Graft vs Host Disease

“闷声发大财”的泽璟制药，开始被发现了。资深分析师：尧   今编审：苏   叶这是一家为数不多，大盘几乎涨了三年的未盈利创新药企。自2022年资本寒冬以来，整个行业面愁云密布。然而，泽璟制药涨幅却超400%，市净率显著高于行业平均，市值也翻了好几番，甚至已经超过了君实、荣昌、再鼎、诺诚健华等营收规模大了好几倍的药企。深挖各项数据后，这家药企似乎都在“闷声发展”。根据最新披露的2024财报，泽璟实现营业收入 5.33亿元，同比上年增长 37.91%；净利润-1.38亿，同比增长50.54%。2025年一季度延续这一趋势，实现营收1.68亿元，同比增长54.87%。但与亮眼股价和业绩涨幅形成鲜明反差的是，这家“小而美”的未盈利创新药企在大众印象中，却活得稍显透明。它成立于2009年，明明较不少创新药企成立时间更早，但却没什么名气，资本圈的相关讨论声也相对沉寂。外界对其最大认知，大多还停留在四五年前的“科创板首家适用第五套标准上市上市的未盈利企业”“国内首个氘代药研发者”两大标签。由此，外界不禁疑惑，泽璟用什么支撑起了高估值？迅速膨胀起来的估值背后，暗藏了投资者哪些预期？还有哪些潜在水面的风险点？CM10医药研究中心将从行业稀缺值、财务健康度、业务健康度等维度一一剖析。▲泽璟制药股价走势图，数据来源：百度股市通两大已上市产品的可预期验证它凭什么高估值？要回答这一问题，还得回归泽璟的核心竞争力——产品本身实力来论。一家年营收仅5亿左右的未盈利药企，之所以市值能超越众多营收规模数倍于己的同行，答案或藏于其“稀缺”的产品矩阵和可预期的商业化空间之中。一是已上市产品的稀缺性和可验证的商业化能力。目前，泽璟已上市两款药物，且均具有一定稀缺性和独特市场地位，分别为首个国产氘代药物甲苯磺酸多纳非尼片、国内唯一采用重组基因技术生产的人凝血酶产品重组人凝血酶。先看泽璟首个获批产品——甲苯磺酸多纳非尼片，这既是首个国产氘代药物，也是首个国产肝癌一线靶向药。作为泽璟的“现金牛”产品，多纳非尼已获批两大适应证。先是2021年6月获批一线治疗晚期肝癌适应证，成为继拜耳索拉非尼、卫材仑伐替尼后第三款被批准用于晚期肝细胞癌一线治疗的小分子靶向药物。后又于2022年8月再斩获一大适应证，用于治疗进展性、局部晚期或转移性放射性碘难治性分化型甲状腺癌。与索拉非尼、仑伐替尼相比，凭借安全性更优，且进入医保后价格优势显著，多纳非尼上市后销售额攀升明显。截至2024年底，多纳非尼已进入医院 1100 余家、覆盖医院 2000 余家、覆盖药房近1000家，销售持续放量。而2024年之所以营收涨幅超30%，便得益于多纳非尼片的销量增加。按照当前趋势，多纳非尼肝癌适应证应该仍有不少上升空间。再加上甲状腺癌适应证2022年获批后贡献增量，短时间业绩增长成为可预期。‌再看泽璟第二款上市产品——重组人凝血酶。这款产品的竞争格局就更为明了。凝血酶是一种重要的局部外用止血药物，由于血浆来源日益缺乏、血浆提取产品潜在残留病毒或免疫原性等安全性风险和血浆提取产品的生产成本日益升高等原因，中国市场上血源生化提取的多数凝血酶产品已经停产。根据卫健委《关于印发国家短缺药品清单的通知（国卫办药政发〔2020〕25 号）》，凝血酶属于《国家临床必需易短缺药品重点监测清单》中品种。而泽璟重组人凝血酶的稀缺性便得以体现，它是国内唯一采用重组基因技术生产的人凝血酶产品，于2024年1月获批上市，目前已进入医保目录，填补外科手术局部止血领域空白。全球同类产品仅有BMS的Recothrom，于2008年美国上市，不过该药物尚未进入国内市场。虽然凝血市场相较“小而美”，但是这款药的独特性，还是有望助泽璟在国内站稳一方脚跟。弗若斯特沙利文预测，外科手术局部止血市场将由2018年的73.0亿元增长至2030年的160.3亿元，年复合增长率为6.8%。对于这款药物，与自建团队进行多纳非尼片商业化不一样，泽璟这款商品未盲目选择自行商业化，而是选择了 “借力打力” 的商业化策略——与远大生命科学子公司远大辽宁达成独家合作，由后者负责大中华区的市场推广。目前，泽璟已累计收到合作方支付的独家市场推广权许可费人民币3.4亿元。此番考量背后不无道理。重组人凝血酶属于外科止血药品，泽璟制药的销售团队主要专注于肿瘤药物销售，与具备外科止血领域市场推广和销售实力的合作伙伴进行商业化合作，将更加有利于重组人凝血酶的市场推广和销售。泽璟看向远大生命科学，也是因为其在围术期和止血领域深耕多年，从而在止血药品入院和销售方面经验丰富。如以注射用矛头蝮蛇血凝酶为代表的止血产品，连续多年销量靠前。二是，泽璟的产品线并非孤立存在，可发挥更大协同效应。以首款上市的多纳非尼片为例，作为晚期肝癌一线治疗的核心药物，其主要覆盖肝胆外科领域；而 2024 年获批的重组人凝血酶，同样可应用于肝胆手术的止血环节。两者在临床场景上的高度契合，或有利于资源共享且提升市场推广效率。此外，临近上市的重组人促甲状腺激素，与多纳非尼新获批的甲状腺癌适应证形成 “诊断+辅助治疗” 搭档，未来或有望为核医学科提供一站式解决方案。这种产品间的聚焦与协同效应，或有助于其更好发挥自身优势。三是，泽璟在研基本无废管线，且具有稀缺价值拉升预期。纵观来看，无论是已临近上市产品，还是尚处临床阶段的在研管线，大多具备 “国产首创” 或 “全球前沿” 的竞争优势。高壁垒在研管线的预期与焦虑目前看来，与多数药企管线中存在 “哑弹” 不同，泽璟制药几乎无“废管线”。每款产品锚定市场空白，且研发都算是走在前列，算是一家梯度相对明晰的药企。细究到一众在研管线，最拉升泽璟当前预期，主要在于两款临近上市的产品——JAK抑制剂盐酸吉卡昔替尼片和注射用重组人促甲状腺激素。▲截图来自泽璟制药官网先看JAK抑制剂盐酸吉卡昔替尼片，这是一个拥有大适应证的大单品，目前共有11个适应证在研。其中进展最快的适应证为骨髓纤维化，已处于上市前审评审批阶段，这是首个提交治疗骨髓纤维化适应证NDA的国产JAK抑制剂类创新药物。目前，骨髓纤维化属于罕见病，治疗药物有限。全球范围内仅有芦可替尼、菲达替尼和帕瑞替尼三款靶向药物获批用于骨髓纤维化，但国内仅有诺华芦可替尼上市，是目前在我国唯一获批上市治疗骨髓纤维化的JAK抑制剂。也就是说，吉卡昔替尼片上市后将直接对标诺华这款产品。这一市场前景算是“小而美”。根据弗若斯特沙利文预测，目前国内骨髓纤维化患者规模或将超过6万人，2030年中国骨髓纤维化靶向药市场的临床可惠及人口渗透率将达到 30.7%，整体市场规模超过30亿元。更值得一提的是，借助这款药，泽璟大肆进军自免这一蓝海领域。不过其在斑秃、特应性皮炎等热门自免适应证中，几乎难抢到先发红利。其中，斑秃是吉卡昔替尼片布局自免领域进度最快的适应证，目前泽璟正推进重症斑秃适应证NDA资料准备工作。但是这一适应证在研情况还是颇为激烈的。泽璟斑秃适应证虽然研发进度靠前，但恐无法抢得国产首个名额了。斑秃这一市场空间较为可观。根据弗若斯特沙利文，2020年中国约有381.2万例斑秃患者，预计到2030年患者规模将达到464.9万人，患者规模大。相关指南和共识将 JAK 抑制剂作为斑秃系统疗法的首选治疗选择。迄今为止，国内已批准礼来巴瑞替尼及辉瑞利特昔替尼两款JAK抑制剂治疗斑秃，都是跨国药企。放眼国内企业，除泽璟外，还有恒瑞医药、石药集团等公司亦布局了JAK抑制剂。其中，针对重度斑秃这一适应证，恒瑞医药JAK抑制剂硫酸艾玛昔替尼片进度最为靠前，药物上市许可申请已于2024年下半年获国家药监局受理。这也意味着，在礼来、辉瑞产品相继在中国获批后，恒瑞很可能摘得“国产首个”。按照当前在研进度，待泽璟斑秃适应证上市后，市场或已较为激烈，不仅要从两大跨国巨头口中夺食，还需要从国内医药一哥恒瑞手中分羹，这对其商业化能力恐是一大较大考验。另一进度较为靠前的适应证是特应性皮炎，目前已处于III期阶段，竞争激烈程度同样不亚于此。此外，吉卡昔替尼片还被用于开展强直性脊柱炎（III期）、特发性肺纤维化（II 期）、移植物抗宿主病（II 期）、中重度斑块状银屑病（II 期）等自身免疫性疾病的临床试验，并于2022年获得了系统性红斑狼疮和重型新型冠状病毒肺炎适应证的临床试验批件。E药资本界认为，未来看点或在于，恒瑞若率先获批，将抢占斑秃市场；而对于泽璟而言，其选择骨髓纤维化这一“小而专”的适应证切入，有差异化定位，避开红海竞争，抢占国产JAK抑制剂在血液病领域的空白市场。若骨髓纤维化适应证先发优势确立，可反哺斑秃领域资源，但需追赶时间窗口。再则，还需考虑一大风险，大家都知道，FDA对JAK抑制剂的黑框警告（血栓、肿瘤风险）可能影响国内监管态度，安全性数据将成为核心审评因素。再看第二款临近上市产品——注射用重组人促甲状腺激素。这是中国首批取得用于甲状腺癌的辅助诊断和治疗临床试验批件的新药。从国内外竞争现状来看，目前国内尚无国产产品获批，全球仅默克的Thyrogen（重组人促甲状腺激素α）获批上市，国内已进口但未纳入医保，患者自费负担相对较重，为泽璟留了些生存口子。而其他国产药企进度大多落后于泽璟，如远大医药、智核生物等处于早期临床。海通证券最新预测，泽璟这款重组人促甲状腺素针对分化型甲状腺癌术后诊断的适应证有望于2025年获批上市，当年销售额达0.2亿元，次年收入达0.5亿元。除了这两款临近上市产品，泽璟生物还有8个处于临床I/II 期阶段的在研新药，投资者尤其对其双抗和多抗产品关注颇多。一款是ZG005（PD-1/TIGIT双抗）。Insight数据库显示，目前全球仅6款PD-1/TIGIT 双抗在研，尚无同类机制药物获批上市。其中阿斯利康Rilvegostomig进展最快，已进入入全球临床III期。泽璟PD-1/TIGIT双抗ZG005全球进度第二。另外国内还有信达IBI321在研，不过进度更靠后一些。另一款，ZG006是一款全球首创的DLL3三抗（CD3/DLL3/DLL3三抗），这款药物已于2024年8月获FDA颁发的孤儿药资格认定，主要针对小细胞肺癌适应证进行开发。横向对比ZG006和其他DLL3 CD3药物或DLL3 ADC，ZG006暂时展现出一定竞争力，ORR相比其他TCE药物接近翻倍。由于ZG005、ZG006等已获FDA临床试验批准，海外授权合作潜在可能性较高。再简单看下其它管线，VEGF/TGF-β双抗（ZGGS18）、LAG-3/TIGIT双抗（ZGGS15）等早期项目均进入Ⅰ/Ⅱ期，覆盖实体瘤及免疫微环境调控。不过，这些在研管线尚处研发早期，仍具有一定不确定风险。 推荐阅读 * 单日暴涨17%！创新药二哥提前盈利，引爆了什么？* 暴降90%，被集采重创的心血管“大玩家”，开始重生商业化与BD能力的大考在创新药企的估值逻辑中，已上市产品的商业化兑现程度，以及在研管线的BD潜力和潜在市场格局，都是重要的评估指标。市场普遍呈现 “赢家通吃” 特征，首款上市产品往往占据过半份额，后续产品市场空间逐级递减，尤其第四位及以后的产品往往难以获得更多市场预期。摆在泽璟面前的问题，同样如此。随着大产品即将上市，外界对其一大核心隐忧便在于，泽璟商业化能力能否匹配市场需求成为关键。其一，大产品上市后的商业化资源瓶颈。上市产品商业化打法，直接决定未来放量空间和机会。泽璟目前市净率显著高于行业平均，需警惕商业化不及预期带来的回调。要知道，对于目前已上市的两款产品，泽璟的商业化路径比较明晰了：一方面，自己搭建肿瘤销售团队，负责多纳非尼的商业化；另一方面，积极寻求外部合作，探索 CSO 等路径，选择与远大生命科学子公司合作推广重组人凝血酶。因同属肿瘤治疗领域，注射用重组人促甲状腺激素可借助现有商业化团队实现资源协同。相比之下，市场目光更聚焦于吉卡昔替尼片获批后的商业化策略。在最新披露的财报中，泽璟已透露，针对吉卡昔替尼片获批后的商业化工作，已提前积极布局，在现有商业化团队核心骨干架构的基础上，新增招聘擅长血液病领域的市场、医学和销售推广的优秀人才。尽管泽璟已着手血液病领域人才储备，但其“自建团队”的商业化模式成效存疑。随着自免适应证产品陆续获批，现有聚焦肿瘤领域的商业化团队将面临资源分散难题，团队扩建或成必然。这一挑战主要受两大因素制约：其一，现金流的可持续性，直接决定团队扩张与运营的资金保障；其二，市场竞争格局下，与头部企业的综合实力博弈，将考验其商业化资源整合与市场渗透能力。现金流压力。2025年一季度，泽璟营收增长但经营现金流净额骤降至-625.32万元（同比下滑107.02%），主因报告期内无大额市场推广授权款入账；同时销售费用同比大增56.49%，侵蚀利润空间。竞争格局严峻。骨髓纤维化适应证患者基数小，需直面诺华芦可替尼竞争；自免疾病市场虽大，但恒瑞、石药、礼来等已占据渠道与品牌优势。若吉卡昔替尼在斑秃等适应证安全性数据显著优于竞品，或存在突围机会。相较而言，泽璟商业化能力存在一些短板。比如销售团队经验不足，对比恒瑞、石药成熟的肿瘤/自免药销售网络，泽璟当前商业化团队规模较小，尚无太多重磅药物销售经验，可能影响市场渗透速度。还有一个老生常谈的问题——安全性数据仍需长期验证。JAK抑制剂类药物的黑框警告（血栓、肿瘤风险）是监管和医生处方的核心顾虑。尽管吉卡昔替尼片机制上有优势，但需大规模真实世界数据证明其风险低于同类产品，否则可能限制市场接受度。其二，纵观泽璟BD历史，在国际化合作方面，尚无经验可循。对于尚处早期研发阶段、已获FDA IND批准的ZG005、ZG006等管线，若参考康方生物AK112高达50亿美元的海外授权案例，考虑BD模式，可通过海外权益出让快速回笼资金。不过，这也将考验泽璟国际化能力，尤其体现在临床开发与BD经验。虽然在临床开发方面，泽璟凭借ZG005、ZG006成功获批FDA IND，已积累与美国监管机构的沟通经验，熟悉申报路径，能够有效降低合作伙伴的后期开发风险。然而在BD方面，泽璟经验明显不足。目前仅完成GS02 TIGIT单抗的国内授权交易，尚未开展与跨国药企的全球性合作。面对ZG006等复杂结构创新药，若把握不当，在国际授权谈判中议价能力不一定能充分体现。这并非不可解决。泽璟可通过多维度策略弥补国际化经验缺口：一方面，可引入具备跨国药企 BD 经验的高管及专业人才，快速提升团队国际化运作能力；另一方面，借助 CRO 机构或专业咨询公司的资源，加速积累行业经验。同样，在授权策略上，可采用分阶段推进模式，比如对早期非核心管线，参考荣昌生物与 Seagen 的合作模式，以技术授权形式快速积累交易经验并回笼资金；对晚期重磅产品如 ZG005，则优先将欧美市场权益授权给跨国药企，换取首付款与里程碑付款，同时保留中国市场自主开发权。E药资本界认为，泽璟若能在2025-2026年关键节点完成1-2笔全球授权交易，将有效验证其BD能力并再度打开市值空间。反之，若因经验不足导致交易条款不利或进度滞后，可能加剧 “重研发、轻变现” 的困境。因此，投资者需重点关注其 BD 团队组建进展，以及 2025 年关键临床数据披露后的合作动态，以此评估潜在风险与收益。总结作为一家小而美药企，泽璟已经逐渐走出了自己的节奏。对比君实生物、荣昌生物等同市值梯队药企，泽璟之所以能凭借5亿规模冲上去，与营收规模占优的它们一较高低，关键就在于差异化的产品定位与高效的协同布局：几乎没有“废管线”，具有差异性且进度领先，基本都能抢占一定市场。即便尚未商业化的产品，经 BD 合作潜力及潜在市场空间评估，前景同样总体向好。更具体来看，泽璟制药的当前市值逻辑源于两点，一是已验证的商业化能力（多纳非尼、重组凝血酶）；二是高壁垒管线预期（双/三抗、JAK抑制剂）的双重支撑。不过，未来需关注ZG005/ZG006的临床数据披露及吉卡昔替尼的上市放量节奏。另外，不要忽略，这家药企本质上“科学家底色”浓厚，或也回答了其为何频繁能再创新药竞争中占据先发优势。如董事长盛泽林拥有30余年新药研发经验，曾任职于BMS等跨国药企，并主导全球首个氘代抗肿瘤药物多纳非尼的研发及上市；首席科学官盛泽琪博士曾任安进药物研发高管，主导多款抗体药物的开发；首席医学官吴济生曾负责多个国际多中心临床试验设计……但挑战仍在。当前，泽璟正处于从“小而美”向 “专而强”的战略转型关键期。未来 2-3 年，吉卡昔替尼的商业化成效与双抗管线临床进展，将成为检验其估值合理性的试金石，也决定其能否突破质疑，成为本土创新药企的“新明星”。一审| 黄佳二审| 李芳晨三审| 李静芝精彩推荐CM10 | 集采 | 国谈 | 医保动态 | 药审 | 人才 | 薪资 | 榜单 | CAR-T | PD-1 | mRNA | 单抗 | 商业化 | 国际化 ｜ 猎药人系列专题 | 出海启思会 | 声音·责任 | 创百汇 | E药经理人理事会 | 微解药直播 | 大国新药 | 营销硬观点 | 投资人去哪儿 | 分析师看赛道 | 药事每周谈 | 医药界·E药经理人 | 中国医药手册创新100强榜单 | 恒瑞 | 中国生物制药 | 百济 | 石药 | 信达 | 君实 | 复宏汉霖 ｜翰森 | 康方生物 | 上海医药 | 和黄医药 | 东阳光药 |  荣昌 | 亚盛医药 | 齐鲁制药 | 康宁杰瑞 | 贝达药业 | 微芯生物 | 复星医药 ｜再鼎医药｜亚虹医药跨国药企50强榜单 | 辉瑞 | 艾伯维 | 诺华 | 强生 | 罗氏 | BMS | 默克 | 赛诺菲 | AZ | GSK | 武田 | 吉利德科学 | 礼来 | 安进 | 诺和诺德 | 拜耳 | 莫德纳 | BI | 晖致 | 再生元

这篇文章于2025年发表在Stem Cell Reviews and Reports，全面评估了临床级MSC可扩展生产的自动化制造工艺和平台。摘要：     间充质干细胞/基质细胞（MSC）具有卓越的再生和免疫调节特性，因此在再生医学方面具有巨大的潜力。然而，它们的治疗应用需要在严格的监管标准和良好生产规范（GMP）指南下进行大规模生产，这带来了重大挑战。本综述全面评估了临床级MSC可扩展生产的自动化制造工艺和平台。分析了各种大型培养容器，包括多层培养瓶和生物反应器，它们在MSC扩增中的功效。此外，还回顾和比较了自动化MSCs生产平台，如Quantum®细胞扩增系统、CliniMACSProdigy®、NANT001/XL、CellQualia™、Cocoon®平台和Xuri™细胞扩增系统W25。我们还强调了优化培养基的重要性，特别强调从胎牛血清转向人源化或无血清替代品，以满足GMP标准。此外，还讨论了替代冷冻保存方法和控速冷冻系统的进展，这些方法为MSC保存提供了有希望的改进。总之，推进自动化制造工艺和平台对于实现基于MSC的再生医学的全部潜力和满足对基于细胞的疗法日益增长的需求至关重要。强调涉及行业、学术界和监管机构的合作举措，以加速基于MSC的疗法向临床实践的转化。1.背景介绍     间充质干细胞/基质细胞（MSC）是一种存在于各种组织中的多能成体干细胞，包括骨髓、脂肪组织和脐带。它们具有显着的自我更新和分化能力，使它们能够产生各种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。此外，MSC分泌多种生物活性分子，包括生长因子、细胞因子和细胞外囊泡，有助于组织修复和再生。这些旁分泌因子发挥抗炎、抗凋亡和促血管生成作用，促进各种损伤和疾病的组织愈合。此外，使MSC对治疗应用具有吸引力的关键特征之一是其免疫调节特性。MSC已被证明可以通过抑制各种免疫细胞（包括T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞）的增殖和功能来抑制免疫反应。这种免疫调节作用使MSC成为治疗各种自身免疫性疾病、移植物抗宿主病（GVHD）和炎症综合征的有希望的候选者。因此，MSC为再生医学、组织工程和自身免疫性疾病的治疗提供了一条有前途的途径，因此在解决未满足的医疗需求方面具有巨大潜力。     由于MSC的生产被视为ATMP（先进疗法药品），因此其应用由特定的监管框架控制。MSC生产需要符合当前良好生产规范（GMP）标准的大规模细胞扩增系统。GMP指南是由政府监管机构制定的严格法规，例如美国的食品药品监督管理局（FDA）或欧洲药品管理局（EMA），旨在确保药品（包括基于MSC的产品）的质量、安全性和有效性。考虑到基于MSC的疗法涉及事后无法过滤或灭菌的活细胞的给药，MSC生产的首要GMP先决条件是具有受控无菌和多级无菌保护解决方案的环境。洁净室设施、无菌防护服、层流罩和封闭培养系统共同参与其中，以限制空气中的颗粒数量并避免最终产品受到污染。最后但并非最不重要的一点是，训练有素、组织有序、了解制造过程的员工对于不伤害患者也很重要。      基于MSC的疗法的生产过程包括供体和MSC来源选择、细胞分离和扩增、质量控制以及扩增细胞的进一步移植等步骤。将MSC用于治疗目的的关键挑战之一是能够在保持其特性和功能特性的同时大量扩增它们。一般来说，天然组织和收集的生物材料中MSCs的初始频率非常低——据报道，骨髓中每104-105个单核细胞或脂肪抽吸物中每102-103个细胞中MSC少于或大约1个。传统的MSC体外扩增至临床相关产量（数百万至数亿个细胞）通常非常耗时、劳动密集型，并且需要大量的培养箱空间。因此，它不仅效率低下，而且还可能损害扩增的MSC的质量。重要的是，以前的研究报道了MSC在晚期传代中的增殖和分化能力下降。      MSC制造过程的另一个组成部分是最终产品的质量控制。这包括细胞活力、表型标志物、分化潜能和无微生物污染的检测，以评估制造细胞产品的纯度、特性、效力和安全性。根据国际细胞治疗学会（ISCT）的规定，MSC必须满足以下方面：（I）塑性粘附性，（II）CD105、CD73和CD90等分化簇（CD）分子表达阳性，缺乏CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α和人类白细胞抗原（HLA）-DR的表达，（III）在体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞[9].然而，为了确保MSC的安全性和功能性，应进行免疫调节活性和基因组稳定性的额外测试。2.MSC生产平台     大规模生产临床级MSC的生物工艺策略是一个复杂的过程，对封闭和无菌环境有很高的要求。因此，MSC加工必须在符合GMP的专用设施中进行，以最大限度地降低物理屏障和空气过滤污染的风险。为了响应该领域的客户需求，一些制造商正在开发和引入用于自动和密闭细胞培养的新技术，例如量子®细胞扩增系统（TerumoBCT）、CliniMACSProdigy®（MiltenyiBiotec）、NANT001/NANTXL系统（VivaBioCell）、CellQualia™（Sinfonia技术）、Cocoon®平台（Lonza）或Xuri™细胞扩增系统W25（Cytiva）（图1）.生物反应器的利用在扩大基于细胞的疗法的可及性方面具有巨大潜力，特别是对于缺乏现场GMP合规实验室的中心。这些生物反应器为细胞培养和扩增提供了受控的环境，确保了细胞生产过程的一致性、可重复性和质量。通过使用生物反应器，没有GMP设施的中心仍然可以生产临床级细胞，从而将基于细胞的治疗范围扩大到更多患者。图1：大规模生产临床级间充质干细胞/基质细胞（MSC）的生物加工策略的复杂概述。MSC扩增平台（Quantum®细胞扩增系统、CliniMACSProdigy®、NANT001/XL、CellQualia™、Cocoon®平台和Xuri™细胞扩增系统W25）需要以下输入：样品或分离的细胞、培养基、洗涤试剂（磷酸盐缓冲盐水）、解离试剂（胰蛋白酶、TrypLE）和可选添加剂。细胞收获、质量控制（最终产品的纯度、特性、效力和安全性）、冷冻保存和产品配方等下游工艺也是临床级MSC生产的重要组成部分。     Terumo-BCT开发的量子®细胞扩增系统代表了一种利用中空纤维生物反应器的自动和闭式细胞培养的替代策略。此外，该设备以适合细胞培养过程的速率提供连续的培养基更换。生物反应器本身的面积为21,000cm2，相当于120个T-175培养瓶。值得注意的是，在细胞接种前，该生物反应器的中空纤维必须涂有粘合基材，如纤连蛋白、波形蛋白或冷沉淀物（通常来自多个供体的血液）。迄今为止，已有多达25项实验研究测试了Quantum®细胞扩增系统用于成人MSC扩增，使其成为贴壁细胞使用最广泛的生物反应器系统。此外，在比较脂肪组织来源的MSC（AT-MSC）的产量和群体倍增时，Quantum®优于基于培养瓶的手动培养，因此适用于大规模生产。此外，用人血小板裂解物（hPL）取代胎牛血清（FBS）作为生长补充剂，可显著增强AT-MSC在Quantum®内的扩增，同时保持其质量。例如，以20×106的密度加载到Quantum®中，来自骨髓的解冻MSC（BM-MSC）（在第2代）（在第2代）扩增7天，产量为100–276×106。此外，几项研究表明，能够在体外抑制T淋巴细胞活化的量子®扩增BM-MSC可以保持免疫调节功能。此外，Quantum®系统可以直接连接到任何气体及其组合，从而提供常氧或低氧微环境。Hanley等人观察到，与Quantum®和缺氧扩增的BM-MSC相比，培养瓶和常氧培养的BM-MSC的生产率较低。另一方面，加强对乳酸和葡萄糖水平的监测，再加上Quantum®生物反应器内新鲜培养基的持续供应，很可能促进了卓越的存活率和整体生长。通常，与基于培养瓶的增殖相比，Quantum®减少了所需的传代次数（减少到一半）和开放作（从54400个步骤减少到133个步骤）。此外，他们的研究还声称量子®扩增BM-MSCs在缺血性卒中大鼠模型中的治疗效果。另一项研究揭示了源自脐带组织（UC-MSC）的Quantum®制造的MSC和移植到诱导膝关节关节表面缺损小鼠身上的BM-MSC的愈合能力。采用Quantum®生物反应器系统的临床试验探索了GVHD、2型糖尿病、帕金森病、高级别神经胶质瘤、缺血性心脏病、中风和急性呼吸窘迫综合征等疾病的治疗方法。利用各种MSC类型，包括BM-MSC、AT-MSC或神经MSC，这些试验证明了使用Quantum®系统在不同剂量和给药途径下产生的细胞的安全性、耐受性和有效性。  来自MiltenyiBiotec的CliniMACSProdigy®设备利用ACC（贴壁细胞培养）工艺和适当的管路组（TS730），可实现自动MSC分离（通过骨髓样本的密度梯度离心）、接种、培养、培养基更换、繁殖和收获。Godthardt等人展示了该系统的大规模和临床级效率以及特定MSC-BrewGMP培养基的使用。此外，他们声称原代组织分离的BM-MSC以及AT-MSC或UC-MSC的单细胞悬液可以由CliniMACSProdigy®处理。此外，据报道，使用1层CellSTACK®的10天程序能够产生100多个集落，由29至5000万个MSC（第零代–P0）组成，这些集落是从马电针动员的外周血样本中分离出来的。分离的MSC具有特征性的成纤维细胞样形态和MSC表型特征。重要的是，与手动方案相比，Prodigy系统在P0收获的MSC数量显著更高，并且通过随后的手动传代提高了纯度，P3中CD73、CD90和CD105的阳性率达到95%。在制造商研究中，人骨髓单核细胞最初接种在1层CellSTACK®腔室中。然后在CliniMACSProdigy®系统内使用MSC-BrewGMP培养基洗涤、培养和扩增这些细胞，并将其扩增成三个5层CellSTACK®腔室。为了进行比较，使用T175培养瓶进行手动扩增过程。扩增14天后，CliniMACSProdigy®系统产生3.8×10⁸个BM-MSC（第2代），而手动过程在同一传代下产生4.5×10⁸个细胞，表明自动和手动方法之间的细胞数量相似。然而，平台复杂性和高耗材价格使CliniMACSProdigy®成为昂贵的制造选择，尤其是对于小规模MSC增殖。     NANT001或XL系统提供了另一个平台，在XL系统的情况下，包含一个CellSTACK®（636cm2）或两个互连的细胞培养容器（T-175和3180cm2的5层培养瓶）。与CliniMACSProdigy®不同，该系统不需要外部培养箱。另一方面，它的产能较低，但足以满足中小批量的自体生产。此外，它还允许对过程控制信息（例如温度、pH值、汇合度和细胞分离）进行智能和远程监控。NANTCartridge是一个封闭系统，由四个通过无菌连接器易于连接的部分组成[23]。Fitzgerald等人测试了NANT001系统在符合GMP的要求下生产来自健康供体的自体AT-MSC的效率。手动和自动过程同时进行，将加工后的基质血管组分（SVF）的细胞以4,000个细胞/cm2的密度放入一个636cm2的CellSTACK®培养室中。总体积为150mL的培养基由补充有5%hPL和1U/mL肝素的最低必需培养基（α-MEM）的α改良型组成。用150mL磷酸盐缓冲盐水洗涤培养样品，然后在第1天、第3天和50%汇合时更换培养基。在达到90%汇合度24小时后，用50mL重组TrypLE溶液收获扩增的细胞。来自三次验证运行的数据显示，分别持续6-8天和7-9天的手动和自动过程的细胞产量（平均2.7×107）和活力（>90%）相当。此外，两种扩增的AT-MSC都具有MSC表型特征以及与脂肪细胞和骨细胞相似的分化能力。      CellQualia™代表了另一个由Sinfonia技术设计的智能细胞处理系统。该系统使用两个细胞培养单元以及从1层到5层（CellSTACK）®和36层（HYPERStack®）腔室的自动传代，实现MSC的紧密和自动化生产。分析技术的内置过程通过对自动采集的样品进行在线（温度、CO2、形态、pH、葡萄糖和乳酸）和离线分析，确保高水平的质量控制。通过监测乳酸水平随时间的变化，可以间接评估细胞生长和增殖动力学。一旦乳酸水平达到表明最佳细胞密度的某个阈值，系统就会表明需要自动传代。此外，犬尿氨酸的积累和低水平2-氨基己二酸的维持表明细胞在整个过程中保持未分化状态。Hosoya等人证实了CellQualia™连续繁殖的MSC的塑料粘附和表型特征，这些MSC对MSC特异性标志物CD105、CD73和CD90呈阳性。然而，该研究缺乏对MSCs阴性标志物及其分化能力的评估。从2×10开始，该公司表示，在培养2次传代和6天后，MSC产量相当于1×108个细胞。     Lonza推出的Cocoon®平台旨在满足自体（患者规模）细胞疗法的生产要求。该系统使用封闭的一次性盒，为培养锚依赖性或独立细胞提供平面或体积空间。在包埋盒内，热障将温暖和寒冷区域分开，确保细胞培养（37°C）和试剂储存（4°C）的最佳条件。此外，该盒还配备了pH和溶解氧传感器，可在制造过程中实时记录数据。该平台是可定制的，易于使用，并且需要最少的作员干预，但是，目前其广泛的实施尚不清楚。     由Cytiva开发的Xuri™细胞扩增系统W25代表了细胞治疗生物工艺的飞跃。该系统采用单向WAVE™摇摆技术和各种培养体积（从300mL到25L），适用于小规模研究或大规模临床生产。WAVE™技术提供的轻柔摇动运动增强了营养物质的分布和气体交换，这是维持最佳细胞生长和活力的关键因素。专为免疫治疗中不依赖贴壁的细胞（嵌合抗原受体T细胞）的可扩展扩增而设计，但也可以参与微载体上的MSC生产。Silva等人在小体积接种到2L细胞袋的CultiSpher-S微载体上进行了UC-MSC的扩增，并在最初的24小时内保持静止。之后，在600mL培养基中的摇摆培养物中扩增UC-MSC。总体而言，该系统产生的膨胀系数范围为12.3至24.8。重要的是，摇摆培养中采用的动态条件不会对扩增细胞的质量产生负面影响，这通过各种质量控制措施（包括活力、表型保留和分化潜力）得到验证。有趣的是，另一项研究发现，在摇摆生物反应器中自发产生的MSCs聚集体表现出增加的干性、迁移特性和血管生成因子表达，从而提供了更高的治疗潜力。总体而言，Xuri™细胞扩增系统W25是一种多功能且高效的MSC扩增工具，为研究和临床应用提供了可靠的解决方案。3.细胞培养容器的放大    多层培养瓶是大规模MSC生产的重要组成部分，与传统使用的T-25、T-75和T-175培养瓶相比，其表面积更大（表1），从而减少了MSC的广泛传代培养。通常，放大涉及使用更大的生物反应器来提高生产能力，需要进行大量优化以保持更大体积的细胞质量。相比之下，横向扩展通过添加更多相同大小的生物反应器来扩大容量，确保各单元的条件一致，但需要更多的空间和资源。在放大和横向扩展之间进行选择取决于生产目标、预算和保持细胞一致性的能力等因素。如今，多层培养瓶是最有效的大规模策略之一，据报道其扩增率为100倍甚至更高。另一方面，随着细胞培养过程扩大到更大的容器尺寸，在整个生产过程中保持无菌和均一的培养环境变得越来越具有挑战性。表1.Corning和ThermoFisher不同多层培养瓶的生长面积   CellSTACK®多层培养瓶（Corning）和Nunc™CellFactory™系统（ThermoFisher）就是此类容器的示例，它们由堆叠在一起的多层细胞培养表面组成。它们都有5种尺寸，从1到40层不等，每层提供636厘米和632厘米的生长面积2。据报道，对于2室CellSTACK®，在5天的培养过程中，最终细胞产量为2.84×108（WJ-MSCs（沃顿氏果冻-MSCs）和4.69–5.65×107（BM-MSCs）。比较这两项独立研究，初始接种的细胞数量存在显着差异，范围为1000至4000个细胞/cm2，导致计算的扩增率存在195.28倍和9.22-11.10倍的巨大差异。同样，两位独立作者使用4室Nunc™CellFactory™在收获时获得了不同的细胞产量，对应于扩增的BM-MSC×7.8×108和2.5108。最后，在5腔CellSTACK®中培养牙髓来源的MSC（DP-MSC）11天，分别产生3.2×108个细胞在补充FBS和hPL的培养基中培养的108个细胞。总体而言，接种密度、培养基、某些添加剂和培养时间等细胞培养参数会影响给定系统的细胞产量。此外，康宁的CellBIND®表面处理通过增加聚苯乙烯细胞培养容器的亲水性来增强细胞粘附和生长，使其更有利于多种细胞类型。这种处理确保了一致、稳健的细胞培养条件，这对无血清或低血清培养基应用特别有益。  HYPERFlask®和HYPERStack®容器采用独特的细胞-介质环境气体交换技术，通过透气材料消除容器内的内部顶部空间。在补充有15%人AB血清的α-MEM中，以2×103个细胞/cm2的浓度接种10层HYPERFlask®（1720cm2）（共3.44×106个细胞）中，从人脐带基质（UCM-MSCs）衍生的扩增MSC能够在培养11天后产生4.5×107个细胞，相当于12.99的扩增率。HYPERStack®由Stackettes组成–一个单独的细胞培养室，由顶板和透气膜组成。每个Stackette拥有500cm2的生长面积，它们通过两个（液体和空气）歧管互连，形成一个模块，每个Stackette之间有一个露天气管空间。因此，HYPERStack®的12层和36层模块（相当于6000和18000cm2）具有与传统的2层和10层堆叠培养容器相同的体积占地面积。从而最大限度地减少培养空间，同时满足培养细胞的代谢需求。Sherman等人进行的初步数据显示，以3×103个细胞/cm2的密度接种BM-MSCs扩增5天后，可以®产生8.7亿个细胞的平均收获产量（扩增比为16.11）。      康宁®CellCube®系统为贴壁细胞培养提供了一个新颖、稳定且可扩展的平台。其模块化设计由平行的10、25或100个聚苯乙烯板组成，可在紧凑的占地面积中提供8500至85000cm2的大生长表面积。在CellCube®系统内，在每个培养板的两侧接种和培养细胞，使培养空间加倍。接种过程需要优化贴壁时间和系统的多次垂直旋转，以均匀接种细胞。此外，内置蠕动泵和一次性生物反应器可确保高效的连续流体再循环，以实现最佳的气体和营养物质输送。CellCube®系统的这种基于灌注的设计创造了一个与体内条件非常相似的环境，从而提高了细胞生产率。提供的信息概述了HEK293T和Vero细胞培养物在100层CellCube®模块中的成功扩增，展示了对培养条件的严格控制以及使用代谢物分析来确定收获时间。HEK293T和Vero细胞培养物均能有效扩增，分别×10个10个细胞的产量达到1.4和1.1。4.优化MSC生产：利用符合GMP要求的血清和无血清培养基     工艺验证是药物开发中的关键步骤，在此期间，必须仔细评估可能危及产品安全性的培养基、添加剂和材料的使用。例如，使用动物源性添加剂存在病原体传播的风险，需要进行彻底的风险分析并考虑替代添加剂。选择合适的培养基对于MSC的扩增和质量是必不可少的，尤其是在临床目的的大规模生产中。FBS作为富含生长因子和营养物质的天然补充剂，在许多实验室应用中用于细胞体外扩增，有着悠久的历史。然而，使用FBS培养旨在进一步用于治疗应用的MSC会带来重大风险，这主要是由于牛病毒、朊病毒和人畜共患病原体的潜在污染，这些物质可能会引发人类的免疫反应。在GMP级MSC生产中，利用经验证的FBS彻底检查免疫调节剂的存在，对于维持质量标准至关重要。γ辐照处理被认为是防止FBS中病毒污染的最佳方法之一，它与GMP流程一致。然而，采用无异种成分（xeno）的培养基，如富含人源物质的含血清培养基或无血清和无异种成分的培养基（SXFM），是符合GMP要求的MSC生产的最佳选择。将人类成分而不是动物衍生物加入培养基中，可确保符合细胞扩增过程的GMP指南。目前，包括人血清、脐带血血清、富血小板血浆和hPL的人源化补充剂被用作FBS的替代品（表2）。尽管自体人血清是MSC扩增的最佳选择，但获得足以产生临床相关量MSC的血清将具有挑战性。然而，来自多个供体的混合同种异体人血清可能有助于克服这一限制并促进MSC的大规模生产。尽管如此，人源补充剂（例如自体人血清）还有下一个显着的缺点，即从一个批次到另一个批次观察到的显着差异。尽管这些变化可以通过每批生产大型供体库来减轻，但它们同时也增加了可能因人类病毒而引起的感染风险。因此，这些障碍可能对大规模临床试验中MSCs的充分扩增和相关治疗效果构成重大挑战。     为了在不使用任何动物产品的情况下获得安全的人类产品，研究人员使用psoralen或核黄素灭活的hPL作为FBS的替代品，验证了在GMP条件下生产MSC。这种方法保留了MSC的多能和免疫调节能力。Mareschi等人使用hPL而不是FBS从5个骨髓样本中分离MSC。他们研究了一种新的hPL生产方法，该方法涉及用Ca-Gluconate处理血小板池以形成凝胶凝块，然后机械挤压以释放生长因子。将通过冻融循环和添加肝素获得的标准hPL（hPL-E）与新的hPL（hPL-S）没有血小板或纤维蛋白原，但含有相似数量的蛋白质和生长因子。hPL-S需要更少的生产步骤来符合GMP条件，保持干细胞标志物，并显示出显着差异，例如HLA-DR表达较低，使其成为MSC生产的有效替代方案。目前，有几种市售的病毒灭活GMPhPL以及最终的商业产品，如人血小板裂解物（生命科学生产）、血小板裂解物MultiPLi（Macopharma）和PLUS™GMP级（CompassBiomedicalInc）。此外，与hPL相关的污染风险得到有效管理。例如，自2018年以来，法国的所有血小板浓缩物都经过补骨脂素处理，以降低微生物污染的风险。另一种消除潜在病原体的方法是在使用hPL之前对其进行伽马射线照射[57]。然而，与hPL产品生产相关的一个重大限制是必须确保血小板供体的充足供应。管理符合GMP的培养基的补充选择是使用合成的、化学成分明确的培养基，例如BDMosaic™间充质干细胞无血清（BDBiosciences）、MesenCult-XF™（StemCellTechnologies）、MSCNutriStem®XF（生物工业）、无血清成分确定的细胞培养物（TNCBioBV）等。上述培养基的成分仅由已知化合物组成，使其成为FBS的潜在可取替代品。尽管如此，它们特别适用于研究目的，因为它们需要不断开发和改进以维持关键的细胞功能，例如粘附、分化、免疫调节和其他基本过程。用于优化和可重复的MSC生产的下一组培养基是具有高质量成分的无血清、无异种成分配方，例如MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec）和StemProMSCSFMXenoFree™（Invitrogen）等。然而，化学成分明确的培养基的一个关键限制是由于缺乏附着因子，MSC增殖缓慢或有限，以及细胞对底物的粘附不足。因此，使用某些培养基需要在塑料表面预涂特定物质，以确保最佳的细胞附着和生长。另一方面，补充人血浆衍生物的StemProMSCSFM™（LifeTechnologies）等培养基对于无包被的MSC培养来说并不是最佳。MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec）是市场上唯一一种符合GMP要求的SXFM，因为它是袋装的，用于封闭系统培养，不需要表面涂层。最常用的分子，如纤连蛋白、层粘连蛋白和肽，用于表面改性，通过引入正表面电荷来促进细胞生长，从而增强粘附力。表2：用于 GMP 级 MSC 生产的培养基     比较补充动物或人血清的不同培养基类型与无血清培养基（SFM）的效果，可得出对MSC特性的显著结果。Dreher等人证明，与在10%FBS中培养的AT-MSC相比，在补充有10%人血清的培养基中培养的AT-MSC在应用后在非肥胖糖尿病免疫缺陷小鼠肺和肝脏中的存在减少。总之，在人血清存在下培养的AT-MSC在特异性粘附和细胞外基质相关分子的下调方面表现出有趣的变化。他们认为整合素α6（CD49f）表达的降低可能与对层粘连蛋白的粘附减少有关。尽管如此，减少间充质干细胞在肺部的滞留可能会降低肺栓塞的风险。细胞扩增培养基的选择在影响MSC的增殖动力学等特性方面起着关键作用。多项实验研究揭示了各种培养基类型对MSC特性和培养动力学的显着影响。Wuchter等人进行了一项比较分析，研究了三种符合GMP的培养基对MSC扩增的影响：补充有10%混合hPL的基础培养基（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）-低葡萄糖）、StemPro®MSCSFMCTS（Invitrogen）（用于人离体组织和细胞培养加工应用）和补充有10%FBS的非XFMSCGM™（Lonza）（仅供研究应用）。最显着的差异出现在延长培养（50天）后BM-MSCs的大小和增殖动力学。StemPro®MSCSFMCTS显著促进了生长，与其他MSC相比，产生的MSC具有更小但高度均匀的形态。在hPL培养基中培养的BM-MSCs表现出明显的突起，但与在含有FCS的MSCGM™中培养的BM-MSC相比更小。然而，与在MSCGM™中培养相比，用hPL培养基培养的MSC观察到的生长增加略大。血小板裂解物对MSCs扩增的促进也与其他研究的结果一致。此外，Poloni等人证明，在含有10%混合同种异体人血清的Iscove改良Dulbecco培养基中培养的CD271阳性BM-MSC与在补充动物血清的培养基中培养的培养基相比，表现出相当的分化能力以及表面和基因标志物的表达。此外，未观察到核型改变。他们还证明，使用CD271选择的细胞和混合的同种异体人血清，仅30天内从5mLBM抽吸物中细胞产生显着增加到临床显着水平（10×10^8MSC）[66]。此外，SFM的使用也对MSC的特性产生了显着影响。例如，PRIME-XVSFM（IrvineScientific）已被证明可以增强人BM-MSC中的集落形成能力，提高成骨潜力，并增加群体倍增。因此，它是动物血清的优质替代品。尽管基于FBS的培养基和PRIME-XVSFM的渗透压相似（分别为0.31和0.29Osmol/kg），但SFM更接近人类生理条件，因此被认为对细胞有更好的影响。此外，Aussel等人证明，SXFM，特别是MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec），显著影响MSC的克隆形成效率。具体来说，与传统的AT-MSC和BM-MSChPL培养基相比，SXFM条件下的菌落大小和密度增加。     值得注意的是，用于收获和分离用于临床应用的MSC的其他补充试剂也必须满足所有安全标准。目前，大多数临床研究使用猪来源的胰蛋白酶进行细胞分离制备。然而，为了优化该程序，使用TrypLE（Gibco，ThermoFisherScientific）或TrypZean（Sigma-Aldrich）等重组胰蛋白酶是有利的，因为它们对细胞的影响更温和，并且与猪来源的胰蛋白酶相比不存在异种蛋白。对于GMP条件下的酶组织消化，建议使用GMP级胶原酶而不是I型胶原酶，因为后者可能含有可能携带传染源的成分。出于这些目的，例如，源自溶组织梭菌的胶原酶NB6GMP级（NordmarkBiochemicals）是一种用于分离干细胞的高纯度组织解离酶。它包含具有酶活性的蛋白质，包括I类和II类胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶。0.4PZU/mL胶原酶NB6的最佳浓度和3h的消化时间表明，在第0代时，沃顿胶溶胶衍生的MSC产量更高。此外，其他类型的胶原酶也用于组织消化：CLSAFA（Worthington）和LiberaseMTF-SGMPGRADE（Roche）。另一方面，胰蛋白酶和胶原酶的另一种替代替代品是Accutase（Life Technologies），它是蛋白水解酶和胶原水解酶的混合物。然而，离心、过滤或微碎裂等机械作提供了避免与胶原酶使用相关的安全问题的替代方法。根据迄今为止收集的数据，来自骨髓、脂肪组织和脐带的MSC是临床试验中最常用的细胞来源。然而，AT-MSC在大规模生产中具有优势，因为与来自同一供体的BM-MSC相比，AT-MSC在长时间培养过程中具有增强的遗传和形态稳定性，并且增殖更快。此外，AT-MSCs在25次传代后表现出分化潜能降低，而BM-MSCs的免疫抑制作用仅在7次传代后观察到下降。5.临床条件下MSC的冷冻保存     细胞或组织在细胞疗法中的应用导致了治疗获得性或遗传性疾病的新型药物的诞生。这些是已知的ATMP，被定义为主要生物作用由细胞或组织执行的治疗产品。冻存保存仍然是延长细胞（包括MSC）保存时间的唯一技术。它有助于维持细胞功能特性，并允许细胞聚集以达到临床使用所需的数量。与成骨细胞和软骨细胞等特殊细胞的冷冻保存相比，MSC必须考虑更多因素。具体来说，评估MSC冷冻保存后的免疫调节和多系分化能力、细胞活力和表型至关重要。如果这些能力受损，MSC可能无法保持原有的免疫调节和再生特性。冷冻保护剂      冷冻保护剂是能够防止生物物体遭受冰冻损伤并确保其解冻后存活的试剂。冷冻保护剂在冷冻过程中的保护作用基于它们与细胞内外的水分子形成牢固键的能力，这比水分子本身之间的键更强。此外，它们还可以降低盐浓度，最大限度地降低破坏细胞蛋白质结构的风险。低温保护剂还与膜的结构部件粘合，保护它们免受冰晶的损坏（图2）。图2：细胞冻存机制作为基于细胞的疗法生产的关键步骤。在冷冻保存过程中导致细胞损伤的过程涉及特定的机制。为了防止这种伤害，必须在细胞悬液中添加适量的适当冷冻保护剂（CPA）并应用最佳冷却速率。      已经开发了各种技术来冷冻保存MSC，例如慢速冷冻和玻璃化。但是，这些方法有局限性。首先，即使使用冷冻保护剂（CPA），使用这些方法保存的MSC仍然存在冷冻损伤的风险。其次，二甲基亚砜（DMSO）等CPA可能会无意中诱导MSC分化为神经元样细胞。为了解决这些问题，需要优化CPA的使用或开发新的冻存方法。微/纳米技术的最新进展提供了有希望的改进，有可能提高冷冻保存的效率并克服当前方法的局限性。在高度疏水性的纳米粗糙表面上冷冻封装在纳升液滴中的细胞以及创建无毒的纳米级生物启发CPA等创新是该领域特别有前途的进展。     已建立的MSC冻存方案使用DMSO。残留的痕量DMSO，即使在洗涤步骤之后，也会对患者造成重大不良反应的风险。此外，DMSO与异常基因表达和MSC分化有关。因此，开发一种不含DMSO的MSC冻存方法是非常可取的。海藻糖、植物蛋白和防冻蛋白模拟物等物质已与降低浓度的DMSO相结合，以改善MSC冻存。这些组合成功地抑制了冰的再结晶，并保护了细胞膜，类似于天然防冻蛋白。目前有几种市售的冷冻保存选项用于MSC的冷冻保存。     CryoStor®CS2、CS5和CS10是市售的GMP级冻存培养基，设计用于优化细胞和组织在−80°C至−196°C的超低温环境中的保存。这些制剂在冷冻、储存和解冻过程中提供保护环境，增强细胞活力和功能，同时无需血清和高细胞毒性试剂。CryoStor专门处理细胞的分子生物学方面，减少冻存诱导的延迟性细胞死亡，从而提高解冻后活力，特别是对于MSC和肝细胞等敏感细胞类型。该产品线包括CryoStorCS2（2%DMSO）、CS5（5%DMSO）和CS10（10%DMSO）。冻存过程涉及关键步骤。最初，通过机械或酶解离制备细胞，然后离心以产生细胞沉淀。去除上清液，同时尽量减少培养基稀释。然后加入CryoStor冷培养基，使其浓度达到0.5-10×10^6个细胞/ml，在2-8°C下孵育约10分钟。以每分钟-1°C的受控速率将温度降低到-80°C，在此温度下保持15-20分钟，然后在-5°C左右开始冰成核，从而开始成核。或者，样品可以在−20°C下保存2小时，然后在−80°C下保存。冷冻后，它们可以在低于-130°C的液氮中储存，或在-80°C的温度下短期储存。解冻至关重要，应在37°C水浴中迅速解冻。解冻后，细胞-CryoStor混合物需要用培养基在20–37°C下稀释。解冻后活力应在24小时后使用活/死荧光测定或MTT等代谢测定进行评估，以仔细比较与非冷冻对照的准确性。      Ho等人提出了一项研究，其中犬AT-MSC被修饰为过表达治疗性转基因，用CryoStor10冷冻保存长达11个月。结果表明，冻存不会影响转基因表达、细胞活力或迁移能力。值得注意的是，解冻的MSC表现出与新鲜MSC相当的细胞毒性，可有效治疗患有癌症的犬患者，并导致超过20个月的无进展生存期，突出了冻存MSC在临床应用中的可行性。此外，将马MSC冷冻保存在CryoStor®CS10中，并评估其在小马体内的活力。Williams等人的研究涉及在模拟冷藏运输后和解冻后立即通过静脉注射这些MSC，并监测临床和血液学变化。结果显示没有不良反应或血液参数偏差。注射后CD4+和CD8+淋巴细胞群增加，表明可能存在免疫反应。CS10有效地维持了MSCs的活力。有必要进一步研究以探索与不同MSCs供体的免疫相互作用。      最近的一篇论文比较了两种冷冻保护剂：STEM-CELLBANKER™（CB）和10%DMSO，均在无异种成分培养基中，用于AT-MSC和BM-MSC。与非冻存MSC相比，两种冻存保护剂都保持了相似的细胞形态和表面标志物表达。然而，冷冻保存的AT-MSC与CB（90.4%）相比于DMSO（79.9%）具有更好的活力。虽然在CB和非冻存条件下，AT-MSC的群体倍增时间相当，但使用DMSO时略有增加。BM-MSC显示两种冷冻保护剂的倍增时间更长。重要的是，两种MSC类型在冷冻保存后都保留了其分化能力。总之，CB比DMSO更能保持AT-MSC的特性，这可能会影响细胞治疗应用。据制造商称，STEM-CELLBANKER®DMSOFREEGMP级是一种创新的冻存解决方案，旨在保存不含DMSO的各种细胞类型。其配方符合JPN、EU、US和PIC/S的GMP指南生产，不含血清、动物源性成分和DMSO，减轻了对研究至关重要的纯度的担忧。STEM-CELLBANKER®DMSOFree可显著提高细胞活力，同时保留细胞多能性和解冻后有效增殖等关键特性。该解决方案提供了卓越的批次间稳定性，确保了批次间性能的一致性。制造商还声称用户会喜欢它的便利性，因为它不需要准备;细胞可以直接在-80°C下冷冻，从而简化了冻存工作流程。它还在美国FDA药物主文件中注册，允许客户申请监管提交授权书。总体而言，该产品代表了那些寻求无DMSO解决方案的人在低温保存方面的重大进步。      人脐带（UC）是MSC的一个有前途的来源，尽管被归类为实体组织，但UC具有单个供体的多种用途等优势。然而，以前使用动物或同种异体血清的冻存方法导致冻融UC-MSC中的细胞增殖较低。Shimazu的研究团队使用无血清和无异种成分的冷冻保护剂STEM-CELLBANKER建立了一种最佳的冷冻保存技术。经过缓慢的冷冻过程和随后的解冻，保存的UC产生的MSC保持了与新鲜细胞相当的典型表型、免疫抑制能力和分化潜力，证明了临床活力。冻存方法和可用系统      冻存MSC有两种主要方法：慢速冷冻和快速冷冻/玻璃化。缓慢冷冻的速率为1°C/min，因其污染风险低且更易于加工而受到诊所和研究实验室的青睐，允许在一个含有低浓度CPA的小瓶中冷冻大量MSC。尽管存在冻伤风险，但优化CPA的使用对于防止冰晶形成至关重要。玻璃化反应涉及使用液氮将细胞悬液从水相快速转化为玻璃态，需要多摩尔CPA混合物和逐步引入，以尽量减少化学毒性。然而，它有渗透损伤的风险，并且由于需要人工作和高技能，不太适合大体积处理。     开发了一种新的低温保存方案，使用甜菜碱和电穿孔。甜菜碱是一种天然的渗透保护剂，稳定、无毒且高度亲水性，这使其能够竞争性地结合水分子并防止结冰。电穿孔被广泛接受用于将非渗透性分子输送到细胞中，在电刺激下在细胞膜上产生临时的疏水孔，允许分子通过。这种联合方法在各种MSC类型中表现出普遍适用性，并在各种MSC类型中保持较高的解冻后细胞活力，包括人源性UC-MSC、小鼠源性BM-MSC和转基因UC-MSC。     对于同种异体“现成”临床应用，需要大量的冷冻MSC。高细胞浓度的冻存可最大限度地减少DMSO输注量，从而降低输注相关毒性。使用CellSeal®冻存管，将1000万个/mL的细胞用5%DMSO冷冻至-80°C，并储存在液氮中。使用该系统冷冻的AT-MSC在解冻时显示出高功能活力。该系统可轻松进行床旁解冻和给药，残留DMSO极少，无需细胞洗涤。未来的研究将检查解冻后AT-MSC在体内的植入潜力。     在表3中，我们列出了用于MSC冻存的控速冷冻系统的市售选项。这些先进的冷冻系统在确保MSC在冷冻保存过程中的活力和功能方面发挥着至关重要的作用，允许受控的温度曲线，防止冰晶的形成并保持细胞完整性。该表提供了各种型号的详细信息，包括其规格、特点和典型应用，可帮助研究人员和从业人员在为其MSC冻存需求选择合适的设备时做出明智的决定。表3.用于MSC冻存的市售受控冷冻系统概述      关于MSCs悬液的冻存，必须专注于标准化细胞培养质量的评估。特别是，冷冻保存前后评估标准的一致性至关重要。通过比较冷冻前后的相似指标，我们可以准确确定冷冻保存对细胞培养的影响。此外，重要的是要认识到细胞培养物在冷冻保存后必须经过修复或驯化过程。几项研究表明，如果没有这个适应阶段，就无法完全恢复冷冻保存的干细胞的治疗潜力。     重要的是要认识到，各种复杂的基于细胞的产品可能有很大差异，这意味着单一的冻存方案可能并不适合所有产品。因此，为每个产品创建单独的协议会使标准化工作复杂化。因此，基于复杂生物医学细胞的产品的冷冻保存是一个具有挑战性和争议性的问题。然而，研究表明，这个概念是可以实现的，值得进行更深入的调查。阻碍冻存标准化的另一个方面是实验室之间技术设备的显著差异。通常，每个实验室都会根据其特定的技术能力和可用试剂来建立其冻存方案。因此，需要一种综合方法来标准化冷冻保存过程。尽管如此，编制通用指南以增强冷冻保存过程，最大限度地减少对细胞的压力应该是可行的。作者希望这篇综述有助于组织和选择冷冻保存MSCs、含MSCs的组织和相关生物医学细胞产品的方法。6.结论     当前用于生产临床级MSC的大规模扩增平台的一个局限性是不同系统和方法之间的细胞产量和质量的差异。虽然已经开发了各种生物反应器和培养容器来满足放大生产的需求，但在培养条件、细胞处理技术和质量控制措施方面仍然缺乏标准化。这种可变性会导致最终产品不一致，从而影响其治疗效果和安全性。此外，与其中一些平台相关的复杂性和成本可能会限制其广泛采用，尤其是在资源受限的环境中或小规模的生产需求中。     展望未来，应将工作重点放在标准化方案和优化大规模扩增平台上，以确保临床级MSC生产的可重复性、一致性和成本效益。这可能涉及开发更加用户友好的模块化系统，以便无缝集成到现有的制造过程中，以及实施先进的监测和控制技术，以确保对培养条件的精确调节。此外，需要继续研究新型培养基底物、培养基配方和生长因子，这些物质可以增强细胞增殖、维持干性并促进治疗效力。MSC的冷冻保存对于在临床应用中保持其活力和治疗潜力也至关重要。虽然DMSO通常用作冷冻保护剂，但它存在毒性和不必要的分化等风险，这促使开发了替代冷冻保存方法和试剂以及市售的GMP级冷冻保存培养基。此外，受控速率冷冻系统的进步提高了MSC解冻后的活力。涉及工业界、学术界和监管机构的合作倡议对于加速基于MSC的疗法从实验室到临床的转化至关重要。最终，应对这些挑战和提高大规模生产能力对于实现基于MSC的再生医学的全部潜力和满足对基于细胞的疗法日益增长的需求至关重要。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

调节性 T 细胞（Tregs）的 30 个标记物在其识别、功能、分化成熟、抑制活性以及在多种疾病中的作用等方面都具有重要意义。FoxP3作为 Treg 谱系最关键的标记，是一种转录因子，对 Tregs 的分化、成熟及获得抑制功能起着核心作用。其基因发生突变会引发 IPEX 综合征，导致多器官自身免疫疾病。FoxP3 有多种异构体，全长变体（FL）的 Tregs 表现出更高的抑制活性和增殖率。Helios属于 Ikaros 基因转录因子家族，多数人和小鼠的 Tregs 会表达。虽其在人类 Treg 稳定性和功能的确切作用尚未完全明确，但可作为 Tregs 稳定性和纯度的监测标记，还可能与细胞激活和增殖相关。CD25即 IL-2 受体的 α 链，高表达是常规 Tregs 的显著特征之一。在 T 细胞增殖、激活诱导的细胞死亡以及 Tregs 和效应（Teff）T 细胞的功能中发挥重要作用，FoxP3 + Tregs 中 CD25 水平最高的亚群具有最强的免疫抑制活性。CD127是 IL-7 受体的 α 链，在 T 细胞的动态调节、淋巴细胞分化和细胞免疫方面有重要影响。稳态时，Tregs 表达低水平的 CD127，激活时其表达显著上调，可辅助更精准地识别 Tregs。CD39作为一种外切酶，在调节嘌呤能信号传递给免疫细胞的持续时间、强度和化学性质方面发挥关键作用。其在 Tregs 上的表达存在个体差异，在炎症部位表达较高。CD39 + Tregs 被认为具有高活性、强抑制性，能分泌 IL-10，且高表达 CD39 可维持更高水平的 FoxP3 表达。CTLA-4属于 CD28 免疫球蛋白超家族的抑制性受体，对 Treg 细胞功能至关重要。它调节 T 细胞的共刺激，持续表达，在免疫抑制活动期间高度表达，可定义具有强抑制活性的 Tregs。CTLA-4 通过与树突状细胞表面的共刺激分子 CD80/86 结合，阻止其与效应 T 细胞上的 CD28 相互作用，从而抑制 T 细胞激活，还能诱导树突状细胞表达吲哚胺 2,3 - 双加氧酶（IDO），调节免疫反应。GITR是 TNF 受体超家族成员，通过提供共刺激信号来调节免疫反应，影响 T 细胞的激活、分化、存活和记忆形成以及巨噬细胞极化。然而，其在 Tregs 中的作用存在争议，既能导致 Tregs 不稳定、细胞耗竭和抑制功能下降，又能诱导 Tregs 在体外增殖和扩增。TIGIT是具有免疫球蛋白和 ITIM 结构域的 T 细胞免疫受体，为跨膜糖蛋白受体。在 Tregs 激活后高表达，TIGIT + Tregs 相比 TIGIT - Tregs 具有更强的抑制作用，能特异性抑制促炎的 Th1 和 Th17 细胞反应，但不影响 Th2 细胞反应。此外，TIGIT 表达与 Treg 效应分子表达增加相关，如颗粒酶 B、IL-10 和纤维蛋白原样蛋白 2（Fg12）。CD120b（TNFR2）具有抗炎活性，对少突胶质细胞、心肌细胞和角质形成细胞有保护作用，通过影响不同类型免疫细胞来实现免疫抑制功能。在激活的 Tregs 上高度且持续表达，TNF-α 与 TNFR2 的相互作用对 Tregs 的激活、扩增和表型稳定至关重要，还能维持 FoxP3 启动子的去甲基化，支持 Tregs 的分化和稳定。LAP即潜伏期相关肽，是转化生长因子 -β（TGF-β）前体的氨基末端结构域，与 TGF-β 形成潜伏复合物，调节单核细胞募集。LAP + Tregs 在 Treg 特异性去甲基化区域（TSDR）高度去甲基化，在体内外均具有抑制作用。CCR6属于 C-C 趋化因子受体蛋白，在协调免疫细胞向炎症部位迁移、维持免疫稳态和免疫系统完整性平衡方面具有关键作用。在多种炎症性疾病中，CCR6 + Tregs 的比例较高。CD223（LAG-3）是一种免疫检查点受体蛋白，可抑制细胞增殖、免疫功能、细胞因子分泌和维持免疫稳态。在 Tregs 上持续表达，通过抑制促进 Tregs 在炎症部位维持的信号通路来限制其增殖和功能，但也能刺激 Treg 介导的抑制作用，还可与 CTLA-4 和 PD-1 协同增强 Tregs 的抑制活性。GARP（LRRC32）作为潜伏 TGF-β 的膜受体，调节膜结合潜伏 TGF-β 的可用性并调节其在 Tregs 和血小板上的激活。在激活的 Tregs 表面表达，是具有高抑制活性的人类 Tregs 的特异性标记。然而，GARP 与 FoxP3 的表达关系存在争议，有研究表明二者相互依赖，也有研究显示它们并非相互调节。GPA33是一种细胞表面抗原，与免疫失调相关。高表达 GPA33 可定义 CD4 + CD25 + CD127 – FoxP3 + Helios + Tregs，这类 Tregs 无法产生常规 T（Tconv）细胞效应细胞因子。CD137CD137 是 TNFR 家族的共刺激受体，可促进自然杀伤（NK）细胞增殖和细胞因子分泌。CD137 + CD154 −是抗原激活的 FoxP3 + Tregs 的标记，具有高效抑制效应 T（Teff）细胞增殖的能力，具体作用取决于免疫反应类型。Nrp-1即神经毡蛋白 - 1，参与轴突导向和血管生成。在小鼠 Tregs 中富集，在人类中表达较低。在诱导 Tregs（iTregs）表面表达 Nrp-1 可识别和分离出在炎症条件下具有卓越抑制功能的 iTreg 亚群，且在周围淋巴器官中的表达高于胸腺 Tregs。FR4是叶酸结合蛋白的异构体，在小鼠中表达，与人类 FR-δ 高度同源。FR4 过表达可增强 Tregs 在体外的增殖能力，在天然和外周 Tregs 中均有表达。CD103属于整合素 αE，通过与 E-cadherin 相互作用介导细胞粘附、迁移和淋巴细胞归巢。CD103 + Tregs 在炎症部位积累的能力增强，参与皮肤局部 Treg 功能，与 FoxP3 的高表达相关，可能增强 TGF-β 依赖的 FoxP3 表达。CD44作为细胞表面的透明质酸受体，参与细胞的运动、存活和粘附等多种过程。其配体高分子量透明质酸（HMW-HA）可促进 Treg 介导的抑制作用，且与 HMW-HA 共刺激可促进 FoxP3 的表达。CD62L即白细胞粘附分子 L - 选择素，是一种跨膜凝集素受体，可调节幼稚和中枢记忆 T 细胞进入淋巴结以及激活的 CD8 + T 细胞向病毒感染部位的迁移，使 Tregs 归巢到次级淋巴器官。CCR7参与将树突状细胞和 T 细胞定位到淋巴结，在诱导外周免疫耐受方面有重要作用，可使 Tregs 归巢到次级淋巴器官。nTregs 高表达 CCR7，而中央记忆 Tregs（cmTregs）和效应记忆 Tregs（emTregs）下调其表达。CD31（PECAM-1）是高度糖基化的 Ig 样膜受体，在免疫和血管系统中均具有粘附和信号传导功能，是 Treg 分化的标记。ICOS属于 CD28 超家族的同源二聚体蛋白，参与 Tregs 的产生、增殖和存活。在癌症中，Tregs 高表达 ICOS，其与 ICOSL 的信号通路对 Treg 介导的自身耐受至关重要。此外，一小部分 ICOS + Tregs 在正常人和小鼠的外周血中可产生 IFN-γ 和 IL-17。Gal-1即半乳糖凝集素 - 1，参与细胞生长、迁移、炎症、血管生成等多种过程，在肿瘤进展、免疫逃逸和免疫耐受中发挥作用。其对 Treg 细胞的作用具有环境依赖性，阻断 Gal-1 会显著削弱 Tregs 的抑制作用。PD-1（CD279）属于 I 型跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族成员。PD-1 可调节 Treg 的生成及其免疫抑制特性，在癌症中，其阻断对 Tregs 的影响存在争议，既可能降低 Treg 介导的抑制作用，也可能增强 Treg 功能；在自身免疫疾病中，PD-1 在 Tregs 上的表达与疾病相关，如在系统性红斑狼疮中，PD-1 + 滤泡调节性 T 细胞功能受损。CCR7参与免疫细胞向淋巴结的定位和外周免疫耐受的诱导，对 Tregs 归巢到次级淋巴器官具有重要意义，其表达水平在 Tregs 的不同分化阶段有所变化。Granzyme B（GZMB）在结直肠癌中，表达升高，介导肿瘤免疫，参与 Tregs 对肿瘤细胞的抑制作用，是评估肿瘤免疫状态的重要指标之一。TIM-3在多种癌症（如结肠癌、黑色素瘤）中标记肿瘤内 Tregs，其表达与 Tregs 的抑制功能增强和肿瘤生长促进相关；在类风湿关节炎中，TIM-3 表达降低与 Tregs 功能活性下降有关；在移植物抗宿主病（GvHD）中，TIM-3 表达升高与 Tregs 功能活性增加相关。LAG-3 在结直肠癌中，LAG-3 + TIM-3 Tregs 表达更高水平的 TGF-β、IL-10 和 CTLA-4，具有更强的抑制功能，参与肿瘤免疫逃逸和疾病进展的调节。 CD45RA/RO属于受体蛋白酪氨酸磷酸酶，在 T 细胞受体信号起始中发挥作用，是 Tregs 分化状态的标记。初始 Tregs（nTregs）表达 CD45RA，记忆 Tregs 通常表达 CD45RO。参考资料Gootjes, C.; Zwaginga, J.J.; Roep, B.O.; Nikolic, T. Defining HumanRegulatory T Cells beyond FOXP3: The Need to Combine Phenotype with Function. Cells 2024, 13, 941. https://doi.org/10.3390/ cells1311094Santosh Nirmala S, Kayani K, Gliwin ´ski M, Hu Y, Iwaszkiewicz-Grzes ´ D, Piotrowska-Mieczkowska M, Sakowska J, Tomaszewicz M, Marı ´n Morales JM, Lakshmi K, Marek-Trzonkowska NM, Trzonkowski P, Oo YH and Fuchs A (2024) Beyond FOXP3: a 20-year journey unravelling human regulatory T-cell heterogeneity. Front. Immunol. 14:1321228. doi: 10.3389/fimmu.2023.1321228Sayitoglu EC, Freeborn RA and Roncarolo MG (2021) The Yin and Yang of Type 1 Regulatory T Cells: From Discovery to Clinical Application. Front. Immunol. 12:693105. doi: 10.3389/fimmu.2021.693105