68Ga-ZH2

从DPI-4452到ZH2：CAIX靶向环肽诊疗药物的结构引导优化与临床转化 透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾癌最常见的亚型，占所有肾恶性肿瘤的70%至80%。碳酸酐酶IX（CAIX）在ccRCC中近乎普遍性过表达，由von Hippel-Lindau基因缺失和缺氧诱导信号驱动，而在健康人体组织中其生理性表达主要局限于胃肠上皮。这一表达谱使CAIX成为ccRCC分子成像和靶向治疗极具吸引力的生物标志物。 基于环肽的CAIX靶向配体在亲和力、药代动力学和可制造性之间实现有前景的平衡。其中，DPI-4452是由3B Pharmaceuticals开发的一种DOTA螯合环肽，可分别与诊断性核素68Ga和治疗性核素177Lu配位，形成诊疗一体化药物对。表面等离子体共振SPR测得DPI-4452对人CAIX的解离常数KD为0.25 nM，其Ga或Lu复合物的KD为0.16–0.21 nM，属于亚纳摩尔级高亲和力。临床前研究显示，[68Ga]Ga-DPI-4452在HT-29和SK-RC-52异种移植小鼠模型中肿瘤摄取迅速且持续，[177Lu]Lu-DPI-4452则显著抑制肿瘤生长且耐受性良好。在ccRCC患者的首次人体研究中，[68Ga]Ga-DPI-4452 PET/CT被证实安全可行。 然而，DPI-4452的临床转化面临着一个 关键障碍 ：明显的胃肠道摄取。在健康犬和患者体内，放射性主要分布于胃和小肠——这与CAIX在胃肠上皮的生理性表达一致。胃肠道的高背景不仅可能掩盖腹部病灶的判读，还在治疗过程中增加胃部毒性风险。因此，如何解偶联肿瘤靶向与胃肠道CAIX结合，成为推动CAIX靶向诊疗药物临床转化的核心命题。 一、结构引导的重新设计策略与环肽修饰合成 针对这一转化瓶颈，研究者采取一种系统性的结构引导优化策略：在环肽支架上通过改变CAIX结合基序、连接子组成和螯合剂架构，生成一系列新型CAIX靶向配体，命名为ZH1-5（ 图1 ）。 图1： ZH1-5的化学结构。 这一设计的核心逻辑在于：胃肠道滞留并非单纯由配体对CAIX的亲和力决定，而是反映肿瘤靶向与生理性CAIX结合之间复杂的结构依赖性关系。通过系统性的 结构-活性关系（SAR） 框架，研究者试图阐明环肽支架中各结构元素对CAIX结合和器官水平生物分布的影响。 ZH1-ZH3 的设计思路是在 保持CAIX结合基序不变的前提下 ，将DOTA替换为DOTAGA以增加分子极性和亲水性，同时通过改变连接子长度和组成来调节药代动力学参数，包括肿瘤滞留、肾脏清除和胃肠道摄取。DOTAGA相较于DOTA具有更高的亲水性，这种修饰使配体整体极性增强，理论上可减少非特异性蛋白结合和脂溶性组织滞留。连接子的调整则直接影响配体的分子柔顺性和空间构象，进而影响其与CAIX结合口袋的适配效率以及在体内的清除动力学。 在ZH4和ZH5 中，研究者 改变螯合剂-连接子片段的偶联位点 ，以评估CAIX结合基序的空间呈现对受体识别的影响。这一设计的理论依据在于：环肽的活性构象高度依赖于螯合剂-连接子片段在肽骨架上的连接位置；改变偶联位点可能扰乱环肽的折叠方式，使CAIX结合基序无法以最优取向与靶点结合。 从化学合成与修饰的角度来看，所有五种配体均通过标准Fmoc固相肽合成法实现。其中ZH1采用CTC树脂，ZH2-ZH5采用Rink酰胺MBHA树脂，分别合成线性肽中间体，再经酰胺环化或其他环化策略制备目标环肽。环化后的粗产物通过制备型高效液相色谱（HPLC）纯化，质谱法验证各配体身份，终产物化学纯度均>95%。这种模块化的合成策略使得对环肽支架各结构单元——包括螯合剂类型（DOTA vs. DOTAGA）、连接子长度（不同PEG或非PEG单元）、连接子电荷性质以及螯合剂-连接子片段的偶联位点——进行系统性替换成为可能，为SAR研究提供坚实的化学基础。 更为重要的是，这些结构修饰直接关系到临床转化中的实际应用： 增加亲水性（DOTAGA取代DOTA）有助于降低血浆蛋白结合率，减少肝胆排泄，从而加快背景清除 ； 优化连接子长度则可在保持肿瘤靶向亲和力的前提下，调节配体的整体分子尺寸和柔性，影响其穿过肾小球滤过屏障的能力和在胃黏膜中的驻留时间 。而 偶联位点的改变虽能显著降低胃摄取 ，但若牺牲过多亲和力则失去临床价值，因此ZH2在二者之间取得的平衡尤为关键。 二、从候选筛选到领先化合物的确立 对五种ZH系列配体及参考化合物DPI-4452的系统性评估揭示清晰的结构-活性关系。 体外亲和力方面 ，竞争性结合实验显示ZH1和ZH2的半数抑制浓度（IC50）分别为0.10±0.04 nM和0.03±0.02 nM，与DPI-4452（0.10±0.02 nM）相当；而ZH3-5的亲和力则显著降低（1.10–95.59 nM）（ 图2A ）。这一结果表明，螯合剂-连接子片段的偶联位点改变（ZH4、ZH5）严重影响CAIX结合基序的正确空间呈现，而DOTAGA替换DOTA（ZH1-ZH3）则基本保持结合能力。 细胞摄取与内化实验中 ，68Ga-ZH1-3的摄取显著高于68Ga-DPI-4452，呈时间依赖性增加，在120分钟时达到峰值（ 图2B ）。尤为值得关注的是177Lu-ZH2的内化行为：与177Lu-ZH1、177Lu-ZH3和177Lu-DPI-4452的内化在1440分钟内逐渐减少不同，177Lu-ZH2表现出持续增加的内化，在1440分钟时其内化水平显著高于177Lu-DPI-4452（9.89±1.48% vs. 4.74±1.23%，P<0.001）（ 图2D ）。 外排实验进一步显示 ，177Lu-ZH2与177Lu-DPI-4452均清除缓慢，1440分钟后超过63%的活度仍留在细胞内（ 图2E ）。 图2： CAIX靶向放射性配体的体外表征（A）竞争性结合；（B）68Ga标记配体的时间依赖性摄取；（C）177Lu标记配体的摄取；（D）内化动力学；（E）外排动力学；（F）CAIX特异性验证。 体内小动物PET/CT成像揭示 关键的差异化特征（ 图3A ）。所有示踪剂主要通过肾脏途径清除，但代表性最大强度投影图像显示：68Ga-ZH1-3和68Ga-DPI-4452在肿瘤和胃中均有明显摄取，而68Ga-ZH4-5在肿瘤和胃中的滞留均极低，与其低CAIX亲和力一致。半定量分析表明，68Ga-ZH2和68Ga-DPI-4452的肿瘤摄取相当（33.49±2.98 vs. 28.64±5.51%ID/g），但68Ga-ZH2的胃摄取显著降低（7.94±0.17 vs. 10.87±2.84%ID/g，P<0.05）。 图3. 68Ga-放射性配体的PET/CT成像与生物分布（A）68Ga-ZH1-5及68Ga-DPI-4452在注射后1小时的PET/CT图像；（B）68Ga-ZH2在OS-RC-2荷瘤小鼠中120分钟内的动态成像；（C）阻断实验和CAIX阴性对照；（D）注射后1小时的离体生物分布；（E）竞争性阻断对肿瘤和胃摄取的影响；（F）肿瘤及主要器官的蛋白质印迹分析。 注射后1小时的 离体生物分布研究 进一步验证这一发现（ 图3D ）：68Ga-ZH2表现出最高的肿瘤摄取（41.84±1.82%ID/g）和最低的胃摄取（5.51±0.73%ID/g） ，与68Ga-DPI-4452相比差异具有统计学显著性（肿瘤，P<0.001；胃，P<0.001）。此外，68Ga-ZH2在肝脏、肺、肾脏、脾脏、胰腺、骨、肌肉、大肠和小肠等多个器官中的肿瘤与背景对比度比值均优于参考示踪剂。 基于这种在保留肿瘤靶向和减少胃肠道蓄积之间的有利平衡，68Ga-ZH2被选定为领先候选物进行进一步评估。 ZH2的CAIX特异性通过多重实验得到证实：竞争性阻断实验（共注射过量DPI-4452）和CAIX阴性AsPC-1细胞实验中，68Ga-ZH2和177Lu-ZH2的摄取均显著降低（ 图2F、图3C、图3E ）。蛋白质印迹分析进一步确认OS-RC-2肿瘤和胃中CAIX的特异性表达，与CAIX在胃肠道的生理性表达一致（ 图3F ）。 三、ZH2的临床前验证与治疗潜力 延长时程生物分布研究显示（ 图4A–B ），177Lu-ZH2和177Lu-DPI-4452在OS-RC-2异种移植瘤中的肿瘤活度均在注射后4小时达到峰值（分别为120.51±15.15和107.92±18.86%ID/g），随后逐渐下降，但在168小时仍保持显著水平。曲线下面积（AUC）分析表明，两种配体的肿瘤AUC相当（9686.00 vs. 9440.00%ID/g·h），但177Lu-ZH2的胃AUC比177Lu-DPI-4452低约1.4倍。177Lu-ZH2的肿瘤与肾脏AUC比约为20，多个非肾脏器官的肿瘤与健康组织AUC比超过200。 在放射性配体治疗实验中（ 图4C–E ），单次37 MBq的177Lu-ZH2或177Lu-DPI-4452均显著抑制了OS-RC-2荷瘤小鼠的肿瘤生长（均P<0.001）。生存分析显示，两个治疗组的生存期均显著长于生理盐水组（中位生存期14天），而两个治疗组之间无显著差异。组织病理学评估在心脏、肝脏、肺、肾脏和胃等主要器官中未观察到明显病理异常（ 图4F ）。 图4： 177Lu-ZH2与177Lu-DPI-4452的离体生物分布、治疗疗效及毒性评估（A）177Lu-ZH2在168小时内的生物分布；（B）177Lu-DPI-4452的生物分布；（C）平均肿瘤体积变化曲线；（D）平均体重变化曲线；（E）生存曲线；（F）主要器官的苏木精-伊红染色。 四、首次人体临床PET/CT研究 基于充分的临床前数据，68Ga-ZH2被推进至一项前瞻性、探索性人体研究，入组21例患者。所有患者均安全接受68Ga-ZH2 PET/CT检查，在示踪剂注射期间或之后未观察到即时或延迟的不良反应。 在非肿瘤器官中，胃（SUVmax 42.87±21.64）、小肠（24.13±8.40）和胰腺（13.79±21.81）的68Ga-ZH2摄取最高——这与CAIX的生理性表达模式一致。 在视觉分析上，68Ga-ZH2 PET/CT在病灶描绘方面显著优于18F-FDG PET/CT（ 表1 ）：原发肿瘤检出率（16 vs. 5，P<0.001）和转移灶检出率（73 vs. 27，P<0.001）均更高。在原发肿瘤中，68Ga-ZH2的SUVmax中位数（108.25）显著高于18F-FDG（3.00）；在所有转移部位（淋巴结、肺、骨等），68Ga-ZH2的SUVmax均显著高于18F-FDG。 表1： 68Ga-ZH2与18F-FDG在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）患者中诊断效能的比较。 在代表性病例中（ 图5、图6 ），68Ga-ZH2 PET/CT成功检出了18F-FDG未能显示的多个转移部位，包括肾静脉癌栓、肾上腺转移及多处骨转移。对于非ccRCC组织学类型（角化鳞状细胞癌和嫌色细胞肾细胞癌），68Ga-ZH2未见明显摄取，体现了对ccRCC的高度特异性（ 图7 ）。 图5：三例ccRCC患者的68Ga-ZH2与18F-FDG PET/CT对比图像（患者#3：左肾原发肿瘤；患者#6：右肾原发肿瘤及肾静脉癌栓；患者#7：术后复发转移）。 图6：患者#4的68Ga-ZH2与18F-FDG PET/CT对比（68Ga-ZH2清晰显示原发肿瘤及右肾上腺、淋巴结、肺、多发骨转移，而18F-FDG显示部分病灶弱摄取或假阴性）。 图7：患者#19（角化鳞状细胞癌）的18F-FDG与68Ga-ZH2 PET/CT对比（原发肿瘤、肾静脉癌栓及腹膜后淋巴结转移在18F-FDG上呈高摄取，而68Ga-ZH2上无摄取）。 五、讨论：从优化策略到转化意义 从DPI-4452到ZH2的优化历程，为研究者提供关于CAIX靶向环肽诊疗药物理性设计的重要启示。 第一 ，肿瘤靶向与胃肠道CAIX结合是可以部分解偶联的。 ZH2的成功表明，通过合理的结构修饰——具体而言，将DOTA替换为DOTAGA以增加亲水性、优化连接子组成——可以在保持亚纳摩尔级CAIX亲和力和强大肿瘤摄取的同时，显著降低胃的放射性滞留。这一发现挑战此前认为胃肠道摄取是CAIX靶向配体“固有缺陷”的观点。 第二 ，解偶联的机制可能涉及多个层面。 研究者指出，ZH2改良的螯合剂-连接子架构和增加的亲水性可能减少有效的胃驻留和/或与胃肠道碳酸酐酶亚型（如胃黏膜中大量表达的CAII）的脱靶相互作用，同时保留肿瘤相关CAIX的结合。这一假设为后续的进一步优化指明方向。 第三 ，临床前与临床数据的高度一致性验证该设计策略的稳健性。从细胞实验到小动物PET/CT，从生物分布到治疗疗效，再到首次人体研究，ZH2在每一个环节都展现出优于或相当于DPI-4452的肿瘤靶向性能和显著改善的药代动力学特征。 从合成与临床转化的角度来看，ZH2的成功还充分体现固相肽合成技术在环肽药物开发中的核心价值。通过标准Fmoc固相合成策略，研究者能够以模块化的方式系统性地替换环肽支架上的各个结构单元——从螯合剂类型（DOTA vs. DOTAGA）到连接子长度与组成（不同PEG链长或非PEG间隔基），再到螯合剂-连接子片段的偶联位点——从而高效地生成结构多样的候选分子库。这种合成上的灵活性使得SAR研究能够快速推进，并将体外筛选出的最优分子直接放大制备，用于后续的临床前毒理评估和临床研究。ZH2从实验室毫克级合成到临床批次生产，再到首次人体应用的完整路径，展示一条清晰可复制的“设计—合成—筛选—转化”路线。 当然，从DPI-4452到ZH2的优化之路并未终结所有挑战。胃肠道（尤其是胃）的生理性摄取依然是CAIX靶向配体面临的共同问题。此外，177Lu-ZH2相对较高的肾脏暴露需要在未来的治疗转化中仔细评估。但ZH2的临床前和早期临床数据已经证明：通过结构引导的理性设计，CAIX靶向环肽诊疗药物有望突破胃肠道摄取的转化瓶颈，为ccRCC患者提供灵敏的诊断工具和潜在的治疗选择。 【 相关文献 】 Structure-based redesign enables clinical translation of CAIX-targeted theranostics in clear cell renal cell carcinoma；Theranostics2026; 16(14): 8247-8262. doi: 10.7150/thno.134970. 免责声明：本文为行业学术交流用途，所涉文献解读及观点仅代表作者个人学术理解，不作为任何机构或领域的权威结论。版权归原作者所有，如有侵权，可联系删除 。 西安纳微生物科技有限公司专注于多肽药物研发，长期致力于高亲和力、高选择性靶向多肽的定制设计与合成。公司具备以下核心能力： PET探针前体合成：FAPI、PSMA、RGD、GCP3、HER2、SSTR、Nectin-4、Trop2、αvβ3、CXCR4、GRPR、CD105、ADAMTS4、CD36、EphA2、DLL3等。 多肽设计与优化：基于靶点结构的理性设计、噬菌体展示筛选、环化（二硫键、首尾环、订书肽等）、非天然氨基酸引入、PEG化及白蛋白结合修饰等； 螯合剂偶联：DOTA、NOTA、NODAGA、HBED-CC等多种双功能螯合剂的高效偶联。 特色服务 ： 储备各类螯合剂（NOTA、DOTA、PSMA Linker等）和中间体，缩短交付周期到1周内。