VRC-01

作为一名长期从事HIV免疫疗法研究的科研人员，我将从专业视角为你详细解析这类重要研究。 🔬 为何它们如此重要？ HIV病毒之所以难以根治，主要因为其高突变率和潜伏库的存在。绝大多数抗体只能中和有限的毒株，病毒极易逃逸。而“精英控制者”是天然的解决方案库。他们的免疫系统能够产生一些广谱中和抗体（bnAbs），这些抗体能识别病毒表面不易变异的保守区域。04_A06的发现，正是这一策略的最新突破。它的临床意义在于，为开发长效、预防与治疗一体的新型生物制剂提供了最强候选分子，有望将艾滋病从慢性病管理推向功能性治愈的新阶段。📝 研究者们如何发现“超级抗体”？这类研究遵循了寻找bnAbs的经典科学路径：1. 样本来源：从能天然控制病毒的“精英控制者”体内分离B淋巴细胞。2. 高通量筛选：从5000多个B细胞中制备了800多种抗体，并进行系统性中和活性测试。3. 结构解析：对脱颖而出的抗体进行原子水平的结构分析，明确其作用机制。4. 功能验证：在细胞水平（中和实验）和动物模型（人源化小鼠）中验证其疗效。5. 潜力预测：利用计算机模型评估其预防应用的潜力。                                          🔬重要结果体现在三个方面· 惊人的广度：中和300多种不同毒株中的98.5%，这是目前公开报道中覆盖面最广的抗体之一。· 结构的独特性：拥有异常长的CDR H3环。这个结构像一把“超长手术刀”，能绕过病毒表面的糖盾和常见突变，直接刺入最保守、对病毒功能至关重要的CD4结合位点区域。病毒若在此处发生逃逸突变，往往自身也会丧失感染能力，这从根本上限制了耐药性的产生。· 动物模型的突破性效果：在人源化小鼠治疗实验中，实现了将病毒载量“永久降至检测不到的水平”。这与多数bnAbs仅能短期压制病毒形成鲜明对比，暗示其可能更强地清除了游离病毒，甚至影响了病毒储存库。                         ⚖️ 横向对比：04_A06与其他顶尖抗体的异同为了更客观地定位04_A06的价值，我将它与另外两个已被广泛研究的著名bnAbs进行对比：• 对比抗体一：VRC01类（代表抗体 VRC01）· 相似性：同属CD4bs靶向抗体，是该靶点的“开创者”。 · 核心差异：VRC01的结合模式更“标准”。病毒已进化出通过在该位点周围添加糖基化修饰（糖盾）或发生特异位点突变来逃逸VRC01。而04_A06凭借其超长的CDR H3环，能够像“绕过路障”一样，穿透这些糖盾，结合到更深的保守表位上，因此对VRC01的逃逸毒株依然有效。• 对比抗体二：PGT121类（代表抗体 PGT121） · 相似性：都是效力极强的bnAbs，且都源于感染者的天然免疫应答。· 核心差异：两者的攻击靶点完全不同。PGT121靶向的是病毒包膜蛋白V3环附近的聚糖位点。这是一个与CD4bs空间位置不同的独立靶点。在联合疗法中，同时使用像04_A06（靶向CD4bs）和PGT121（靶向V3聚糖）这类靶向不同表位的抗体，可以产生强大的协同效应，使病毒极难同时产生双重逃逸突变，这是目前抗体疗法的主要策略。                                                           💎 小知识学堂· 靶向区域：  · 04_A06：CD4结合位点 (CD4bs)  · VRC01：CD4结合位点 (CD4bs)  · PGT121：V3聚糖位点· 核心结构优势：  · 04_A06：超长CDR H3环  · VRC01：经典结合模式  · PGT121：识别特定糖基化模式· 主要逃逸机制：  · 04_A06：理论上极难逃逸  · VRC01：糖盾、位点突变  · PGT121：糖基丢失、V3环突变这项研究得出了三个颠覆性的结论：1. 精英控制者体内存在“终极”抗体：04_A06的发现证实，人类免疫系统有能力产生接近“通用”的HIV抗体，这为疫苗设计提供了终极模板。2. 结构决定功能的突破：其超长CDR H3环的结构，打破了我们对CD4bs抗体结合模式的传统认知，开辟了抗体工程的新方向。3. “治愈”潜力的初现：在动物模型中实现“永久抑制”，这暗示此类抗体可能具备干扰病毒储存库或激发更强免疫清除的潜能，超越了单纯病毒抑制的概念。 当然，从卓越的实验室结果到惠及患者，道路依然漫长。下一步需要完成临床前安全评估、在非人灵长类动物中进行更接近人体的预防和治疗实验，最终推进人体临床试验。如何实现该抗体的大规模生产、确定其最佳给药周期和成本，也都是未来产业化的关键。

摘要： 治疗性单克隆抗体主要为免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）。作为重组蛋白生物药物，IgG具有广泛的临床适应性。植物平台为治疗性重组蛋白的生产提供了快速、灵活和易于扩展的替代平台，在个性化治疗蛋白的生产和流行性疾病药物开发时期受到广泛关注。由于单克隆抗体在生产过程中容易受到多种翻译后修饰途径的影响，植物平台生产的重组单克隆抗体可能存在微观异质性，从而影响抗体的稳定性、生物活性或引起不必要的免疫原性。此文就以下方面展开综述：植物平台中特异性β-1,2-木糖和核心α-1,3-岩藻糖的消除、β-1,4-半乳糖基化途径的引入和其他糖基化修饰方式的修改等优化策略进展；植物源重组抗体表达体系、培养体系和下游加工方式的优化策略进展，以提高植物源单抗的有效性、安全性和生产条件。 引言 治疗性重组蛋白的主要生产平台为原核和真核系统，但这些平台存在上游成本高、可能传播人类病原体、不能在分泌途径中进行人源蛋白类似的翻译后修饰等局限。 植物平台因高效、低成本、易于规模化且无人类病原体传播风险，在人源化治疗蛋白和流行性疾病药物开发中备受关注。继1986年“分子农业”概念被提出后，2012年植物源治疗戈谢病的蛋白Elelyso®、2022年植物源冠状病毒样颗粒疫苗Covifenz®先后获批，但目前尚无植物源人类抗体药上市。 植物细胞糖基化模式复杂、缺乏哺乳动物类似糖基化模块，易导致重组蛋白聚糖结构异质。故糖基化修饰对治疗性重组蛋白的生物活性，乃至生产效率和质量控制都至关重要。 此文综述了植物平台生产IgG的相关优化进展，包括表达体系、N-糖基化修饰、生产方式、及下游加工等方面，并展望了该系统在治疗性重组单抗中的应用前景。 研究内容 1. 植物表达体系 植物基因工程的核心是植物稳定与瞬时转化技术。稳定的遗传转化对植物自身生长和繁殖特性要求严格，而瞬时转化技术作为一种高效便捷的手段，已被广泛应用于治疗性重组蛋白的上游生产和下游加工修饰等相关研究。 1.1 瞬时表达系统 分为植物病毒介导（如烟草花叶病毒，tobacco mosaic virus，TMV）和农杆菌介导两类。病毒介导法通过基因体外转录后直接侵染、基因枪或农杆菌侵染。因载体可能污染生态系统而存在风险。农杆菌介导法通过注射或真空浸润叶片。可高效递送目的基因，重组蛋白表达量更高，可生产抗体、疫苗等多种产物。如magnICON系统，绿色荧光蛋白在本氏烟草中一周产量达4 mg/g。 1.2 稳定表达系统 含细胞核与叶绿体转化两种方式。细胞核转化：通过农杆菌或基因枪将基因整合至植物基因组后培养稳定遗传组织或植株。成本低，适合生产条件欠缺地区，但需多代筛选、表达量低、周期长且有基因污染风险，如利用烟草转化生产HIV抗体P2G12，是首个进入一期临床的植物源单抗。叶绿体转化：经聚乙二醇法或基因枪定点整合基因。拷贝数高，为100~10000个，重组蛋白积累量远高于细胞核转化，如CTB-胰岛素，高160倍；但有母性遗传降低风险，且难以进行复杂蛋白修饰，不过叶绿体含基本聚糖，或可引入聚糖修饰途径来生产糖蛋白(表1)。 表1 不同植物表达系统的优缺点 2. N-糖基化修饰方式的优化 IgG-Fc上的N-聚糖能影响其与Fcγ受体(Fcγ receptor，FcγR)的结合，进而影响抗体依赖的细胞毒作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）、抗体依赖的细胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）和补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）等。植物与哺乳动物相比缺乏部分糖基转移酶，但同时存在特定糖基转移酶，从而调控植物特异性N聚糖残基生成，这可能导致抗体性能降低。因此，核心优化方向为消除植物特异性糖残基、引入β-1,4-半乳糖基化途径，及其他辅助修饰。 2.1 植物特异性聚糖残基的消除 β-1,2-木糖基转移酶（β-1,2-xylosyltransferase，XylT）和核心α-1,3-岩藻糖基转移酶（α-1,3-fucosyltransferase，FucT）基因调控植物特异性聚糖残基的形成。早期通过T-DNA插入、RNAi等技术难以完全敲除，但CRISPR/Cas9技术的出现实现突破，可生成无XylT和FucT基因的烟草细胞系或植株。这类植物生产的人源化抗体不含β-1,2-木糖和核心α-1,3-岩藻糖等植物特异性糖残基，如2G12、抗HIV IgG1，与受体的亲和力、免疫原性等关键性能显著提升，甚至接近CHO细胞或商业化产品水平，同时增强ADCC等效应功能，降低潜在免疫原性。又如HEK细胞来源的VRC01对FcγRⅠ的亲和力比植物源VRC01高30倍，而去除岩藻糖和木糖后，后者对FcγRⅠ亲和力显著提升，恢复对FcγRⅡa、Ⅱb的结合活性，对FcγRⅢa的亲和力更是比HEK细胞来源的高10~20倍，ADCC效应显著增强。再如用糖工程ΔXF本氏烟草生产的纳武利尤单抗，能增强IL-2和IFN-γ表达，可像商业化产品一样激活T细胞效应。故消除植物特异性聚糖残基可降低单抗潜在免疫原性，对增强抗体-抗原结合亲和力及抗体效应功能至关重要。 2.2 β-1,4-半乳糖基化途径的引入 植物缺乏β-1,4-半乳糖基转移酶（β-1,4-galactosyltransferase，GalT），不能对蛋白质进行β-1,4-半乳糖基化，而N-聚糖的半乳糖残基可增强IgG1和IgG3的CDC效应。因此，核心策略是将哺乳动物存在GalT的CTS区与植物的CTS区进行替换，靶向N-糖基化方式的改变。如改造后稳定表达GalT的植物，抗体半乳糖基化率最高达90%；稳定表达GalT的烟草细胞生产的IgG2半乳糖基化结构占41.2%。但稳定转化耗时且可能影响植物生长，因此利用植物的GalT，与重组抗体的瞬时共表达，成为快速简便的优选方案。 2.3 其他修改方式 N-聚糖上的末端唾液酸残基会减弱抗体的CDC效应，核心岩藻糖残基也会降低抗体的ADCC效应，而对N-聚糖进行高聚甘露糖型修饰能提高抗体与自然杀伤细胞的结合亲和力和效应功能。故其他修改方式主要分为三类：N-聚糖末端唾液酰化、内质网保留和抑制N-聚糖加工。N-聚糖末端唾液酰化：通过引入哺乳动物唾液酰化的整个生物合成途径来完成，缺点是存在效率低、表达不稳定等问题，多采用瞬时表达研究。内质网保留：添加（SE）KDEL/HDEL基序能把含高聚糖式N-聚糖的重组蛋白保留在内质网中，避免蛋白质传递到高尔基体后产生的糖基化异质性、增加抗体积累量，但形成的高聚甘露糖结构会加速体内清除，适用范围有限。抑制N-聚糖加工：使用甘露糖苷酶抑制剂可显著提升ADCC活性；与杜氏利什曼原虫的单亚基寡糖基转移酶（Leishmania donovani oligosaccharyltransferase，LdOST）共表达，能将抗体N-聚糖占有率从50%提升至97%，降低异质性并改善稳定性。 3. 重组抗体生产方式的优化 相较杂交瘤技术，重组抗体具有批间一致、无动物源病原体、易工程化等优势。而植物源重组抗体生产又可通过表达体系设计和培养技术改进，提升抗体产量、质量并控制成本。 3.1 表达体系的优化 重组抗体表达体系已被证明可调整重组抗体的半衰期、增强异源基因的翻译效率、增加重组单抗的表达和积累水平，优化了植物源单抗的表达和体内生物活性。 3.1.1 IgG优化 IgG半衰期的延长与其在pH=6的环境下对新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor，FcRn）的亲和力增加有关，IgG-Fc区域与FcRn的结合可以减弱溶酶体对IgG的降解。如抗体Fc区引入M252Y/S254T/T256E（YTE）或M428L/N434S（LS）突变，能使抗体的体内清除率下降22%~28%，半衰期延长3~4倍。又如通过对抗体重链糖基化保守碱基进行N298A/D359E/L361M突变，生产无糖基化修饰的抗体，其在体外具有相当的抗原结合能力，半衰期也有所延长，且阻断免疫抑制通路的功能不受影响。 3.1.2 载体设计 可以通过非翻译区和载体骨架的设计、信号肽的添加等优化策略，增强重组IgG异源表达效率。常用的载体骨架有TMV、马铃薯病毒X（potato virus X，PVX）、豇豆花叶病毒（cowpea mosaic virus，CPMV）和DNA双生病毒豆黄矮病毒（bean yellow dwarf virus，BeYDV）等病毒骨架，其中基于TMV和PVX的magnICON载体和基于CPMV的pEAQ载体占主导地位。花椰菜花叶病毒的35S启动子可以驱动外源基因在双子叶植物中高效表达，如通过在载体中克隆多重基因来实现抗HIV“鸡尾酒疗法”混合物的瞬时共表达。5′和3′非翻译区（untranslated region，UTR）对mRNA的稳定性和翻译有很大的影响，BeYDV表达载体可用于检测5′和3′UTR对增强重组蛋白在植物中表达的影响。如检测拟南芥的光系统基因作为翻译增强子时，蛋白活性高于TMV的5′UTR；又如检测到将烟草Rb7基质附着区基因添加在重组蛋白表达盒的3′端时，蛋白瞬时表达产量增加3.4倍，并且植物组织坏死显著减少，生产效率提高。也有研究指出靶向信号肽可引导抗体至低蛋白酶活性细胞区室，提高积累效率。 3.1.3 密码子优化 密码子优化是指使用植物偏好密码子替换同义密码子，修改基因序列，但不改变其氨基酸序列，能提高表达效率75~80倍。但需同时兼顾密码子频率、GC含量、mRNA二级结构和顺式调节元件等因素。且密码子优化对蛋白质功能和免疫原性增加存在潜在影响，还需要通过临床试验后期或上市后的药物反馈来评价。 3.1.4 转录后基因沉默抑制 转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）是生物细胞抵抗外来核酸入侵及保持生物自身基因组完整性的防御机制。利用植物病毒编码的RNA沉默抑制因子，通过隔离短干扰RNA解除外源基因沉默，使抗体表达量提升。如p19与伐利鲁单抗载体共表达时，单抗产量达174 μg/g，为对照组的3.2倍。 3.2 培养体系的优化 用于重组蛋白生产的植物培养技术，除土壤栽培外，细胞悬浮培养技术及水培技术能突破环境限制，实现大规模、低成本生产。植物细胞悬浮培养是指在离体条件下，将易分散的组织置于液体培养基中进行震荡培养，得到携带重组蛋白表达质粒的悬浮细胞，继代培养后大量生产重组蛋白。水培技术是指在营养丰富的水中栽培植物，脱离惰性介质的机械支撑，通过营养物质的可控供给以及浇灌技术的优化，提高了蛋白生产效率和经济效益。 3.2.1 无菌化培养 烟草BY-2细胞悬浮培养，可精准控制温度、pH等参数，纯化流程简单，单抗如M100，生产力已达到约8 pg/细胞/天，接近CHO细胞20~40 pg/细胞/天的水平。通过CRISPR/Cas9敲除XylT/FucT基因，可获得非转基因细胞系以生产治疗性重组蛋白。配套生物反应器（搅拌罐式、一次性、光生物反应器等）和3D培养系统，能进一步提升生产效率。 3.2.2 水培技术 具有节省劳力、水资源循环利用、封闭环境防疾病传播等优势，衍生出深水培养、营养膜技术等多种模式，通过该技术可生产MucoRice-CTB（口服霍乱疫苗）、SARS-CoV-2中和抗体。该技术可显著提升抗体产量，如varlilumab产量比土培高3.5倍，且能增加抗坏血酸积累，从而抑制农杆菌引发的叶片坏死。又如毛状根水培系统可实现IgG完整分泌表达，一周内产量达46 μg/mL，且培养基蛋白酶活性低，下游纯化流程简化，成本降低。 3.3 下游加工技术的优化 规模化生产植物重组蛋白的主要困难是纯化的复杂性和高成本，例如如何快速去除纤维颗粒、植物色素和酚类化合物。单克隆抗体纯化常用是亲和层析技术，也可用疏水相互作用色谱法、羟基磷灰石色谱法、混合模式色谱法、阳离子和阴离子交换色谱法等。如使用蛋白A磁珠可从粗提取物中快速纯化SARS-coV-2 S蛋白中和抗体M15及其scFv-Fc同源物S15，融合了澄清、纯化和浓缩步骤，减少抗体与粗提取物中杂质接触时间。因此，开发绿色、简单、高效和低成本的下游加工技术是植物重组蛋白规模化生产的关键。 总结与展望 依托合成生物学和现代基因工程技术的发展，植物平台逐步实现了精确调控治疗性重组蛋白生产。通过表达系统的选择、N-聚糖基化方式的修改、表达体系和培养体系的设计以及下游加工技术的优化，植物源单抗与动物源单抗的同质化水平显著提升，弥补了后者的劣势。植物平台虽还无法完全取代微生物发酵和哺乳动物细胞培养技术，但在个性化医疗和单抗、治疗酶和疫苗的定制化生产方面具有优势，其可扩展性和成本效益为大规模生产提供了机会(图1)。但其仍存在产品下游加工困难、质量参差不齐、规模化产量相对较低等问题。值得关注的是，基于植物细胞包的自动化瞬时表达方案，已通过批内和批间变异系数（CV）试验并获监管机构批准，为其应用于生物制药行业奠定基础。 图1 植物平台生产重组IgG的优化策略   原文出处 陈子晴,刘德,于荣敏,等.植物平台生产单克隆抗体的优化策略[J].生命的化学,2024,44(07):1205-1215. DOI:10.13488/j.smhx.20240298. 指导教师：王战辉 教授 点击下方，关注我们