。另外，聚乙二醇化的脂质被广泛用于提供“隐形效应”。这减少了总体蛋白质的吸附，提高了 LNPs 的胶体稳定性，但也阻碍了 LNP的细胞摄取和转染能力。在这里，具有较短酰基链的PEG脂质，可以提供一种有效的策略来克服这种“PEG壁垒”。这些PEG脂质逐渐扩散出LNP，从而暂时赋予LNP系统隐身性能，同时较长期、持久存在PEG脂质，可获得更高的转染效率。从另一个有利的角度来看，这种生物电晕的形成，为纳米颗粒提供了新的(表面)特性，有可能被用于靶向和/或增强传输。重要的是，在这个生物分子电晕中存在的单个蛋白质的数量和特性将取决于(“原始”)纳米颗粒的特性和它的生物学背景。一般而言，已知静脉注射的纳米粒子会与调理性血液蛋白反应，如补体片段、免疫球蛋白和纤维连接蛋白，从而促进吞噬细胞的摄取，以及纳米粒清除。最近，Vu 等人阐明了纳米颗粒是如何介导补体作用的，并发现这在一系列临床批准的脂质体中是相当普遍的。生物分子电晕的形成使自我表位暴露，自然产生的抗体可以结合。仅仅几个表面结合的免疫球蛋白分子，就足以触发补体激活。几项研究表明，自然调理过程可能被被动靶向APCs策略操纵，或者有可能将补体级联作为接种目的的危险信号。其他通过纳米粒子特殊扩散反应，引发广泛补体激活，临床表现为心肺不适。然而，最近的研究表明，这些纳米粒子介导的融合反应是由急性肺内巨噬细胞中毒引起的。聚乙二醇化策略已被用来减轻纳米粒的识别和吞噬细胞的快速清除。Schöttler等人证明了聚乙二醇化的纳米粒子避开了巨噬系统，不仅通过降低沉积在纳米粒子表面的补体片段和免疫球蛋白，而且通过一种选择性更高的凝集素的存在，这种凝集素的功能是一种强烈的 去调理作用。然而，聚乙二醇化也有其局限性: 对于已有抗聚乙二醇抗体的患者，输注聚乙二醇化LNPs是逆向的，因为这可能导致更强的补体激活，以及聚乙二醇化纳米粒子的快速血液清除。因此应该事先了解病人的PEG敏感性，并促使人们研究新的“隐形”策略。应该指出的是，关于生物分子电晕形成的作用及LNPs动力学的详细研究仍然非常有限。然而，在这个领域的进一步进展可能会发现更多系统递送特异mRNA LNPs产物后生物分布和细胞特异性靶向方面的情况。例如，Akinc 等人发现，选择性地吸附在可离子化(中性)LNP上的 E型载脂蛋白质，通过受体介导的内吞作用与(si)RNA特异性递送给肝细胞有关。相比之下，由阳离子脂质和胆固醇，或DOPE组成的阳离子mRNA LNPs，被发现主要针对肺部，在那里它们转染组织驻留的树突状细胞，巨噬细胞和内皮细胞。有趣的是，通过降低脂质与 mRNA的比例，从而降低其脂质成分，kranz 等人发现 DOTMA-DOPE mRNA LNPs 携带负电荷，在脾脏中特异性靶向DCs。这些阴离子mRNA LNPs特异性靶向脾脏的发现，在参与I期黑色素瘤临床试验的患者中得到证实。虽然观察到的位点特异性靶向可能是由于LNP表面电荷，但是不能排除生物分子电晕的作用。因此，对这些不同荷电mRNA LNPs的生物分子电晕进行详细的比较，有助于进一步阐明静脉注射后观察到的器官分布和细胞靶向性变化背后的机制。正如前面所提到的，抗体或其他靶向性蛋白可以被纳入LNP系统，以支持mRNA LNPs的选择性器官处置，或促进特定(免疫)细胞类型受体介导的的吸收。举几个其他的例子，Parhiz 等人证明了离子化的mRNA LNPs与抗血管细胞粘附分子(PECAM-1)的抗体结合，促进了系统递送后肺内内皮细胞mRNA转染。Perche等制备了含有 mRNA的甘露糖化纳米粒子，该纳米粒子可以作为一种主动靶向策略来提高脾树突状细胞的转染率。关于潜在目标受体的更详细的总结和配体结合策略的技术细节，我们还建议读者参阅相关文献。值得注意的是，Dan Peer实验室最近提出了一个模块化的靶向平台，用于将(si) RNA LNPs选择性传递给体内不同的白细胞。在这里，LNP系统中脂蛋白通过非共价连接与靶抗体Fc区域结合。然而，应该注意的是，将靶向配体附加到 LNP系统复合物外层，增加了合成步骤、成本和管理障碍。此外，这种功能化的纳米粒子的靶向能力可以被内源蛋白质的沉积和纳米粒子的迁移和清除所取代。因此，利用这些靶向基因片段进行特异性 mRNA方法的潜在临床效益应该权衡成本的复杂性。mRNA自佐剂效应I型IFN对mRNA疫苗免疫原性的作用是双重的。很多研究揭示mRNA LNPs触发CTL反应强度的能力取决于I型IFN的产生。2篇文章显示静脉注射未修饰mRNA LNPs引发I型 IFN迅速和系统性产生，其可参与选择性靶向DC和巨噬细胞，以及TLR7通路的活化。基因敲除IFN-α受体1或TLR7受体小鼠实验表明由mRNA LNPs引发的系统性I型 IFN对于APCs和效应细胞的活化起到关键作用。当肺转移模式小鼠静脉注射mRNA LNPs同时腹腔注射抗IFNAR1抗体时，其抗肿瘤效果明显减弱。通过本研究组和其他实验室对比实验发现核酸修饰mRNA LNPs较未修饰mRNA LNPs翻译能力提高，但由于I型IFN产生大幅降低，从而无法成功诱发CTL反应。I型IFN对诱发效应T细胞反应具有巨大作用，而其他文章显示早期I型 IFN的产生抑制抗原编码mRNA的表达，这对mRNA疫苗的效果是相当不利的。De Beuckelaer和其同事表明B16黑色素瘤模型经皮下或皮内注射DOTAP-DOPE mRNA LNPs，其诱发CTL抗肿瘤免疫的效果在I型IFN阻断后明显增强。对于自扩增mRNA LNPs疫苗，Pepini等人报道在IFN-α/β缺失时，抗原表达明显增强，这与免疫原性和IgG抗体反应增强有关。另外，核酸修饰mRNA较未修饰mRNA高强度和持续的抗原表达与更优化的抗体反应有关。很明显，这提出了一个基本问题，如何处理mRNA疫苗的自我佐剂作用。一般来说，急性I型IFN介导天然免疫细胞和适应性免疫细胞的多向性和促炎症效应。事实上，I型 IFN信号诱导DC成熟，改善抗原的加工和呈递，增强DC迁移到丰富的T细胞区(例如，通过CCR7)。重要的是，I型IFN直接作为信号3细胞因子用于T细胞活化，促进克隆扩增，存活和CTL以及T辅助细胞的效应分化。在体液免疫中，I型IFN通过间接增强辅助性T细胞反应和对B细胞的直接免疫刺激作用，促进产生长期抗体反应。通过调节其他促炎细胞因子，I型 IFN还参与调节其他免疫细胞类型，如自然杀伤细胞(NK)反应。在持续性病毒感染过程中，我们可以从I型IFN的有害角色中学到经验教训。在这里，研究发现I型IFN通路的慢性激活导致调节性DCs 的产生以及病毒特异性B细胞的缺失和 T细胞反应的强烈削弱。在一篇观点文章中，De Beuckelaer 等人提出，mRNA疫苗I型 IFN反应对初始性T细胞有双重影响，这取决于I型IFN信号和T细胞启动的持续时间和相对时间。如果I型IFN是在T细胞识别MHC呈递的抗原后产生的，它们作为一种3型信号细胞因子刺激T细胞的激活和增殖。通过对比，在不同的时间段，APC和T细胞之间的相互作用被延迟甚至消失时，I型 IFN有完全相反的作用: 它们不是刺激T细胞，而是激活一个抗增殖和促凋亡的程序。这也许可以解释为什么由mRNA疫苗诱导的早期I型IFN反应，可能不仅限制 mRNA编码的抗原表达，甚至对T细胞反应产生有害影响。I型IFN参与调节免疫耐受，可以促进自我反应B细胞和T细胞的发育，这是一个更大的威胁。这会导致严重的自身免疫后果，比如系统性红斑狼疮和糖尿病。随着不同mRNA疫苗临床结果的首次发表，我们对它们在人类中的疗效和潜在副作用有了更多的了解。虽然病人的数量仍然有限，Pardi 等人指出，临床测试的 mRNA疫苗的一些观察到的副作用可能仍不全面，包括自身免疫性疾病的潜在风险。在一个非小细胞肺癌(NSCLC)的RNactive疫苗 I/IIa期临床试验中，经过5次皮内注射(剂量400-1600g) ，发现自身免疫的常见诊断指标升高到20%。另一项研究测试了RNactive平台用于狂犬病预防性疫苗的安全性和免疫原性，在第二次肌肉注射最高剂量640ug (1/37名患者)后一周，引起了中等程度的贝尔氏麻痹。这是暂时性的颜面神经麻痹，与自身免疫有关。I型IFN信号在有效性和安全性方面的复杂性，如何通过 mRNA疫苗的设计解决，需要进一步的研究。然而，毫无疑问，不同的 mRNA疫苗，不同的mRNA设计，不同的制备工艺和给药途径，将表现出不同的mRNA表达动力学和天然免疫激活细胞特异性。因此，这些 mRNA疫苗参数的改变，将会影响I型 IFN 信号对 mRNA疫苗结果的作用，从而决定它是好的，坏的，还是烦人的。诱导抗体反应和CTL反应需要在翻译效果和mRNA疫苗I型IFN活性方面做出权衡，这也许可以解释为什么未经修饰的mRNA疫苗更适合诱导CTL反应，而核苷修饰的 mRNA疫苗能检测出更好的抗体反应。尽管如此，可以肯定的是mRNA疫苗可以获得高滴度和持续表达的抗原，将有利于T细胞和B细胞反应的幅度和持续时间。令人兴奋的是，新的成像工具已经应用于新型mRNA传递系统的评价，这种系统在单细胞和组织水平上使mRNA药理学可视化，包括转基因报告小鼠品系的产生，如IFN-β报告小鼠和Cre 重组酶(mRNA)报告小鼠，以及高分辨率检测 mRNA的荧光成像mRNA探针的开发。为了举出一个突出的例子，Santan-gelo 实验室将荧光标记的 mRNA传递和基于近距离的检测结合起来。因此，小鼠肌肉递送裸mRNA或者LNP修饰mRNA时，他们能够同时检测细胞特异性摄取，转化和TLR7，RIG-I，MDA5通路的原位激活。这些实时跟踪mRNA活性的不同工具，将非常有助于确定不同 mRNA疫苗平台之间的差异，以及免疫途径的比较。结合免疫读数和彻底的安全性评估，这将有助于开发更有效和安全的mRNA疫苗。I型 IFN反应以外考虑到抗mRNA I型IFN反应的两面性，我们假设将mRNA疫苗的翻译和I型 IFN活性之间的联系解除，并用另一种更可控的免疫激活来代替I型 IFN反应将是有益的。 这种策略为mRNA的结构优化为高翻译容量提供自由，例如，使用核苷修饰的 mRNA，同时选择一个“更聪明的”免疫佐剂: 一个不干扰 mRNA翻译过程，能提供有效但可控的免疫反应。在一项概念验证研究中，我们证明核苷修饰mRNA可以与临床批准的TLR4激动剂 MPLA共同递送，实现像未修饰的 mRNA一样的功能性 CTL反应，但却明显降低I型 IFN反应。此外，我们还优化了一个新的 mRNA LNP平台，该平台结合了核苷修饰的 mRNA和天然杀伤T(NKT)细胞配体α-半乳糖神经酰胺(mrna galsomes)的体内递送，称为mRNA Galsomes。在I型 IFN诱导LNP工艺mRNA和裸mRNA小鼠中，通过传统T细胞和NKT细胞的双重“抗原”信号，mRNA Galsomes能够诱导肿瘤内较高的抗原特异性CTLs、 NKT和 NK细胞细胞流，并且能够降低免疫抑制性骨髓细胞的存在。除了用更可控的免疫刺激来替代I型 IFN反应之外，在免疫疗法的框架内还开发了特异性的策略，避免I型 IFN反应以确保高蛋白表达，这是有益的。适应性免疫细胞重新启动的第一个替代方法，是利用直接编码不同抗体形式的mRNA，包括单克隆抗体、抗体片段或双特异性抗体来探索被动免疫。由于肝脏是系统递送后许多制剂的主要靶点，这个器官被用作mRNA编码蛋白制备和分泌的生物工厂。举两个例子，Thran 等人评估了序列设计mRNA 编码预防性或治疗性抗体LNP配方。这可以预防狂犬病毒感染、肉毒杆菌中毒和肿瘤。Stadler 等人设计了编码针对 T细胞受体相关CD3分子和肿瘤抗原的双特异性抗体的mRNA，被称为RiboMABs。这个 mRNA平台作为经典mRNA癌症疫苗的有效替代品，提供了一个能够消除小鼠肿瘤的T细胞强有力的浸润。另一种方法是直接将mRNA编码免疫调节分子递送到肿瘤部位，如细胞因子和共刺激分子。Breckpot和同事证明瘤内注射TriMix mRNA（CD40L,caTLR4和CD70）或使用编码含有IFN-β和TGF-β受体II的胞外结构域的融合因子的 mRNA，DC进行重新编程。与此相一致，Moderna Therapeutics 最近发表了一篇关于抗癌免疫治疗的文章，使用直接瘤内和LNP介导的mRNA编码的IL-23，IL-36γ，和OX40(L)配体的混合物递送。通过这些免疫调节分子的局部表达，这种策略能够打破DC免疫耐受，并激活肿瘤特异性T细胞反应。而且，Van Hoecke 等人的研究表明，通过肿瘤内电穿孔编码含有混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL) mRNA，已经确定可以将肿瘤转化成原位疫苗。事实上，MLKL的表达引起了一种免疫原性细胞死亡，称为坏死症，它促使肿瘤特异性抗原的释放和诱发抗肿瘤反应DAMP的形成。mRNA疫苗和免疫检查点组合对于mRNA治疗癌症或肿瘤疫苗来说，仅仅激活效应免疫是不够的，对于影响免疫激活的几个免疫抑制机制也应该重视。在T细胞的激活过程中，检查点分子的表达形成了一个强大的负反馈回路，使T细胞的反应保持在理想的生理范围内。总的来说，免疫系统应该能够迅速地对失控或潜在的危险做出反应，但同时也应该建立一个平衡来维持免疫的稳态。多项研究表明，mRNA癌症疫苗上调了效应T细胞检查点分子程序性死亡1(PD-1)及其配体(PD-L1)在肿瘤细胞和 APCs 上的表达。值得注意的是，PD-1/PD-L1检查点通路的上调主要由IFN-γ介导，也可由I型 IFN诱导。因此，出现了mRNA疫苗和PD-1检查点抑制剂结合治疗的机会。事实上，临床前的大量证据表明，与抗PD-1(L)、抗CTLA-4抗体等检查点抑制剂相结合，可以强化 mRNA治疗引起的 T细胞反应和抗肿瘤作用。这也在为数众多的I/IIb临床试验中进行测试，这些试验或在进行中，或在招募患者中，用以测试mRNA疫苗结合检查点抑制物治疗不同癌症适应症的效果。在单一疗法中，检查点抑制剂对高度难治性和晚期癌症患者，如转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)的疗效和耐受性令人印象深刻。然而，只有一部分病人受益于这些检查点疗法。因此，建立能够提高检查点抑制剂反应的有效联合疗法是一个需要强化研究的领域。尽管一些 mRNA癌症疫苗在获得客观的临床反应之前已经失败，但这些mRNA平台与检查点抑制剂的结合可能是一种有价值的途径(i)，确保诱导的抗肿瘤免疫的持久性和持续有效性，(ii)促成T细胞炎症肿瘤表型，使更多的患者对检查点抑制疗法适用。总结与展望从最早发表的mRNA体内递送文献开始，核酸成为了万能和充满希望的疫苗形式。本篇综述指出并分析了决定mRNA疫苗取得成功的2个关键因素。首先，应确保体内存在足够数量的mRNA胞内递送，尤其是靶向体内APCs。近几年来，mRNA在体内行为方面的大量知识空白已得到填补。包括裸mRNA递送或纳米颗粒递送，以及经过各种免疫途径的免疫。如今，使用脂纳米颗粒用于局部和系统递送mRNA已成为趋势。我们讨论了LNPs设计需完成的多指标任务，整体mRNA转染率取决于穿越胞外胞内壁垒的不同需求，然而需要采取预防措施，防止潜在的纳米粒子入侵(免疫)毒性。如果要将这些mRNA LNP应用于临床，满足药物和注册产品的要求也是至关重要的，从GMP条件下的规模生产，以及产品的质量控制，稳定性测试，以及临床前阶段在相关动物模型中良好安全性和有效性的评估。值得注意的是，FDA和EMA 第一次批准 siRNA治疗(OnpattroTM) ，利用可离子化LNP技术辅助亲本siRNA注射，这将为未来 mRNA疫苗的使用开创先河。另一个难以找到的平衡点是 mRNA编码的抗原表达和足够的免疫刺激之间的平衡。这两个参数对疫苗的研制至关重要，但它们都与 mRNA分子本身的结构特性有关。更具体地说，虽然 mRNA诱导的I型 IFN反应可能会增加mRNA疫苗的免疫原性，但它同样会干扰 mRNA编码的抗原表达，甚至可能导致有害的免疫效果。基础研究应该进一步关注如何控制 mRNA疫苗的 I型 IFN活性，这可能取决于 mRNA的工艺、给药途径、个体病人和预期的治疗应用。 因此，不必须依赖于 mRNA自佐剂效应的方法正在兴起，例如用更可控的佐剂系统替代I型 IFN反应，或者使用 mRNA被动免疫接种方法。这些新策略是否比“传统的” mRNA疫苗更有益，这是一个值得进一步探讨的话题。不同的生物技术公司将 mRNA疗法应用于临床实践，这是令人兴奋的时刻。 在不久的将来，针对突变衍生表位(新抗原)的 mRNA癌症疫苗可能成为其他临床领先癌症疫苗的有吸引力的替代品，例如那些由合成(长)肽和免疫佐剂组成的疫苗。 在这里，可以预期的是，未来的临床试验检测(个体化)mRNA疫苗和检查点抑制剂的组合将更有机会成功，然而，这种组合疗法的安全性和优化将是另一个研究课题。对于预防感染性疾病的mRNA疫苗，(在非人灵长类动物)临床前研究表明，mRNA疫苗接种是可行的，通常具有良好的耐受性，并且可能比其他传统的疫苗方法更具优势。 然而，在病人对 mRNA疫苗的反应方面，还需要更广泛的临床经验，包括更多的比较研究，以选择最适合的mRNA平台和给药途径，以及相对于其他疫苗策略，显示明确的治疗优势。总之，我们能够确定哪款mRNA疫苗在人体内能够安全、有效诱发免疫反应是从迟早的事，希望mRNA疫苗能成为新一代疫苗。参考来源：R. Verbeke, et al., Three decades of messenger RNA vaccine development, Nano Today Volume 28, October 2019, 100766

两种基于mRNA的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）疫苗在病毒序列公布约11个月后获得紧急使用授权（EUA），突显了这种核酸技术平台的转化潜力。迄今为止，大多数mRNA的临床应用都集中在传染病和癌症疫苗上，由于某些mRNA种类和配方固有的免疫刺激特性，因此低剂量、低蛋白表达和局部传递也可能有效。此外，关于mRNA编码蛋白或细胞免疫疗法的研究工作也已开始进行，但由于需要最小的免疫刺激、靶细胞和组织中的高蛋白表达以及重复给药，导致了临床转化上制造与配方的挑战。在这一势头的基础上，去年mRNA技术在COVID-19疫苗、Omicron特异性加强针和季节性流感疫苗、Epstein-Barr病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）和癌症疫苗方面取得了临床进展。在此，我们回顾了mRNA治疗的临床进展，并对这些基于mRNA的药物背后的转化技术进行了概述和展望。­­随着两种针对COVID-19的mRNA疫苗：Comirnity（BNT162b2）和Spikevax（mRNA-1273）的全面批准，mRNA的医学前景终于实现。2020年3月16日，在2020年1月11日公布病毒序列后的几周内，Moderna的mRNA-1273（针对SARS-CoV-2 spike（s）蛋白的几种mRNA疫苗之一）首次给人类志愿者注射。这一显著成就得益于近十年来感染性疾病和癌症mRNA疫苗的临床经验（见图1）。图1   2020年抗SARS-CoV-2 mRNA疫苗快速发展的时间线1990年，Wolff等人证明了在小鼠中肌肉注射（i.m.）mRNA可产生靶蛋白，首次在体内验证了使用mRNA编码蛋白质用于疫苗接种或蛋白质替代的概念。然而，这项技术的前景经过几十年的临床验证后才得以实现，部分原因是由于mRNA稳定性和传递方面的技术瓶颈，以及2000年期间研究重点、资金投入和行业重点向DNA疫苗的暂时转移。与此同时，mRNA作为疫苗的潜在优势（设计和测试的容易性和速度、固有免疫原性、快速扩大和制造以及插入突变的风险可忽略不计）使得少数学者继续对这种单链核酸展开研究。­­­mRNA技术的一个特别重要的优势来自其作为蛋白质翻译模板的生物学作用。传统疫苗技术依赖于在生物反应器中使用哺乳动物细胞或鸡胚批量生产疫苗，而mRNA疫苗只在患者细胞内一次转化为最终产物。事实上，mRNA利用人体作为自己的疫苗生产设施，具有一些附带的优势。首先，它允许人类对蛋白质产品进行翻译后修饰（PTM），具有降低免疫原性和完整功能的潜力。其次，不适合在生物反应器中生产的多聚体蛋白质可以在患者细胞中正确翻译、折叠和组装（例如，Moderna为研究性巨细胞病毒（CMV）疫苗（mRNA-1647）设计了五种mRNA混合物，产生五聚体蛋白）。第三，mRNA疗法可以产生跨膜和细胞内蛋白质，并将其运输到细胞环境中的适当位置。­与基于病毒载体的方式相比，mRNA还降低了针对载体的预先存在的抗体或产生给药后抗体的可能性（会降低后续给药的疗效）。尽管临床前模型中观察到了RNA纳米制剂的抗载体抗体，但已开发出消除这些反应的方法，使重复给药不会降低疗效。当然，也有一些成功的重复人体给药和重复人体给药相关短干扰 RNA 纳米制剂的例子。与其他药物类似，mRNA的剂量可以很容易地上下调整，间隔更长或更短，具体取决于个体患者的需要、体重和疾病状态。此外，作用的持续时间本质上是有限的，从而降低了不可逆副作用的可能性并能够治疗急性适应症；由于mRNA降解受正常细胞过程的调节，因此可以通过对分子和递送方法的修饰来调节体内半衰期。­mRNA作为医疗产品mRNA药物分为三个基本类别：预防性疫苗、治疗性疫苗和蛋白质编码疗法。尽管每个应用程序都有其独特的挑战，但所有应用程序都面临一个共同的挑战，即在保持mRNA稳定性的同时，需要将mRNA部分在细胞内输送到靶细胞。RNA本质上是一种不稳定的分子，早期将mRNA药物的概念转变为现实的许多工作都集中在稳定性上。为此使用了各种技术，包括优化5′帽结构和3′聚（A）尾长度，以及5′和3′非翻译区域内的调节元件。除了在改善mRNA稳定性方面取得的进展，有效的体内mRNA药物还需要高效的细胞内传递。研究探索了将mRNA浓缩成纳米制剂，逐渐集中于脂质制剂以实现传递。典型的脂质纳米颗粒（LNP）配方由（1）与聚阴离子RNA相互作用的可电离或阳离子脂质组成，（2） 一种辅助磷脂（例如，1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）），类似于细胞膜中的脂质并支持双层结构（3） 一种胆固醇类似物，用于调节脂质双层的流动性和（4） 聚乙二醇（PEG）-改善胶体稳定性和减少调理作用的脂质（图2）。图2   mRNA递送纳米颗粒的组成尽管在临床上远不如LNP先进，但聚合物纳米颗粒（PNP）也显示出作为输送系统的前景。这些配方通常由可生物降解的含胺聚合物组成，可与RNA自组装。根据应用情况，PNP也可与辅助磷脂、胆固醇和PEG脂质调配（图2）。LNP和PNP都可以用特定配体进一步修饰，以促进细胞特异性靶向。正在开发的非病毒载体制剂的具体成分差异很大，可能对细胞内传递的效率、纳米粒子-mRNA复合物靶向的细胞类型以及所给mRNA药物的免疫原性产生重大影响。­­在需要时激发适当的免疫原性（疫苗）或为其他适应症（mRNA蛋白替代疗法）而逃避它是制造和配制mRNA药物时需要考虑的一个重要方面。RNA作为RNA病毒的遗传物质或DNA病毒复制的副产品，可以对先天免疫系统产生强大的刺激。微生物RNA具有许多结构和序列特征，这些特征将其与宿主细胞中模式识别受体可以识别的自身RNA区分开来。模式识别受体的两个系统通过产生I型干扰素（IFN）和炎性细胞因子来协调适当的免疫反应：第一个是Toll样受体（TLR）系统，位于上皮细胞和免疫细胞（包括DC，单核细胞和巨噬细胞）的质膜、内体和溶酶体中；第二种是视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体，位于大多数细胞的胞浆中。TLR3由双链RNA（dsRNA）激活，而TLR7和TLR8由单链RNA激活。RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）在胞浆中分别被5′-三磷酸化短（18–19 bp）dsRNA和长（>1000 bp）dsRNA差异激活。TLR3激活导致通过含TIR结构域的适配器分子1（TICAM-1）途径产生I型IFN，而其他TLR使用MYD88依赖性级联，导致核因子（NF）-κB依赖性或IFN调节转录因子（IRF）3依赖性产生促炎性细胞因子。这些途径被mRNA产物及其传递载体激活的程度在很大程度上取决于应用，是mRNA药物开发的一个关键方面。­­­mRNA的生物医学应用前景继续快速发展。下面，我们将分三个方面进行讨论：直接体内注射用于预防传染病疫苗的mRNA（表1）、治疗性癌症的mRNA疫苗（表2）和mRNA编码的免疫疗法（表3）。表1   过去和正在进行的感染性疾病mRNA疫苗II期或III期临床研究总结表2   过去和正在进行的仅用于癌症II期或III期的mRNA疫苗临床研究总结表3   过去和正在进行的mRNA用于蛋白质替代应用的II期或III期临床研究总结传染病疫苗在美国食品和药物管理局（FDA）批准COVID-19疫苗后，mRNA现在被认为是传染病中潜在的转化疫苗形式（表1），针对SARS-CoV-2以外病原体的mRNA疫苗的进一步验证十分迫切。­mRNA分子固有的免疫刺激性质和作为免疫佐剂的功能被视为疫苗应用的关键优势，但将这些特性转化为一种安全有效的临床产品面临着平衡免疫刺激与编码抗原表达之间的挑战。迄今为止，临床上最先进的产品是具有化学修饰和未修饰核苷酸碱基的非复制性mRNA疫苗。辉瑞生物科技公司的BNT162b2和摩德纳的mRNA-1273这两种经批准的mRNA产品，是含有化学修饰的尿嘧啶碱基的疫苗。相比之下，迄今为止，针对COVID-19的未修饰RNA疫苗试验的结果令人失望。尽管最终数据仍有待公布，但CureVac报告称，其未经修饰的CureVac 2019冠状病毒疾病疫苗（CVnCOV）对冠状病毒感染的保护率仅为47%。对于未经修饰的CureVac疫苗与经修饰的疫苗相比的效力较低，学者提出了各种解释。CureVac在试验过程中提出SARS-CoV-2变异情况的变化，而BNT162b2或mRNA-1273的情况并非如此；其他学者注意到，与BNT162b2（30µg）和mRNA-1273（100µg）相比，CureVac使用较低剂量（12µg）（选择为未修饰RNA比修饰RNA更具反应性）可能不足以产生有效的中和抗体反应；另有学者假设，未修饰RNA的翻译效率可能较低，导致表位水平较低。­­­除了上述非复制性mRNA疫苗外，还有几个研究小组也在研究编码RNA依赖性RNA聚合酶的自我扩增结构，这些RNA依赖性RNA聚合酶可以扩增传递的RNA，从而增加抗原蛋白表达。到目前为止，这些药物只完成了早期临床试验。最后一种疫苗的一个潜在缺点是任何mRNA递送技术都必须应对与自我复制mRNA疫苗相关的显着更大的mRNA构建体大小。与重组蛋白疫苗类似，上述所有mRNA疫苗都具有不产生传染性颗粒的优点。因此，与减毒活病毒疫苗或具有复制能力的病毒载体相关的担忧及其恢复为致病形式或导致某种形式的加重疾病的可能性（如在呼吸道合胞病毒（RSV）减毒活疫苗中观察到的）不适用。与DNA疫苗或某些病毒载体相比，mRNA疫苗的另一个主要优点是没有因整合到受体DNA中而导致插入突变的风险。加快发现和开发时间SARS-CoV-2大流行在全球的迅速传播突出了能够快速部署用于人体试验的疫苗技术的重要性。mRNA疫苗的发展速度如此之快，以至于在非人灵长类动物的研究证实通过感染SARS-CoV-2或通过DNA疫苗可以实现保护性免疫之前，首批产品已经进入临床试验。­­图1所示的时间顺序说明了mRNA公司以前所未有的速度转向生产SARS-CoV-2候选疫苗。Pfizer-BioNTech和Moderna两项独立工作的时间线非常相似，表明监管机构从病原体的基因鉴定到EUA的发展轨迹，比典型的疫苗开发时间短11个月或几年。其他mRNA公司也能够以相对快速的方式利用其先前在疫苗开发方面的专业知识。例如，CureVac宣布批准于2020年6月开始CVnCOV的I期临床研究（NCT04449276），并于一年后获得其第II-III试验的中期结果（HERALD，NCT04652102）；2020年11月9日，Arcturus宣布了ARCT-021（NCT04480957）I期研究的中期结果；Sanofi Pasteur–Translate Bio（NCT04798027）、伦敦帝国理工学院（ISRCTN17072692、Eudract 2020-001646-20）和云南华威生物技术（ChiCTR2000034112）都在SARS-CoV-2序列公布后不到一年的时间内将mRNA疫苗用于人体试验。­COVID-19大流行挑战了疫苗开发的传统方法，并为促进mRNA疫苗研究创造了独特的环境。一个关键的区别是公司从生物医学高级研究与发展局和防疫创新联盟获得的大量注资。突发公共卫生事件推动了开发工作的快速发展，并促使制造商找到缩短临床时间的方法（例如，通过并行化系列开发过程的不同部分，尽量减少试点研究和进行最低限度的产品质量发布测试）；相反，针对已建立疫苗的新mRNA技术的广泛验证（正如之前在mRNA疫苗CV7202与灭活菌株疫苗Rabipur的并行评估中所做的那样）被取消了优先级。制造和扩大规模mRNA（和某些类型的DNA）疫苗的许多优点与制造的速度和灵活性有关，而制造的速度和灵活性在很大程度上取决于含有化学成分的体外过程。由于mRNA编码相关免疫原性蛋白，不需要活病毒，因此不需要专门的设施或生物安全实验室。与以鸡胚为基础的疫苗相比，mRNA疫苗不受鸡胚生产能力的限制，允许对鸡蛋过敏的个人进行疫苗接种。在无细胞系统中生产可将细菌污染的风险降至最低，无需生物反应器工艺。所有基于核酸的疫苗（无论是mRNA还是DNA）都编码感兴趣的免疫原，但其特性独立于该免疫原。具有mRNA平台的不同疫苗的制造依赖于相同的化学成分，这意味着，一旦对该平台进行了投资，就可以很容易地适应新的病原体。在为新出现的流行病或季节性疫苗做好准备的情况下，这是一个特别有吸引力的特点。­此外，相同的制造工艺可用于疫苗和其他基于mRNA的药物，提供了效率和灵活性。鉴于在第一代疫苗推出的同时出现了新的SARS-CoV-2株，这种在同一运载工具中切换编码mRNA的灵活性尤其有用。尽管对制造成本没有达成共识，但预计该技术比旧方法更具成本效益。快速的抗原特异性序列优化mRNA技术的另一个优势是能够在引入核酸变化的基础上设计和重新设计抗原，与不同蛋白质或肽的生物工程相比，这是一个相对简单的过程。对于SARS-CoV-2，则主要是以引入脯氨酸的形式将免疫原性S蛋白稳定在融合前结构中。BioNTech应用了这种技术灵活性，将不少于五种不同的COVID-19 mRNA疫苗候选疫苗投入临床（三种使用核苷修饰的mRNA，一种使用含尿苷的mRNA，一种使用自扩增mRNA）。BNT162b1候选疫苗使用核苷修饰的mRNA编码SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域，该结合域通过添加T4原纤维蛋白衍生的foldon三聚体结构域进行修饰，以增加其免疫原性。最终选定的候选基因BNT162b2编码由两个脯氨酸取代修饰的全长S蛋白，以将其锁定在融合前构象中。来自CureVac29、47、Moderna48和Translate Bio49的其他COVID-19 mRNA疫苗也使用经过各种修饰的S蛋白。目前正在开发的几种疫苗至少经历了一个迭代优化步骤，这是mRNA产品开发的一个特点。例如，针对RSV的mRNA-1777在一期试验中进行了测试，临时数据显示，单次给药后通过中和抗体水平测定的体液免疫反应。然而，这种药物的开发已经暂停，转而支持mRNA-1172，在动物模型中，它被证明比mRNA-1777更有效。类似地，寨卡病毒疫苗候选基因mRNA-1325（NCT03014089）的开发也被暂停，取而代之的是mRNA-1893，该基因使用了不同的序列，据报道在非人灵长类动物研究中的效力是mRNA-1325的20倍。截至2020年2月，90名黄病毒血清阳性和血清阴性的参与者接受了mRNA-1893或安慰剂的给药方案，两次给药间隔1个月，剂量分别为10、30和100µg（NCT04064905）。编码多种蛋白质和/或蛋白质亚单位­­对于SARS-CoV-2，S蛋白免疫原是同源三聚体，因此只需引入单个mRNA序列。对于主要免疫原由多个亚单位组成的病原体，生产重组蛋白亚单位并以正确的化学计量将其成功重组为完整蛋白质的挑战很容易想象。相比之下，mRNA很容易用于此应用。单独的亚单位可以编码在单个长mRNA中，也可以作为单独的mRNA链。例如，针对CMV的疫苗mRNA-1647包含六种mRNA，其中五种编码五种不同的蛋白质，结合形成五聚体蛋白质，第六种编码CMV糖蛋白B（gB）蛋白质。在一种相关的方法中，单一疫苗可以针对两种不同的病原体，如mRNA-1653，它结合了两种mRNA，针对人类偏肺病毒（hMPV）和副流感病毒3型（PIV3）的F蛋白。调节mRNA免疫原性除了反复优化序列以优化抗原的免疫原性外，还可以利用完整mRNA转录本本身和其制造过程中产生的其他RNA产物的固有免疫原性来增强对mRNA疫苗的免疫应答。RNA的先天潜在免疫原性在疫苗接种中可能是有利的，因为它可以激活免疫反应途径，如TLR系统，从而导致DC成熟，随后产生强大的B和T细胞免疫反应。如前所述，CureVac的CVnCoV具有未经修改的mRNA。然而，这种RNA驱动的免疫抑制也可能是有害的，导致临床副作用以及相关蛋白的表达减少。例如，RNA依赖性蛋白激酶R（PKR）的激活与翻译抑制有关。­­近年来，学界在如何调节体外转录mRNA免疫原性方面取得了进展。调节mRNA免疫原性的主要方法之一是用化学修饰的核苷酸替代未修饰的核苷酸。Kariko、Weissman及其同事的研究报告称，某些核苷修饰，如假尿苷和5-甲基胞苷，显著降低TLR信号传导和PKR激活，导致小鼠中蛋白质表达水平增加。值得注意的是，BioNTech和Moderna批准的COVID-19 mRNA疫苗（BNT162b2和mRNA-1273）均以尿苷被N1甲基假尿苷完全替代为特征。然而，与带有修饰核苷的mRNA相比，其他人随后证明，未修饰核苷的掺入实际上会导致HeLa细胞中蛋白质表达水平较高，而在小鼠的肝脏中表达水平相似。我们假设，mRNA纯化的改进和RNA污染物的去除可能部分解释了这些与早期工作的差异。通过柱纯化（高压液相色谱（HPLC）或快速蛋白质液相色谱）去除dsRNA，以及最近通过较便宜的过滤结合技术去除dsRNA，可显著提高翻译效率。CureVac的研究人员报告，HPLC纯化、序列优化、未修饰的核苷mRNA没有免疫原性，在小鼠体内产生的蛋白质表达水平高于化学修饰的核苷mRNA。最近， Genentech的科学家报道，白细胞介素（IL）-1β和白细胞介素-1受体激动剂（IL-1RA）是控制系统对mRNA反应的关键调节因子，表明小鼠体内这些调节因子之间的差异，灵长类动物和人类可以解释观察到的尿苷修饰和未修饰mRNA在这些物种体内的反应性差异。­­­­­­­用于 mRNA 递送的纳米制剂尽管早期的mRNA疫苗交付工作主要集中在裸mRNA或鱼精蛋白的使用上，但mRNA疫苗开发的最新趋势集中在mRNA交付的LNP上。早期狂犬病疫苗（CV7201）是用鱼精蛋白配制的，但由于免疫原性水平似乎严重依赖于疫苗接种方法，只有无针系统在皮内（i.d.）给药（NCT02241135）后才能提供所需的免疫反应，因此研发被中断；该产品的开发被暂停，以支持LNP配方的候选疫苗CV7202（NCT03713086）。在其他地方，结合TriMix（三种编码组成性活化TLR4、CD40配体和CD70的mRNA物种的混合物，所有这些都是免疫刺激分子）和HIV免疫原的裸mRNA试剂（iHIVARNA-01）在三次血管内注射（NCT02413645）后对HIV患者的安全性和有效性进行了评估；然而，由于缺乏免疫原性，这项研究已经中止（NCT02888756）。­目前，临床上大多数mRNA药物都使用LNP进行递送。FDA批准的第一种基于RNA的寡核苷酸药物（patisiran，一种用于治疗遗传性转甲状腺素（TTR）介导的淀粉样变性多发性神经病的短干扰RNA药物）是一种LNP制剂，包含可电离脂质d-Lin-MC3-DMA（MC3）和DSPC，胆固醇和1,2-二甲基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（PEG2000-DMG）。BioNTech 的COVID-19疫苗BNT162b2是使用（（4-羟基丁基）氮杂二烯基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）（ALC-0315）、2-（PEG）-2000）-N，N-二贸易酰乙酰胺（ALC-0159）、DSPC和胆固醇配制而成的。看来，在确定进入临床试验的速度方面，识别、测试和生产合适的脂质制剂可能很重要。例如，mRNA-1273使用与mRNA-1647（CMV病毒疫苗）和mRNA-1653（hMPV–PIV3病毒疫苗）相同的LNP，已经建立了一些临床和监管先例（表1）。­­LNP制剂的组合物可显著影响细胞内递送效率，确定递送的细胞特异性并调节免疫原性。尽管所有脂质成分对LNP的功能都很重要，但LNP的可电离脂质成分在RNA传递的多个方面起着关键作用，包括颗粒形成、细胞摄取和内体逃逸，因此受到了广泛关注。在LNP配方中发现的可电离脂质的结构多样性很大，为了促进可电离脂质的快速合成和评估，已经开发了用于合成大型新脂质库并在体内对其进行评估的组合、高通量方法。能够在体内传递mRNA的有效可电离脂质的列表继续扩大，通过引入生物可降解链接，传递载体的效力和耐受性都有所提高。虽然脂质发展的最新趋势集中于加入水解键以促进清除，但这些可降解键可能会影响配方稳定性，这仍然是LNP配方的一个挑战。mRNA LNP冻干的进展似乎有可能改善配方稳定性，但对于低剂量应用（例如疫苗），抗水解脂质可能证明是有利的。­­­­­­除了系统输送的RNA纳米粒外，其他RNA应用模式也有可能为神经系统、眼睛、心脏和肺提供治疗。特别值得注意的是，基于生物可降解聚合物和低聚聚合物以及脂质的纳米制剂已经开发出来，以便于通过雾化输送到肺上皮。例如，囊性纤维化患者反复服用MRT5005，MRT5005是一种LNP配方mRNA的雾化制剂，编码囊性纤维化跨膜调节蛋白（NCT03375047）。­储存和运输与配方相关的一个重要方面是储存和运输条件。2014-2016年埃博拉疫情期间，维持疫苗冷链运输和储存的挑战凸显出来，当时基于减毒重组水泡性口炎病毒（2019年批准为Ervebo）的研究疫苗必须储存在−80°C至−60°C，这在非洲最需要疫苗的地区并不总是可行的。COVID-19影响所有大陆；从全球应急准备的角度来看，当务之急是数百万剂可以在全球范围内，跨越一系列极端温度，运往医疗保健基础设施标准迥异的国家。据报道，CureVac的CVnCoV在标准冰箱温度+5°C（+41°F）下储存至少3个月，在室温下储存最多24小时，在规定的规格范围内保持稳定。Moderna的mRNA-1273在−20°C，最多6个月，在制冷条件下最多30天，在室温下最多12小时。相比之下，BioNTech的疫苗最初需要储存在−70°C时，BioNTech的合作伙伴辉瑞公司开发了含有干冰的特定装运箱，以便于物流配送。随后，申办方提交了额外信息，支持在标准冷冻柜温度下最多储存2周。­­第一次人体试验通常只涉及有限数量的参与者和临床试验地点，有时使用不太理想的配方进行，改善储存条件的开发与临床计划并行进行。例如，摩德纳的mRNA-1647是一种CMV候选疫苗，在I期研究中作为冷冻液体配方提供，但在II期研究中作为冻干配方提供，在冷藏温度下稳定18个月。­­­靶向CMV磷蛋白65 T抗原的mRNA-1443突出了运输、储存和稳定性考虑的重要性。这在与mRNA-1647相同的试验中进行了评估，但2018年8月，mRNA-1443的临床材料在储存1年后未达到内部规范，随后被临床封存。这种疫苗的研制似乎已经暂停。将配方转变为干粉形式是许多药品运输和长期储存最常用的方法之一。然而，冻干过程中结晶和真空脱水产生的应力可能会降低大分子或LNP的稳定性，导致活性损失。据报道，添加适当的低温保护剂，如海藻糖、蔗糖和甘露醇，可以在特定配方的甘露醇中保持LNP的稳定性。辉瑞已经启动了一项III期研究，以比较冻干BNT162b2配方与其冷冻液体BNT162b2配方（NCT04816669）的安全性和耐受性。­给药途径尽管已批准的SARS-CoV-2 mRNA疫苗采用i.m.给药，但对于最佳给药途径尚未达成共识。大流行性流感疫苗的全球推广理想的支持方式是采用低技术的给药途径­只需对众多被要求接种疫苗的医疗保健提供者进行少量培训。通过腹腔注射给药BTN162b2、CVnCoV、ARCT-021和mRNA-1273。伦敦帝国理工学院的一个研究小组正在考虑研究他们吸入后自我扩增mRNA的COVID-19疫苗，类似于对季节性流感所做的研究。吸入疫苗或鼻内疫苗可引起细胞和体液反应，这些反应在中和传染性呼吸道病毒（如SARS-CoV-2）方面特别有效；然而，鼻内mRNA疫苗的研究仅限于临床前动物模型，进一步开发LNP载体可能需要有效靶向上呼吸道的适当细胞类型。­­在更广泛的mRNA领域，i.d.和i.m.注射都用于评估候选疫苗，有时用于同一研究中的同一疫苗。这两种给药途径在免疫原性和耐受性方面可能产生不同的结果。针对H10N8流感毒株的血凝素（HA）蛋白的mRNA-1440（VAL-506440）在健康志愿者（NCT03076385）的一期研究中进行了测试，使用i.m.（25–400µg）和i.d.给药（25–50µg）路线。­­­­与i.m.途径相比，i.d.途径引起的注射部位反应更多，因此没有进行研究，即使在25μg时，它似乎比i.m.途径更具免疫原性。三名接种400µg i.m.疫苗的参与者中有两名经历了头痛和红斑等严重不良反应，安全委员会停止了在此水平下的进一步给药。如我们所见，狂犬病疫苗CV7201仅在通过无针系统注射时才引发免疫反应，这是针对i.m.和i.d.途径（NCT02241135）的。联合国注射了早期HIV疫苗（iHIVARNA-01），但这似乎是唯一的此类研究。目前，注射i.m.似乎是最广泛使用的传染病mRNA疫苗给药途径，与蛋白质和DNA疫苗的情况相同。­给药方案理想的给药方案，尤其是对于全球预防，是单次给药，给药后不久100%血清转化。但由于增强免疫力的现象，大多数给药方案包括至少两次注射，通常间隔几周。SARS-CoV-2 mRNA疫苗也是如此：BNT162b2分两次注射，间隔21天；对于CvnCOv和mRNA-1273，在初始注射4周后进行强化注射。BNT162b2和mRNA-1273获得了各自给药方案的EUA。然而，由于早期疫苗短缺和单次注射后观察到的部分保护，一些人主张免疫更大的人群使用单剂量，而不是为第二次注射保留部分供应，或将注射间隔的时间长于关键临床试验的研究。一项针对80岁以上成年人的小型试验数据表明，两次BNT162b剂量间隔约3个月而非3周，可提高抗体生成峰值，而有关细胞免疫的结果则不太清楚。与此同时，公众越来越认识到，第三次（助推器）射击是为了实现最佳控制。最近的数据显示，疫苗的有效性在6个月后略有下降以及新毒株变体的出现，为这个问题注入了新的紧迫感。­­­自扩增mRNA疫苗，如ARC-021和BNT162c2，打算作为单剂量给予。还描述了更为详细的治疗方案。例如，在I期研究（NCT03382405）中，对健康志愿者施用针对CMV的mRNA-1647，健康志愿者在第0、2和6个月接受了三剂30、90、180或300µg mRNA-1647或安慰剂。RSV疫苗mRNA-1345作为三剂注射方案（间隔2个月）正在一项I期研究（NCT04258719）中进行研究，该方案现已作为单剂方案进入III期。­尽管在技术和抗原选择上有相似之处，但正在研制的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的剂量范围很广。正如基于该技术所预期的那样，自扩增mRNA疫苗每剂使用的量较小：帝国理工学院自扩增mRNA 2019冠状病毒疾病疫苗正在以0.1至1μg的剂量进行试验。ARCT-021在1至10μg的剂量下进行了单次剂量试验，并采用了prime-boost方案；7.5μg的剂量将用于进一步开发。BNT162b2和mRNA-1273分别在30μg和100μg剂量下成功预防了约95%的COVID-19病例。CVnCOV正在进行III期试验，剂量为12μg（NCT04652102）。在SARS-CoV-2领域之外，剂量范围同样广泛。在不同的疫苗中，研究的剂量水平为300倍，从1μg（CV7202）到300μg（mRNA-1653和mRNA-1657）。给药剂量和方案，以及mRNA疫苗的储存物流，对全球免疫计划有着巨大的影响：最具影响力的COVID-19疫苗或针对未来大流行病毒的疫苗可能不是第一个接受EUA的疫苗，而是第一个生产数百万剂并将其有效交付服务点的疫苗。­­作为佐剂的作用如上所述，RNA可以具有固有的免疫激活特性。作为通过天然RNA感应进行免疫刺激的补充或替代，一些研究小组已经在疫苗中添加了刺激分子，以增强对编码抗原的免疫反应，并取得了不同程度的成功。例如，CureVac使用CV8102，一种与阳离子肽载体复合的非编码无盖单链RNA，以增强狂犬病疫苗的免疫原性。CureVac的RNActive疫苗技术平台是之前提到的已停产CV7201疫苗的基础，它依赖于一种双组分mRNA疫苗，其中裸mRNA用于抗原表达，而与鱼精蛋白复合的相同mRNA用作激活TLR7和TLR8信号-ING的佐剂。然后，刺激TLR信号通路导致DC激活，作为鱼精蛋白复合物天然免疫反应的一部分。另一种产品，iHAVARNA-01，结合了编码TriMix的DC激活mRNA物种和编码HIV免疫原的mRNA（来自HIV-1分支A的普遍Gag蛋白和一系列CD8+T细胞表位）。然而，在mRNA疫苗中使用佐剂似乎是一个例外；BNT162b2和mRNA-1273都只依赖mRNA-LNP配方，不使用佐剂，大多数公司在临床上开发mRNA疫苗都遵循无佐剂的方法。这可能是因为LNP成分本身刺激免疫系统的特定元件，如IFN-γ（STING）途径的刺激因子和先天免疫反应的TLR-RIG-I样受体（RLR）-非依赖性介质。纳米制剂既能将mRNA传递到适当的细胞靶点，又能通过设计选择性刺激免疫系统，这是mRNA作为疫苗平台的另一个优势。不良反应由于其作为预防性、非治疗性药物的性质，针对传染源的疫苗具有高标准的安全性和耐受性。迄今为止，本综述中讨论的RNA疫苗的安全性与基于蛋白质的疫苗的安全性一致。局部注射疼痛和局部或全身炎症反应（发热、不适）是最常见的不良反应。这两种COVID-19 mRNA疫苗已接种于300000多名健康志愿者，包括老年人，是评估副作用的最佳数据集，但比较时必须记住，BNT162b2（30μg）和mRNA-1273（100μg）之间的剂量水平（因此给药的mRNA和脂质）有三倍的差异。此外，这些试验有排除标准，排除了一些风险最高的参与者（例如，既往过敏史），因此不一定代表需要保护的全部人群。在BNT162b2和mRNA-1273 III期研究中，超过80%的疫苗接种者报告了局部不良反应，主要是疼痛。全身事件主要为头痛、疲劳、体温升高、肌痛和关节痛。对于mRNA-1273，第二次给药后，不良反应的频率和严重程度往往更为明显。目前尚不清楚mRNA和LNP对这些不良反应的相对作用，因为在这些III期试验中，安慰剂是0.9%的生理盐水，而不是裸mRNA或空LNP。­­­第二次给药后不良反应严重程度的增加可能反映出反应性的增加，并且在mRNA-1647的II期研究的较小数据集中也观察到了这一点。mRNA-1647是一种CMV疫苗，用于CMV阳性和CMV阴性参与者。两个患者组之间的安全性没有差异，但在第二次接种疫苗后，出现更频繁和更严重的不良反应的趋势。­即使是非常大的试验，例如两种mRNA COVID-19疫苗，其检测非常罕见但潜在令人担忧的不良反应的能力也有限。关于年轻男性在接种疫苗后几天到几周内发生心肌炎的报告促使FDA免疫实践咨询委员会审查COVID-19疫苗的益处和风险。根据他们的计算，年轻男性人群患心肌炎的风险最高（预计12-29岁组每百万次接种疫苗39-47次），但其益处（预防11000例新冠肺炎、139例重症监护病房入院和6例死亡）大于风险。­­­­­­癌症治疗疫苗最近，癌症免疫疗法的迅速发展和成功引发了人们对使用mRNA疗法进行此项应用的兴趣（表2）。对于mRNA癌症免疫治疗，一种方法是通过表达缺失或改变的肿瘤抑制蛋白来改变免疫抑制肿瘤微环境。然而，目前的mRNA传递方式不太可能到达患者体内的每一个癌细胞。相反，人们越来越关注使用mRNA作为治疗性疫苗来训练免疫系统寻找并杀死癌细胞。mRNA疫苗的关键特性使其能够成功地作为SARS-CoV-2疫苗和一般传染病疫苗，包括快速开发和制造mRNA药物的能力以及mRNA编码整个抗原的能力，使其作为癌症疫苗的用途特别有希望。此外，许多患者对当前免疫靶向药物具有耐药性的肿瘤，为基于mRNA的方法创造了新的机会。­治疗性癌症疫苗的开发，无论其形式如何，都面临着许多挑战，必须解决这些挑战才能成功地进行临床翻译。与传染病预防性疫苗不同，治疗性癌症疫苗的抗感染保护在很大程度上（如果不是完全的话）是由强大的体液反应提供的，治疗性癌症疫苗还必须确保诱导强烈的细胞毒性CD8+T细胞反应，以根除癌细胞。尽管有可能为癌症接种预防性疫苗，但目前只有两种FDA批准的癌症相关疫苗，这两种疫苗都是针对已知的致癌病毒（人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒）。另一个挑战是选择能够诱导高度肿瘤特异性免疫反应的适当抗原，因为不同个体间抗原的高度可变性。越来越多的患者特异性新抗原旨在应对这一挑战。最后，即使抗原能够诱导细胞免疫反应，抑制性肿瘤微环境也可以阻止T细胞浸润到肿瘤中，并可能导致T细胞衰竭。因此，治疗性疫苗可能需要与另一种旨在克服抑制性微环境（如免疫检查点抑制剂）的治疗方法结合使用，如下文所述的BNT111。肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原（TAA）优先表达于肿瘤细胞表面，是肿瘤细胞免疫杀伤的靶点。针对TAA的癌症疫苗涉及生产用于多种肿瘤的固定、现成的TAA。其中最先进的是BNT111，它是四种黑色素瘤相关抗原（纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）、酪氨酸酶、黑色素瘤抗原家族A3（MAGE A3）和具有张力蛋白同源性的跨膜磷酸酶（TPTE）的混合物，目前正在1-2期试验（Lipo-MERIT，NCT02410733）中作为单一疗法或与检查点抑制剂联合进行评估。该疫苗以反复静脉注射（i.v.）的形式注射，从一系列八次注射开始，并可能每月额外注射，现在与cemiplimab联合治疗晚期黑色素瘤（NCT04526899）已发展到II期。­­­­上述研究中BNT111的免疫作用已有详细报道。四种TAA的mRNA序列均针对未成熟DC的翻译进行了优化。每个序列还包含一个信号肽和破伤风类毒素CD4+表位P2和P16，以及增强人类白细胞抗原（HLA）呈递和免疫原性的主要组织相容性复合体（MHC）I类转运域。脾脏的F-氟-2-脱氧-2-d-葡萄糖正电子发射断层扫描显示，脾脏的代谢活性增加，从而显示淋巴组织的激活。通过酶联免疫吸附斑点试验，50名接受评估的患者中约75%对四种TAA中的至少一种表现出IFN-γ反应，表明诱导了免疫反应。抗原特异性T细胞为OD1+CCR7−DD27+/−D45RA− 刺激后效应器记忆表型和分泌的IFN-γ和肿瘤坏死因子。在继续接受疫苗接种的患者中，TAA特异性细胞保持稳定，甚至数量增加，而在停止接受维持性疫苗接种的患者中，T细胞保持数月，随后下降。通过将克隆的TAA特异性T细胞受体转染健康供体CD8+细胞，并评估其裂解黑色素瘤细胞系的能力，证明了这些细胞杀伤黑色素瘤细胞的能力。­每次给药后，患者的IFN-α、IFN-γ、IL-6和其他细胞因子的血浆水平均升高，通常在注射后数小时达到峰值，并在24小时内恢复正常。这与观察到的不良反应特征一致，其特征是轻度至中度流感样症状，同样短暂且具有自限性。首次对42名患有放射图形可评估疾病的患者进行评估令人鼓舞。在接受疫苗单一疗法的25名患者中，3名患者出现部分反应，7名患者出现稳定反应，而接受疫苗-抗PD1联合疗法的17名患者中，有6名患者出现部分反应。一个有趣的观察结果是，两名在接受抗PD1治疗期间有所进展并接受过疫苗单一治疗的患者后来再次对抗PD1治疗作出反应，这与诱导的T细胞属于PD1+效应记忆表型的观察结果一致。BNT111目前正在进行黑色素瘤的II期研究（NCT04526899）。mRNA-5671（V941）是一种串联体，设计用于向免疫系统呈现KRAS抗原，并编码四种最常见的KRAS替换（G12D、G12V、G13D、G12C）。目前正在进行一期研究（NCT03948763），作为单一疗法，并与pembrolizumab联合使用。­­其他示例包括BNT112（编码五种前列腺癌特异性抗原）和BNT113（编码HPV16衍生的肿瘤抗原E6和E7（病毒癌蛋白））、BNT114（编码所选乳腺癌抗原的混合物）和BNT115（编码三种卵巢癌TAA编码RNA物种的混合物）。CureVac对编码TAA的未修饰mRNA物种进行了早期研究，包括作为免疫治疗方案的自体扩增肿瘤mRNA的裸mRNA物种、编码六种肾癌相关抗原的裸mRNA 和六种不同黑色素瘤相关抗原（NCT00204516、NCT00204607）的鱼精蛋白稳定mRNA。这些研究主要提供所用制剂的安全性和耐受性信息。研究肿瘤相关抗原的其他研究包括CV9103（前列腺癌四种抗原的混合物）、CV9104（前列腺癌六种不同抗原的混合物，由六种不同的mRNA物种编码和CV9201（五种非小细胞肺癌抗原的混合物）。所有这些项目和/或候选药物似乎都已停止开发。CV9202包含六种mRNA物种，它们编码六种不同的抗原（NY-ESO-1、MAGE C1、MAGE C2、滋养层糖蛋白（TPBG（5T4））、survivin和黏蛋白-1（MUC1）），目前仍在进行研究（NCT03164772）。­­­个性化新抗原在癌变过程中，恶性细胞获得体细胞突变，导致产生正常细胞不表达的蛋白质序列。这些蛋白质通过蛋白酶体加工成肽，呈现在与MHC I类受体结合的细胞表面，并在那里被T细胞受体识别。这些新抗原通常对每个患者都是独特的，因此代表了与肿瘤特异性和患者定制免疫治疗相关的机遇和技术挑战。­­­为了产生针对患者特异性新抗原的mRNA疫苗，切除单个患者的肿瘤，并通过下一代测序鉴定患者特异性新抗原。然后将编码这些新抗原的mRNA注射到同一名患者体内，期望它能诱导免疫反应，攻击患者的肿瘤。当然，整个过程必须花费最少的时间，以便在癌症发展和进展之前对患者进行治疗，据报道，治疗周期短至30-40天。这给制造业带来了额外的挑战，制造业必须满足人类使用试验产品的标准。­迄今为止，个性化新抗原疫苗的大部分工作涉及基于肽的新抗原疫苗而非mRNA疫苗的部署；总的来说，这些方法取得的成功有限。具有最高突变负担的肿瘤，理论上是这种新抗原方法的最佳候选，也最有可能对治疗产生耐药性。与肽疫苗相比，我们假设mRNA编码的新抗原疫苗具有适当的免疫刺激，可能提供更强的免疫原性反应和临床益处。与基于肽的疫苗不同，mRNA可以编码整个抗原，从而确保呈现多个表位，而不局限于定义的HLA型。此外，mRNA可以合成表达多种新抗原，既可以作为单独的分子，也可以作为多个编码序列的串联。某些类型的肿瘤可产生多达几十种新抗原，从诱导广泛免疫反应的角度来看，表达可能引起T细胞反应的多个表位是可取的。­­­­­­BioNTech已经开发了几种用于治疗癌症的临床新抗原候选疫苗。通过对13例转移性黑色素瘤（NCT02035956）患者的腹股沟淋巴结重复给药研究BNT121。这项研究的结果令人鼓舞，有强大的免疫反应和一些临床活动的证据。BNT122（RO7198457）可包含多达20个个体化患者新表位，静脉注射，目前正在四项研究中进行评估（表2）。初步结果表明，BNT122，无论是否含有抗PD-L1抗体阿替唑单抗，都具有可接受的安全性，主要是短暂的不良反应，如输液相关反应和/或细胞因子释放综合征，表现为发热和寒战。BNT122也正在胰腺癌I期研究（NCT04161755）中进行评估，非小细胞肺癌研究（NCT04267237）以及一项未公开的辅助指标研究预计将很快开始。­­­­­­mRNA-4157是另一种个性化的癌症疫苗，可包含多达34种编码在单个mRNA链上的新抗原（“新抗原结合物”），并在LNP中配制并经静脉注射。该药物目前正在对切除的原发性实体瘤患者（单药治疗）和转移性未切除肿瘤患者进行1期研究（NCT03313778）。截至2020年2月，据报道共有71名患者接受了至少一剂mRNA-4157。最常见的不良反应是疲劳、注射部位疼痛、结肠炎和肌痛。同时，还正在进行一项随机2期研究，将其作为辅助药物与彭布罗利珠单抗联合用于高危黑色素瘤患者（NCT03897881）。化合物NC-I4650与mRNA-4157密切相关，主要区别在于使用的新抗原选择方案。­­­新抗原疫苗依赖于患者特异性mRNA序列的快速转变，肯定受益于mRNA–LNP平台固有的灵活性和速度。最后，肿瘤学中的各种给药途径值得注意：瘤内给药、i.n.和i.v.或i.m.，其中一些相同的LNP用于多种给药途径。这表明单一候选药物具有广泛应用的潜力：不能通过直接瘤内注射达到或没有可触及淋巴结的肿瘤可能仍然对静脉注射或注射相关mRNA疫苗有反应。目前的挑战是确定最有效的蛋白质或蛋白质组合进行编码，以引导免疫系统攻击癌症，使免疫系统能够深入肿瘤并为每位患者提供个性化的治疗。蛋白质和细胞免疫疗法一个新的兴趣领域是使用mRNA给药，以产生治疗水平的免疫或免疫调节蛋白（表3），如抗体或细胞因子。与传染病和癌症疫苗相比，需要生产更多的蛋白质才能使此类治疗有效，在某些情况下，可能需要终身重复给药治疗。­­­蛋白质免疫疗法的另一个挑战是将mRNA输送到所需的器官和细胞类型，以实现最佳的治疗效果。例如，某些表达的蛋白质需要进一步的PTM，如糖基化和蛋白水解处理，才能发挥完全的功能。然而，PTM对蛋白质的形成方式可能是组织依赖性的，并且可能不是简单地由mRNA序列决定的，因此强调需要组织特异性地传递mRNA。­­当mRNA物种与LNP复合系统给药时，由于载脂蛋白E与LNP表面结合，导致肝细胞受体介导的摄取，许多物种倾向于回到肝脏。非肝器官选择性可以通过改变脂质成分来实现，包括调整脂质比例和特性，从而产生靶向肺内皮或脾脏的LNP。最近，通过调节PEG脂质结构改变LNP表面化学，导致LNP靶向造血干细胞生态位中的骨髓内皮细胞。­因此，与疫苗相比，mRNA蛋白质免疫治疗在传递、蛋白质生产效率和耐受性方面提出了一些独特的挑战。这可以解释为什么mRNA的应用进展比mRNA免疫慢。mRNA编码的单克隆抗体治疗通过直接注射将mRNA传递到特定组织或器官是一大障碍。相反，暴露可以简化临床应用，只要它是安全的，并且表达足够水平的蛋白质以获得治疗效果。在mRNA药物中编码单克隆抗体（mAb）就是这种方法的一个例子，并以mRNA-1944为例，mRNA-1944是一种mRNA–LNP，编码一种抗基孔古亚病毒的中和mAb，在一名免疫患者（NCT03829384）中鉴定。第一批接受治疗的健康志愿者的结果表明，在所有试验剂量下（0.1、0.3和0.6 mg/kg，静脉注射），都可以检测到中和单克隆抗体水平。然而，在最高剂量时，四名受试者中有三名出现输液相关反应，其中一名受试者出现3级心动过速和白细胞计数升高，心电图上还有2级恶心、呕吐、发热和短暂的倒置T波。同一剂量水平但经类固醇预处理的单独队列没有3级不良反应，但产生的基孔肯雅特异性抗体（Chikungunya-specific antibodies）（Emax）水平较低1.7倍。一个队列的数据显示，两次给药0.3 mg/kg，间隔2周，第一次给药与第二次给药后，不良反应没有恶化，也没有脂质积聚。­­­­利用mRNA生产抗体的应用仍然令人感兴趣，目前正在进行多个行业合作，例如CureVac和Genmab（基于mRNA的抗体抗癌疗法148）之间的合作，以及Neurimmune和Ethris（编码抗SARS-CoV-2单克隆抗体的吸入式mRNA（参考文献149））之间的合作。这里一个重要的考虑因素是从mRNA表达单克隆抗体的好处，而不是使用通过传统重组制造的相同抗体。最终，最有希望的方法将是所需剂量、作用持续时间、所需PTM类型以及输送系统和相关抗体的相对治疗指数比的函数。­­mRNA编码的免疫刺激蛋白用于癌症治疗另一种抗癌方法是注射预期具有直接治疗效果的mRNA编码蛋白，通常通过刺激免疫系统，如OX40配体（OX40L）或IL。其中一种产物mRNA-2416是编码免疫检查点调节器OX40L的mRNA，在肿瘤内给药。尽管首次报道的41名患有多种恶性肿瘤的患者的单药治疗结果不符合实体瘤部分疗效的疗效评估标准，但申办方目前正在将其纳入与杜洛单抗联合治疗卵巢癌的II期扩展队列（NCT03323398）。其他mRNA产物编码几种不同的免疫调节蛋白。一个例子是ECI-006，它是TriMix（编码DC激活分子（CD40L、CD70和caTLR4）的mRNA物种）和编码黑色素瘤特异性TAA（酪氨酸酶、gp100、MAGE A3、MAGE C2和PRAME）的mRNA的组合，该药物经静脉注射，正在切除黑色素瘤的I期研究（NCT03394937）中进行测试（TriMix单独用于乳腺癌的I期研究（NCT03788083）并给予瘤内注射）。另一个例子是mRNA-2752（编码OX40L、IL-23和IL-36γ的三种mRNA物种），它正在实体瘤和淋巴瘤的剂量递增研究（NCT03739931）中进行评估。类似地，BNT131（SAR441000）编码IL-12sc、IL-15SUSH、IFN-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），目前正在研究作为一种旨在改变肿瘤微环境的瘤内注射。另一类产品是免疫调节融合蛋白。MEDI1191编码含有IL-12α和IL-12β亚单位的单链融合蛋白，亚单位之间有连接子。该药物是为肿瘤内注射而开发的，目的是与全身注射重组IL-12相比，提高耐受性。过继免疫细胞治疗中的mRNA过继细胞移植是一种相对较新的治疗方法，涉及收集和使用患者自身的免疫细胞来治疗癌症。这一点已在乳腺癌患者中进行了探索，Tchou等人观察到，肿瘤内注射转染了编码c-Met嵌合抗原受体（CAR）mRNA的T细胞的耐受性良好，并在乳腺癌肿瘤组织内诱导炎症反应；同样，Maus等报告了四名接受电穿孔自体T细胞治疗的个体，电穿孔的mRNA编码一种来自人类间皮瘤特异性小鼠抗体的CAR。其中一名受试者在第三次输注后几分钟内出现过敏反应和心脏骤停，作者将其归因于产生免疫球蛋白（Ig）E型人抗小鼠抗体（NCT01355965）。最近，Beatty等评估了转染了编码间皮素导向CAR的mRNA的T细胞作为胰腺癌的治疗，避免了T细胞启动；在I期研究中，这些细胞不会诱发细胞因子释放综合征，也不会引发神经症状。­­过去，利用逆转录病毒基因转移成功地生成了CAR T细胞，最近又利用CRISPR–Cas9介导的基因整合系统成功地生成了CAR T细胞。据报道，不仅使用mRNA，而且使用核糖核蛋白介导的传递系统都取得了成功。然而，如上所述，我们在体内中看到了生成CAR T细胞的潜力。尽管核糖核蛋白在体内的功能传递尚待描述，但最终，假设可以证明向T细胞安全有效地传递，mRNA在负载能力和氧化方面可能比病毒传递具有实质性优势。还描述了能够促进体内递送至多类免疫细胞的纳米制剂，包括巨噬细胞、B细胞和T细胞，为一系列免疫疗法提供了希望。例如，通过T细胞靶向mRNA递送，体内CART细胞的产生可能成为可能，从而为癌症创造新的治疗方法。通过识别有利于向这些细胞递送的特定脂质结构，已经实现了将LNP重新靶向T细胞。此外，靶向抗体的mRNA纳米颗粒（通过表面偶联赋予其特异性）能够对免疫细胞特异性受体（如CD4）具有亲和力。对于旨在在体内编辑免疫细胞的疗法，mRNA可能允许基因组编辑核酸酶或碱基编辑器的瞬时表达，由于RNA降解，它们会在细胞中短暂地持续表达。尽管到目前为止，已发表的关于将mRNA递送至T细胞的报告仅显示了体外绿色荧光蛋白标记物的破坏，但通过将mRNA全身递送至肝细胞的基因编辑成功已经在人类TTR淀粉样变性中得到证实，其中mRNA编码Cas9蛋白的LNP与靶向TTR的引导RNA一起被递送。在患者中，血清TTR蛋白浓度与基线相比呈剂量依赖性平均降低，只有轻微的不良反应。这一令人印象深刻的结果暗示了mRNA在系统基因编辑中的未来潜在用途。结论和未来方向mRNA在基因疗法和蛋白质疗法之间占有独特的地位，它结合了两者的许多优点，同时解决了任何一种面临的独特挑战。例如，对生物反应器中的生产造成无法克服的技术挑战的多聚体蛋白可以在患者自己的身体中通过编码不同亚基的mRNA或mRNA种类的组合来生产，这是一个已在候选者中使用的灵活性机会CMV疫苗和癌症应用，随着世界正在努力应对不同SARS-CoV-2毒株的出现，这些毒株对授权的SARS-CoV-2疫苗具有不同的敏感性。随着该领域对技术的优化和改进，mRNA药物很可能也将被开发用于传染病和癌症以外的适应症。靶蛋白表达的固有短暂持续时间使mRNA治疗成为需要单次或不超过少量蛋白质表达的情况的理想方式，例如传染病疫苗。重复给药、滴定剂量或改变给药间隔的能力为临床医生提供了经典药物治疗的灵活性，使其成为个体患者需求可能不同或对基因治疗可能存在犹豫的适应症的有吸引力的选择。从安全的角度来看，对于两个疫苗项目（SARS-CoV-2的mRNA-1273和mRNA-1647），似乎第二剂后的不良反应比第一剂后更明显。然而，这似乎不是一个普遍的观察结果。癌症疫苗BNT111已被给予超过8剂的一些患者，并且明显保持疗效。吸入mRNA治疗剂MRT5005每周给药多达五剂，在第一剂和第五剂之间没有出现安全性恶化的迹象。通过对工程化、非人类和人工蛋白质构建体的评估，mRNA疗法的潜力将进一步扩大。蛋白质治疗剂已被设计用于延长半衰期，例如，通过将Fc域与治疗域融合。同样可以在mRNA疗法中编码。也许更令人兴奋的是表达新细胞内疗法的能力。来自mRNA的基因编辑机制的瞬时表达对于减少持续表达的副作用很有吸引力。此外，抗体、抗体片段或其他蛋白质结合基序的细胞内表达提供了一种独特的治疗类别，可以与亚细胞定位结构域（例如细胞核）结合，以集中编码蛋白质的作用。mRNA的首次应用涉及刺激免疫系统，用于传染病疫苗或癌症疫苗。传染病应用一直是平台的试验场；迄今为止，癌症疫苗作为一个类别并不是特别成功，但BNT111令人鼓舞的结果暗示了高蛋白表达和免疫激活途径的结合可能会克服早期蛋白疫苗遇到的一些障碍。由于RNA通过TLR和RIG-I通路激活免疫通路的内在能力，在产品中利用RNA的免疫刺激特性非常有意义。这与编码蛋白无关，如CV8102所示，这是一种用作免疫佐剂的非编码RNA。在审查已进入临床试验的mRNA候选药物的安全性和耐受性概况时，这种免疫刺激特性的缺点就很明显了。新出现的情况是，与mRNA药物相关的最常见的不良反应是某种形式的炎症反应。这种潜在的途径可以通过多种方式表现出来：肌肉注射或皮下注射时的局部反应（局部疼痛、发红、酸痛），或者更广泛的发热综合征或静脉注射、肌肉注射或吸入药物的流感样反应.这些似乎通常可以用经典的抗炎药治疗，尽管在静脉注射编码基孔肯雅特异性mAb的mRNA的情况下，预防性类固醇的使用被用来减轻在接受最高剂量的队列中观察到的不良反应。这种干预似乎确实成功地抑制了不良反应，但也与蛋白质表达的减少有关。这些数据为研究重复给药mRNA疗法的一些潜在未来方向提供了有趣的见解。类固醇对于减轻mRNA编码的蛋白质疗法的炎症副作用谱是否有效并且是必需的？如果是这样，这是否以减少蛋白质表达为代价？同时观察到较少的副作用和减少的表达是否暗示一定程度的炎症实际上可能是良好蛋白质表达的先决条件？如果是这种情况，一个临床挑战将是穿上那根针并允许启动足够的亚临床炎症过程以促进良好的转化，而不会让它们上升到危及重复给药的临床可行性的严重程度。这些问题有些复杂，因为大多数mRNA应用不涉及简单的裸mRNA，而是封装在LNP或PNP中的mRNA，所有这些都有助于耐受性。已提议在临床试验的对照组中使用不含mRNA的“空LNP”，以帮助阐明mRNA与LNP对耐受性曲线的不同贡献。这种方法的一个理论上的限制是，当没有与带负电荷的mRNA复合时，空LNP具有不同的物理化学性质，因此不代表真正的比较器。尽管在单剂量（疫苗接种）或危及生命的疾病（肿瘤学）的情况下，短暂的炎症反应是可以接受的，但对于需要长期治疗的适应症，尤其是静脉给药时，选择适当的、耐受性良好的和安全的脂质和配方至关重要。似乎动物实验在这里的价值有限，因为注意到在人类中引发细胞因子释放的癌症疫苗BNT111的浓度在人类中比在小鼠中低1,000倍以上，并且在吸入后观察到的发热反应MRT5005不是基于动物毒性实验预测的。除了直接耐受性之外，还必须解决有关脂质积累潜力的长期问题。如果产生的蛋白质的半衰期短，那么维持表达和临床疗效所需的给药间隔可能比消除脂质的理想时间短。因此，重复给药可能导致靶组织或脱靶组织中的脂质积累，具有难以预测的长期安全风险。制剂科学将成为mRNA治疗学未来的一部分，就像进一步了解mRNA本身的生物学一样。引入临床的不同给药途径也说明了mRNA治疗的非凡潜力：i.m.、i.d.、皮下、i.n.、瘤内、i.v.、心外膜和吸入。其他应用很容易想象：鼻内疫苗、滴眼剂或滴鼻剂、皮肤软膏、栓剂、膀胱内滴注溶液、鞘内给药装置或Ommaya储液罐。我们相信未来mRNA治疗的广度将由递送纳米颗粒的进步来定义。越来越多的证据表明，可以对LNP和PNP进行工程改造，以输送到包括肝脏在内的一系列身体组织、内皮、肺、骨髓和免疫系统的多种元素。通过改进的递送材料和包含额外的靶向元件在效力和组织靶向方面的额外进展将继续为mRNA治疗的新治疗应用打开大门。两种接受EUA的SARS-CoV-2疫苗的成功凸显了mRNA的制药优势之一：临床试验材料的生产速度。最初开发用于将个体化新抗原疫苗从切除的患者肿瘤快速转变为可注射的临床产品的制造技术已通过在SARS-CoV-2发布后数周内启动候选mRNA疫苗的临床试验来证明其潜力序列。同时，我们在COVID-19疫苗方面的经验也凸显了该技术目前的局限性之一：对冷链储存和运输的依赖。能够处理-80°C温度的冷冻机是专用设备，并非在每个药房或临床试验场所都容易获得。对于打算在患者家中自行给药的治疗，即使在-20°C下储存也可能具有挑战性。将mRNA药物从实验室带到床边的下一个前沿领域很可能是制剂科学。在生产COVID-19疫苗的竞赛中，mRNA作为一个安全有效的平台的出现，为全世界提供了关于mRNA-LNP技术的益处和风险的加速教育。尽管BNT121和mRNA-1273的生产速度和储存条件以及两剂方案的副作用已经引起了很多关注，但科学和医学界正在关注这两种疫苗之外，并急切地等待进一步验证其他适应症的mRNA药物。原文标题：The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。