Influenza mucosal vaccine(Nanobio Corporation)

摘要：纯化Vero细胞狂犬病疫苗（purified Vero cell rabies vaccine, PVRV）在狂犬病预防中的应用已历经40余年。对近年来国内外PVRV在狂犬病预防中的相关研究进行综述显示，在简化的Zagreb免疫方案中，PVRV具有与在标准Essen方案中相似的免疫原性和安全性。PVRV与鸡胚细胞纯化疫苗、人二倍体细胞狂犬病疫苗（human diploid cell rabies vaccine, HDCV）具有相似的免疫原性和安全性。在疾病等特殊人群中，PVRV也同样具有良好的免疫原性和安全性。此外，PVRV与吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎联合疫苗(DTP-IPV 四联苗)等的联合接种并未发现免疫干扰现象，这为儿童在接种免疫规划疫苗同时进行狂犬病疫苗接种提供了可行性。PVRV与马狂犬病免疫球蛋白联合应用也可获得较好的预防效果。PVRV在预防狂犬病方面发挥着重要的作用，其广泛应用将为实现WHO提出的2030年消除犬传人狂犬病目标作出积极贡献。狂犬病是一种严重自然疫源性人畜共患传染病[1]。全球每年约59 000人因狂犬病而死亡[2]，其中99%的死亡发生在非洲和亚洲[3]，由其造成的经济损失估计为每年86亿美元[4]。中国是狂犬病流行较为严重的国家之一，每年约有4 000万人被动物咬伤[5]。接种人用狂犬病疫苗是预防狂犬病的重要手段，其发展经历了脑组织疫苗、禽胚疫苗和细胞疫苗阶段[6]，当前正研发mRNA等新型疫苗。20世纪80年代以来，以Vero细胞为基质生产的狂犬病疫苗开始广泛应用，对狂犬病的预防发挥了重要的作用[4]。我国批签发数据显示，2020年全年共签发1 755万人份人用狂犬病疫苗，其中Vero细胞基质生产的狂犬病疫苗签发量为1 573万人份，占全年狂犬病疫苗签发总量的90%[4]。本文将就纯化Vero细胞狂犬病疫苗（purified Vero cell rabies vaccine, PVRV）在狂犬病预防中的应用进行综述。01PVRV的国内外应用历史采用Vero细胞系生产人用疫苗的开创性工作是法国的Merieux研究所从20世纪80年代初发起的，该细胞系最初用于大规模生产灭活脊髓灰质炎疫苗和狂犬病疫苗，随后用于生产口服脊髓灰质炎减毒疫苗。PVRV（Verorab）由法国Merieux研究所研发成功。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）推荐使用Vero细胞大量生产狂犬病疫苗，并于1987年颁发了Vero细胞生产人用纯化狂犬病灭活疫苗规程[7]。1983年，人们开始对PVRV的有效性进行研究 [8]。1985—2019年发表的关于Verorab的数项研究表明：暴露前免疫后2至8周的狂犬病病毒中和抗体（rabies virus neutralizing antibody, RVNA）血清转化率为90%~100%，1年时加强免疫后第14天的血清转化率达100%。暴露后预防接种后第14~28天的血清转化率为99%[9]。中国从美国国家菌种保藏中心引进细胞代次在126~134代的Vero细胞，于20世纪80年代末开始研制人用Vero细胞狂犬病疫苗。经国家药品监督管理局批准的用于生产Vero细胞狂犬病疫苗的毒株有2株，分别为CTN-1株和aG株，由中国药品生物制品检定所建株和保存[7]。CTN株于1956年在山东分离[6]。1989年李宏玲等[10]报道了用CTN株适应Vero细胞的研究。1998年张玉慧等[11]用Vero细胞适应10代以后的CTN毒种制备了Vero细胞狂犬病疫苗。1990年曾蓉芳等[12]进行了aG株在Vero细胞上的适应研究。同时期，长春生物制品研究所的科研人员也开展了狂犬病病毒疫苗株适应Vero细胞的研究[13]。2002年辽宁成大生物股份有限公司引进微载体生物反应器细胞培养技术，利用狂犬病病毒PV2061疫苗株和Vero细胞，开始研发PVRV，2005年获得国家药监局批准使用[4]。02PVRV的免疫原性和安全性2.1 Zagreb与Essen方案的免疫原性和安全性比较2017年，Shi N等[5]报道暴露后接种PVRV具有良好的安全性和免疫原性。这项研究采用Zagreb和Essen两种接种方案，结果显示Zagreb方案（n=4972）在第1次和第2次接种时的不良事件（adverse event, AE）发生率虽高于Essen方案（n=5587）分别为12.7%和8.9%，但两组之间在第3次（9.2% vs. 8.5%）和第4次（5.5% vs. 5.9%）接种时的AE发生率相似。在第14天和42天，所有受试者都产生了足够的RVNA。在第180天和365天，两组抗体水平急剧下降。但是，中和抗体>0.5IU/ml的受试者比例仍然很高，均>75%（第180天）和>50%（第365天）。1年后，经确认的狂犬病暴露受试者均未患狂犬病。对37名暴露于实验室证实的狂犬病病毒感染犬的受试者进行>12个月的随访显示，所有受试者中均未患狂犬病。与第0天测得的RVNA水平（0.12 IU/ml）相比，第14天（22.75 IU/ml，P=0.016）和第42天（16.44 IU/ml，P=0.000）RVNA水平显著增加。2021年一项随机、双盲、阳性对照、III期临床试验比较了Zagreb和Essen方案免疫接种PVRV在中国健康受试者中的免疫原性和安全性[14]。结果显示，Essen方案组的AE发生率显著高于Zagreb方案组（P=0.0248）。首次注射后，Zagreb方案组AE发生率高于Essen方案组，可能是由于Zagreb方案首次注射两剂PVRV，但组间并无显著差异。在疫苗接种前抗体呈阴性的受试者中，Zagreb和Essen方案组在第14、35、42天的抗体血清转化率均为100.0%；Zagreb方案组抗体几何平均滴度（geometric mean titer, GMT）不低于Essen方案组，且均远高于0.5 IU/ml的免疫保护水平。然而，在第7天，Zagreb方案组的抗体血清转化率更高，这表明该方案可更早诱导抗体反应[14]。2021年另一项上市后平行对照临床试验中，比较了Zagreb和Essen方案下PVRV的安全性和免疫原性[15]。研究未观察到严重AE。两种方案的AE总发生率和严重程度无显著差异，抗体GMT和血清转化率亦无差异。第14天，Zagreb组和Essen组受试者的抗体阳转率分别为100%和99.16%。第42天，两组血清转化率均达到100%。在关注的AE中，25例(5.22%, 25/479)局部事件和10例(2.09%, 10/479)全身事件来自Zagreb方案组；Essen方案组发生32例(5.33%, 32/600)局部AE和8例(1.33%, 8/600)全身AE。大部分AE为1级，轻微且短暂，且大多发生在早期接种。研究者显示，对于PVRV，在所有年龄组的患者中，Zagreb方案并不劣于Essen方案[15]。2019年，黄竹航等[16]对狂犬病暴露后使用Zagreb程序接种PVRV的3年免疫持久性及2剂加强免疫效果进行了观察。结果，接种疫苗后1年、2年和3年的GMT分别为1.33 IU/ml、1.04 IU/ml和0.72 IU/ml，血清阳性率分别为77.78%(84/108)、66.67%(70/105)和55.56%(50/90)。2剂加强免疫后1年、2年、3年的抗体GMT分别为16.83 IU/ml、19.37 IU/ml和21.05 IU/ml，加强免疫后抗体GMT 均显著高于加强免疫前。血清阳转率分别为100%(100/100)、99%(99/100)和100%(82/82)。可见，狂犬病暴露后使用Zagreb程序接种具有良好的免疫持久性，3年内2剂次加强免疫后具有较好的免疫应答。2.2 PVRV皮内注射与肌肉注射的免疫原性和安全性比较1987年，Phanuphak等[17]对58名受试者进行了狂犬病暴露后PVRV肌肉注射或皮内注射接种的免疫原性比较。结果显示，1/3剂量2位点皮内注射方案所获得的抗体水平与全剂量肌肉注射方案无显著差异。在一项I期临床研究中，研究者在60名18至50岁成年受试者中评估了一种新的PVRV肌肉注射或皮内注射的免疫原性。与市售PVRV肌肉注射相比，接种后第7天，各组间RVNA≥0.5 IU/ml的受试者比例无显著差异。第21天和第42天，所有受试者RVNA均达到保护水平。接种后第7天和第21天，各组的GMT均相似[18]。2008年，Warrell等[19]将254名受试者随机分为三种不同的皮内注射和标准5剂量肌肉注射方案四组。各皮内注射方案组的PVRV疫苗总剂量相同，且比肌肉注射方案少60%。结果显示，皮内注射方案与经典5针法免疫程序一样具有免疫原性。各皮内注射方案组间的免疫原性相似。接种后第7天，4位点、8位点、2位点皮内注射以及肌肉注射组中抗体>0.3 IU/ml的受试者比例分别为60%、77.6%、86.2%和62.5%。第14天，所有受试者的抗体水平均≥0.5 IU/ml。第90天，各组间GMT水平相似。在1年时，所有皮内注射组受试者抗体水平均>0.3 IU/ml，但肌肉注射组中有两人抗体水平≤0.3 IU/ml。Jaiiaroensup等[20]研究显示，在接受肌肉注射和皮内注射方案的1198名受试者中，注射部位瘙痒是唯一显著的局部AE，在皮内注射组更常见。低热是唯一显著的全身AE，在肌肉注射组更常见。84名（44名接受肌肉注射，40名接受皮内注射）有明确狂犬病动物暴露史者在3年后仍然存活，身体状况良好。2.3 PVRV与人二倍体细胞狂犬病疫苗（human diploid cell rabies vaccine, HDCV）的免疫原性和安全性比较Ajjan等[21]在144名兽医学校学生中比较了PVRV和HDCV应用于狂犬病暴露前预防（第0、7、21天接种疫苗）的安全性和免疫原性。结果显示，接种人群均未出现严重AE。HDCV组局部AE（红晕、硬结和疼痛）发生率显著高于PVRV组，全身AE组间无显著差异。HDCV和PVRV都具有良好的免疫原性，其中，PVRV的GMT显著高于HDCV（接种后5周：30 IU/ml vs. 23 IU/ml，P=0.016；第4.5个月：6 IU/ml vs. 3 IU/ml，P=0.006；第21个月：3 IU/ml vs. 2 IU/ml，P=0.012）。两种疫苗的免疫反应均在首次接种后4个月迅速下降，此后在整个研究期间抗体水平保持稳定。值得注意的是，在首次注射21个月后，两组仍保持>90%的血清转化率。一项在80名肯尼亚健康医学生中进行的研究比较了PVRV和HDCV用于狂犬病暴露前预防（第0、7、28天接种疫苗）的抗体反应。结果显示，两种疫苗均引发了快速抗体反应，两组在接种后第7天的血清转化率分别为34%和17%。接种后第28天，两组受试者血清转化率均为100%。PVRV诱导的抗体GMT高于HDCV，但差异并不显著[22]。Strady等采用相同暴露前预防方案的研究同样证实，PVRV和HDCV免疫原性相似：免疫后14 d血清转化率均为100%，1年后加强免疫后14 d血清转化率均为100%，10年加强免疫后血清转化率分别为96.2%和96.9%[23]。2022年，Quiambao等[24]开展的一项III期、多中心、开放标签、随机对照试验，在570名2~64岁健康受试者中使用HDCV或PVRV进行了为期1周的肌肉或皮内注射暴露前预防，暴露前预防方案包括：第0、7天，HDCV肌肉注射（1组）；第0、7、21天，HDCV肌肉注射（2组）；第0、7天，HDCV皮内注射（3组）；第0、7天，PVRV肌肉注射（4组）；第0、7天，PVRV皮内注射（5组）。1年后进行模拟暴露后预防接种（2剂HDCV或PVRV，间隔3 d）。暴露前预防最后1次接种后14 d，血清转化率均很高（1组、3~5组为96.7%~97.2%，2组为100%）。模拟暴露后预防后，除1名受试者外，其余受试者均实现了快速血清转化（GMT≥0.5 IU/ml）。各组疫苗的耐受性良好，接种部位和全身AE发生率相似。研究期间无死亡、严重AE或导致接种中断的AE。该研究显示，HDCV和PVRV的1周暴露前预防方案在不同年龄组（2~64岁）均提供了有效的免疫保护，能够在模拟暴露后疫苗接种后启动快速而有效的免疫反应。2015年，蔡勇等[25]以1 200名10~60岁高危狂犬病感染的健康人为研究对象，随机分为HDCV组和PVRV组，按照Essen暴露后接种程序，分别于第0、3、7、14和28天经上臂三角肌肌肉注射接种1剂疫苗。结果所有受试者接种疫苗后反应轻微，均未发生Ⅲ级及以上AE，所有AE均在72 h内恢复。两组局部AE总发生率分别为7.67%(46/600)和6.83%(41/600)，全身AE总发生率均为5.00%(30/600)。HDCV组和PVRV组首剂免疫后7、14、42 d的血清转化率分别为28.77%(84/292)、100%(292/292)、100%(292/292)和28.72%(83/289)、98.96%(286/289)、100%(289/289)；抗体GMT分别为0.2748 IU/ml、19.7443 IU/ml、37.5750 IU/ml和0.2474 IU/ml、17.3274 IU/ml、37.7231 IU/ml。在安全性和免疫原性方面，两组间差异均无统计学意义。2022年一项纳入27项研究，共计18 630名受试者的Meta分析显示，与PVRV相比，HDCV在狂犬病暴露后预防的安全性方面表现出优越性，但在免疫原性方面未观察到显著差异。HDCV的总体AE的汇总发生率为3.2%（95%CI: 0.9%~10.9%），PVRV为11.7%（95%CI: 5.2%~ 24.1%）。与PVRV相比，HDCV接种导致局部疼痛、发热和虚弱的发生率较低，分别为PVRV的51%（RR=0.51，95%CI: 0.21~0.98）、20%（RR=0.20，95%CI: 0.03~0.64）和25%（RR=0.25，95%CI: 0.06~0.73）。HDCV的汇总血清转化率为35.7%（95%CI: 8.6%~ 69.3%），PVRV为55.6%（95%CI: 22.6%~86.2%），二者在接种后第7天的血清转化率或第14天的RVNA水平无显著差异[26]。2.4 PVRV在特殊人群中的免疫原性和安全性多种疾病，如先天性免疫缺陷、艾滋病、骨髓移植、恶性肿瘤和癌症（白血病、淋巴瘤）、肾衰竭、糖尿病或肝硬化，以及使用皮质类固醇、抗代谢药物、烷基化剂等治疗也会导致患者免疫功能受损，这可能会抑制机体对疫苗的免疫反应。2015年伊朗一项研究对特殊疾病患者按照Essen方案进行暴露后肌肉注射PVRV的免疫反应进行了评估。受试者所患疾病包括慢性乙型肝炎病毒感染、淋巴瘤、糖尿病、类风湿关节炎和红斑狼疮服用皮质类固醇等导致机体免疫功能受损等。结果显示，特殊疾病患者可成功获得血清转化。接种疫苗后第14天至第35天（接种最后1剂PVRV后1周），所有受试者的抗体滴度均>0.5 IU/ml[27]。Tanisaro等[28]对血液透析患者暴露后皮内注射PVRV后的免疫反应进行了研究。20名血液透析患者接受了标准的泰国红十字会皮内狂犬病疫苗免疫方案。在进行疫苗接种之前，20名患者中有6名患者的RVNA超过0.5 IU/ml的保护水平。接种疫苗后第14天，所有受试者的RVNA均高于0.5 IU/ml。接种疫苗后第90天，14名患者中有13名患者的RVNA高于保护水平，有效率为92.8%。未发现严重AE[28]。Cramer等[29]在2008年报道了8名儿童实体器官移植受者（5名肝脏移植、3名肾脏移植）接受暴露后预防处置（post-exposure prophylaxis, PEP）后均获得充分的免疫应答。患儿均未发生狂犬病或对PEP有任何严重AE，免疫期间未发生同种异体移植排斥反应。根据血清学反应，与接受三联药物治疗相比，接受他克莫司单药治疗患儿的RVNA滴度更高。另有一项研究[30]报道了一名48岁的男性肾移植患者被一只狂犬病犬咬伤，该患者的免疫抑制治疗方案包括环孢素60 mg/d、霉酚酸酯250 mg/d和泼尼松5 mg/d。在伤口护理后的第0、3、7、14和28天，患者接受了5剂PVRV，并于咬伤后注射了人狂犬病免疫球蛋白（human rabies immunoglobulin, HRIG）。在注射第3剂疫苗后，患者即获得足够水平的RVNA。但在第28天检测到抗体滴度下降。遂即调整免疫抑制方案：撤除霉酚酸酯并减少环孢素剂量，并于第38、41、45、52和66天进行加强免疫。在随后的12个月内，患者恢复了足够水平的RVNA。事件发生19个月后，患者仍具有良好的移植肾功能，未发生狂犬病。然而，患者所获得的免疫应答是强化免疫的结果，还是减少免疫抑制的结果，仍有待确定。除伴有基础疾病的患者外，孕妇也是一个特殊的群体。由于关系到胎儿的安危，孕妇接种疫苗的安全性备受关注。早在1989年就有研究者评估了孕妇接种PVRV的安全性[31]。21名孕妇于暴露后接种了PVRV，其中12名严重暴露者同时注射马狂犬病免疫球蛋白（equine rabies immunoglobulin, ERIG）。结果显示，受试者AE轻微、短暂，无需治疗。15%（3/20）的患者报告有副作用，如肌肉痛、不适、注射部位红斑和肿胀、荨麻疹皮疹和轻度局部淋巴结病。随访1年后，母亲或婴儿均未患狂犬病，未发现先天性畸形，所有婴儿的健康状况良好。这与之后Sudarshan等的研究结果一致。在他们的研究中还评估了孕妇暴露后接种PVRV的免疫原性：所有孕妇接种疫苗后第14天到第365天的血清RVNA滴度远远高于最低保护水平0.5IU/ml；部分婴儿（最大为3月龄）的血清中也发现保护性抗体水平[32]。2013年来自中国广州的随访研究评估了妊娠期狂犬病暴露后Essen免疫方案的安全性[33]。接种PVRV后，所有受试者均未出现中度或重度AE。个别受试者表现出轻微的副作用，如疼痛、红斑、发热、头痛和疲劳，无需药物治疗。AE程度并不比其他近期研究结果中的普通人群更严重。所有经阴道或剖腹产分娩的婴儿均发育正常。该研究提示，中国需要采取教育等措施来阻止因担心狂犬病疫苗的接种风险而实施的终止妊娠行为。2.5 PVRV与其他疫苗的联合接种研究目前，有多项研究评估了婴儿PVRV暴露前预防与吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎联合疫苗(DTP-IPV四联苗)联合接种的可行性。越南一项研究将84名婴儿随机分为两组，分别在2月、3月和4月龄时接种3剂DTP-IPV（n=43），或在2月和4月龄联合接种2剂PVRV（肌肉注射，n=41）。所有婴儿均获得了对白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎的血清免疫。对于各种抗原，两组间的抗体GMT无显著差异。接种PVRV 1个月后RVNA GMT为20.09 IU/ml，所有婴儿的RVNA滴度均高于0.5 IU/ml。未报告严重AE，两组之间的全身反应也无差异。可见，婴儿联合接种PVRV和DTP-IPV是安全的，且具有高度免疫原性[34]。其后，越南另一项研究评估了PVRV暴露前预防（1/5剂量皮内注射）与DTP-IPV联合接种的免疫原性和安全性，并与DTP-IPV联合PVRV肌肉注射进行比较。皮内注射组更多的婴儿出现局部反应，特别是发红，但这些反应通常是轻微和短暂的。两组的全身反应发生率相似。尽管在第3次接种疫苗后1个月，肌肉注射组的RVNA滴度较高（30.6 IU/ml，皮内注射组为12.0 IU/ml），但两组均达到WHO规定的可接受的保护性抗体滴度（≥0.5 IU/ml）。接种疫苗后，两组的白喉抗体水平均显著升高。所有婴儿都具有脊髓灰质炎病毒I型、II型和III型的血清保护性抗体滴度。以上结果表明，DTP-IPV和PVRV之间不存在免疫干扰，且低剂量PVRV皮内注射接种对婴儿安全且具有免疫原性。因此，PVRV与免疫规划疫苗联合接种，可在不影响疫苗的安全性或免疫原性的情况下，将与狂犬病接种相关的成本降至最低[35]。暴露前PVRV与DTP-IPV联合接种还可为儿童提供长期的保护作用。越南一项长达5年的随访研究中，追踪了两组儿童，分别在2、3、4月龄和1岁时接种DTP-IPV，或在2、4月龄和1岁时联合接种3剂PVRV。5年后，两组分别有96.7%和93.8%的儿童血清保护性白喉抗体滴度≥0.01 IU/ml；所有儿童均具有血清抗脊髓灰质炎（I型、II型和III型）抗体保护性滴度（≥5 1:dil）；超过60%的儿童仍然具有保护性RVNA（≥0.5 IU/ml）。可见，PVRV与DTP-IPV联合接种可诱导对所有抗原的保护性抗体滴度持续至少5年。在狂犬病流行率高的国家，如越南，在免疫规划同时考虑暴露前狂犬病疫苗接种是一个现实可行的方案，可以为大多数狂犬病感染风险高危人群，即儿童，提供长期的狂犬病预防保护[36]。除与DTP-IPV联合接种外，PVRV与破伤风、乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）等疫苗联合接种亦表现出良好的安全性和免疫原性。研究发现，在Zagreb免疫程序中，铝佐剂破伤风疫苗与PVRV在同一注射器中联合接种对PVRV具有免疫增强作用。破伤风抗体水平未受影响，无论是否存在氢氧化铝，接种1剂破伤风类毒素3周后，破伤风抗体水平增加100倍以上。在第21天接种另一剂破伤风类毒素后，破伤风抗体水平进一步增加。虽然联合破伤风类毒素组更易出现局部疼痛和肿胀，但组间并无显著差异。所有副作用均轻微且短暂、耐受性好，且主要在首次接种后出现[37]。近期，泰国学者对儿童同时接种嵌合乙脑减毒活疫苗（Japanese encephalitis chimeric virus vaccine, JE-CV）和PVRV（暴露前两位点皮内注射接种）的免疫原性和安全性进行了研究。49名12~16月龄血清阴性儿童按2:1随机分为两组：A组受试者于第0、28天在两个位点皮内注射0.1 ml PVRV，B组受试者在第0、7、28天肌肉注射0.5ml PVRV。两组均在第0、365天皮下接种1剂JE-CV。结果显示，所有儿童在第42天的RVNA均＞0.5 IU/ml，两组抗体GMT无显著差异。在第365天，两组均有92.3%的儿童RVNA持续超过0.5 IU/ml。两组在接种JE-CV后第42天的血清转化率和抗体GMT均无显著差异。初次免疫后1年，两组均保持高血清阳性率和抗体GMT。两种疫苗联合接种后30 min内均未出现速发反应或疫苗相关的严重AE。注射部位AE均轻微。在被咬伤后长达12个月的随访中，未报告狂犬病相关的发病或死亡。由此可见，暴露前PVRV两位点皮内注射免疫与JE-CV联合接种对学步期儿童具有免疫原性和安全性，二者之间不存在免疫干扰，这可能是亚洲儿童预防狂犬病和JE的一种新的具有成本效益的策略，也可能有助于在幼儿期进行暴露前狂犬病疫苗接种[38]。2.6 PVRV联合免疫球蛋白的应用研究有研究显示，免疫球蛋白对PVRV的免疫原性具有抑制作用，其中HRIG的作用较ERIG更明显。该研究按照2-1-1暴露后免疫程序，将受试者分为3组，第一组只接种PVRV，第二组和第三组接种PVRV的同时，接受ERIG或HRIG。结果显示，在接受免疫球蛋白治疗的两组中，第28天的血清转化率未达到100%，分别为94.4%（34/36）和90.7%（49/54），抗体GMT较低。第一组的抗体滴度显著高于其他两组，这种显著差异在第90天持续存在[39]。但也有研究发现，在III级暴露患者中，PVRV联合HRIG免疫后7 d，血清转化率即达到100%[40]。泰国红十字会对100名确认被狂犬病动物严重咬伤的泰国暴露者进行了暴露后皮内注射免疫的前瞻性评估。分别在第0、3、7天在两个部位皮内注射PVRV。第0天，96名暴露者接受ERIG。暴露后随访1年，无死亡病例发生。根据历史对照，如果不治疗，约有14名暴露者预计会死亡。因此，该方案的有效率为100%。3名暴露者在第6天和第7天出现与ERIG相关的轻度迟发过敏反应，但经抗组胺药和止痛药治疗后获得缓解，无需改变治疗计划。1名暴露者有轻微的迟发过敏反应，再次注射PVRV后病情加重，因此被认为非ERIG所致。10名暴露者出现无痛暂时性局部淋巴结病，3名出现可能由于疫苗、同时接种破伤风类毒素、抗生素或传统治疗而引起的轻度发热、不适或头痛。随机选择的10名暴露者均获得了血清转化。免疫后14、90和360 d，所有患者的抗体滴度均保持在0.50 IU/ml以上[41]。我国一项研究报道，在III级暴露者中，联合使用PVRV和ERIG的全身反应发生率为7.6%（13/171），PVRV和ERIG的局部反应发生率分别为1.3%（11针次/849针次）和10.53%（18/171）。接种第14、28天的血清转化率均达到100%，抗体GMT均大于0.5 IU/ml[42]。Lang等[43]研究了PVRV Essen免疫程序与一种新的高纯度热处理ERIG（PHT-Erig）联合使用的安全性和免疫原性。研究未报告严重AE，特别是未观察到速发或迟发过敏反应。第14天，所有受试者均获得保护性抗体滴度。在28 d的随访期内，PHT-Erig与市售ERIG组均可产生足够的抗体反应，抗体GMT无显著差异。在儿童和孕妇群体中，PVRV联合ERIG亦具有良好的安全性。研究人员对1 494名＜15岁的III级暴露儿童进行了研究。暴露儿童在第0、3、7、28天在两个部位皮下注射0.1 ml PVRV。第0天给予ERIG。对ERIG的皮肤试验呈阳性反应的儿童在口服抗组胺药（左旋西嗪）后给予ERIG。未发生严重的全身副作用，低热和不适是观察到的唯一全身副作用。所有儿童均无过敏反应或局部淋巴结病。第5天和第7天，仅3%的儿童出现轻微的血清病样症状，口服止痛药和抗组胺药后症状消失[44]。另一项研究对接受Essen方案狂犬病暴露后预防的14名孕妇进行随访。其中8名接受了ERIG治疗。研究未报告疫苗或ERIG的任何AE。所有孕妇均安全行阴道分娩，母亲和婴儿均健康无异常[45]。03总结目前，狂犬病疫情形势与实现WHO提出的2030年消除犬传人狂犬病目标还有差距，需要全社会的共同努力。在具有良好安全性与免疫效果的情况下，PVRV，尤其是采用Zagreb免疫程序接种，以及与DTP-IPV等疫苗的联合接种对于推广狂犬病疫苗的使用具有重要的实际意义。现阶段我国批准使用的狂犬病疫苗免疫程序有两种：Essen方案和Zagreb方案。Zagreb方案在我国于2010年获得批准，于2016年列入《狂犬病预防控制技术指南》[2]。WHO在1992年就推荐使用Zagreb方案，因为Zagreb和Essen方案相比，具有早期RVNA阳转率更高、依从性高和经济负担少的优点[2]。与 Essen方案相比，Zagreb方案可减少1剂次疫苗的接种费用和2次就诊，提高疫苗的全程接种率[46]。狂犬疫苗接种的依从性是治疗有效性的有力保障。Zagreb程序接种PVRV的不良反应并未增加，但接种的依从性更高[46]，经济成本更低[47]，值得在临床上进一步推广和应用。虽然目前对PVRV的研究已比较深入，但仍有一些问题有待进一步研究。第一，PVRV的抗体水平一般维持1~2年，之后应加强注射，因此，更长免疫持久性的PVRV是以后的研究方向；第二，随着Zagreb免疫程序的推广，能否以此为切入点，使该程序更简化，降低国家及个人经济成本是未来新的方向。参考文献上下滑动阅读更多内容[1]WHO. 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结直肠癌是全世界第三大癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。结直肠癌的主要治疗方法是手术切除、放化疗和靶向治疗，然而临床治疗手段效果有限，复发率仍然很高。mRNA肿瘤疫苗通常通过肌肉注射或静脉注射给药，激活引流淋巴结中的抗原呈递细胞，例如树突状细胞（DC），并触发抗原特异性细胞毒性T细胞的产生。然而，结直肠癌发生在粘膜表面（0期），并逐渐生长到内壁（I期）和肠壁（II期）。由于在解剖学上的功能距离和区室化，mRNA疫苗激活的DC和T细胞在治疗结直肠癌上的疗效有限。尽管口服或直肠免疫已被提议作为在肠道中引发粘膜免疫反应的首选策略，然而渗透效果不佳以及胃肠道环境中抗原和载体系统的不稳定性仍然是需要克服的挑战性障碍。因此，开发以系统给药的方式有效激活肠道粘膜表面抗肿瘤免疫反应的mRNA疫苗对于提高治疗结直肠癌的疗效至关重要。3月25日，中国科学院化学研究所吕雪光课题组联合北京大学药学院苗蕾课题组在Advanced Science上发表了题为：“All-Trans-Retinoic Acid-Adjuvanted mRNA Vaccine Induces Mucosal Anti-Tumor Immune Responses for Treating Colorectal Cancer”的研究论文。本研究在脂质、胆固醇和mRNA的自组装过程中直接掺入全反式维甲酸（维A酸）ATRA，成功制备了具有不同ATRA含量的LNP（ATRA-LNP）。这类ATRA-LNP有效激活了引流淋巴结中的树突状细胞，引发了强烈的全身性T细胞反应，并有效增加了抗原特异性细胞毒性T细胞在原位结直肠肿瘤中的浸润。增强的黏膜抗肿瘤免疫反应大大改善了小鼠对原位结直肠肿瘤模型的肿瘤抑制。全反式维甲酸（ATRA）是一种天然存在的维生素A（视黄醇）衍生物，在淋巴细胞运输和粘膜免疫中起着至关重要的作用。ATRA通过诱导趋化因子受体9型（CCR9）和α4β7整合素的表达，分别与肠上皮细胞表达的趋化因子配体25（CCL25）和肠道相关淋巴组织中表达的粘膜地址细胞粘附分子-1（MAdCAM-1）结合，使活化的T细胞具有肠道趋向性。研究表明，共递送蛋白质抗原和ATRA可引起全身和粘膜免疫反应。单独施用高剂量ATRA（~300μg）时，观察到抗原特异性肠道IgA反应。ATRA-LNP的制备表征本研究采用了Moderna使用的SM-102，DSPC，DMG-PEG2000和胆固醇配方和比例，mRNA可电离脂质的氮磷比（N/P）为5.67。将ATRA溶解在脂质乙醇相中，通过微流控装置与荧光素酶mRNA（mLuc）混合。动态光散射测量表明，具有不同ATRA含量的LNP均成功制备，其流体动力学直径和多分散指数（PDI）与不含ATRA的LNP几乎相同（图1b,c）。ATRA-LNP表现出球形形态，如低温电子显微镜（Cryo-EM）图像所示（图1e）。ATRA的掺入不影响LNPs的mRNA包封效率，通过高效液相色谱法测定，ATRA在LNP中的包封效率约为76%。ATRA-LNP的表面电荷比SM102-LNP更负，并且随着ATRA量的增加而降低（图1d）。ATRA-LNP在4和37℃下保持其胶体稳定性至少50天（图1f，g）。图1. ATRA-LNP的制备和表征ATRA-LNP的递送效率为了研究ATRA是否影响体外LNP的mRNA递送，将裸mRNA和SM102-LNP作为对照，测量各组与DC2.4细胞共孵育后荧光素酶的表达。其中，裸mRNA组无法检测到荧光素酶表达信号，SM102-LNP表现出非常高的mRNA递送效率，而ATRA-LNP的转染效率是SM102-LNP的约2.5倍。基于这一结果，研究继续探究了ATRA对不同LNP的DC细胞转染改善作用。在包括使用ALC-0315、cKK-E12、L-319和MC-3的LNP组中，均观察到mRNA转染效率的提高，证明ATRA可作为提高体外LNP-mRNA递送效率的一般策略。图2. ATRA对不同LNP配方转染效率的提高作用在雌性C57BL/6小鼠的体内实验中，均观察到SM102-LNP和ATRA-LNP组在注射位点有较强的mRNA表达，肝脏中的mRNA表达较低。IVIS图像定量显示，在所有测试时间点，ATRA-LNP的mRNA表达都高于SM102-LNP（图2d），ATRA-LNP的平均曲线下面积（AUC）比SM102-LNP高约42%（图2e），表明ATRA-LNP在体内也改善了LNP的mRNA表达。ATRA的递送改善机制LNP-mRNA递送效率很大程度上取决于其细胞摄取和内体逃逸效率，因此，研究采用了荧光素酰胺（FAM）标记的寡核苷酸（FAM-A20）作为细胞摄取的评估标志物。与SM102-LNP相比，ATRA-LNP的细胞摄取约为1.7倍（图2f）。此外，研究还采用了荧光染料标记的脂质NBD-PE和N-Rhod-PE构建了内体评估模型。如图2h所示，与SM102-LNP相比，ATRA-LNP表现出更高的融合能力。总的来说，这些结果表明，将ATRA掺入LNP中改善了其细胞摄取和内体逃逸，从而增强了mRNA的表达。这一发现可能对开发更有效的LNP-mRNA疗法具有重要意义。ATRA的靶向机制和免疫功能性增强T细胞肠道归巢受体的表达在T细胞活化过程中，ATRA的存在被证明能诱导CCR9和α4β7的表达，从而使T细胞具有肠道趋向性。与PBS组相比，ATRA-LNP和裸ATRA均显著增加了CD8和CD4 T细胞上CCR9和α4β7的表达。与裸ATRA处理相比，ATRA-LNP处理增加了约59%的CD3CD8CCR9、14%的CD3CD8α4β7和71%的CD3CD8α4β7CCR9 T细胞群，表明ATRA-LNP在诱导CD8 T细胞的肠道归巢受体方面具有更高的疗效，ATRA-LNP较裸ATRA具有更好的水溶性。图3. ATRA-LNP诱导T细胞肠道归巢受体表达激活体内全身和黏膜免疫反应通过肌肉注射给雌性C57BL/6小鼠接种每剂含有10μg mOVA的SM102-LNP或ATRA-LNP，并在一天后分离流淋巴结以评估DC的激活。ATRA-LNP显示出与SM102-LNP相似的DC活化功效，表明ATRA对DC活化没有贡献。在首次接种疫苗后第22天分离脾细胞，并分析抗原特异性细胞毒性T细胞群。ATRA-LNP处理组脾细胞中OVA四聚体CD8CD3 T细胞的数量分别是SM102-LNP和PBS处理组的约1.6倍和16倍，表明ATRA-LNP更有效地激活了系统性T细胞反应。此外，研究还分离了肠道的固有层，并检验了抗原特异性CD8 T细胞群。与SM102-LNP相比，ATRA-LNP显著增加了OVA四聚体CD8CD3 T细胞的数量，这表明ATRA-LNP激活的T细胞具有肠道归巢性。接下来，研究团队使用小鼠皮下MC38-OVA模型评估了ATRA-LNP或SM102-LNP封装mOVA的治疗效果。SM102-LNP对原位MC38-OVA肿瘤几乎没有治疗效果，但极大地抑制了皮下MC38-OVA肿瘤的生长，延长了动物存活率，表明LNP-mRNA癌症疫苗对治疗皮下肿瘤有效，但对治疗原位结直肠肿瘤的疗效有限。与SM102-LNP相比，ATRA-LNP显示出相似的治疗效果。与PBS治疗相比，空白ATRA-LNP（无mOVA）治疗显示出相当的肿瘤生长和生存率，表明ATRA本身并不直接抑制肿瘤生长。因此，相较于传统LNP，ATRA-LNP的意义在于更好诱导T细胞的肠道归巢效应，并以此增强肠道抗肿瘤免疫反应。此外，流式细胞术分析显示，ATRA-LNP增强了肿瘤和肠系膜淋巴结中的CD8和CD4 T细胞浸润，诱导了先天性炎症生态位，有可能引发适应性免疫。ATRA-LNP还增加了M1与M2型巨噬细胞的比率，表明其减缓了肿瘤微环境的免疫抑制性。总结本研究中，将ATRA掺入LNP不仅增强了其mRNA递送效率和脾脏中的全身T细胞反应，而且使活化的T细胞具有肠道趋向性，显著增加了细胞毒性T细胞对原位结直肠肿瘤的浸润，从而增强了治疗效果。这些结果表明，ATRA可以用作mRNA疫苗的佐剂，以增强肠道中的粘膜免疫反应。此外，由于ATRA的掺入并不改变LNP-mRNA的制备过程，也有利于生产放大。参考资料[1]Li W, Li Y, Li J, Meng J, Jiang Z, Yang C, Wen Y, Liu S, Cheng X, Mi S, Zhao Y, Miao L, Lu X. All-Trans-Retinoic Acid-Adjuvanted mRNA Vaccine Induces Mucosal Anti-Tumor Immune Responses for Treating Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2024 Mar 25:e2309770. doi: 10.1002/advs.202309770.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。