CAP-2003

偶联药物生物分析，对临床前研究及临床研究具有重要意义。其中总抗体，偶联抗体，游离载荷和相关代谢物的生物分析，贯穿偶联药物早期发现/筛选、临床前以及临床全流程中。总抗体检测，通过抗偶联药物的抗体部分检测。总抗体的测定包括捕获、酶切等步骤，对于试剂选择、反应时间和用量等，需进行细致的探索，以达到更好的回收率。总抗体分析方法：ELISA、电化学发光免疫法ECLAADC药物的非临床PK和TK研究时，选用的检测抗体分类：1、结合到抗体的非可变区域的多克隆抗人抗体（抗FC的抗体）；2、抗人IgG抗体；ADC药物临床试验中，可使用结合重组抗原、抗独特型或抗互补确定区抗体，减少非特异结合，以最小化血清蛋白背景。对于用于临床前和临床开发的ADCs总抗体检测，确保所有体内预期的DARs，都准确的定量为总抗体浓度。偶联抗体检测：1、使用与总抗体检测相同的捕获试剂，检测试剂是抗细胞毒素的抗体；2、捕获试剂是抗细胞毒性药物的抗体，检测试剂是靶点抗原，或是抗CDR区单克隆抗体。分析偶联抗体时，需针对不同的Linker，选择不同的解离条件。偶联抗体ADC分析:ELISA、电化学发光免疫法ECLA偶联抗体的PK分析，使用抗小分子的抗体作为包被试剂，检测抗体与总抗体分析中保持一致。通常使用ELISA法，测定血清中的抗体偶联物。游离毒素检测：通过蛋白沉淀，液液萃取或固相萃取等小分子生物分析常用的前处理方法，提取细胞毒素后直接进行LC-MS/MS的检测。游离毒素分析应注意灵敏度和稳定性。 连接子的血浆稳定性同样需要考察。小分子细胞毒素分析：LC-MS/MS使用LC–MS/MS定量分析游离小分子前，需进行蛋白沉淀和/或固相萃取去除血浆蛋白。若需对药物相关代谢物进行定量，就需要先鉴定出代谢产物，并制备出其标准品。确定了分解代谢物结构，合成稳定同位素标记的内标物或模拟分子，小分子LC–MS/MS分析方法，可用于小分子分解物相关研究。 免疫原性分析—抗药抗体ADA、中和抗体NAb抗药物抗体（Anti-drug antibody, ADA），抗体药物免疫原性评价主要方式。ADC在人体内可能导致免疫原性，产生相应的抗药抗体（ADA），造成对PK，PD和安全性影响。ADA产生机制：1、把抗体药物当作外源蛋白质，类似疫苗接种，产生免疫应答；2、自身蛋白质机体耐受机制被破坏，类似于自身免疫性疾病，自身抗体产生的机制。ADA的分析：1、筛选，对生物样本进行初筛，高于阈值为潜在阳性，低于阈值则为阴性样本。2、确证，对筛选的阳性样本免疫确证，确证抗体与药物之间的特异性；根据加药前后的抑制率，确定是否是阳性样本。3、滴度，将阳性样本进行不同的稀释，使稀释后的样本为筛选阈值时的稀释倍数，是ADA的抗体效价；4、中和：中和抗体是一种特殊的 ADA，NAb 通过阻断产品到达其靶标，或干扰受体/配体的结合，以此干扰药物的体内活性。 ADC质量控制项生物活性测定活性测定也是至关重要， 生物学活性指物质对生命体产生的生物学影响或治疗作用的程度和能力。生物活性测定，即为抗体药物有效成分含量、药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质量控制指标，因而需要建立完整的体系进行表征。结合活性可以直接的反映抗体结合抗原的能力，以及与效应分子/受体的结合能力，如FcγRIII，C1q等。在此基础上，通过细胞学生物活性测定，如ADCC、CDC、细胞增殖抑制、细胞毒性、细胞因子分泌，内化作用等，组成了体外检测抗体活性的全面表征体系，是抗体药物进入活体实验的基础，和临床实验获得成功的保证。抗体药物，需要对其活性进行全面的表征。不同抗体药物发挥效应的机制不同，需要建立不同的生物活性测定方法。 生物学活性包括：内化作用、抑制细胞增殖、细胞毒性、细胞因子分泌能力、ADCC、CDC等。ADC 也具备 CDC、ADCC、ADCP 等抗体的免疫效应。 内化作用内化作用是指细胞通过细胞膜的包围将外部物质或其他细胞成分引入细胞内的过程。细胞增殖抑制实验生长因子类靶点（如VEGF、HER2、EGFR）的抗体药物，通过阻断靶点和其受体的结合，从而抑制生长。因而在进行生物学活性测定时，可以采用细胞增殖抑制实验来测定。ADCC（适用于：CD20抗体、CD38抗体、HER2抗体、GD-2抗体等。）抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC,antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity )ADCC，抗体药物Fc段，与效应细胞（最主要是NK细胞）表面的Fc受体（如FcγRIIIa/CD16）结合，介导效应细胞杀伤肿瘤细胞。是抗肿瘤的治疗性抗体药物发生作用的重要机制。ADCC基本成分：效应细胞、抗体和靶细胞。三种Fc受体可以结合IgG：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD3）和FcγRIIIA（CD16）。ADCC检测方法：制备外周血单个核细胞（PBMC），进行效应细胞杀伤实验。近年来开始使用荧光素酶报告基因法，进行ADCC评价。抗体依赖性细胞介导的细胞毒法：抗体的Fc段和经过改造NK细胞的FcγR结合，使NK细胞激活，诱导效应分子的释放，诱导细胞凋亡。ADCC发生的先决条件是，与靶细胞结合的抗体和效应细胞上的Fc受体的相互作用。FcγR介导的ADCC/ADCP改造当FcγR与抗体Fc段结合，可以激活抗体依赖的细胞毒性（ADCC），以及抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）。目前对Fc区功能的工程化突变主要集中在增强ADCC/ADCP的效应功能，其主要方式是提高Fc与激活性FcγR的结合能力。在技术策略上通过氨基酸突变和糖基化修饰来实现。CDC 补体依赖的细胞毒性（适用于：CD20抗体、CD38抗体、CD52抗体等）。CDC影响因素：抗体亚型（IgM＞IgG3＞IgG1＞IgG2）；靶细胞抗原的表达水平，靶细胞表达足够的抗原，结合抗体以及激活补体；补体调节蛋白；抗原-抗体结合方位。CDC活性测定，将重组抗体稀释后，与靶细胞进行孵育，在补体存在的情况下，抗体药物会在靶细胞表面形成膜攻击复合体，导致细胞溶解，采用检测细胞存活的试剂，可以对CDC作用效果进行评价。ADC药代动力学面临着各种挑战，其中有药代动力学特征、PK-PD相关性、目标分析物质、生物分析方法和数据解释的复杂性和多样性等。综合考虑评估靶点生物学特性，预期的生物学过程，各结构成分，ADC药物的理化特性等因素。对于不同类型的偶联分析物，需根据药物研发和评价的不同目的，以及分析物的特性，选择不同的分析方法来完成检测，因此ADC的生物分析具有极大挑战性。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。