Ibudilast/Bumetanide

第一作者：陈泽平，男，生于1995年，博士，中国科学院南海海洋研究所博士后，主要从事中药活性成分及海洋放线菌中次生代谢产物研究。 并列第一作者：周镇槟，男，生于1994年，博士，中国科学院南海海洋研究所博士后，主要从事海洋微生物活性天然产物研究。 通信作者：马俊英，女，生于1980年， 博士，博士生导师，中国科学院南海海洋研究所研究员，广东省海洋药物重点实验室副主任。国家自然科学基金委优秀青年科学基金获得者，主要从事海洋微生物活性次级代谢产物的发现及其生物合成研究，在Nat Commun, Angew Chem Int Ed, J Am Chem Soc, J Hematol Oncol等期刊发表SCI论文50余篇，获得授权专利10件，主持NSFC-山东联合基金重点项目、国家优秀青年科学基金和面上项目等17项。 通信作者：鞠建华，男，生于1972年，博士，博士生导师，山东大学教授，院长。国家自然科学基金委杰出青年科学基金获得者，国家重点研发计划首席科学家，广东省“特支计划”本土创新团队项目负责人。主要从事海洋微生物活性次级代谢产物的发现、生物合成和创新药物研发，在Nat Chem Biol, Nat Commun, J Am Chem Soc, Angew Chem Int Ed等期刊发表SCI论文210余篇， 获授权专利29件，主持NSFC重点项目、NSFC-山东联合基金重点项目、国家重点研发计划、国家杰出青年科学基金项目等20余项。 1928年青霉素的发现开启了从微生物中寻找抗菌物质的新纪元。1945年抗结核抗生素链霉素的发现及基于活性筛选的抗生素发现方式，促使了抗生素发现的“黄金时代”的到来，产生了一大批抗感染抗生素，并奠定了当前抗感染抗生素药物库的基础[1-4]。抗生素的发现改变了人类与感染性疾病的对抗模式，使人类拥有了正面应对多种病原菌的强大武器，为人类寿命的延长和社会的健康发展作出了巨大贡献[5-7]。曾经不可想象的医疗程序，包括器官移植、心脏手术和骨关节置换术等，因抗生素提供的感染控制，已经成为了常见的医疗手段[8]。抗生素与用于控制疼痛和实现根治性手术干预的麻醉剂一起，是现代医学的基础药物，不可逆转地改变了医学，也改变了我们对医疗实践的期望[8]。 然而，随着抗生素的长期、广泛和大量使用，其对抗病原菌的威力日益减弱甚至无效。目前，每年因耐药菌导致的死亡人数达到195万，预计到2050年，因耐药菌感染造成的死亡人数将达到1000万，远超癌症所致的死亡人数，耐药菌将成为人类健康的“头号杀手”，且造成的年经济损失将达百亿美元[9]，成为影响人类健康和社会发展的重要危险因素。因此病原微生物耐药性已成为危害公共卫生安全的最大隐患，给公共卫生的健康发展带来了巨大挑战。 鉴于病原菌耐药的严峻形势及其造成的严重危害，世界卫生组织(WHO)分别在2017年2月和2022年7月发布了首份迫切需要开发新型抗生素的细菌和真菌类病原体清单[10-11]。2024年5月，WHO在2017年版本基础上，更新了2024年细菌类重点病原体清单(2024 WHO BPPL)[12]，旨在为开发新药物、制定必要的治疗方法以应对耐药菌感染，遏制耐药菌传播提供指导。 具有新结构、新机制抗生素是对抗耐药菌感染关键武器。然而，目前针对这些病原体的药物研发进展依旧缓慢，最关键的影响因素就是结构新颖、活性显著的新机制活性分子的稀缺，致使抗生素研发管线几近枯竭；同时受投资回报和政策因素等影响，大型制药公司不再青睐于抗感染抗生素的开发投入[13]。因此，如何高效研发结构新颖的抗耐药菌活性分子，成为突破现有抗耐药菌药物研发困境的关键。从新资源中挖掘或利用新技术进行新颖抗生素的发现成为当前创新药物研发的一个重要方向。海洋微生物作为新资源的典型代表和重要资源，受到了全球药物研发领域的高度关注。经过亿万年来对海洋特殊生境包括高盐、高压、低温(高温)和寡营养等的适应和进化，海洋微生物具备了产生结构独特、活性显著、机制新颖和靶向性强的新天然产物的巨大潜力[14-15]，因而成为了创新药物开发的重要资源，将有望为新机制药物研发提供源头创新的活性分子，并为抗耐药菌药物研发提供新的机遇。Montaser和Kong等[16-18]研究表明，海洋天然产物在化学新颖性方面优于陆地天然产物，约71%的分子骨架仅由海洋生物生产。此外，与陆地生物相比，海洋生物样品中获得活性分子的几率是陆源样品中获得活性分子的10倍[19]。因此，基于海洋天然产物新颖的结构、显著的生物活性及成药性高的特征，其已成为创新药物开发的前沿领域。近60年来从近42656个海洋天然产物分子中已开发出了18个海洋药物。此外，处于I期临床研究的海洋药物有13个，处于II期临床研究的海洋药物有17个，处于III期临床研究的海洋药物有5个，这些药物的适应证主要是癌症、感染性疾病和疼痛等病症，且具有新颖的作用机制[20-23]，充分体现了海洋天然产物成药性高的特点与对其开发的重要意义和价值。 鉴于土壤放线菌源活性次级代谢产物在抗感染药物开发中发挥的巨大作用，以及当前多种技术的发展和进步，有理由相信，海洋放线菌有望成为下一波抗感染药物开发浪潮中的主力军。因此，本综述系统总结了近十年海洋放线菌源具有强抗感染活性次级代谢产物发现的概况，并综述了部分结构新颖、活性显著的抗感染的聚酮、聚肽、生物碱、杂萜、核苷等分子的生物合成研究进展。 1 海洋放线菌源抗细菌活性分子 根据细胞壁结构成分的不同，可以分为革兰阳性菌和革兰阴性菌，二者所引起的疾病种类和危害存在明显区别。2024年5月，WHO在2017年版本基础上，更新了《2024年细菌类重点病原体目录》(2024 WHO BPPL)，纳入了15种耐药细菌，依照重要性分为关键、高度和中度优先级[12]。本综述依据活性分子对WHO列出的病原菌清单的优先顺序和活性强弱展开阐述。近些年，海洋放线菌受到高度关注，其来源的次级代谢产物非常丰富，具有强活性分子结构类型见图1。此外，本文根据化合物的类型，从聚酮、聚肽、生物碱、核苷、杂萜及其他类型进行分类介绍。 点击查看本节剩余内容▼ 1.1 聚酮类抗细菌活性分子 聚酮类分子是一类结构复杂新颖、活性多样的分子，在抗感染、抗肿瘤药物开发中具有重要地位。聚酮类分子从合成机制来说，可分为3类： I型聚酮、II型聚酮和III型聚酮。其中，I型聚酮分子具有更显著的结构和活性多样性，其次是II型聚酮分子，源自于海洋放线菌的具有抗感染活性的III型聚酮分子相对较少。 1.1.1 Ⅰ型聚酮抗细菌活性分子 结核分枝杆菌独特的生理特征和生物学特性，极大增加了抗结核药物研发难度。目前，结核病依然处于单一病原菌引起死亡疾病的首位[24]，但近40年来仅上市3个药物，且伴随新上市的药物抗药性的产生，迫切需要发现更多的抗结核活性分子，为抗结核药物研发提供储备。分离自小单孢菌(Micromonospora sp.) RJA4480中的3-amino-27demethoxy-27-hydroxyrifamycin S、3-amino-rifamycin S、sporalactam A和sporalactam B是属于利福霉素(rifamycin)家族的大环内酯类抗生素，其中3-amino-27-demethoxy-27-hydroxyrifamycin S(1)和3-aminorifamycin S(2)(图2)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 33591, MRSA ATCC 33591)、大肠埃希菌(Escherichia coli #1105)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) 具有超强抑制作用，MIC90值为0.1~0.9 nmol/L，构效关系表明3-氨基取代基能够显著增强这类抗生素对MRSA、E. coli和M. tuberculosis的抑制活性[25]。Niphimycins C~E、17-O-methylniphimycin、niphimycin Iα和19-O-malonylniphimycin是分离自菌株链霉菌(Streptomyces sp.) IMB7-145的6个尼菲霉素(niphimycin)类化合物，其中niphimycin C(3)和niphimycin Iα(4)对M. tuberculosis H37Rv、M. tuberculosis FJ05349和M. tuberculosisFJ05060具有抑菌活性，MIC值均为4 μg/mL；此外niphimycin Iα对S. aureus ATCC 29213和MRSA ATCC 33591也具有较强抑菌活性，MIC值范围为4~8 μg/mL；niphimycin C和17-O-methylniphimycin(5)对S. aureus ATCC 29213和S. aureus12-28具有较强抑菌活性，MIC值均为8 μg/mL；而17-O-methylniphimycin和niphimycin Iα对白念珠菌(C. albicans) ATCC 10231具有抑制活性，MIC值为8 μg/mL[26](图2)。 海洋放线菌中的多数分子具有良好的抗革兰阳性菌活性。Yangpumicins F~G是分离自菌株M. yangpuensis DSM 45577两种新的10元蒽醌融合的烯二炔化合物(图2)，它们对金黄色葡萄球菌具有超强活性，其中yangpumicin F(6)对S.aureus ATCC 29213 的最小抑菌浓度(<1 pg/mL)比万古霉素(1 μg/mL)强106倍，yangpumicin G(7)对S. aureusATCC 29213的 MIC值为2 pg/mL[27]。Terrosamycins A~B(8~9)是分离自菌株Streptomycessp. RKND004中的两个多环聚醚化合物(图2)，对革兰阳性菌MRSA、万古霉素耐药肠球菌(vancomycin-resistant enterococcus, VRE)和沃氏葡萄球菌(S. warneri)表现出抑菌活性，MIC值为0.34~0.9 μg/mL，与阳性对照药物万古霉素和利福平的抑菌活性相当[28]。MDN-0170是从菌株Streptomycessp. CA-271078中分离鉴定出的新napyradiomycin类化合物，与其一起被分离的还有3个已知化合物，其中已知化合物4-dehydro-4a-dechloronapyradiomycin A1(10)和 napyradiomycin A1(11)(图2)表现出显著的抗S. aureus MB5393(MRSA)活性，MIC值为0.5~8 μg/mL[29]。 Aldgamycins J~O是具有罕见辛糖支链的6种大环内酯类化合物，它们是分离自Streptomyces sp. HK-2006-1菌株，与aldgamycins一起被分离的还有两个已知化合物，其中已知化合物chalcomycin(12)(图2)对S.aureus 209P具有抑菌活性，MIC值为4 μg/mL[30]。分离自菌株Streptomyces sp. HZP2216E的23-O-butyrylbafilomycin D(13)对MRSA具有抑制作用(图2)，MIC值为7.4 μmol/L[31]。分离自S. cyaneofuscatus M-169菌株的化合物anthracimycin B(14)和anthracimycin(15)(图2)具有良好的抗菌活性，其中anthracimycin对4种革兰阳性菌S. aureus MB5393(MRSA)、S. aureusATCC29213(MSSA)、屎肠球菌(E. faecium) CL144754(VANS)和粪肠球菌(E. faecalis)CL144492(VANS)具有强抑制作用，MIC值小于0.03 μg/mL；anthracimycin B 的抑菌活性稍弱，MIC值为0.125~8 μg/mL[32]。Phocoenamicins B~C和phocoenamicin是分离自 Micromonospora sp. CA-214671菌株的螺酮类化合物，其中phocoenamicins B~C为新螺酮类化合物，但仅已知化合物phocoenamicin(16)(图3)对S. aureus MB5393(MRSA)表现出一定的抑制活性，MIC值为4~8 μg/mL[33]。分离自海洋放线菌Verrucosispora sp. SCSIO 07399菌株的3种kendomycin类似物 kendomycins B-D(17~19)，对6种革兰阳性菌S. aureusATCC 29213、S. aureus 745524、MRSA shhs-A1、 E. Faecalis ATCC 29212、B. SubtilisBS01、苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis) BT01具有抑制效果，MIC值为0.5~8.0 μg/mL[34]。分离自Streptomyces sp. 1425S.R.1a.1的化合物7,8-dideoxygriseorhodin C(20)(图3)，对S. aureus(MRSA)和E. faecium具有选择性抑制作用，MIC值为0.125~0.5 μg/mL；此外，7,8-dideoxygriseorhodin C能够与苯唑西林(oxacillin)协同对抗S. aureu ATCC 43300(MRSA)，使oxacillin的MIC值降低为原来的1/10[35]。基于放线菌Streptomyces rochei MB037与真菌Rhinocladiella similis35的共培养策略，Yu等从中分离鉴定了大环内酯类化合物borrelidin J(21)，其对MRSA表现出显著的抗菌活性，MIC值为0.195 μg/mL[36]。 Shin等Streptomyces sp. 06CH80分离得到两种大环内酯化合物macrolactin A1~B1(22~23)(图3)，对B. subtilis、E. coli、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、 S. aureus和酿酒酵母(S. cerevisiae)具有抑制活性，MIC值为0.055~0.220 μmol/L[37]。分离自 Streptomyces sp. SCSIO 41399菌株的化合物是属于替达霉素(tirandamycin)类化合物，分别命名为 isotirandamycin B、tirandamycin A和tirandamycin B，但仅有tirandamycin A(24)和tirandamycin B(25)(图3)对S. agalactiae具有较好的抑制作用，MIC值分别为5.9和5.7 μmol/L[38]。Ecteinamycin(26)是分离自Actinomadura sp. WMMB499菌株的一种聚醚类抗生素(图3)，其对艰难羧菌(Clostridium difficile) ATCC 43255、BAA-1870、 ATCC 9689、ICCD 001和ICCD 006具有强选择性抑制作用，MIC值均为0.059 μg/mL；其对C. difficile ATCC 700057、B6/6 005和B6/6 006也具有强抑制作用，MIC值均为0.117 μg/mL[39]。M. auratinigra是分离自海洋哺乳动物的肠道内溶物一种小单胞菌，Ochoa等从中鉴定了一种新的糖基化聚酮抗生素phocoenamicin(16)(图3)，该抗生素对包括肠道病原体C. difficile在内的多种革兰阳性菌具有强效抑制活性，MIC值为2.6 μmol/L[40]。 Sealutomicin A(27)是分离自菌株Nonomuraea sp. MM565M-173N2的enediyne抗生素(图4)，其对碳青霉烯类耐药菌株Enterobacteriaceae具有强抑制作用，MIC值为0.05~0.2 μg/mL[41]。Nocardiopsis sp. HYJ128是一种嗜盐诺卡菌株，Kim等从中分离鉴定了3种新型大环内酯勃利霉素(borrelidins) C~E和一种已知物borrelidin(28)(图4)，但仅有borrelidin对沙门菌(Salmonella enterica) ATCC 14028显示出强抑菌活性，MIC值为0.51 μmol/L，大约是阳性对照药物氨苄西林(MIC 1.4 μmol/L)的3倍[42]。具有罕见的大环双内酯结构特征的化合物streptoseomycin(29) 是Zhang等通过异源表达来自菌株S. chartreusis 1018 的一个76 Kb的生物合成基因簇而分离得到(图4)，其主要对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)具有强的抑制活性，MIC值为2 μg/mL；其对一组微需氧细菌嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短优杆菌(Eubacterium brachy)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)也具有较强抑制活性，MIC值为4~8 μg/mL[43]。 Gui等从菌株M. harpali SCSIO GJ089分离鉴定了 6种新螺酮糖苷microsporanates A~F(30~35)和3种已知物tetrocarcin A、tetrocarcin B和tetrocarcin P(36~38)(图4)，这10种化合物对B. thuringiensis BT01和B. subtilisBS01具有强至中等程度的抑制作用，MIC值为0.016 至8.0 μg/mL[44]。Tan等基于葡萄糖4,6-脱水酶基因筛选，获得可以生产含有糖基化合物的潜力菌株Micromonospora sp. 5-297，并从中分离鉴定了两种糖苷酸酯抗生素tetrocarcin N和tetrocarcin O和3种类似物(图4)，其中tetrocarcin A、tetrocarcin G(39)和tetrocarcin N(40)对B. subtilis ATCC 6633表现出抗菌活性，MIC值分别为2、0.125和2 μg/mL，构-效关系表明C-9的糖基和C-32的甲酰基在tetrocarcin类化合物的抗菌活性中起着重要作用[45]。 Strepoxepinmycins A~D(41~44)(图5)是分离自Streptomyces sp. XMA39菌株的medermycin型萘醌化合物，其对E. coli ATCC 25922具有抗菌活性，MIC值为4.0~10.0 μg/mL；它们对C. albicans也具有抑制活性，MIC值为6.0~10.0 μg/mL[46]。Zhou等对菌株Micromonospora sp. TP-A0468中的主代谢产物kosinostatin的骨架基因的敲除，敲除后的工程菌株不能生产kosinostatin化合物外，但发现了另外一些新峰，通过分离鉴定得到4种新聚酮化合物16-demethylrifamycins。进一步的研究发现化合物16-demethylrifamycins(45)的产生是通过两个相距甚远的聚酮基因簇pks3和M-rif之间的串扰实现。活性评价发现16-demethylrifamycin S对S. aureus、B. subtilis、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、E. coli、P. aeruginosa和耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)具有显著抑制活性，抗菌活性与rifamycin S相似。该研究不仅丰富了利福霉素的类似物库和生物合成多样性，而且还为通过聚酮生产微生物的基因组挖掘发现天然产物提供了一种辅助策略[47]。Desertomycin G(46)是分离自S. althioticusMSM3菌株的大环内酯类化合物(图5)，其对革兰阳性菌解脲棒杆菌(Corynebacterium urealyticum)1492、E. faecalis10544、E. faecalis ATCC 51299、E. faecalisATCC 29212、E. faecium 10701、S. aureus 11497、S. aureusATCC 43300和S. aureus ATCC 25923表现出抑菌活性，MIC值为0.25~8 μg/mL[48]。 Yi等从菌株Streptomyces sp. ZZ820中分离得到6种新化合物(streptoprenylindoles A~C、18-acetylcyclooctatin、5,18-dedihydroxy-cyclooctatin和5-dehydroxy-cyclooctatin)和6种已知物(3-cyanomethyl6-[3-methyl-2-butenyl]indole、N-(2-(1H-indol-3yl)ethylacetamide、1-acetyl-β-carboline、indole-3methylethanoate、cyclooctatin和chromomycin A3)，其中 chromomycin A3(47)(图5)对S. aureus(MRSA)和E. coli 表现强抑菌活性，MIC值分别为0.59和0.04 μmol/L[49]。 1.1.2 Ⅱ型聚酮类抗细菌活性分子 Rubromycins CA1和CA2(48~49)是分离自S. hyaluromycini MB-PO13T菌株的两种新的芳香聚酮类化合物(图5)，其对S. aureus IFO 12732具有显著的抑菌活性，MIC值分别为0.2和0.4 μg/mL；此外rubromycin CA1对M. smegmatis NBRC 3207具有较强抑菌活性，MIC值为3.1 μg/mL[50]。Khalil等从菌株Streptomyces sp. CMB-M0150中分离得到4种蒽环类抗生素aranciamycin I、aranciamycin J、aranciamycin A和aranciamycin，其中aranciamycins I~J 对牛分枝杆菌(M. bovis)BCG具有体外抑制作用，MIC值均为10 μmol/L；aranciamycins I-J(50~51)和aranciamycin A(52)(图6)对B. subtilis ATCC 6051和B. subtilisATCC 6633也具有抑菌活性，MIC 值为3.7~7.5 μmol/L[51]。Sattahipmycin(53)是分离自 Streptomyces sp. GKU 257-1菌株的多环氧杂蒽醌类化合物(图6)，其对B. subtilis KB211、嗜根考克菌(Kocuria rhizophilla) KB212、S. aureus KB210和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pvoryzae)KB88具有强抑菌活性，MIC值均为0.25 μg/mL[52]。Jiang等通过对M. echinospora SCSIO 04089菌株进行基因敲除，从而获得中间体homo-dehydrorabelomycin E(54)(图6)，其对S. aureus ATCC 29213的MIC值为1 μg/mL，对藤黄微球菌(M. Luteus)SCSIO ML01的MIC值为8 μg/mL[53]。Mersaquinone(55) 是分离自Streptomyces sp. EG1菌株的II型聚酮化合物 (图6)，其对S. aureusTCH1516(MRSA)具有抑菌活性，MIC值为3.36 μg/mL[54]。此外，Kim等还从菌株 Streptomyces sp. EG32中分离鉴定了两种含氯五环聚酮类化合物chlororesistoflavins A~B(56~57)(图6)，它们对MRSA TCH1516表现出抑菌活性，MIC值分别为0.25和2.0 μg/mL[55]。Nocardiopsistins A~C是分离自Nocardiopsis sp. HB-J378菌株的中3种angucyclines 类化合物，其中nocardiopsistin B(58)(图6)对MRSA 具有较强抑制活性，MIC值为3.12 μg/mL[56]。Adnani通过将菌株Rhodococcus sp. WMMA-185和 Micromonospora sp. WMMB-235的共培养从而分离得到一种新颖的双硝基糖基化蒽环化合物keyicin(59)(图6)，其对B. subtilis和S. aureus具有抑制作用，MIC值分别为8.0和2.0 μg/mL[57]。 Buanmycin和buanquinone是从菌株Streptomyces sp. SNR69分离鉴定的两种蒽醌类化合物，其中buanmycin(60)(图6)对S. enterica ATCC 14028具有强抑制作用，MIC值为0.7 μmol/L[58]。Yang等从菌株M. rosaria SCSIO N160鉴定出fluostatin生物合成基因簇fls，并通过在底盘菌株S. coelicolor YF11 中异源表达，从中分离鉴定了两种新颖化合物fluostatin L和difluostatin A，其中difluostatin A(61)(图6)是一种不常见的异二聚体，其对肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae) ATCC 13883、嗜水气单胞菌(A. hydrophila) ATCC 7966、S. aureus ATCC 29213 和E. faecalis ATCC 29212均具有抑菌活性，MIC值为4~8 μg/mL[59]。此外，Huang等将菌株M. rosaria SCSIO N160的fluostatin的生物合成基因簇flu在底盘菌株S. albus J1074进行异源表达，得到一个已知化合物mansouramycin A(62)(图6)，其对MRSA ATCC 43300 具有抑制作用，MIC为8 μg/mL[60]。 Medermycin(63)和antibiotic G15-F(64)(图6)是分离自 S. albolongus CA-186053菌株的两个属于II型聚酮的已知化合物，它们对MRSA具有抗菌活性，MIC值为2至4 μg/mL[61]。Koyama等从菌株Streptomyces sp. OPMA02852中分离得到新化合物steffimycin E及其3 种同系物(65~68)(图6)，其中steffimycin E对胞内分枝杆菌(M. intracellulare)JCM6384具有抑制活性，MIC值6.25 μg/mL；而steffimycin、10-dihydrosteffimycin 和8-demethoxysteffimycin对M. intracellulare JCM6384 和鸟型分支杆菌(M. avium) JCM15430的抗菌活性更强，MIC值为0.39~6.25 μg/mL[62]。 1.1.3 Ⅲ型聚酮抗细菌活性分子 Shen等从菌株Streptomyces sp. B9173中分离鉴定了7个含萘醌的混源萜类化合物，它们是从常见的萘醌骨架和随后的氧化、甲基化、异戊二烯化和氨基掺入后衍生而来的flaviogeranin同系物或中间体，其中flaviogeranin D(69)和flaviogeranin C2(70)对S. aureus ATCC 43,300和M. smegmatis MC2 155具有抑制作用 (图6)，MIC值为5~9 μg/mL，与阳性对照药物红霉素的MIC值相当[63]。 1.2 肽类抗细菌活性分子 1.2.1 非核糖体肽抗细菌活性分子 怡莱霉素(Ilamycins)又叫ruformycins，其最早于20世纪60—70年代以单体或混合物的形式从几株链霉菌中分离得到[64-67]。其于2000年又被从另外一株链霉菌S. macrosporeus DSM-12818中分离得到[68]。Ma等于2017年首次报道了分离自深海来源放线菌S. atratus SCSIO ZH16的6个环七肽化合物ilamycin B1、 B2、C1、C2、D及微量成分ilamycin E1(图7)，研究人员在鉴定ilamycin生物合成基因簇和解析其生物合成机制的基础上实现了对微量成分的高产表达。活性评价发现该类分子具有专属性的结核分枝杆菌抑制活性，其中怡莱霉素ilamycin E1(71)(图7)的抗结核活性(M. tuberculosis H37Rv)达到9.8 nmol/L[69]。Sun等又通过对S. atratusSCSIO ZH16 ΔilaR工程菌株的200 L的规模发酵，从中分离得到另外12个怡莱霉素结构衍生环肽ilamycins G~R(72~83)(图7)，均对 M. tuberculosisH37Rv具有显著或良好的抑制作用，MIC值为0.0096~10 μmol/L不等[70]。近期研究团队还基于突变合成原理，将4种不同类型的酪氨酸衍生物分别喂养给两个生物合成突变体ΔilaLM和ΔilaMNR 后，生产了18个含有卤代或二硝基取代的新ilamycin 衍生物(84~94)(图7)，其中卤代化合物表现出良好的抗结核活性(MIC约0.30~10 μmol/L)，同时显示较小或无细胞毒性(IC50 >50 μmol/L)，并且溴代ilamycin与氯、氟或硝基相比表现出更强的抗结核活性和更低的细胞毒性[71]。抗结核作用机制研究表明，怡莱霉素是一类作用于结核分枝杆菌蛋白降解系统的伴侣蛋白Clp1和ClpX的双靶点抑制剂(内部资料)。上述研究揭示了怡莱霉素的构-效关系，为抗结核药物研发提供了药物先导。为了充分挖掘该菌株的代谢潜力，Sun通过等离子诱变和代谢阻断技术，又从工程菌株S. atratus SCSIO ZH16NS-100S中激活、分离、鉴定了含肉桂酸侧链环肽类化合物atratumycin(95)(图 8)，其对M. tuberculosis H37Ra和H37Rv具有抑菌活性，MIC值分别为3.8和14.6 μmol/L[72]。Yang等基于肉桂酰环肽的合成原理，又通过组合生物合成又获得了抗结核活性更强的atratumycin B(96)(图8)，其对M. tuberculosisH37Rv的抑制活性分别为2.3 μmol/L[73]。 点击查看本节剩余内容▼ Aquimarins A~B(97~98)(图8)等是分离自 Aquimarina sp. Aq135菌株的抗菌肽，其特征在于具有不寻常的C末端氨基和氯代的新骨架。活性评价发现aquimarins A~B对M. tuberculosis H37Rv具有很强的抑制作用，IC50值分别为45和23 nmol/L，IC90值分别为323和231 nmol/L[74]，基于aquimarins A~B及其非天然变体的全合成与活性评价揭示了其构-效关系，发现aquimarin的卤化与其抗菌活性关系不大，但能增强其细胞毒活性。相比之下，缺乏C末端胺的变体分子几乎是无活性的，这表明类似于aquimarin末端残基的二胺结构是新型拟肽抗生素的候选构建模块。Geninthiocin是具有广谱抗菌活性的硫肽类化合物，Iniyan等从菌株Streptomyces sp. ICN19中分离鉴定了新硫肽类化合物Ala-geninthiocin和两个已知geninthiocin类化合物(图8)，其中Ala-geninthiocin(99)和 geninthiocin(100)(图8)对革兰阳性菌B. subtilisDSM10、 M. smegmatis DSM43756和M. luteusDSM1790表现出抑菌活性，MIC值为0.2~10 μg/mL[75]。Streptocinnamides A~B是分离自Streptomyces sp. KMM 9044菌株的两个高度氯代的缩酚酸肽化合物，其中streptocinnamide A(101)(图8)对革兰阳性菌微球菌属(Micrococcus sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.) ATCC 21022和M. smegmatisMC2 155具有显著抑制作用，MIC值分别为4、20和300 ng/mL[76]。Jiao等从菌株Streptomyces sp. LHW52447中分离鉴定了4种新D型放线菌素类似物actinomycins D1~D4和已知物actinomycin D(102) (图8), 其中actinomycins D1~D2(103~104)对MRSA的抗菌活性(MIC值为0.125~0.25 μg/mL)比actinomycins D3~D4(105~106)(图9)和actinomycin D(MIC值为 0.5~1.0 μg/mL)的活性更强[77]。Reynolds等通过对菌株Saccharomonospora sp. CNQ-490中的沉默基因簇进行异源表达，从中分离得到两种新脂肽类抗生素taromycins A~B和一种已知物daptomycin(107~109) (图9)，它们对MRSA A8819-DapS表现出强效活性，MIC值分别为3.1、3.1和2.5 μg/mL[78]。Marformycins A~F(110~114)是分离自S. drozdowiczii SCSIO 10141 菌株的6种环七肽类化合物(图9)，其中marformycins A~E对M. luteus具有抑制活性，MIC值分别为0.25、4.0、0.25、0.063和4.0 μg/mL[79]。尽管核磁共振技术在天然产物鉴定方面取得了重要进展，但结构测定通常很慢，并且构成了天然产物发现的瓶颈。Eudistamides A~B是Zhang等首次应用三维核磁共振技术从Streptomyces sp. WMMB 705菌株鉴定的两种新型肉桂酰环肽，其中eudistamide B(115)(图10)对B. subtilis具有抑菌活性，MIC值为2.8 μmol/L，基于三维核磁共振技术对复杂分子进行结构鉴定将有助于天然产物结构解析瓶颈问题的突破[80]。 Kresna等从菌株Streptomyces sp. s120中分离鉴定了两种azinothricin环六缩酚酸肽polyoxyperuin A seco acid和polyoxyperuin A(116)(图10)，其中 polyoxyperuin A对M.luteusDSM20030和李斯特菌 (L. monocytogenes) DSM20600表现出显著抑菌效果，MIC值<0.031 μg/mL；而对S. aureus ATCC25923活性稍弱，MIC值为0.125 μg/mL[81]。 Chen等从菌株M. chalcea FIM 02-523中分离鉴定了3种含长脂肪酸链环肽rakicidins G-I(117~119) (图10)，对革兰阳性厌氧菌C. difficile ATCC 43255、 C. difficileATCC BAA-1382、厌氧消化链球菌 (P. anaerobius)ATCC 27337、牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis) ATCC BAA-308和P. acnes ATCC 11827 表现出抑制活性，MIC值在0.125~8 μg/mL[82]。Mollemycin A(120)(图10)是分离自Streptomyces sp. CMB-M0244菌株中的一种环肽化合物，其对革兰阳性S. aureusATCC 25293、S. aureus ATCC 9144、S. epidermidis ATCC 12228、B. subtilis ATCC 6051、B. subtilisATCC 6633和革兰阴性菌E. coli ATCC 25922、P. aeruginosa ATCC 27853具有抑制作用，IC50值为10~50 nmol/L；此外mollemycin A对药物敏感型恶性疟原虫(Plasmodium falciparum) 3D7和多重耐药型P. falciparumDd2疟原虫也具有显著的抑制活性，IC50值分别为7和9 nmol/L[83]。Hormaomycins B~C(121~122)(图10)是分离自Streptomyces sp. SNM55 菌株中的两个hormaomycin家族的肽类化合物，它们对革兰阳性菌S. aureus、K. rhizophila抑菌活性较强，MIC 值为0.23~7 μmol/L；此外hormaomycin C对酿脓链球菌(S. pyogenes)具有较强抑菌活性，MIC值为8 μmol/L[84]。 1.2.2 核糖体肽抗细菌活性分子 Seyedsayamdost等通过使用高通量激发子筛选HiTES 与生物活性偶联的方法，从菌株Saccharopolyspora cebuensis中分离鉴定了一种羊毛硫肽抗生素cebulantin (123)(图10)，该化合物能够选择性地抑制革兰阴性菌E. coli(ΔlptD)和副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)，IC50值分别为(9.7±0.4)和(8.8±2.1) μmol/L，为抗革兰阴性菌的开发提供了潜力分子[85]。 1.3 生物碱类抗细菌活性分子 Aksoy等从菌株S. rochei 06CM016中分离得到一种新胞嘧啶核苷类化合物rocheicoside A和4种类似物，其中plicacetin(124)(图11)对E. coli O157: H7RSKK 234、MRSADSM11729和C. albicans DSM 5817具有较强抑菌活性，MIC值为4~8 μg/mL；norplicacetin(125)和rocheicoside A(126)仅对MRSADSM11729和C. albicans DSM 5817表现较强抑菌活性，MIC值为4~8 μg/mL[86]。Actinonin(127)(图 11)是分离自Streptomyces sp. NHF165菌株中的化合物，具有抑制V. anguillarum肽脱甲酰基酶和抗V. anguillarum的活性，IC50值分别为6.94和2.85 μmol/L。研究人员基于诱导突变和可能靶标的基因敲除，初步推测actinonin对鳗弧菌的抑制作用是通过作用folD基因发挥功能[87]。Bulbimidazoles A~C(128~130)(图11)是分离自Microbulbifer sp. DC3-6菌株3种烷基酰咪唑类化合物，它们对Kocuria rhizophilaATCC9341 和S. aureus FDA209P JC-1具有抑制作用，MIC值为0.78~3.12 μg/mL；bulbimidazoles A~B对 Tenacibaculum maritinum NBRC16015活性稍弱， MIC值为3.12和6.25 μg/mL[88]。Song等从深海来源链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 11791菌株中分离鉴定了两种新的氯化双吲哚生物碱，dionemycin(131)(图 11)和6-OMe-7',7″-二氯色原酸，以及7种已知类似物，这两种双吲哚生物碱对人源和猪源的6种MRSA 具有抑制作用，MIC值范围为1~2 μg/mL，构-效关系分析表明，C-6"处的氯原子可能是赋予其生物活性的关键，从而为药物设计中双吲哚生物碱骨架的化学修饰提供了线索[89]。Pseudonochelin(132)(图11) 是从海洋来源的Pseudonocardia sp.细菌中分离到的一种铁载体，该化合物的发现得益于基因组挖掘和代谢组学技术的应用。其抗菌活性显示为非离子依赖型特征，非离子结合型的pseudonochelin对MSSA 和MRSA具有抑菌作用，MIC值为4 μg/mL，而铁或镓结合型pseudonochelin没有抑制活性[90]。Xu等从菌株Streptomyces sp. SMS636中分离鉴定了两种新的哌嗪三酮类化合物，分别命名为lansais E和F，此外还发现了4种已知的次级代谢产物，分别是lansai D、1-N-甲基-(E,Z)-albonoursin、咪唑并[4,5-e]-1,2,4-三嗪和streptonigrin，其中已知化合物streptonigrin(133)(图11)对 S. aureus、MRSA和B. Calmette-Guérin表现出显著的抑菌活性，MIC值分别为0.78、0.78和1.25 μg/mL[91]。Takehana等从菌株S. fradiae MM456M-mF7分离鉴定了一种新型铁离子载体fradiamine A和其衍生物fradiamine B(134)(图 11)，其中fradiamine B对C. difficile BAA-1382表现出抑菌活性，IC50值为8 μg/mL[92]。 点击查看本节剩余内容▼ Chen等从菌株Verrucosispora sp. FIM06-0036中分离鉴定了两种生物碱化合物2-ethylhexyl 1H-imidazole-4-carboxylate和butyl 1H-imidazole4-carboxylate，其中2-ethylhexyl 1H-imidazole-4carboxylate(135)(图11)对Helicobacter pylori具有较强抗菌活性，MIC值为8 μg/mL[93]。Newaz等从菌株 Streptomyces sp. ZZ1118中分离得到4种新吲哚生物碱streptoindoles A~D，其中streptoindole B(136)(图11) 对MRSA和C. albicans具有较强抑菌活性，MIC值为7 μg/mL；streptoindole C对E. coli和C. albicans也具有抑菌活性，MIC值为7 μg/mL[94]。Igarashi等从菌株Kocuria sp. T35-5中分离鉴定了4种烷基酰咪唑类化合物nocarimidazoles A~D(138~141)(图11)，其中nocarimidazole A、nocarimidazole C和nocarimidazole D对革兰阳性菌Kocuria rhizophila ATCC9341表现出抑菌活性，MIC值均为6.25 μg/mL；此外nocarimidazole A、nocarimidazole B和nocarimidazole D 对真菌红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)NBRC5467，MIC值均为6.25 μg/mL[95]。 1.4 混源萜抗细菌活性分子 混源萜(Meroterpenoids)是一类由萜类(terpenoid)和非萜类(如聚酮、苯丙素、生物碱等)结构单元混合形成的天然化合物，广泛存在于植物、真菌和海洋生物中。它们结构多样，生物活性显著，是药物研发的重要来源。混源萜的结构多样性源于萜类与非萜类模块的灵活组合，其独特的化学结构和生物活性使其成为天然产物研究和药物开发的热点领域。Jin等从菌株S. olivaceus OUCLQ19-3中分离得到两种新dixiamycin型抗生素和6种xiamycin类似物，其中dixiamycin 12a、dixiamycin 12b、dixiamycin B、dixiamycin A和dixiamycin 8(142~146)(图12)对S. aureus CCARM 3090、E. faecalis CCARM 5172和P. aeruginosa15690 的抑制作用比阳性对照四环素更强，MIC值为 0.78~6.25 μg/mL[96]。 Kaysser等在他们从海洋微生物中寻找具有抗癌和抗感染活性的药物筛选时，从一株加利福尼亚州的海洋沉积物样品来源的Streptomyces sp. CNH-189中发现了一类罕见的含有四羟基萘结构单元的混源萜类化合物merochlorin A、merochlorin B 和merochlorin C(图12)。其中merochlorin A(147)和 merochlorin B(148)对临床来源的MRSA具有显著的抑制活性，MIC为2~4 mg/mL，但是merochlorin C的抑菌活性较弱[97]。Merochlorins E~F(149~150)也是分离自Streptomyces sp. CNH-189菌株的另外两个混源萜类化合物(图12)，其对B. subtilis ATCC 6633、K. rhizophila ATCC 9341和S. aureus ATCC 6538表现出抑菌活性，MIC值范围为1~2 μg/mL[98]。 1.5 其他类抗细菌活性分子 借助基于MS/MS的分子网络和X射线单晶衍射分析，Chang等从菌株Nocardiopsis sp. HDN154086 中分离鉴定了5种对三联苯衍生物nocarterphenyls D~H，其中nocarterphenyl D(151)(图13)对变形杆菌 (Proteus species)、蜡样芽孢杆菌(B. cereus)、草分枝杆菌(M. phlei)、B. subtilis、V. parahemolyticus和E. coli显示出良好的活性，MIC值为1.5~6.2 μmol/L[99]。通过在海洋来源的短杆菌属7002-073中异源表达表达VioAG231L变体的重组质粒pWLI823，从中获得了一种新的14元同型二聚体大环二内酯brevidiolide以及4种已知的芳香族化合物，其中已知化合物2-methyl1,4-naphthalenedione(152)，对S. aureusCCARM 3090和 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883表现出抑制作用，MIC 值为3.12 μg/mL[100]。Tripathi等从菌株S. tempisquensis分离鉴定了两种铁离子载体类抗生素baulamycins A~B， baulamycin A(153)(图13)在缺铁条件下对E. coli具有抑菌活性，IC50值为4.2 μmol/L[101]。 2 海洋放线菌源抗真菌活性分子 真菌感染，尤其是侵袭性真菌感染，已成为全球公共卫生的重大威胁，其特征包括高致死率(部分感染致死率高达88%)、易感人群集中于免疫缺陷患者 (如HIV感染者、癌症患者及器官移植受者)，以及真菌的免疫逃逸机制(如白念珠菌通过激活B细胞连接蛋白 BLNK抑制巨噬细胞迁移)导致的治疗复杂化[102]。目前抗真菌治疗面临多重困境，包括耐药性问题严峻(如耳念珠菌等耐药菌株的出现)、药物选择有限(过去10 年仅4种新药获批)、副作用显著(如两性霉素B的肾毒性)、儿童适用方案缺乏，以及商业化困难等(市场小、研发投入回报低)。抗真菌药物研发虽道路艰难，但科学家和企业界从未停止探索的脚步。中国药科大学的王宗强教授团队近期在抗真菌的研发方面取得突破性进展，他们发现了靶向真菌细胞膜磷脂，广谱杀菌且毒性较低的曼迪霉素(mandimycin)，为抗真菌药物研发提供了新机制候选药物[103]。国产两性霉素B脂质体(欣必松®)的上市，为耐药真菌感染提供了新选择。然而，全球范围内仅有9种抗真菌药物处于临床研发阶段，其中仅3种进入后期试验，远不能满足需求，还需要开发新的抗真菌抗生素。近10年来从海洋放线菌中发现的活性在10 µmol/L或<10 µg/mL 的抗真菌分子有27个，根据结构类型其占比如图14。 点击查看本节剩余内容▼ 2.1 聚酮类抗真菌活性分子 基于抗真菌的活性追踪的分离方法，Pérez-Victoria等从放线菌S. caniferus CA-271066中分离鉴定了4种36元多元醇的新大环内酯类caniferolides A~D(155~158)(图15A)，其对C. albicans和烟曲霉 (A. fumigatus)表现出显著的抑菌活性，MIC值分别为2~8和0.5~2 μg/mL[104]。 2.2 肽类抗真菌活性分子 Wibowo等从菌株S. cavourensis SV 21中分离鉴定了4种肽类化合物streptodepsipeptide P11B、streptodepsipeptide P11A、valinomycin和 streptodepsipeptide SV21，其中streptodepsipeptide P11A和valinomycin(159~160)(图15B)对冻土毛霉(Mucor hiemalis)和鲁杰菌(Ruegeria glutinis)具有抑制活性，MIC值为2.1~8.3 μg/mL[105]。Mohangamide A~B是分离自S.sp. SNM55菌株的含有14个氨基酸的环肽类化合物，其中Mohangamide A(161)对C. albicans异柠檬酸裂解酶具有很强的抑制活性，IC50值为4.4 μmol/L[106]。 2.3 聚酮聚肽杂合抗真菌活性分子 Lacret等通过活性追踪的方法从菌株S. zhaozhouensis CA-185989分离鉴定了3种新多环内酰胺类化合物isoikarugamycin、28-N-methylikarugamycin和30-oxo-28-Nmethylikarugamycin和4种已知化合物，其中isoikarugamycin、28-N-methylikarugamycin和Ikarugamycin(162~164)(图15C)对Aspergillus fumigatus、C. albicans和MRSA具有抑菌活性，MIC值为2~8 μg/mL[107]。 2.4 生物碱类抗真菌活性分子 Marinocyanins A~F是从菌株Actinomycete sp. CNS-284和CNY-960中分离鉴定了一类新溴苯吩嗪类化合物，其中marinocyanins A~C(165~167)(图15C) 对耐两性霉素C. albicans具有抑菌活性，MIC值为0.95~5.79 μmol/L[108]。 2.5 其他类抗真菌活性分子 Mangamuri等从菌株S. cheonanensis VUK-A中分离鉴定了两种化合物2-methylbutyl propyl phthalate 和diethyl phthalate，其中2-Methylbutyl propyl phthalate(168)(图15C)对Proteus vulgaris的抑菌活性最佳，MIC值为4 μg/mL；对C. albicans具有较强的抗真菌活性，MIC值为8 μg/mL[109]。 3 海洋放线菌源抗寄生虫活性分子 寄生虫病依然是很多发展中国家或地区的一个重要公共卫生问题。随着全球化进程的加快、气候变化以及人口流动的增加，寄生虫病的流行特征也在发生变化。抗寄生虫药物研发是寄生虫病防治的重要支柱，当前市场上的抗寄生虫药物主要包括化学合成药物、生物制剂和传统中药3大类。这些药物针对不同寄生虫的生活史特点和致病机制，发挥着治疗和预防作用。尽管现有抗寄生虫药物在疾病控制中发挥了重要作用，但仍存在诸多局限性和挑战：①耐药性问题日益严峻；②药物副作用影响患者依从性；③治疗成本限制了在资源匮乏地区的应用；④药物研发投入不足。面对这些挑战和局限，抗寄生虫药物研发需要不断创新，探索新靶点、新机制，开发更安全、有效且不易产生耐药性的新型药物，同时优化现有用药方案，提高药物的可及性和可负担性。我们系统总结了近十年来海洋放线菌来源的活性显著的抗寄生虫活性分子，不同类型的抗寄生虫活性分子共29个，不同类型分子所占的比例见图16。 点击查看本节剩余内容▼ 3.1 聚酮类抗寄生虫活性分子 Kirromycin B、kirromycin A和kirromycin C(169~171)(图17)是分离自Streptomyces sp. CB00686 菌株的3个聚酮类化合物，在体外对LDW1 Drosophila 细胞的Wolbachia清除实验中，发现这3个分子比阳性对照药物doxycycline(IC50值为152±55 nmol/L)具有更优的抗Wolbachia活性，IC50值分别为(0.58±0.15)、 (0.25±0.11)和(1.08±0.29）nmol/L。此外，在对离体的Brugia pahangi卵巢中的Wolbachia内共生体清除实验中，这3个化合物在1 µmol/L浓度下清除 Wolbachia体内共生体的效率(65%~90%)高于阳性药多西环素(50%)。这些结果表明，kirromycin是一种有效的先导化合物骨架，对它们的进一步探索可能有助于开发治疗丝虫感染的新方法[110]。Lobosamides A~C是分离自Micromonospora sp. RL09-050-HVF-A 菌株的新聚烯大环内酰胺类化合物，研究人员通过分析其基因簇及采用了一种“从分子到基因再到分子”的策略，以确定其他细菌中相似簇的普遍性，并因此从另一株放线菌Actinosynnema mirum 中发现了其他两个同类的大环内酰胺mirilactams A~B。活性评价发现lobosamides A~B(172~173)(图 17)对布氏锥虫(Trypanosoma brucei Lister) 427表现出生长抑制作用，IC50值分别为0.8和6.1 μmol/L，但lobosamide C、mirilactams A和B对T. brucei Lister 427的活性是大于10 μmol/L。基于对不同结构分子的活性评价，发现C14-C15的双键构型及C10的羟基化修饰与否与其抗虫活性强弱相关，揭示了该类分子的构-效关系。此外，“分子-基因-分子” 研究策略通过整合化学分析与基因组学技术，在发现和鉴定针对被忽视疾病靶点的新型天然产物先导化合物方面展现出显著优势[111]。SF2446A2(174)(图17)是分离自Streptomyces sp. RV15菌株的萘酚糖苷类化合物，对沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)具有抑制作用，其IC50值为(4.03±0.35) μmol/L。此外，SF2446A2还对Schistosoma mansoni表现出显著的抑制作用，主要体现在卵产量减少、畸形卵增多、血吸虫体表变化以及其生殖腺损伤[112]。Elaiophylin(175)和herbimycin G(176)(图17)是分离自Strptomyces sp. USC-16018 菌株的两类聚酮化合物，其中elaiophylin对药物敏感型Plasmodium falciparum 3D7和pyrimethamine耐药型P. falciparum Dd2均具有抑制活性，IC50值分别为778和 598 nmol/L；而herbimycin G(176)在40 μmol/L浓度下对P. falciparum 3D7具有77%的抑制作用[113]。Tawfike 等从放线菌Actinokineospora spheciospongiae中分离鉴定了两种新糖基化聚酮化合物fridamycins H~I，其中fridamycin H(177)(图17)在48和72 h对布鲁氏锥虫 Trypanosoma brucei TC221表现出良好的抑制作用，IC50值分别为7.18和3.35 μmol/L[114]。Wang等从放线菌突变株S.sp. S1502/∆stp1中分离鉴定了5种angucyclines 类化合物WS-5995 A~E，其中WS-5995 A(178)(图17)具有明显的抗艾美尔球虫Eimeria tenella活性，IC50值为2.21 μmol/L[115]。 3.2 肽类抗寄生虫活性分子 以促进抗疟疾NPEs(natural product extracts) 的快速识别和优先级排序，Cheng等采用药理学驱动的定量高通量筛选(qHTS)方法，从两种菌株S. ballenaensis 22278-N3和07-234-A1中分离鉴定了结构异常复杂的含有非蛋白源氨基酸四肽化合物actinoramides A~B，其中actinoramide A(179)(图17) 对5种寄生虫P. falciparum Dd2、HB3、7G8、GB4和 cp250具有抑制作用，EC50值为0.01~0.03 μmol/L[116]。 Harinantenaina等从菌株Streptomyces sp. S.4分离鉴定的一种酸类化合物±-monactic acid和一种新二肽类化合物xestostreptin，其中±-monactic acid(180)对恶性疟原虫Plasmodium falciparum Dd2表现出较强的抑制活性，IC50值为6.5 μmol/L[117]。 3.3 生物碱类抗寄生虫活性分子 Buedenbender等从菌株S.sp. USC-636中分离鉴定了二酮哌嗪类化合物naseseazine C(182)(图17)，该化合物对chloroquine敏感型Plasmodium falciparum(3D7)具有中等程度抑制活性，IC50值为(3.52±1.2) μmol/L[118]。 3.4其他类抗寄生虫活性分子 Schulze等从Salinispora sp. RL08-036-SPS-B中分离鉴定了11个长链双环磷酸酯类化合物salinipostins A~K(183~193)(图17)，对恶性疟原虫Plasmodium falciparum有抑制活性，但不同分子对恶性疟原虫的活性差异较大，EC50值为50 μmol/L到50 nmol/L；构-效关系分析表明R2链长的增加使活性增强，乙烯基脂肪链(R1)的碳原子数量增加也会使活性提高，R1位置的取代基含有支链脂肪链会使活性降低[119]。Adipostatins A~D(194~197)(图17)是分离自 Streptomyces sp. 4875菌株的4个烷基间苯二酚类新化合物，它们能抑制马来丝虫天冬酰胺酰tRNA合成酶的活性，进而有效杀死Brugia malayi parasites成虫。在100 μmol/L浓度下，adipostatins B~C能在24 h内迅速杀死所有成虫，而在该浓度下，adipostatin A和adipostatin D 需要48 h才能完全杀死成虫；在低于100 nmol/L的浓度下，adipostatin C和adipostatin A分别在8和9 d内才能有效杀死成虫[120]。Nakashima等从菌株Lechevalieria aerocolonigenes K10-0216中分离得到两个新环十五烷类化合物mangromicins A~B，其中mangromicin A(198)(图17)具有抗Trypanosoma brucei brucei GUTat 3.1活性，IC50值为2.4 μg/mL[121]。 4 海洋放线菌源抗病毒活性分子 Euanorasetr从菌株Actinomadura sp. 2EPS中分离鉴定了3种对登革热病毒血清型2(DENV-2)具有抑制活性的spirotetronate类化合物2EPS-A、2EPS-B 和2EPS-C(199~201)(图18)，在Vero细胞的细胞毒性测试中，2EPS-A、2EPS-B和2EPS-C的LC50值分别为11.6、27.5和12.0 μg/mL。在基于细胞的复制试验中，进一步分析了细胞毒性最小的2EPS-B对病毒繁殖的影响。当感染DENV-2的细胞暴露于2EPS-B时，在6.25 μg/mL的浓度下，它可以减少约94%的Vero细胞的DENV-2感染，而在用相同浓度的2EPS-B直接处理DENV-2并随后感染Vero细胞时，则发现2EPS-B 没有抑制DENV-2对Vero细胞的感染作用。在体外试验中，2EPS-A、2EPS-B和2EPS-C对DENV-2 NS2BNS3蛋白酶表现出强烈的抑制作用，IC50值分别为 (1.94±0.18)、(1.47±0.15)和(2.51±0.21) μg/mL。因此，2EPS类螺酮化合物可能通过抑制病毒蛋白酶来阻止病毒复制和病毒组装[122]。 5 海洋放线菌源抗感染活性次级代谢产物的生物合成 海洋放线菌来源的次级代谢产物通常具有复杂新颖的化学结构以及多样的生物活性，暗示其存在特殊的生物合成途径以及新颖的酶学机制负责次级代谢产物的生物合成。2000年Moore课题组报道了首例海洋放线菌来源的次级代谢产物enterocin的完整生物合成基因簇[123]，随后开启了海洋来源放线菌的次级代谢产物生物合成研究热潮。近十年文献资料表明，目前有62个具有抗感染活性的海洋来源放线菌天然产物开展了生物合成研究。在这被报道的 62个生物合成基因簇中(表1)，以聚酮类化合物的合成途径为主，包括I型聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)、II型聚酮合酶。此外还包括非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase, NRPS)以及PKS/ NRPS杂合合成途径以及一些生物碱和核苷酸类化合物合成途径(图19)。海洋放线菌源活性次级代谢产物生物合成机制的阐释为仿生合成提供了思路借鉴，功能新颖的生物合成酶的功能表征及催化机制阐明为复杂分子的结构改造提供酶学工具。 点击查看本节剩余内容▼ 5.1 聚酮分子生物合成基本原理 聚酮类化合物(polyketides, PKs)是一类由PKS负责催化合成的天然产物，该类化合物种类庞大，结构复杂多样，因此解析和阐明该类天然产物的复杂生物合成过程成为了近十年来海洋放线菌天然产物生物合成的热点，且其基本的合成范式已被阐明[124-127]。PKs通过PKS催化简单小分子羧酸辅酶A的连续脱羧克莱森缩合(decarboxylative Claisen condensation) 构建核心骨架。根据PKS的合成方式或使用的底物的不同可以将PKS分为I型、II型和III型。I型PKS的经典模块包含酰基转移酶(acyltransferase, AT)，催化Claisen缩合反应的酮脂酰-ACP合酶(KS)，以及接受KS催化产物并将其传递到下一个AT模块的酰基载体蛋白(acyl carrier protein, ACP)这3个基本的酶结构域。合成装配线上修饰结构域如酮还原酶 (ketoreductase, KR)、脱水酶(dehydratase, DH)、烯酰还原酶(enoylreductase, ER)参与控制β酮羰基的氧化还原状态以及α/β-C上取代基的立体构型，组装完的碳链由硫酯酶(thioesterase, TE)结构域以环化或水解方式释放[128-129]。环化或水解释放的聚酮前体在复杂多样的后修饰酶作用下生成成熟的次级代谢产物。近10年发现的具有抗感染活性的海洋放线菌聚酮次级代谢产物包括20个I型PKs，8个II型PKs和3个IIⅠ 型PKs(表1)。 5.1.1 海洋放线菌源代表性I型聚酮分子的生物合成 5.1.1.1 Streptoseomycin的生物合成 Streptoseomycin是一种分离自S. seoulensis A01菌株的具有罕见5/14/10/6/6五环环系以及一个醚桥的大环内酯类化合物，且其具有显著的抗幽门螺杆菌活性[43]。Zhang等通过生物信息学分析和异源表达确定了其生物合成基因簇stm，stm全长约76 kb，包括32个开放阅读框[43]。由于还没有streptoseomycin这类分子的遗传和生源途径的报道，Zhang等首先通过同位素喂养实验揭示了streptoseomycin多个C原子的生源途径，其中streptoseomycin的10/6/6三环遵循典型聚酮生源途径。同时，13C标记乙酸钠和琥珀酸盐的喂养实验证实，马来酸酐的五碳组分直接来源于α-酮戊二酸(α-KG)。然而，四碳部分没有被13C标记的琥珀酸盐标记，推测其可能来源于三羧酸循环 (TCA)。Streptoseomycin在结构上与nargenicin[130]、 nodusimicin[131]、coloradocin[132]和branimycin[133]相关，所有这些分子都是强效抗生素且共享10(9)/6/6三环系统。推测这些抗生素共有的顺式十氢萘环是通过分子内[4+2]环加成反应酶促形成[43,134]。然而， Zhang等确定这种结构是以一种前所未有更为复杂的方式形成[43]。进而通过“自下而上”的策略，重构目标合成途径，获得重要的生物合成中间体，并基于中间体体喂养、体外酶学功能表征、蛋白晶体结构解析及密度泛函理论计算，鉴定了StmD为催化 [6+4]-和[4+2]-双周环酶，介导6/10/6-和10/6/6-三环加合物(6和7)的生成(图20)，首次发现了自然界中负责[6+4]环加成反应周环酶，并揭示了其催化周环反应的分子机制[135]。此外，还发现[6+4]-加合物(6)和[4+2]-加合物(7)可以通过自发的[3,3]-Cope重排相互转换[135](图20)。 研究团队进一步利用前面构建的研究策略(基因敲除、途径重构、体外酶学表征及蛋白晶体结构解析等)，确定了3种氧化还原酶StmO1、StmO2和 StmK以协同方式构建STM生物合成所需的10/6/6三环骨架[134]。一对核黄素依赖的氧化还原酶StmO1 和StmO2负责[6+4]加合物(6)的直接羟基化。随后，自发的[3,3]-Cope重排和烯醇酮互变异构导致形成 10/6/6-三环中间体12b，其可以通过StmK的酮还原进一步转化为稳定的10/6/6-三环醇(11)(图20)。异二聚体酶复合物NtfO1-NtfO2(具有与StmO1-StmO2等效功能的同源物)的晶体结构揭示了蛋白质-蛋白质相互作用。他们的研究结果表明，[6+4]-加合物而不是[4+2]-加合物是streptoseomycin真正的生物合成中间体(图20)[136]。因此，他们的工作展示了大自然是如何创造酶和非酶反应组合，以精确控制天然产物的合成。 5.1.1.2 非经典安沙霉素类聚酮化合物kendomycin B 的生物合成 海洋来源的稀有放线菌Verrucosispora sp. SCSIO 07399可产生安沙霉素类聚酮衍生物kendomycins B~D，结构上kendomycins B~D包含一个独特的全碳环的大环安沙骨架[34]，但其全碳环骨架的合成机制一直是未解之谜。基于生物信息学分析、基因敲除和异源表达，Chen等从Verrucosispora sp. SCSIO 07399基因组上鉴定出kendomycin的生物合成基因簇 kmy。kmy基因簇包含33个开放阅读框，研究人员通过基因敲除和喂养实验验证了III型PKS Kmy18、双加氧酶 Kmy16、苯甲酰甲酸脱羧酶Kmy15和苯甲醛脱氢酶Kmy14协同负责生成前体单元3,5-二羟基苯甲酸(3,5-DHBA)，被装配到Kmy19起始模块的ACP结构域，并与Kmy19的模块1和模块2的识别的甲基丙二酰单酰辅酶A进行脱羧缩合实现装配线的延伸，进而由Kmy20、Kmy10、Kmy11和Kmy12组成的装配线以另外的4个甲基丙二酰单酰辅酶A和2个丙二酰单酰辅酶A为延伸单元，完成kendomycin聚酮骨架的组装合成。研究人员通过进一步的基因敲除、18O标记实验、生物转化、体外酶反应及点突变实验等，证明FAD依赖的单加氧酶Kmy13通过介导多步连续氧化来实现的kendomycin B全碳环的形成，并基于蛋白结构预测、底物对接和点突变实验确定了Kmy13 的催化活性中心，推测了其催化机制(图21)[137]。此外，研究团队还通过定量PCR(RT-qPCR)确定了该基因簇中调节基因kmy4的正调控功能[138]。 5.1.2 海洋放线菌源II型聚酮分子的生物合成 II型PKS聚酮合酶与I型聚酮合酶相比，相对较小，其特点在于可以重复催化多次克莱森脱羧缩合反应，形成多酮基不稳定碳链。II型的PKS模块包含缩合酶KSα，KSβ和一个酰基载体蛋白(ACP)，聚酮链的延伸机理同I型PKS类似，不同之处在于合成反应完成后，II型PKS酶的催化亚基对合成的聚酮化合物前体分子的折叠有指导作用[139]。天然合成的II型PKS 产物由于链的长度、酮还原位置和环化上有差别，因而形成不同的多环结构。近10年发现的含有抗感染活性的海洋放线菌次级代谢产物通过II型PKS途径合成的有10种，包括Julichromes和fluostatins等(表1)。 5.1.2.1 Julichromes的生物合成研究 Julichromes或julimycins是一类结构复杂新颖，活性多样的II型聚酮分子，最初是于1960s分离自陆源链霉菌S. shiodaensis[140]，该类分子具有广谱抗革兰阳性菌活性及其他的肿瘤细胞毒活性、自由基清除活性和农用抗生素活性等[141-142]。Julichromes的生物合成基因簇最早是由Muller团队于2014年鉴定并通过基因敲除、基因回补、无细胞转化实验等确定细胞色素P450单加氧酶JulI是负责催化julichrome Q6二聚以形成具有对称结构的julichrome Q6-6的功能酶[143]，但 julichrome Q6-6是一类结构非常复杂的分子，具有多个位点的氧化修饰，但这些基团的合成顺序和合成机制不详。 Dong等于2020年从海洋软体动物来源的S. sampsonii SCSIO 054分离到多个Julichromes类化合物，包括主代谢产物julichromes Q3-5，Q3-3和微量代谢产物julichromes Q10, Q11, Q6, Q6-6, Q5, Q12, 大黄酚和黄龙霉素A[144]。基于此代谢产物和生产菌株，Ji等通过基因敲除和突变株回补鉴定了julichrome Q6-6的生物合成基因簇，阐明了氧化还原酶JuiL、乙酰基转移酶JuiM和细胞色素P450单加氧酶JuiI参与julichrome的生物合成，并实现Q10→Q11→Q6→Q66的依次转化， FAD依赖的氧化还原酶JuiN是以julichromes Q6-6为底物进行环氧化形成julichrome Q3-3和副产物julichrome Q3-5[145]。由于该后修饰过程避开了相应的单体而发生在对称二聚体的双侧，因此juchrome Q6-6经多步氧化修饰形成终产物julichrome Q3-3的过程尚不明晰。 Tian等又通过基因敲除与回补以及对突变株代谢中间体的分离和结构鉴定，并结合体外酶学实验的结果，揭示了有两种关键后修饰酶JuiN和JuiO共同催化了这一多步氧化过程，它们在julichrome Q6-6的C-C 轴双侧迭代地催化复杂的羟基化和环氧化反应(图22)。研究人员进一步结合蛋白质结构分析和点突变的结果，阐明了JuiN的底物识别机制。同时还发现氧化酶JuiO，可以在JuiN进行双侧环氧化的基础上进行酮基还原反应。研究团队基于同源建模、点突变及突变体的体外酶反应分析，提出了JuiO催化双侧环氧化及酮基还原反应的机制模型[146]。研究成果揭示新颖的氧化酶对双芳基julichrome Q3-8芳环的氧化修饰功能，并为julichrome Q3-3完整生物合成机制的阐明提供新见解，丰富了生物合成的酶学工具，也为未来的药物研发提供新的类似物。 5.1.2.2 fluostatins的生物合成研究 Zhang等从海洋来源的小单孢菌M. rosaria SCSIO N160中分离并鉴定出具有酶抑制和肿瘤细胞毒活性的含有苯并芴结构单元的非典型角环素fluostatins I~K[147]，通过基因敲除和异源表达鉴定了其生物合成基因簇并获得了具有生物活性的异源二聚体，该基因簇全长约40.1 kb，包含32个开放阅读框[59]。研究人员通过对flsO1基因的体内敲除获得了4个新的角环素类新衍生物，其中的两个新衍生物fluostarenes A 和B具罕见的苯并[b]芴与六元内酯环融合而成的6/6/5/6/6五环骨架[148]。为了探究fluostatin中高度氧化的A环形成机制，Huang等灭活了一个编码黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合氧化还原酶编码基因flsP，从而产生了罕见的1,4-氧氮杂环连接的fluostatin异二聚体—difluostatin I，以及5个新的fluostatins相关衍生物，即fluostatins T-X[149]。Huang等通过对多个具有不同C-C和C-N偶联模式的fluostatin型二聚芳香酮化合物的研究，发现了FlsH的去酰基化反应功能，并证明这些二聚体并非真正的次生代谢产物，而是源自生物合成酰基fluostatin的非酶促脱酰反应产物。非酶促脱酰反应通过一个类似于醌甲基化中间体进行，这一过程促进了随后的C-C/C-N偶联二聚反应。酰基fluostatin这一特殊性质的表征揭示了二聚反应的机制，并为C-C和C-N偶联的芳香聚酮二聚体的组装提供了策略[150]。黄素酶FlsO2是双功能酶，可将prejadomycin经中间体CR1转化为 dehydrorabelomycin，但体内的基因敲除发现，在 ΔflsO2突变体中仍然观察到dehydrorabelomycin的产生。为了探究这个问题，Yang等通过基因体内敲除、详细的生化表征、中间体鉴定和蛋白晶体结构解析，证实了黄素酶FlsO1不仅在功能上补偿了将 prejadomycin转化为dehydrorabelomycin的单加氧酶 FlsO2，而且还通过利用模拟中间体的体外酶反应证实FlsO1催化3次连续氧化(包括羟基化，环氧化和Baeyer-Villiger氧化)将prejadomycin意外转化为含氧杂蒽酮的产物fluoxanthoe A和B以及C-环开环化合物fluoxanol。该研究的巧妙之处是研究人员利用与酶底物化合物benzofluorene intermediate具有相同C骨架但来自于另外一个菌株的代谢中间体nenestatin C作为 FlsO1的反应底物，证实了黄素酶FlsO1可以催化三次连续的氧化反应(图23)，支持FlsO1作为苯并[b]-芴 C5水解酶的生理作用，并提供了生物化学证据。最后，他们还解析了FlsO1的晶体结构与辅因子核黄素腺嘌呤二核苷酸的复合物接近“in”构象，从而能够构建反应性底物对接模型，揭示单一酶催化的多次氧化的结构基础[151]。这项研究揭示了放线菌酶促氧杂蒽酮形成的机理，拓展了黄素蛋白的功能研究视野，并为黄素酶的多功能研究提供了借鉴。 5.2 聚肽分子的生物合成原理 非核糖体肽类化合物是由微生物利用巨型多模块非核糖体肽合成酶(NRPS)通过协同缩合氨基酸合成的一类结构丰富且活性多样的次级代谢产物，代表性分子有用于临床耐药菌感染的药物万古霉素、达托霉素及抗肿瘤的放线菌素D等。非核糖体肽类分子的合成范式也已被解析[152-153]。非核糖体肽类化合物一般以天然氨基酸或非天然氨基酸为原料，由 NRPS的不同模块顺次识别、装载、缩合形成前体分子。一个基本的NRPS延伸模块至少包括3个催化功能域，分别是腺苷化结构域(adenylation domain, A)、肽酰基载体蛋白结构域(peptidyl carrier protein, PCP) 和缩合结构域(condensation domain, C)，有些模块可能还含有甲基化结构域(methylation, M)、异构化结构域(epimerization, Z)或Cy(cyclization, Cy)结构域，其中A结构域负责底物氨基酸的识别和活化，PCP结构域负责承载A结构域活化的氨基酸或延伸中的肽链，C结构域负责将上游模块PCP承载的多肽链或起始单元与本模块活化的氨基酸进行缩合，M、E和Cy 结构域分别负责所在模块A结构域识别氨基酸的N甲基化、异构化或分子内脱水环化形成杂环氨基酸结构单元等。在装配线的末端还有负责肽链环化释放或水解释放的硫酯结构域(TE)或还原释放的还原结构域(R)[128-129]，形成环肽或线肽前体分子。释放后的环肽前体分子往往会被不同的后修饰酶进行区域选择性和立体专一性的修饰，形成成熟的功能化的环肽或线肽分子。近10年具有抗感染活性的海洋放线菌源非核糖体肽分子有ilamycins和cahuitamycins等10 种(表1)，下面列举部分环肽分子的生物合成研究进展。 点击查看本节剩余内容▼ 5.2.1 具有抗结核活性的怡莱霉素的生物合成 Ilamycins又叫ruformycins，是一类结构新颖且具有显著的抗结核活性的环七肽化合物，在该环肽的7个氨基酸结构单元中有4个是非天然氨基酸结构单元，分别是异戊烯基化的L-色氨酸、硝基化的L酪氨酸、末端甲基氧化的L-亮氨酸和L-2-氨基-4己烯酸结构单元。Ma等综合利用全基因组测序、生物信息学分析、结构基因的体内敲除及突变株的代谢分析，鉴定了怡莱霉素的生物合成基因簇并确定了基因簇的边界，其基因簇全长约为59 Kb，有20个ORF 组成(I1aA-T)。研究人员又通过一系列基因失活、前体小分子喂养、同位素标记前体喂养实验、新中间体的分离和结构解析等，推测了L-3-硝基酪氨酸是由一氧化氮合酶IlaM裂解精氨酸产生一氧化氮分子，细胞色素P450 IlaN把IlaM产生的一氧化氮分子氧化装载到酪氨酸上形成3-硝基-L-酪氨酸；L-2-氨基-4-己烯酸单元是由I型聚酮合酶IlaE合成4-己烯的 C6骨架，细胞色素P450单加氧酶IlaD对ACP上的C6 单元进行α-位的4电子氧化获得α位发生酮基化的C6单元，氨基转移酶IlaH催化a位的转氨反应形成2-氨基-4-己烯酸-S- ACP，接着在水解酶或II型硫酯酶的作用下合成2-氨基-4-己烯酸结构单元；异戊烯基化的L-色氨酸是由异戊烯基转移酶IlaO利用DMAPP合成异戊烯基化的L-色氨酸。巨型NRPS蛋白IlaS的七个模块依次识别和装载7个氨基酸结构单元，最终在 IlaS末端TE的作用下，环化释放形成ilamycin B1。Ilamycin B1在细胞色素p450单加氧酶IlaL的作用下将第二个N-甲基化的Leu单元中的末端甲基氧化成羧基以及细胞色素p450单加氧酶IlaR将怡莱霉素分子中的异戊烯双键环氧化成的两个后修饰步骤，初步阐释了ilamycin的生物合成途径(图24)[69]。值得强调的是通过基因工程改造的突变株中间体ilamycins E1/E2显示出更强的抗结核活性，对M. tuberculosis H37Rv的最小抑制浓度值约为9.8 nmol[69]。上述研究为怡莱霉素的仿生合成提供了思路借鉴，也为抗结核药物研发提供了药物先导。He等于2020年又利用基因的体内敲除、反式回补及过表达策略确定了怡莱霉素生物合成途径中2个调控蛋白和2个转运蛋白的功能，也实现了怡莱霉素生物合成基因簇ila在模式底盘的异源表达[154]，为怡莱霉素高效生产和分离创造了条件。 5.2.2 具有生物膜形成抑制活性的线肽分子 cahuitamycins A~C的生物合成 Park等基于静态和动态的高通量筛选方法(HTS) 从他们的海洋微生物天然产物粗提物库(NPE)中筛选到具有生物膜形成抑制活性的样品。由于研究团队在锁定目标菌株后尝试了多种方法依然不能获得目标活性分子，他们进一步通过对样品来源菌株S. gandocaensis的核糖体进行链霉素诱变，获得核糖体突变的菌株S. gandocaensis DHS287并建立稳定生产活性分子的发酵条件后，从中分离到3个结构新颖和具有抗鲍曼不动杆菌生物膜形成活性聚肽 (cahuitamycins A~C)，其中cahuitamycin C是最有效的生物膜形成抑制剂(IC50为14.5 µmol/L)。研究团队通过生物信息分析和基因敲除确定了cahuitamycin的生物合成基因簇，该基因簇是由两个相距较远的基因簇(相距50 kb)以聚合的方式共同介导cahuitamycins A~C的生物合成。该基因簇含有4个NRPS基因 (cahABCD)，2个参与合成起始的基因cahIJ、1个参与合成终止的基因cahG、9个参与转运的基因cahT1-T8 和cahH、1个调控基因cahR和其它8个基因组成，全长约40 kb。研究人员通过基因敲除、前体喂养揭示了水杨酸是cahuitamycin A和cahuitamycin B的起始单元，6-甲基水杨酸是cahuitamycin C的起始单元，均是由水杨酸酰苷化连接酶CahJ识别活化并上载到ChaA的 T1结构域上，然后依次与装配线上的其他5个模块识别的氨基酸进行缩合，最后经水解酶介导装配线的释放，获得cahuitamycins A~C(图25)。研究团队通过突变合成获得了生物膜形成活性抑制更强的非天然类似物cahuitamycins D和E(IC50为8.4和10.5 µmol/L)[155]。这些结果为从在途径起始过程中具有特定灵活性的基因工程菌株中发现和开发新抗生素提供了独特的机会。 5.2.3 PKS/NRPS杂合抗生素的生物合成 随着越来越多聚酮类和聚肽类微生物次代谢产物的分离和生物合成基因簇的鉴定，近年来由PKS/ NRPS杂合生成的天然产物报道也在逐年增加并引起广泛关注。PKS/NRPS杂合存在多种形式，包括PKS 后紧跟着NRPS、NRPS后紧跟着PKS、在PKS中嵌入NRPS以及在NRPS中嵌入PKS等，多种形式的杂合丰富了聚酮、聚肽杂合天然产物的结构，近10年开展了生物合成研究的海洋放线菌源抗感染次级代谢产物通过PKS/NRPS杂合途径合成的有11种，包括 caerulomycin和thiotetroamide等，见表1。 5.2.3.1 抗菌活性的caerulomycins的生物合成 初期基于假定前体标记的饲喂实验揭示了 caerulomycin生物合成中第一个吡啶环的形成是由赖氨酸转化的吡啶甲酸作为关键中间体来实现的[156-157]。然而，第二个吡啶环形成的起源和机制仍不清楚。在此背景下，Zhu等对来自A. cyanogriseus WH1-2216-6 的caerulomycin开展了系统的生物合成研究，包括caerulomycin生物合成基因簇crm的克隆、生物合成基因的功能表征以及crm基因簇在天蓝色链霉菌中的异源表达。研究人员通过以caerulomycin中第一个吡啶环合成中的L-赖氨酸-2-氨基转移酶为探针，设计兼并引物、步移法测序和基因簇的异源表达确定了 caerulomycin完整生物合成基因簇，其基因簇全长约 44.6 kb，由24个开放阅读框组成，其中20个基因可能与其生物合成相关[158]。研究人员进一步通过基因敲除、前体小分子喂养、中间体分离、无细胞转化实验及酶的体外功能表征等，确定CrmD是吡啶酸合酶，CrmE类似于已被功能表征的其同源蛋白NikE和 SanJ负责吡啶酸活化并使其装载到CrmE末端的ACP 上，CrmABIJ参与浅蓝菌素中第二个吡啶环的形成和修饰，CrmL是负责将caerulomycin L末端的亮氨酸水解下来形成中间体caerulomycin O的金属依赖性酰胺水解酶[158]。CrmH是一种与多种黄素还原酶相容的依赖于黄素的双组分单加氧酶，负责caerulomycin A 中的肟基的形成。研究人员基于结构同源物引导的定点突变实验确定了对CrmH催化至关重要的4个氨基酸残基。这项研究提供了催化肟形成的双组分单加氧酶的第一个生化证据[159]。醇氧化酶CrmK属于双共价FAD结合蛋白家族，通过醛中间体催化醇转化为羧酸盐。CrmK介导的反应不是在caerulomycin A的生物合成的过程中，而是通过将分流产物再循环回到caerulomycin A的主要途径而发挥了底物循环再利用的重要作用。晶体结构和定点突变研究揭示了负责FAD结合、底物结合和催化活性的关键残基，从而推测了CrmK的催化机制[160]。这项研究为次级代谢中黄素酶介导的底物循环提供了第一个生化和结构证据。基于其实验研究结果和相关同源蛋白在不同分子中的合成作用，研究人员推测了caerulomycin完整的生物合成途径(图26)。Zhang团队对caerulomycin 的生物合成的系统研究，不仅使我们全面认识了 caerulomycin生物合成的独特过程和生物合成酶在合成新颖结构单元的精妙之处，而且也为具有独特结构单元的天然产物的定向挖掘或复杂分子的结构改造提供分子探针和酶学工具。 5.2.3.2 抗真菌活性的Thiolactomycin和thiotetroamides的生物合成 Tang等采用自主开发的抗性基因靶向挖掘策略，从86株盐孢菌的泛基因组中鉴定出一类包含细菌脂肪酸合酶(FASII)的基因簇。随后，他们利用基于转化相关重组的克隆策略和不依赖PCR的克隆方法，分别从S.pacifica CNS-863和S.afghaniensis NRRL 5621的基因组DNA中成功捕获了含有FASII 基因的tlm和ttm生物合成基因簇(BGC)。通过在链霉菌宿主中进行异源表达，研究人员获得了由这两个基因簇编码的化合物thiolactomycin A(1)及其同系物 (2~7)和thiotetroamide C(8)[161]。Tlm基因簇是一个由 10 个开放阅读框(TlmA-TlmJ)组成的约22 kb PKSNRPS杂合基因簇。ttm基因簇与tlm基因簇具有类似的基因组成，该基因簇含有17个基因，但较tlm多出了短链脱氢酶编码基因ttmK、氨基转移酶编码基因ttmN、还原酶编码基因ttmO、另外一个细胞色素P450单加氧酶编码基因ttmP和酮酰基载体蛋白合酶III 编码基因ttmQ，提示该基因簇编码的分子具有复杂的修饰过程。他们的工作首次证明了靶向基因组挖掘策略可用于发现具有新合成机制化合物的挖掘，从而产生有目标活性的抗生素分子。后来Li等进一步通过基因的体内敲除和体外酶学表征，确证了细胞色素P450单加氧酶TtmP负责催化中间体 thiotetromycin(5)的C4上乙基上末端甲基的6电子氧化生成化合物8，进而在氨基转移酶TtmN的作用下将8转变为thiotetroamide C，为氧化-酰胺化酶级联反应提供了第一个遗传和生化表征的证据(图27)。研究团队基于TtmP-TtmN酶对的级联反应特性、底物多样性催化特征及伯酰胺在药物应用中的普遍性和重要性，揭示了TtmP-TtmN酶对可能在合成生物学和药物发现过程中具有用作生物催化剂价值[162]。 5.3 具有抗感染活性的生物碱类分子的生物合成 抗菌剂脱氧尼博霉素(deoxynybomycin, DNM) 和尼博霉素(nybomycin, NM)具有独特的四环结构，并含有角融合的4-恶唑啉环，这类分子的恶唑啉环的形成不同于其他天然产物中的恶唑啉环。DNM和NM最初是从StreptomycesA 717和S. hyalinus NBRC 13850(最近分类为Embleya hyalina sp.nov.)中分离出来[163-164]，后来又有分离自几种环境来源的链霉菌菌株的报道[165-167]。DNM和NM与脱氧醌(DNQ)[168-170]， Sch 538415[171]和二氮喹霉素(DAQ)[172]共享一个共同的三环核心。基于同位素喂养实验的初步生物合成研究表明，尼博霉素由乙酸盐和蛋氨酸构筑而成，中心环碳来自未鉴定的莽草酸型中间体[173-174]。最近，通过异源表达鉴定并证实了来自S.albus NNRL B-24108的尼博霉素的生物合成基因簇nyb[169]和来自Streptomyces sp. F001的脱氧醌的生物合成基因簇 daq[175]。然而，基于体内和体外实验证据来鉴定参与DNM/NM生物合成的酶研究未见报道。Liu等基于基因组比较分析、基因敲除、中间体分离和体外酶学反应鉴定来自P. antitumoralis sp. nov. SCSIO 01299的DNQ的生物合成基因簇，功能表征了包括一个N-甲基转移酶DnmS和两个Fe(II)/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶(Fe/αKGDs)DnmU和DnmT 3种生物合成酶负责DNM/NM中4-恶唑啉环的形成。N-甲基转移酶DnmS在化合物prenybomcin上进行双N-甲基化，随后，α-KG/Fe(II)依赖性双加氧酶DnmT催化化合物nybomycin D以形成含有4-恶唑啉环的化合物deoxynybomycin，然后DnmU催化的C-12羟基化完成化合物nybomycin的生物合成。有趣的是， DnmT显示出意想不到的功能多样性，不仅可以在化合物deoxynybomycin中生成4-恶唑啉环，还可以打开恶唑啉环，并进行N-去甲基化，从而将所得产物 prenybomcin带回主流途径，代表了一种新的生物合成范例(图28)。此外，团队研究人员基于结构建模，定点诱变和量子力学计算阐释DnmT的潜在异常功能并提出了其酶促机制。对DnmT的催化机理的揭示，显示了DNM化合物中恶唑啉环结构的合成机制不同于已有的其他天然产物中关于恶唑啉环的形成机制[176]，丰富了我们对微生物采用不同途径和利用不同生物合成酶合成恶唑啉环结构的理解和认识。 5.4 具有抗感染活性的混源萜类分子的生物合成 5.4.1 吲哚倍半萜化合物xiamycin的生物合成 Xiamycin是海洋来源Streptomyces sp. SCSIO 02999生产的吲哚倍半萜，具有罕见的五环结构。基于基因组测序和生物信息学分析显示xiamycin的生物合成基因簇包含18个相关基因，其中包含通过非甲羟戊酸途径合成萜烯的基因，8个编码氧化还原酶的基因，以及5个调控和抗性的基因。基因簇中存在8个编码氧化还原酶的基因，提示生成五环结构是一个复杂的氧化还原途径。Li等对xia基因簇中的13个基因进行了基因敲除，但大多数敲除突变株不再生产xiamycin或者中间体。编码芳香环羟化酶的基因xiaK敲除后有中间体吲哚烯生产，并进一步通过喂养中间体验证该酶功能[177]。通过体外酶学反应证实黄素依赖性加氧酶XiaI可以将吲哚烯转化为 xiamycin，揭示了一种不寻常的氧化环化策略来修饰吲哚倍半萜的生物合成[178]。通过化学合成两种关键前体，3-法尼吲哚和3-(环氧法尼基)吲哚，阐明了 XiaO催化3-法尼吲哚的环氧化形成3-(环氧法尼基)吲哚，膜蛋白XiaH催化3-(环氧法尼基)吲哚的萜烯环化形成preindosespene，XiaM是催化preindosespene C24 甲基的6电子氧化形成indosespene[179]，在XiaI的作用下形成prexiamycin并自发氧化为xiamycin，进一步在 XiaK的作用下形成N-hydroxyxiamycin(图29)，XiaI是一种用于组装中心环的吲哚加氧酶，并具有底物灵活性，具有作为酶学工具的价值[180]。 5.4.2 混源萜化合物merochlorins A~D的生物合成 Merochlorins的独特结构暗示它们可能具有非同寻常的生物合成机制，可能涉及钒依赖性卤代过氧化物酶催化类似于萘乙酸霉素形成的氯醚化反应[181]。为了探究其合成途径或机制，Jaremko通过菌株的基因组扫描测序、生物信息学分析和基因敲除及异源表达确定了merochlorins的生物合成基因簇mcl，全长57.6 kb，含有41个基因，涉及到化合物的骨架合成、抗性基因、转运、调控和修饰基因，并基于生物信息学分析推测了其生物合成途径，确定钒依赖性卤代过氧化物酶Mcl40参与了氯离子辅助的化合物4至3的大环化[97]。他们推测1,3,6,8-四羟基萘合成酶Mcll7利用5个丙二酰基单酰辅酶A合成四羟基萘 (THN)作为化合物1~4的共同前体，而后经过两个路径合成不同的分子(图30)。其中路径A可能是通过异戊烯化、氯化和两个不同的环化反应产生1和2；路径B是3和4的产生，可能涉及氧化、甲基化、异戊烯化和两个氯化反应(图30)。化合物中不同位点的异戊烯基化可能是由基因簇中唯一的异戊烯基转移酶Mcl23催化形成。进一步的研究发现，基因簇中另外一个钒依赖性卤代过氧化物酶Mcl24催化位点选择性萘酚氯化、氧化脱芳构化和萜烯环化，这代表了一种前所未有的级联反应。研究团队通过开发模拟 Mcl24反应性的合成氯化方案阐明Mcl24酶促反应特征。此外，他们开发的新型试剂仅需5个步骤即可完全合成以前未被注意到的二氢卟吩天然产物[182]。该应用概念提示了非同寻常的生物合成转化的潜力，为合成试剂系统的开发提供了灵感。 5.5 核苷类抗细菌抗生素A201A的生物合成 核苷抗生素以一个杂环核碱基为苷元与糖相结合而构成的抗生素，绝大多数由链霉菌产生。海洋沉积物来源的菌株M. thermotolerans SCSIO 00652可生产具有抗菌活性的核苷类抗生素A201A。前期，通过基因组测序及基因敲除等手段鉴定了A201A的基因簇，并解析了位于基因簇最上游的mtdA基因的功能。该基因预测为编码GntR家族的转录调节因子，敲除后mtdA，会使得A201A的产量比野生型菌株高约25倍，ΔmtdA突变体的获得将为A201A高效生产创造条件[183]。紧接着，研究人员对A201A结构中糖基单元的生物合成以及后修饰过程进行了系统解析。通过异源表达结合基因敲除、同位素标记的前体喂养、中间体分离和体外酶反应，发现参与后修饰的4个甲基转移酶和一个脱氢酶都显示出严格的区域选择性和较为宽泛的底物识别性；糖基转移酶 MtdG1也具有底物宽泛性，能够识别GDP-α-D-甘露糖和GDP-α-D-鼠李糖作为底物(图31A)[184]。GDP-L半乳糖变位酶MtdL在二价阳离子Mn2+或Mg2+存在的情况下，能够可逆地催化GDP-β-L-Galp转化成GDPα-L-Galf[185-186](图31B)。该酶是自然界中被发现的第一个吡喃糖-呋喃糖基变位酶，对于指导发现自然界中包含L-呋喃半乳糖结构单元的活性天然产物具有重要指导意义。 6 讨论与展望 点击查看本节剩余内容▼ 6.1 近十年海洋放线菌源抗感染分子发现现状 通过对近十年海洋放线菌来源的具有良好抗感染活性的分子的系统总结发现，海洋放线菌来源的抗感染分子中约76.61%表现出抗菌活性、12.93%的分子表现出抗真菌活性、约1.49%的分子表现出抗病毒活性和14.9%的分子表现出抗寄生虫活性。在抗菌的活性天然产物中约70.77%是表现出抗革兰阳性菌活性(结核分枝杆菌除外)，22.72%的表现出抗结核活性，仅有约20.12%的分子表现出抗革兰阴性菌活性，而同时表现出抗革兰阳性菌和抗革兰阴性菌的分子则比较稀少。抗病毒和抗真菌的活性分子也同样稀少，分别占发现的活性分子的1.49%和12.93%。此外，随着耐药菌尤其是耐药革兰阴性菌的日益严重及针对耐药革兰阴性菌可及的药物越来越少的现状，需要新的策略或从新的资源中去寻求抗革兰阴性菌的活性分子，例如真菌或其他一些革兰阴性菌中去发现对革兰阴性菌具有显著抑制作用的新分子，以有效应对耐药革兰阴性菌的药物开发。 活性显著和结构新颖的分子无疑具有更大开发潜力，例如活性达到了皮摩级别甚至亚皮摩级别的烯二炔分子yangpumicin F[27]、对E. coli和M. tuberculosis具有纳摩级别的3-amino-27-demethoxy27-hydroxyrifamycin S和3-amino-rifamycin S[25]、对 Clostridium difficile具有纳摩级别的ecteinamycin[39]、对真菌具有显著抑制作用的caniferolide A[104]，对革兰阳性菌和革兰阴性菌及药物敏感型Plasmodium falciparum 3D7和多重耐药型P. falciparum Dd2疟原虫均具有显著的抑制活性mollemycin A[83]、对5种P. falciparum寄生虫具有纳摩级别的actinoramide A[116]。过往的用药历史与细菌耐药性产生的机制表明，广谱的抗生素虽然对病原菌具有较好的杀灭作用，但同时也会对其他共生菌或益生菌具有杀灭作用，对菌群产生强选择压力，致使耐药基因的出现或传播。因此，随着诊断技术的进步，窄谱抗生素也许更有开发潜力和价值。在本综述的分子中，怡莱霉素属于专属性、高安全指数和具有全新作用机制的抗结核分枝杆菌的抗生素，具有作为抗结核药物开发的巨大潜力。 6.2 近十年海洋放线菌源抗感染分子生物合成研究现状 已开展生物合成研究的62个海洋放线菌源抗感染抗生素的研究结果表明，海洋微生物次级代谢产物合成途径中蕴藏了新的合成途径及多功能和机制新颖的生物合成酶。例如通过对streptoseomycin的生物合成研究，发现了自然界中首个催化[6+4]的周环反应酶[135]。通过对kendomycin的生物合成研究首次解决了非经典安沙霉素类中全碳环的形成机制[137]。通过对脱氧尼博霉素和尼博霉素的生物合成研究发现了恶唑啉环形成的全新机制和合成酶系[176]。通过对混源萜化合物merochlorins A~D的生物合成研究发现了钒依赖的卤化酶介导的大环化及级联反应的生物合成酶[181-182]。通过对A201A的生物合成研究发现了首个可以催化吡喃糖和呋喃糖转化的金属离子依赖的变位酶MtdL[184-186]。对新颖分子的生物合成研究不仅提升我们对微生物合成不同分子的精巧策略的认识，还将为复杂活性分子的结构改造和合成生物学的发展提供仿生思路和酶学工具。 6.3 病原菌耐药性危机与对新型抗生素研发需求 病原菌耐药性的持续蔓延已对全球公共卫生安全构成严峻威胁，并造成沉重的社会经济负担。当前，人类正面临开发新型作用机制抗生素以应对耐药菌感染的关键历史节点。尽管研发安全有效的新型抗生素仍面临诸多挑战，但随着基因组学、生物信息学、微生物遗传学、合成生物学、天然产物化学及药物化学等学科的协同发展和人工智能或机器学习在药物开发中快速应用，正迎来天然药物发现的重大机遇，有望开启继20世纪中叶之后的”第二个抗生素发现的黄金时代”。此外，多学科融合的创新研究范式将有望发现大量具有新颖化学结构、显著生物活性和独特作用机制的微生物源先导化合物，为开发具有自主知识产权的抗耐药菌药物提供优质候选分子。这些突破将有效激活当前停滞不前的抗生素研发管线，显著加快抗感染药物研发进程，最终为临床提供安全有效的新型抗耐药菌药物，突破当前耐药菌感染的治疗困境。 然而需要清醒地认识到，从活性分子到临床应用药物的转化过程充满挑战，需要经历漫长而曲折的研发路径。在当前形势下，必须采取多管齐下的综合策略：①加强抗生素合理使用管理，维护现有药物的临床有效性；②深入开展耐药性产生与传播机制研究；③积极推进”一体化健康”(One Health) 理念的普及教育；④确保抗生素研发的持续性投入；⑤制定科学的药物政策保障体系。 只有通过科技创新、公众教育和可持续发展策略的有机结合，动员全社会力量共同参与，才能有效遏制耐药菌的蔓延趋势，避免人类进入“后抗生素时代”的灾难性困局。 6.4 当代海洋微生物源新型抗生素研发的优势分析与历史机遇 结构新颖、生物活性显著及作用机制独特的药物先导分子的获得是新型抗生素开发的关键要素。当前，多学科技术融合正系统性突破传统海洋药物开发的瓶颈问题，使得从海洋微生物(特别是海洋放线菌)中发掘抗感染抗生素的研究具备了前所未有的综合优势。这一研究范式不仅能够提供丰富的候选分子资源，更在克服抗生素抗性危机方面展现出独特价值。当下从海洋微生物中进行新型抗生素开发的优势和历史机遇体现在以下几方面：第一，随着深潜装备的持续升级和采样方法的显著进步，人类现已具备获取全球深海极端环境生物资源的能力。特别值得关注的是，现代深潜器已成功实现对马里亚纳海沟等“第三极”深渊环境的系统性采样，这标志着深远海资源获取能力取得了质的飞跃。第二，通过对全球海洋样本的宏基因组数据进行系统分析，研究发现海洋环境中蕴藏着丰富的微生物新资源和大量未被表征的生物合成基因簇[187-188]。尽管目前可培养微生物的数量仍不足环境微生物总量的 1%，但随着分离培养技术的不断优化和微流控等新型仪器的应用，微生物的可培养率和新种发现率有望显著提高，这将为扩充海洋微生物资源库提供重要支持。值得注意的是，异源表达技术的发展为开发利用海洋微生物中庞大的“暗物质资源”(生物合成基因簇资源)提供了新的技术路径，有望获得一系列具有新颖结构或独特生物活性的天然产物分子。第三，海洋微生物次级代谢产物通常具有结构复杂且含量低的特点，这给其分离鉴定带来较大挑战。然而，随着天然产物分析平台(如质谱和核磁共振技术)的不断改进，以及代谢组学方法的快速发展，特别是基于谱学分析的天然产物数据库(如GNPS和 SMART 2.0等)的持续扩充，为海洋来源微量天然产物的获取和结构解析提供了强有力的技术支持。这些进展不仅促进了海洋天然产物的发现，还将为合成化学研究提供更多结构新颖的模板分子。第四，通过系统整合合成生物学、基因组学、生物信息学、合成化学及药学等多学科的前沿技术，可显著推进海洋微生物次级代谢产物的发现与开发。这种多学科交叉的研究策略不仅有助于阐明新型生物合成途径和机制，更能通过合成生物学手段实现微量活性成分的高效生产和制备，从而有效解决药源供给等关键问题。该研究模式将极大促进海洋生物资源的深度开发利用，并为创新药物研发提供丰富的候选分子，最终推动海洋药物研发管线的持续拓展与完善。第五，人工智能技术在药物研发全流程中的系统性应用，有望显著缩短新药研发周期、降低研发成本并提高开发成功率。这一革新技术不仅能够延续微生物天然产物在药物研发领域的卓越贡献，更重要的是将为人类应对耐药菌感染等重大公共卫生挑战提供创新的治疗策略和解决方案。 来源：陈泽平, 周镇槟, 李小华, 等. 近十年（2014—2024）海洋放线菌源抗感染抗生素的发现及其生物合成研究进展[J]. 中国抗生素杂志, 2025, 50(09): 987-1037. 来源：中国抗生素杂志 版权声明：我们分享文章、图片来自网络，版权归原作者及原出处所有。此文出于学习分享、传播更多资讯之目的，无商业用途。若涉及作品内容、版权或其他问题，敬请原作者联系我们(邮箱：xianghaiwenyao@126.com)，立即处理。