Trypsin

Organoids: Concepts, Hands-on Culture, Mastery and Frontiers内容摘要类器官（Organoid）是近年来生命科学与生物医药领域发展最快的技术平台之一。它是利用成体干细胞（ASC）或多能干细胞（PSC）在体外三维（3D）培养条件下，通过细胞自组织形成的、在细胞组成、组织结构与功能上模拟真实器官的微型三维结构。自 2009 年 Sato 等人在《Nature》发表小鼠小肠类器官以来，类器官技术经历了“概念验证—方法成熟—体系扩展—临床转化”四个阶段：2015 年前后肿瘤类器官活体生物银行的出现使个体化药敏检测成为可能；2018 年类器官药敏预测临床结局的前瞻证据发表于《Science》；2020 年类器官在新冠病毒（SARS-CoV-2）感染研究中大放异彩；2022 年美国《FDA 现代化法案 2.0》从立法层面认可了包括类器官在内的非动物替代方法；2023-2026 年，单细胞测序、人工智能（AI）、器官芯片与类组装体（assembloid）技术深度融入，类器官进入“数字孪生”与“多系统模拟”的新阶段。1.1 什么是类器官 类器官（organoid）一词由“organ”（器官）与后缀“-oid”（类似物）构成，直译即“器官样结构”。学界普遍接受的严格定义来自 Lancaster 与 Knoblich 2014 年提出的表述：类器官是由干细胞（包括成体干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞）在体外三维培养体系中，通过细胞-细胞、细胞-基质相互作用自组织（self-organization）形成的、含有多个器官特异性细胞类型、再现所对应器官部分关键结构与功能特征的微型三维组织。类器官直径通常为数十微米至数毫米，无需支架引导即可自发产生出芽、腔化、分层等形态发生事件，这是其区别于传统三维细胞球（spheroid）的本质特征。 理解类器官需要抓住三个关键词。第一是“自组织”：培养者提供的是信号环境（基质胶 + 生长因子组合），而腺体出芽、隐窝-绒毛形成、玫瑰花环排布等结构均由细胞自身涌现（emergent）产生，这正是发育生物学基本原理在培养皿中的重现。第二是“干细胞驱动”：类器官的长期扩增依赖其中的成体干细胞或类干细胞群体（如肠道的 Lgr5+ 隐窝基底柱状细胞），干细胞在分裂中不断产生分化细胞，维持自我更新与分化之间的动态平衡。第三是“器官保真度”：类器官并非完整器官，它通常只再现器官的部分区室（上皮为主），但能保留关键的生理功能，例如肠类器官的分泌吸收、肝类器官的白蛋白合成、脑类器官的电活动等，这是它区别于普通细胞系的核心价值。 · 类器官 ≠ 类球体：类球体是多种细胞简单聚集，缺乏层次结构与干细胞区室；类器官具有自组织形成的结构与功能分区。 · 类器官 ≠ 组织块：组织块培养维持的是原有结构，类器官是干细胞在体外重新“建造”的结构。 · 类器官 ≠ 完整器官：目前多数类器官缺少血管、神经与免疫细胞，属于“微型器官类似物”，完整器官再造仍任重道远。1.2 类器官的学科基础 类器官技术是干细胞生物学、发育生物学、细胞外基质生物学与组织工程四大学科交汇的产物。在干细胞生物学层面，2007 年 Hans Clevers 团队鉴定出 Lgr5 作为小肠、结肠等上皮组织的成体干细胞标志物，为后续类器官的“种子”来源提供了分子标记；在发育生物学层面，对 Wnt、BMP、Notch、FGF、EGF 等信号通路在器官发生中时空作用的理解，直接转化成了类器官培养基中生长因子的“配方”；在基质生物学层面，基质胶（Matrigel，小鼠Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤来源的基底膜提取物）提供了层粘连蛋白、IV 型胶原与巢蛋白等信号，支撑了极性与形态发生；在组织工程层面，微流控、生物打印与合成水凝胶等工程手段正在将类器官从“研究工具”升级为“工程化组织”。 从信号通路的角度看，多数上皮类器官的长期培养依赖四大类信号的组合：Wnt 通路（Wnt3a/R-spondin1，维持干细胞干性与增殖）、EGF 通路（促进增殖）、BMP 抑制剂 Noggin（防止分化、保留干细胞）、以及 Notch/前列腺素等辅助信号。不同器官对上述信号的依赖程度不同，例如小肠类器官对 Wnt 高度依赖，而结肠类器官还需要额外补充 Wnt3a；肝类器官则对 EGF、HGF 与 FGF 组合更敏感。这种“信号依赖图谱”既是类器官培养的难点，也是研究器官特异性干细胞生态位（niche）的窗口。1.3 与二维培养及动物模型的比较 传统二维（2D）贴壁培养的细胞系（如 HeLa、Caco-2、HepG2）在药物研发中的失败率广受诟病：2D 环境使细胞失去极性、丧失正常信号依赖，长期传代累积了与真实人体差异巨大的基因突变。动物模型（小鼠、斑马鱼、非人灵长类）虽然能提供系统水平的生理环境，但存在种属差异、周期长、成本高、通量低与伦理负担。类器官恰好位于两者之间：它保留人类基因组与患者个体特征（个体化），具有三维结构与部分功能（生理相关性），又能大规模扩增与冻存（高通量与可重复），因此被《Nature Methods》评为 2017 年度方法（Method of the Year 2017），并被全球药企与监管部门视为“补充甚至部分替代动物实验”的关键技术。 表 1-1 类器官与二维细胞培养、动物模型的多维比较 比较维度 二维细胞系 类器官（3D） 动物模型 细胞来源 永生化/肿瘤细胞株 原代干细胞（ASC/PSC/肿瘤） 完整活体动物 基因背景 高度突变、非生理 接近患者/正常人基因组 种属特异，与人差异大 三维结构与极性 无（贴壁单层） 有（出芽/腔化/分层） 有（完整器官） 关键功能 部分酶活与转运 分泌/吸收/电活动等部分功能 完整生理功能 血管/免疫/神经 无 多数无（需共培养补充） 有 个体化程度 低 高（患者来源） 低（模式动物品系） 通量与成本 高通量、低成本 中高通量、中等成本 低通量、高成本 伦理负担 低 低-中（需知情同意） 高（3R 原则约束） 典型用途 机制初筛 药敏、疾病建模、再生医学 药代/药效、系统毒性 需要强调的是，三种模型并非互相替代而是互为补充：类器官用于“人源化、高通量”的机制研究与药敏初筛，动物模型用于“系统水平”的验证，最终在临床试验中确证。2022 年美国《FDA 现代化法案 2.0》取消了新药必须进行动物实验的强制规定，允许使用细胞检测、类器官、器官芯片等替代方法，这是类器官监管地位的历史性提升。1.4 常用术语速览 表 1-2 类器官领域高频术语表（详见附录 A 完整术语表） 术语 含义 类器官（Organoid） 干细胞体外三维自组织形成的微型器官样结构 类球体（Spheroid） 细胞聚集形成的三维球体，无明确自组织层次 类组装体（Assembloid） 多个类器官或类器官+其他细胞群融合形成的复合结构 基质胶（Matrigel/BME） 基底膜提取物水凝胶，类器官培养最常用支架 传代（Passage） 将培养物解离后重新接种以扩增或维持的过程 出芽（Budding） 类器官表面萌发新腺体样结构的形态发生事件 隐窝（Crypt） 肠道干细胞所在结构，类器官出芽的模板单位 R-spondin1   / Noggin 分别增强   Wnt 信号、抑制 BMP 信号的关键蛋白 Y-27632 ROCK 抑制剂，单细胞接种与复苏时抑制失巢凋亡 PDO（Patient-derived organoid） 患者来源类器官，个体化药敏的核心载体第二章类器官的历史与背景2.1 前史：从自组织现象到三维培养 类器官的思想源头可以追溯到 1907 年：美国生物学家 H. V. Wilson 将海绵解离成单细胞后，观察到细胞重新聚集并重建出完整海绵个体，首次证明了多细胞生物的自组织能力。此后近一个世纪，科学家陆续在鸡胚、蛙胚与哺乳动物细胞中发现类似现象。1975 年 Rheinwald 与 Green 建立了角质形成细胞共培养体系；1987 年 Li 等将乳腺上皮细胞包埋于胶原凝胶中，获得了能形成腺泡样结构的乳腺类器官雏形。这些工作虽然零散，但共同确立了两个关键原则：三维基质是形态发生的前提，上皮-间质信号对结构形成不可或缺。2.2 奠基十年：2009-2015 的体系爆发 2009 年是类器官纪元的元年。Sato 等在《Nature》报道：单个 Lgr5+ 小肠干细胞在 Matrigel 中，仅凭 EGF、Noggin 与 R-spondin1 三种因子即可长成包含隐窝-绒毛结构的“迷你肠”（mini-gut），长期培养与传代均可行。这篇论文解决了三个根本问题——找到了正确的干细胞、正确的基质、正确的信号组合。2011 年，Sato 等将该体系推广到人结肠、腺瘤与腺癌；Spence 等用人多能干细胞定向分化出肠类器官；2013 年 Lancaster 等建立了脑类器官，首次用类器官模拟小头畸形等神经发育疾病；同年 Huch 等实现单枚 Lgr5+ 肝干细胞在 Wnt 驱动下的肝类器官扩增。2014-2015 年，类器官进入肿瘤领域：Gao 等建立前列腺癌类器官，van de Wetering 等建立首个结直肠癌类器官活体生物银行（20 例肿瘤中 19 例建成），Boj 等建立胰腺癌类器官，Huch 等实现成人肝细胞类器官长期培养。至此，类器官完成了从“新奇现象”到“可复制平台”的转变。2.3 成熟与临床转化：2016-2022 2016-2018 年，技术体系走向标准化：Drost 等发表前列腺类器官标准方案（Nature Protocols），Takasato 等发表肾脏类器官方案；Gjorevski 等用合成水凝胶替代基质胶，开辟了“设计者基质”方向；2017 年《Nature Methods》将类器官评为年度方法；2018 年三篇里程碑工作相继发表——Sachs等建立乳腺癌活体生物银行（Cell）、Vlachogiannis 等证明患者来源类器官能预测胃肠癌患者化疗疗效（Science，敏感预测准确率约 88%）、Neal 等用气液界面培养建立保留免疫微环境的肺癌类器官（Cell）。2019-2020 年，卵巢癌、肝癌、肾小管、血管类器官相继建成；新冠疫情中，Lamers 等用肠道类器官、Monteil 等用肾与血管类器官、Han 等用肺与结肠类器官证明了 SARS-CoV-2 的感染机制并筛选出候选药物，类器官第一次成为全球公共卫生事件的直接研究工具。2022 年美国《FDA 现代化法案 2.0》与欧洲相关指南的出台，标志着类器官被正式纳入监管科学框架。2.4 新浪潮：2023-2026 的融合创新 2023 年以来，类器官研究呈现四个鲜明趋势。其一，单细胞与空间组学深度嵌入：Li 等 2023 年在《Nature》发表基于单细胞测序的脑类器官自闭症风险基因筛查，Park 等证明 iPSC 来源小胶质细胞通过胆固醇转移促进脑类器官成熟，Schafer 等实现人脑类器官体内神经免疫重建（Cell）。其二，肿瘤药敏走向多组学与临床评估：2024 年《Cancer Cell》发表 399 株肝癌类器官大型生物银行的药敏图谱，2025 年《Cell Stem Cell》连续发表胰腺癌类器官生物银行多组学-药物响应关联及他汀联合疗法临床评估。其三，工程化与 AI 融合：2025 年《Nature Methods》“数字化类器官”实现高速 3D 结构与细胞拓扑分析，类器官智能（organoid intelligence）与 AI-类器官整合系统成为新学科方向。其四，冷冻保藏与多器官系统成为产业化瓶颈突破口：2026 年《Biopreservation and Biobanking》发表类器官冻存原理与工程策略综述，多器官芯片（如心-胰岛轴）进入疾病建模。本章之后各章将逐步展开这些内容。 图 2-1 类器官研究里程碑时间轴（1907-2026） 表 2-1 类器官发展里程碑（1907-2026） 年份 里程碑事件 代表文献（期刊） 1907 海绵细胞解离后自组织重建，自组织概念起源 Wilson,   J Exp Zool 1987 乳腺上皮胶原凝胶三维培养形成腺泡结构 Li   et al., PNAS 2009 单枚 Lgr5+ 干细胞建成小肠类器官 Sato   et al., Nature 2011 人结肠类器官与   hPSC 肠类器官建立 Sato,   Gastroenterology; Spence, Nature 2013 脑类器官与肝类器官建立 Lancaster,   Nature; Huch, Nature 2014-2015 前列腺癌/结直肠癌/胰腺癌类器官与活体生物银行 Gao,   Cell; van de Wetering, Cell; Boj, Cell 2016-2017 方案标准化；类器官获评《Nature Methods》年度方法 Drost,   Nat Protoc; Takasato, Nat Protoc 2018 药敏预测临床结局；保留免疫微环境的肺癌类器官 Vlachogiannis,   Science; Neal, Cell 2019-2020 卵巢癌/肝/血管类器官；SARS-CoV-2 感染研究 Kopper,   Nat Med; Lamers, Science 2022 美国 FDA 现代化法案   2.0 认可非动物替代方法 US   Congress, Public Law 2023-2024 单细胞筛查自闭症；肝癌 399 株生物银行；乳糜泻自身免疫模型 Li,   Nature; Cancer Cell 2024; Nature 2024 2025-2026 数字化类器官、类器官智能、冻存工程与多器官芯片 Nat   Methods 2025; Biopreserv Biobank 2026第三章类器官的分类与构建策略3.1 按细胞来源分类 类器官按“种子细胞”来源可分为五大类。第一类是成体干细胞类器官（ASC-organoid），直接由成体组织中的组织特异性干细胞（如 Lgr5+ 隐窝干细胞、导管干细胞）体外扩增而来，路径短、基因稳定，是目前临床应用与生物银行的主力；代表性体系包括肠、结肠、胃、肝、胆管、胰腺导管、肺气道、乳腺、前列腺、子宫内膜、输卵管与唾液腺等。第二类是多能干细胞类器官（PSC-organoid），由胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPSC）经拟胚体与逐步信号诱导分化而来，过程较长（数周至数月）但可再现发育过程、生成多谱系结构，主要用于脑、肾、视网膜、血管等难以直接取材的器官，以及遗传病建模。第三类是肿瘤类器官（tumor organoid/PDO），直接由肿瘤组织建成，保留患者肿瘤的基因组与表型异质性，是个体化药敏检测的核心载体。第四类是气液界面类器官（ALI organoid），组织片段不包埋于基质胶而置于膜上，上层接触空气、下层接触培养基，可保留上皮与间质、部分免疫细胞的天然微环境。第五类是复合与工程化类器官，包括类组装体（assembloid，多个类器官融合）、类器官芯片（organoid-on-a-chip）与生物打印类器官。 表 3-1 五类类器官体系特征对比 类别 种子细胞 周期 主要优势 主要局限 代表体系 ASC 类器官 成体组织干细胞 1-2 周 基因稳定、贴近患者、建系快 上皮为主、无免疫血管 肠/肝/乳腺/前列腺 PSC 类器官 ESC/iPSC 3-8 周 再现发育、多谱系、可基因编辑 耗时、成熟度不足、批次差异 脑/肾/视网膜/血管 肿瘤类器官 肿瘤细胞（含癌干细胞） 2-4 周 保留瘤内异质性与驱动突变 正常细胞竞争、基质依赖 结直肠/胰/胃/肺/卵巢癌 ALI 类器官 完整组织片段 1-2 周 保留间质与部分免疫微环境 通量低、标准化难 肺癌/结肠癌/鼻咽 类组装体/芯片 多类器官或细胞群融合 数周 模拟细胞互作与流体力学 工艺复杂、成本高 皮层-纹状体/心-胰岛轴3.2 按器官类型分类与代表体系 截至 2026 年，文献报道的类器官体系已覆盖 30 余种器官与组织。下表汇总最常见体系的种子细胞、关键信号因子、常用标志物与代表文献，是初学者选择与搭建体系的第一张“地图”。表中缩写：ENR=EGF+Noggin+R-spondin1；EGF=表皮生长因子；FGF=成纤维细胞生长因子；HGF=肝细胞生长因子；Wnt3a=Wnt 通路激动剂；Gastrin=胃泌素；Nic=烟酰胺；DHT=双氢睾酮；NRG1=神经调节蛋白1；TSH=促甲状腺激素。 表 3-2 常见类器官体系的关键因子与标志物（部分经简化的经典配方） 器官/组织 种子来源 关键信号因子组合 常用标志物 代表文献（年） 小肠 Lgr5+ 隐窝 ENR   + EGF + Noggin + R-spondin1 Lgr5、Villin、Muc2、Lyz1 Sato,   Nature 2009 结肠 Lgr5+ 隐窝 ENR   + Wnt3a + Nic + A83-01 + SB202190 Lgr5、Muc2、CA2 Sato,   Gastroenterology 2011 胃 Lgr5+/Troy+  干细胞 EGF+Noggin+R-spondin1+FGF10+Wnt+Gastrin MUC5AC、MUC6、胃蛋白酶原 Bartfeld,   Gastroenterology 2015 肝/胆管 Lgr5+  肝干细胞/EpCAM+ EGF+FGF+HGF+Wnt+R-spondin1 ALB、CK19、HNF4A Huch,   Cell 2015 胰腺导管 导管细胞 EGF+FGF10+Noggin+R-spondin1+Wnt CK19、SOX9、PDX1 Boj, Cell 2015 肺（气道） 基底细胞/肺泡上皮 EGF+Noggin+R-spondin1+FGF7/10（ALI 或   BME） KRT5、SCGB1A1、FOXJ1、SFTPC Sachs,   EMBO J 2019 乳腺 乳腺上皮干细胞 EGF+Noggin+R-spondin1+FGF7/10+NRG1 KRT5/8/14、ER、GATA3 Sachs,   Cell 2018 前列腺 基底/腔上皮 EGF+R-spondin1+Noggin+FGF10+DHT+A83-01 AR、PSA、CK5/CK8 Drost,   Nat Protoc 2016 子宫内膜 上皮+基质细胞 EGF+Noggin+R-spondin1+Wnt+雌/孕激素 ESR1、PAX8、MUC1 Turco,   Nat Cell Biol 2017 肾（PSC） iPSC/ESC CHIR99021→FGF9（时序诱导） PODXL、LTL、ECAD、SIX2 Takasato,   Nat Protoc 2016 脑（PSC） iPSC/ESC 神经诱导+基质胶悬浮自组装 SOX2、TUJ1、CTIP2、GFAP Lancaster,   Nature 2013 视网膜（PSC） iPSC/ESC BMP4→视杯自组织 CRX、RCVRN、视蛋白 PNAS 2024 高效方案 血管（PSC） iPSC/ESC VEGF+FGF2（中胚层诱导） CD31、CDH5、α-SMA Wimmer,   Nature 2019 甲状腺 甲状腺滤泡上皮 EGF+Noggin+R-spondin1+TSH TG、TSHR、NIS 多项 2023-2025 报道3.3 构建原理：干细胞生态位在培养皿中的重现 类器官培养的本质，是把体内干细胞生态位（niche）的“关键信号配方”搬到培养皿中。体内肠隐窝底部，潘氏细胞与间质细胞分泌 Wnt3a、EGF 与 Noggin，基底膜提供层粘连蛋白信号，共同维持 Lgr5+ 干细胞的自我更新。体外体系中，Matrigel 替代基底膜，重组 EGF、Noggin、R-spondin1 替代旁分泌因子——三者缺一不可：去掉 Wnt 类信号，干细胞会向分泌与吸收细胞分化并耗竭；去掉 Noggin，BMP 信号驱动干细胞分化；去掉 EGF，增殖停滞。这正是“信号依赖图谱”的第一层含义。第二层含义是谱系分化的可诱导性：撤去 Wnt 或添加 Notch/BMP 激动剂，即可推动类器官向特定谱系分化，用于产生成熟细胞类型（如肠内分泌细胞、杯状细胞富集的类器官）。第三层含义是肿瘤演化：正常类器官严格依赖外源因子，而肿瘤类器官在癌基因突变积累后逐步“戒断”生态位因子依赖（niche factor independence），这种依赖性的递减本身就是肿瘤恶性程度的读出指标（Fujii 等 2016 年的结肠肿瘤类器官库研究对此作了经典刻画）。 图 3-1 类器官两大构建策略：成体干细胞（ASC）路线与多能干细胞（PSC）路线3.4 从患者到类器官：建立流程概览 患者来源类器官的建立流程可概括为“五步曲”：①取材——手术标本、穿刺活检或内镜活检，取材后冰上快速转运；②处理——清洗、剪碎、酶解或螯合释放组织片段；③接种——片段与基质胶混合种成胶滴；④培养——加入培养基后 37℃ 常规培养，每日观察，按方案换液；⑤鉴定——形态学、标志物表达与基因组测序确认类器官身份与患者来源一致性。第四章类器官的用途：从基础研究到临床应用4.1 发育生物学与器官发生研究 类器官让人类第一次可以在体外“实时观看”人的器官如何长成。脑类器官再现了皮层板层形成、放射状胶质细胞增殖与神经元迁移；肾类器官再现了肾单位从后肾间充质中的形态发生；2025 年《Nature》发表的“人早期脑类器官形态动力学”研究结合光片成像与力学建模，刻画了类器官褶皱形成的物理-生物耦合机制；2024 年《Cell Stem Cell》的人类胎儿肺泡类器官揭示了远端肺细胞命运分区的调控逻辑。相比小鼠胚胎研究，类器官可研究人特异发育事件，且不受伦理窗口限制。4.2 疾病建模与机制研究 ·遗传病：囊性纤维化（CF）类器官的毛喉素诱导肿胀实验（FIS assay）可功能性读出 CFTR 通道活性，已成为个体化 CF 药物评价的金标准之一；小头畸形、自闭症谱系障碍（2023 年《Nature》单细胞筛查）、早发性帕金森病（2024 年《Nature Communications》中脑类器官溶酶体模型）等均有类器官模型。 · 感染病：幽门螺杆菌感染胃类器官（Bartfeld 2015）、沙门氏菌与艰难梭菌感染肠类器官、SARS-CoV-2 感染肺/肠/肾/血管类器官（2020 年系列工作）揭示了宿主受体、细胞嗜性与药物干预靶点。 · 代谢与炎症性疾病：脂肪性肝炎、炎症性肠病、乳糜泻（2024 年《Nature》自身免疫类器官模型揭示 IL-7 功能）等模型用于发病机制与候选药物验证。 · 肿瘤：类器官捕捉肿瘤发生的序贯突变过程（APC/KRAS/TP53 组合）、瘤内异质性与微环境互作，详见第十二章。4.3 药物筛选与毒性评价 类器官在药物研发链中扮演三重角色。在早期发现阶段，类器官库（正常+疾病+肿瘤）可进行化合物表型筛选：2023 年《Nature Communications》报道了基于生物打印的单类器官分辨率药筛平台；2025 年《Cell Stem Cell》的胰腺癌类器官平台鉴定出 KRAS 突变特异性抑制剂；2026 年《Bioactive Materials》的 AI 集成类器官平台实现金属离子活性的高通量功能评价。在安全性评价阶段，2023 年《Journal of Hepatology》的人肝类器官筛选平台可预测药物性肝损伤（DILI）风险；心脏、肾类器官用于心毒与肾毒评估。在转化阶段，肿瘤类器官药敏检测（PDO-DST）直接服务临床用药决策（第十二章）。据 2024 年《Theranostics》发表的国际共识，类器官药敏检测的标准化正从“实验室方法”走向“注册前评价工具”。4.4 个体化医疗与活体生物银行 活体生物银行（living biobank）是类器官最具变革性的应用形态：将大量患者的肿瘤类器官连同基因组、转录组与临床数据共同冻存，形成“可反复复苏、可反复试验”的患者替身库。荷兰 Hubrecht Organoid Technology（HUB）的结直肠癌生物银行已超过千株规模；2018 年《Cell》乳腺癌生物银行（100 余株）、2019 年《Nature Medicine》卵巢癌（56 株）与《Cell Stem Cell》胃癌（63 株）生物银行、2024 年《Cancer Cell》肝癌 399 株生物银行、2025 年《Cell Stem Cell》胰腺癌多组学生物银行相继建成。生物银行的价值在于：一次建库、多次使用，可回溯验证历史用药、前瞻指导新方案、并作为药企的“人源化试验场”。 图 4-1 代表性肿瘤类器官活体生物银行规模（公开报道约数）4.5 再生医学与移植 类器官移植正在从动物实验走向临床探索。2021 年《Nature》报道了结肠类器官移植治疗短肠综合征小鼠的成功案例（Sugimoto 等）；2023 年《Nature Communications》报道了 iPSC 来源软骨类器官在灵长类关节软骨缺损模型中的整合与修复；2025 年《Protein & Cell》报道皮肤类器官移植促进冻伤创面无瘢痕修复；2026 年《Experimental & Molecular Medicine》报道胸膜类器官移植修复脏层胸膜缺损。日本、荷兰等国的团队正推进“类器官移植治疗炎症性肠病”“胆管类器官修复胆道缺损”等 IIT/注册临床研究。需要指出，类器官移植的安全性与规模化生产（GMP 级培养）仍是主要瓶颈。4.6 感染病研究与疫苗药物评价 2020 年是类器官感染研究的转折年。Lamers 等（Science 2020）证明 SARS-CoV-2 能感染人肠类器官的肠上皮细胞并在其中复制；Monteil 等（Cell 2020）用肾类器官与血管类器官证明可溶性 ACE2 可显著抑制病毒感染；Zhou 等（Nature Medicine 2020）比较了蝙蝠与人肠类器官对 SARS-CoV-2 的易感性；Han 等（Nature 2021）用肺与结肠类器官筛选出瑞德西韦等候选药物。2026 年《Emerging Microbes & Infections》进一步用类器官评价了 SA55 与 Pemivibart 两种抗体对新变异株的中和效果，展示类器官作为“变异株快速评价平台”的持续价值。 图 4-2 类器官研究应用方向热度分布（PubMed/Europe PMC 标题检索，截至 2026 年）4.7 小结：类器官能做什么、不能做什么 能做的：体外再现上皮器官的结构与功能；长期扩增与冻存患者材料；高通量药敏与毒性检测；发育与疾病机制研究；部分移植修复。不能做的（目前）：不能代替完整的系统生理（无心脏泵血、无完整代谢器官轴）；多数体系无血管、神经与获得性免疫，不能回答全身药代与免疫检查点疗法的完整问题；类器官≠患者，药敏“预测”仍需临床队列证实。理解边界，才能用对、用好类器官。第五章类器官的前景与挑战5.1 应用前景 · 个体化医疗：肿瘤类器官药敏检测与患者筛选将进入常规诊疗路径，国内外已有数十项前瞻性临床试验在研（第十二章）。 · 新药研发范式：类器官+器官芯片有望替代部分动物实验，缩短临床前周期、降低转化失败率；FDA 现代化法案 2.0 后，类器官数据已开始出现在 IND 申报材料中。 · 再生医学：肠、肝、胆管、软骨、皮肤类器官移植的注册临床研究将扩大；GMP 级类器官生产成为 CGT 产业新赛道。 ·疾病机制与脑科学：脑类器官+类器官智能（organoid intelligence）可能为神经疾病与计算科学提供新范式。 · 流行病与新发传染病应对：类器官可作为病原体快速评价与人源化疫苗效价检测平台。 · 航天与极端环境医学：类器官芯片已进入空间站研究计划，用于微重力下的组织损伤与药物评价。5.2 技术挑战 第一是血管化与免疫化：多数类器官缺乏血管网与获得性免疫细胞，缺氧坏死限制了体积，免疫共培养只能部分弥补。第二是成熟度：PSC 类器官（尤其脑、肾、肝）在转录组上更接近胎儿组织而非成人器官，功能成熟需延长培养或体内移植“催熟”。第三是可重复性与标准化：Matrigel 批间差异、实验室间方案差异导致药敏结果可比性不足，2024 年《Stem Cell Reports》“人脑类器官严谨性与可重复性”共识论文对此作了系统检讨。第四是成本与通量：生长因子与基质胶费用高，自动化与合成基质是降本方向。第五是伦理与监管：脑类器官的意识边界、类器官的“人源化”程度、知情同意与数据共享、商业化利益分配等议题仍在演化，2025 年《Science》发表政策评论呼吁建立全球性神经类器官与类组装体研究治理框架。 表 5-1 类器官主要挑战与应对策略 挑战 表现 应对策略（2023-2026 进展） 血管化不足 中心缺氧坏死、体积受限 器官芯片流体灌注、血管类器官融合、共培养内皮 免疫微环境缺失 无法评估免疫疗法 ALI  培养、TIL/PBMC 共培养、人源化小鼠移植 成熟度不足 胎儿样转录谱 延长培养、机械/电刺激、体内移植成熟化 可重复性差 基质与方案差异 合成水凝胶、定义培养基、共识指南与自动化 成本高 生长因子/基质胶 工程化细胞株产因子、Gjorevski 式合成基质 伦理监管 脑类器官意识议题 ISSCR  指南、2025《Science》全球治理倡议 图 5-1 类器官研究八大前沿方向活跃度（2023-2026，综合评估示意）5.3 市场与产业化前景 据公开行业研究综合估算，全球类器官市场 2022 年约 11 亿美元，2026 年约 23 亿美元，2030 年有望达到约 50 亿美元，年复合增长率约 18%-22%；中国市场 2022 年约 7 亿元，2026 年约 22 亿元，2030 年有望突破 60 亿元。驱动因素包括：肿瘤精准医疗需求、药物研发降本压力、监管政策放开与自动化和 AI 技术的渗透。产业链分为上游（基质胶、培养基、生长因子、耗材与设备）、中游（类器官建库与药敏服务、生物银行）与下游（药企、医院、科研机构）。荷兰 HUB、美国 Emulate 与国内丹望医疗、大橡科技、伯桢生物等为代表的企业群正在快速扩张。 图 5-2 全球与中国类器官市场规模走势（2022-2030，综合公开行业研究估算）第六章入门准备：实验室、设备、试剂与安全6.1 实验室功能区与核心设备 类器官培养对无菌条件的要求高于普通细胞培养：组织处理环节涉及大量开放操作，建议设立独立的“组织处理区”与“培养观察区”。核心设备包括：生物安全柜（BSC II 型 A2）、二氧化碳培养箱（37℃、5% CO2、饱和湿度）、倒置相差显微镜（10×/20× 物镜，最好带成像与台标）、冷冻离心机（4℃、可离 15/50 mL 管）、恒温水浴锅、-80℃ 超低温冰箱、液氮罐（气相保存）、程序降温盒（如 Mr. Frosty）、移液器组、细胞计数仪（或血球计数板）、冰盒与冰桶、无菌滤器、pH 计/渗透压仪（可选）。若开展肿瘤类器官或脑类器官，另需摇床/旋转培养器（EB 培养）与共聚焦/光片显微镜（进阶）。 表 6-1 类器官实验室设备清单与用途 设备 规格要求 主要用途 生物安全柜 II 型   A2，HEPA 组织处理、接种、换液、传代 CO2 培养箱 37℃±0.5，湿度≥90% 常规培养（胶滴培养） 倒置显微镜 相差/荧光，配相机 每日观察、拍照、形态评分 冷冻离心机 4℃，96  孔板转子可选 组织片段/细胞收集与洗涤 -80℃ 冰箱 温度记录与报警 程序降温与短期保存 液氮罐 气相，液位监控 长期保种（-196℃） 程序降温盒 -1℃/min 降温 冻存标准化 恒温水浴锅 37℃±0.2 基质胶冻融、复苏 细胞计数仪 台盼蓝法或荧光法 接种密度控制 无菌滤器/注射器 0.22 μm 培养基除菌过滤6.2 试剂与耗材 类器官培养基通常以 Advanced DMEM/F12 为基础，叠加 GlutaMAX、HEPES、B27 与 N2 添加剂，再按器官类型加入重组生长因子与小分子。基质胶是另一个核心耗材：推荐使用无酚红（growth factor reduced，GFR）型 Matrigel 或等效基底膜提取物，4℃ 冰上分装，避免反复冻融。耗材方面需准备：组织剪、眼科镊、刀片、培养皿、细胞滤网（40/70/100 μm）、低吸附孔板与冻存管等。下表给出通用培养基的“骨架配方”，各器官体系的因子差异见表 3-2。 表 6-2 通用类器官培养基骨架（以肠类器官为例，因子浓度见体系说明书） 组分 作用 典型终浓度 备注 Advanced   DMEM/F12 基础培养基 - 营养底液 GlutaMAX（L-丙氨酰-谷氨酰胺） 稳定谷氨酰胺 1× 避免氨积累 HEPES 缓冲 pH 10 mM 稳定 CO2 波动 B27 添加剂 无血清营养补充 1× 含胰岛素/转铁蛋白 N2 添加剂 神经/上皮营养 1× 与 B27 协同 N-乙酰半胱氨酸 抗氧化/黏液保护 1 mM 肠类器官必需 EGF（重组人） 促进增殖 50 ng/mL 各体系通用 Noggin 抑制 BMP、维持干性 100 ng/mL 可用条件培养基替代 R-spondin1 增强 Wnt 信号 500 ng/mL 条件培养基可大幅降本 Wnt3a（结肠） 补足 Wnt 50-100 ng/mL 小肠体系可省 Gastrin I（胃/肠） 促进分化与增殖 10 nM 胃体系必需 Nicotinamide（烟酰胺） 促进扩增 10 mM 结肠体系常用 A83-01（TGFβRI 抑制剂） 抑制 TGFβ 促分化 500 nM 结肠/肿瘤常用 SB202190（p38 抑制剂） 抑制应激分化 10 μM 结肠/肿瘤常用 Primocin（或青/链霉素） 广谱抗污染 100 μg/mL 前 1-2 周使用 Y-27632（ROCK 抑制剂） 抗失巢凋亡 10 μM 接种/传代/复苏前 48 h6.3 基质胶的选购、分装与使用 基质胶在 2-8℃ 呈液态，室温下快速凝胶，操作全程须在冰上完成：枪头、离心管、孔板预先 4℃ 预冷；基质胶 4℃ 过夜解冻后，按 200-500 μL/管冰上分装；接种时与细胞悬液在冰上混匀，种胶后立即放入 37℃ 培养箱 15-30 分钟凝胶。批间差异是类器官实验最大的隐藏变量之一，建议：同一实验使用同一批次、新批次先做“小样验证”（出芽率与生长曲线）、记录批次号。替代方案包括合成水凝胶（如 PEG 基设计者基质，Gjorevski 等 2016/2022）与明胶/层粘连蛋白复合凝胶。6.4 生物安全、伦理与合规准备 人源组织研究须在知情同意框架下开展：患者签署生物样本捐献知情同意书，方案经机构伦理委员会（IRB）审批；涉及人类遗传资源时按《人类遗传资源管理条例》办理保藏/国际合作备案。生物安全层面：人源组织按潜在感染性材料处理，操作在 BSL-2 条件下进行；废弃物（含基质胶培养基）按医疗废物分类处置；实验室建立支原体与无菌检测的例行制度。动物组织取材须遵守实验动物福利伦理（3R 原则）。这些文件是课题立项、文章发表与临床转化的“通行证”，应在一开始就准备齐全。第七章类器官制作全流程（入门核心） 本章给出从新鲜组织块到稳定培养类器官的完整入门流程，严格对应“取组织块—清洗—剪碎—加入培养基—每日观察—每 5-7 天换液一次”的主线，并以肠类器官为示范体系展开细节。全流程可用一句话概括：把组织块变成富含干细胞的片段，包埋进基质胶，用“配方培养基”模拟体内生态位，让干细胞自组织成类器官。 图 7-1 类器官制作核心八步流程总览7.1 第一步：组织块获取与转运（取组织块） 组织来源有三类：①手术标本——切除组织中最理想，量足、活性好，取肿瘤时应避开坏死与电灼区域；②活检标本——内镜活检（肠、胃、肺）或穿刺活检（肝、胰、乳腺），量少但创伤小，是患者来源类器官的主要来源；③动物组织——小鼠肠道（隐窝法）是最常见的教学与机制研究材料。取材要点：组织离体后立即放入预冷的组织保存液（Advanced DMEM/F12 + 2×青链霉素 + 10 μg/mL Primocin，可加 2% FBS），4℃ 冰盒转运，2 小时内处理为佳，最长不超过 24 小时；记录患者/动物信息、取材部位、缺血时间与体积，拍照存档。7.2 第二步：清洗（去除污染与杂组织） 清洗是防止污染的第一道关口。步骤：①在生物安全柜内将组织转入 10 cm 培养皿；②用预冷 PBS（含 1% 青/链霉素或 100 μg/mL Primocin，必要时加两性霉素 B 2.5 μg/mL）充分浸洗；③用无菌镊子剔除脂肪、血管、坏死组织与黏液；④更换 PBS 重复漂洗至少 3 次，至洗液清亮；⑤手术标本可用 0.1% 碘伏溶液浸泡 1 分钟后再用 PBS 漂洗 2 次（碘伏残留会抑制生长，务必冲净）。整个过程在冰上进行，总时间控制在 15-20 分钟以内，防止组织缺氧损伤。7.3 第三步：剪碎（机械破碎至约 1 mm³） 用无菌组织剪（或眼科剪+手术刀片）将组织剪碎成约 1 mm³ 的均匀碎块，呈“肉糜”状但不可研磨过度。技巧：在少量 PBS 湿润环境中剪 5-10 分钟；剪刀开合要快而轻，避免挤压细胞；碎块过大会导致消化不均，过小会降低干细胞存活率。若做肠道隐窝分离，可跳过细剪，将肠段纵剖后刮除绒毛层，再剪成 2-5 mm 片段进入 EDTA 螯合步骤。7.4 第四步：酶消化或螯合（释放隐窝/导管/细胞团） 不同组织选择不同释放策略。①肠隐窝：肠段剪碎后加入 2-5 mM EDTA-PBS，4℃ 缓慢摇动 30-45 分钟，经吹打与重力沉降收集上清中的隐窝——EDTA 冷螯合法对隐窝干细胞损伤最小，是金标准；②实质器官与肿瘤（肝、胰、乳腺、肿瘤）：胶原酶 II（1-2 mg/mL）或胶原酶 IV/Dispase 组合，37℃ 摇动消化 30-60 分钟，每 10 分钟镜检一次，至片段边缘松散即用含 10% FBS 的培养基终止；③过硬组织可先用胶原酶短时消化再配合机械吹打。终止消化后过 100 μm 滤网去除大块，再过 70 μm 滤网富集小片段，300 g 离心 5 分钟，弃上清，用基础培养基洗涤 1-2 次。所得沉淀即“隐窝/导管富集物”，计数后即可接种。 表 7-1 不同组织类型的释放/消化方案 组织 释放策略 关键试剂与条件 收集目标 小肠/结肠 EDTA 冷螯合 2-5   mM EDTA，4℃ 30-45 min 摇动 隐窝（Lgr5+） 胃 EDTA 螯合+机械刮取 10   mM EDTA，37℃ 15-20 min 胃腺体 肝/胆管 胶原酶灌注或消化 胶原酶 II 1 mg/mL，37℃   45-60 min 胆管片段/肝干细胞 胰腺 胶原酶+机械吹打 胶原酶 IV 1-2 mg/mL，37℃   30 min 导管片段 乳腺 胶原酶消化 胶原酶 I/II 1-2 mg/mL，37℃   1-2 h 乳腺上皮簇（organoid 片段） 前列腺 胶原酶消化 胶原酶 II 1-2 mg/mL，37℃   1-3 h 腺泡/导管簇 肿瘤（通用） 胶原酶+Dispase+DNase I 各 0.5-1 mg/mL + 10 μg/mL DNase，37℃   30-60 min 肿瘤细胞团7.5 第五步：基质胶包埋与接种（种成胶滴） 接种即“把种子埋进基质”。步骤：①预冷 24 孔板、枪头与离心管至 4℃；②将隐窝/片段沉淀与适量基质胶在冰上混匀（推荐密度：每 50 μL 胶滴含 100-300 枚隐窝或 2000-5000 个细胞）；③用预冷枪头吸取 50 μL 混合液，在孔板中央种成半球形胶滴（dome），每孔 1 个胶滴；④将孔板迅速放入 37℃ 培养箱静置 15-30 分钟使基质胶凝固；⑤沿孔壁缓慢加入预热至 37℃ 的类器官培养基，每孔 500 μL（24 孔板），覆盖胶滴。注意：加液动作要轻，切勿直接冲击胶滴；若胶滴浮起，可用枪头轻微按压复位；接种后 48 小时内培养基含 10 μM Y-27632 以提高存活率。7.6 第六步：培养条件（加入培养基，37℃ 常规培养） 标准条件：37℃、5% CO2、饱和湿度。培养基按表 6-2 配方配制，0.22 μm 过滤除菌，4℃ 保存不超过 2 周（含 EGF 等因子建议 1 周内用完）。入箱后前 24 小时不要移动孔板，给胶滴留出“定形”时间。此后的主线动作只有两个：每日观察与定期换液，再加一个周期性动作：传代（第八章）。7.7 第七步：每日观察（看什么、记什么） 每日观察是类器官培养质量的根本保障，建议固定时间（如每天上午）在相差显微镜下完成，并拍照留档。观察六项内容：①培养基状态——颜色（酚红指示剂由红转黄提示代谢旺盛或需要换液）、澄明度（浑浊或絮状沉淀是细菌/真菌污染的第一信号）；②胶滴完整性——胶滴坍塌、溶解或漂散提示基质胶质量问题或操作失误；③类器官数量与直径——用目镜测微尺或成像软件记录 3-5 个视野的平均值；④形态——是否出芽、腔化、上皮极性（隐窝样芽体 vs 实心球）；⑤生长异常——中心发黑（坏死）、贴壁逃逸（基质胶破裂）、成片脱落（凋亡）；⑥环境设备——培养箱温湿度、CO2 读数、水盘液位。建议使用标准观察记录表（表 7-2）逐项打钩，异常情况立即拍照并在备注中描述。 表 7-2 类器官每日观察记录表模板 观察项 记录内容 正常标准 异常提示 培养基颜色 红/橙红/黄 橙红-红 变黄=代谢强或该换液 澄明度 清亮/微浑/浑浊 清亮 浑浊=污染警报 胶滴形态 半球完整/坍塌 完整贴底 坍塌=基质胶失效 类器官数量 视野内计数 稳定或增加 骤减=凋亡 平均直径 μm 逐渐增大 停滞=营养/因子不足 出芽情况 芽体数/大小 D3-D7 出现芽体 无芽=干性信号不足 坏死/发黑 有无、范围 无 有=传代时机或换液 拍照 存图编号 每日存图 用于生长曲线 图 7-2 培养期“每日观察 + 每 5-7 天换液”时间轴（D0-D14示例）7.8 第八步：换液（每 5-7 天换液一次） 本研究采用“每5-7 天全量换液一次”的方案，兼顾营养供给与操作负担，适合多数上皮类器官的常规维持。操作要点：①将新鲜培养基预热至 37℃；②倾斜孔板，用移液器沿孔壁轻轻吸去旧培养基（保留底部胶滴，切勿吸到胶滴）；③沿孔壁缓慢加入等量新鲜培养基（24 孔板 500 μL/孔）；④放回培养箱。判断是否需要提前换液的三个信号：培养基颜色明显变黄、出现细小死细胞碎片漂浮、类器官生长停滞伴少量发黑。需要说明的体系差异：生长极快的小肠类器官或高密度培养，文献与商品化方案多推荐每 2-3 天换液；而生长较慢的肝、胆管、脑类器官，5-7 天换液完全可行。若中间出现营养不足迹象，可在 3-4 天时补加半量新鲜培养基，再在 7 天节点全量更换。定期换液比“营养耗尽才换”更能保持类器官的稳定表型与可重复性，这是入门阶段最值得养成的习惯。 表 7-3 不同类器官体系的换液频率参考 体系 推荐换液频率 单孔体积（24 孔板） 备注 小肠类器官 2-3 天（本方案按 5-7 天维持） 500 μL 生长快，注意培养基变黄 结肠类器官 2-3 天 500 μL Wnt3a 消耗快 胃/胰导管类器官 3-4 天 500 μL 常规体系 肝/胆管类器官 5-7 天 500 μL 生长较慢，本方案适用 乳腺/前列腺类器官 3-5 天 500 μL 按生长速度微调 脑/肾类器官（悬浮） 3-4  天（或半换液 2 次/周） 培养皿体系 震荡/静态培养视方案而定 肿瘤类器官 2-4 天 500 μL 快速生长株缩短间隔7.9 生长评估与建系判定 以肠类器官为例，理想的时间进程是：接种后 24 小时内隐窝闭合形成小囊泡；D2-D4 囊泡开始出芽，形成“带芽球体”；D7 左右典型类器官直径达 50-150 μm、出现 3-8 个芽体；D10-D14 直径可达 100-300 μm，进入传代窗口。当类器官连续稳定扩增 3 代以上、形态典型、标志物表达符合预期（如 Villin+ 肠上皮、Lgr5+ 干细胞）并经测序确认与来源组织一致后，即可判定“建系成功”，随后冻存保种。 图 7-3 常见类器官形态模式示意（囊性/出芽/玫瑰花环/管状/实体肿瘤/胶滴培养）7.10 入门阶段最容易犯的十个错误 · 基质胶在室温操作过久，导致胶滴不均或提前凝固； · 接种密度过高导致类器官融合成片，或过低导致生长停滞； · 换液时吸走或冲散胶滴，损伤三维结构； · 酶消化过度，干细胞大量死亡，接种后无出芽； · Y-27632 未加或加错浓度，单细胞/片段大量失巢凋亡； · 培养基因子降解（反复冻融或存放过久）导致干性丢失； · 组织清洗不充分或抗生素遗漏，2-3 天后真菌/细菌污染； · 观察只看不记，错过早期异常信号，无法追溯问题； · 培养箱水盘干涸或温度漂移，类器官生长停滞； · 同一实验混用不同批次基质胶，数据不可比。第八章类器官的传代与扩增8.1 为什么要传代 类器官是活的“细胞社会”，会持续长大：直径过大（一般超过 300-500 μm）后，中心区因扩散限制出现缺氧与营养匮乏，表现为中心发黑、腔体塌陷，继而坏死崩解。传代（passage）即定期将类器官解离为小片段或单细胞，重新包埋接种，从而：①维持对数生长期与健康形态；②实现数量的指数扩增（1:2-1:6 比例）；③清除分化细胞与衰老细胞、富集干细胞；④为冻存保种提供状态最佳的细胞来源。8.2 传代时机判定 满足以下任一条件即应传代：①直径达到该体系上限（肠类器官约 100-300 μm，肝类器官可至 200-400 μm）；②中心出现暗色坏死区；③芽体过多、形态拥挤紊乱；④培养基消耗显著加快（1-2 天即变黄）。相反，若类器官小而实、无出芽、生长缓慢，说明干性不足，应优先优化培养基而非强行传代。经验法则“宁早勿晚”：在坏死出现之前传代，回收率与后续生长质量显著更好。 图 8-1 类器官传代时机判定与操作决策流程8.3 三种传代方式与适用场景 ①机械吹打传代：用 P1000 枪头反复吹打或注射器针头切割，将类器官打碎为 50-150 μm 片段，不破坏细胞间连接，干细胞存活率最高，适用于结构脆弱或对酶敏感的体系，缺点是片段大小不均、比例控制较粗。②TrypLE 温和酶解传代：回收类器官后用 TrypLE 在 37℃ 消化 5-10 分钟（可配合 70 μm 滤网），得到小片段与少量单细胞，效率与存活兼顾，是肠、肝、胰等多数体系的首选。③Trypsin-EDTA 强力消化：5-10 分钟消化成单细胞，用于需要精确计数、分选或基因编辑的场合，但单细胞克隆效率低，必须配合 Y-27632（10 μM）与较高接种密度。 表 8-1 三种传代方法对比 方法 消化强度 产物 存活率 适用场景 机械吹打 无酶 50-150 μm 片段 最高 脆弱体系、快速扩增 TrypLE 温和酶解 温和 小片段+少量单细胞 高 常规传代（首选） Trypsin-EDTA 强 单细胞悬液 较低 精确计数、分选、基因编辑8.4 标准传代操作步骤（以 TrypLE 法为例） 1. 弃去旧培养基，每孔加入 1 mL 预冷 PBS，用枪头或细胞刮轻柔打散胶滴，转移至 15 mL 离心管，冰上静置 10-15 分钟使基质胶解离（可加入 0.5 mL 预冷 PBS 混匀加速）。 2. 300 g 4℃ 离心 5 分钟，弃上清（含解离基质胶），沉淀即类器官。 3. 加入 1 mL TrypLE 重悬，37℃ 消化 5-10 分钟，期间每 2-3 分钟轻弹管壁并镜检，至类器官解离为 5-20 个细胞的小片段即可终止。 4. 加入 4 mL 含 10% FBS 的基础培养基终止消化，300 g 离心 5 分钟，弃上清。 5. 沉淀用基础培养基洗涤 1 次后，按目标比例（常用 1:2-1:6）分装为若干等份，分别离心备用。 6. 每份沉淀与预冷基质胶混匀（每 50 μL 胶滴约 2000-5000 个细胞），重新种胶，37℃ 凝胶 15-30 分钟。 7. 加入含 10 μM Y-27632 的完全培养基，48 小时后换回常规培养基。 8. 记录传代比例、代次（P 编号）与日期，观察 3-4 天确认新芽生长。8.5 传代中的质量控制 传代是基因漂移与污染的高发环节，应同步完成：①形态评估——传代后 24-48 小时应见新囊泡闭合，72 小时见出芽，否则回溯消化程度与因子活性；②支原体抽检——每 3-5 代或每 4 周做一次 PCR 检测；③关键标志物复核——每 5-10 代做免疫荧光或 qPCR（如肠类器官 Lgr5/Villin）；④长期培养策略——实验性使用建议不超过 P15-P20，重要实验优先使用 P5 以内的低代次，患者样本在 P2-P4 尽早冻存“种子库”。第九章类器官的保种：冻存、复苏与种质库管理9.1 保种的意义与策略 保种（cryopreservation）是类器官平台“可重复、可回溯、可共享”的基石。合理策略是“三库一管”：种子库（master bank，P2-P4低代次，长期液氮保存，绝不动用）、工作库（working bank，从种子库复苏扩增 2-3 代后分装，供日常实验）、备份库（异地或双罐备份，防范设备故障）；一管即全程条形码/编号管理，冻存位置、代次、质控结果电子化记录。每株至少冻存 10-20 支，每支含 1-3 个 50 μL 胶滴当量的类器官（或 1×10⁵-1×10⁶ 个细胞）。9.2 冻存操作流程 1. 时机选择：对数生长期、形态健康的类器官（传代后 2-3 天），冻存前一天更换新鲜培养基。 2. 收集：按第八章方法冰上解离基质胶，离心收集类器官；如用单细胞冻存，先 TrypLE 消化（勿过度）。 3. 配液：冻存液现配现用，预冷至 4℃。经典配方为 90% FBS + 10% DMSO；无血清替代方案用 CryoStor CS10 等商品化冻存液（含渗透保护剂，复苏存活率更稳定）；在冻存液中补加 10 μM Y-27632 可显著提高复杂结构类器官（肠、肝、脑）的复苏率。 4. 分装：每支冻存管标记编号（耐液氮标签纸+油性笔双重标识），加液后 4℃ 平衡 10 分钟。 5. 程序降温：冻存管放入程序降温盒（Mr. Frosty，含异丙醇，约 -1℃/min）或程序降温仪，置 -80℃ 过夜；次日转移至液氮气相（约 -156℃至-196℃）长期保存。 6. 记录：登记入库（编号、代次、数量、日期、位置、质控研究）。9.3 复苏操作流程 1. 准备：水浴锅预热至 37℃，复苏培养基（含 10 μM Y-27632）预热，冰上准备基质胶。 2. 速融：从液氮取出冻存管，立即投入 37℃ 水浴，轻晃至仅剩小块冰晶（1-2 分钟内完成），喷洒 75% 酒精擦拭管外壁后进入安全柜。 3. 洗涤：将内容物转入 9 mL 预温基础培养基中轻柔混匀，300 g 离心 5 分钟，弃上清，必要时再洗一次以彻底去除 DMSO。 4. 接种：沉淀与基质胶混匀种胶（接种密度可较常规提高 1.5-2 倍），37℃ 凝胶 15-30 分钟，加入含 Y-27632 的完全培养基。 5. 观察：24 小时后观察囊泡闭合，48-72 小时见出芽；若 72 小时仍无出芽且大量碎片，提示复苏失败，检查冻存液与降温记录。 6. 过渡：48-72 小时后换回常规培养基，按第七章节奏继续培养。 图 9-1 类器官冻存保种流程与程序降温曲线示意9.4 冻存液配方与选择 表 9-1 常用类器官冻存液配方比较 配方 组成 优点 注意点 经典 DMSO 配方 90%   FBS + 10% DMSO 成本低、通用 批间差异、血清病原风险 改良 DMSO 配方 70%   FBS + 20% 完全培养基 + 10% DMSO 兼顾营养与保护 同上 无血清配方 CryoStor   CS10 / 商品化冻存液 成分明确、复苏率高 成本较高 复杂结构强化配方 CS10  或 90% FBS+10% DMSO + 10 μM   Y-27632 提高脑/肠类器官复苏率 Y-27632 现加 玻璃化（研发中） 高浓度冷冻保护剂+超快降温 无冰晶损伤，2026  年结直肠癌类器官工作流见报道 操作门槛高、尚未普及9.5 保种质检与风险管理 入库前与复苏后各完成一次“保种质检”：①活率——台盼蓝染色计数，入库活率≥80%、复苏活率≥60% 视为合格；②无菌/支原体——液氮不杀支原体，冻存管本身必须无菌；③功能抽检——随机抽取 1 支复苏，48 小时出芽率、生长曲线与标志物表达达标后方可确认该批可用；④身份确认——肿瘤类器官复苏后 STR 比对防止错管混管。风险管理要点：液氮罐液位每周记录、双罐备份关键种子、-80℃ 冰箱断电报警、冻存管只入液相不长期浸没（防炸管）、异丙醇降温盒每 5 次更换一次异丙醇。第十章质量控制与故障排除10.1 质量控制框架 类器官质量控制的本质是回答三个问题：它是活的吗（活力与增殖）、它是对的吗（身份与保真度）、它稳定吗（批间一致）。日常层：每日观察与生长曲线（第七章）；周期层：每 2-4 周支原体 PCR、无菌检测；批次层：新批次基质胶/培养基/因子的平行验证；鉴定层：形态学+标志物（免疫荧光/qPCR）+功能实验（如 CFTR 肿胀实验、白蛋白分泌）+组学抽检（RNA-seq 与来源组织比对）；稳定性层：冻存复苏考核与跨代次（P5 vs P10）表型比较。七个维度可用雷达图直观呈现（图 10-1）。 图 10-1 类器官质量控制七维评估雷达示意10.2 污染识别与处置 污染分三类。细菌污染：培养基 1-2 天内变浑、变黄或变酸臭，镜下见细小颗粒布朗运动——立即废弃该孔并追溯操作环节，同一批次其他孔加抗生素预防；真菌污染：棉絮状菌丝或白色/黑色斑点，可跨孔扩散——整板废弃，环境用抗真菌剂消毒，检查培养箱水盘（常为源头）；支原体污染：培养液不浑但生长变慢、形态异常、代谢改变——最隐蔽，只能 PCR 检出，确诊后原则上废弃培养物，若为珍贵保种株可尝试商业支原体清除试剂并联检 3 次。预防优于治疗：安全柜定期消毒验证、操作规范（一人一板、少开盖）、抗生素预防（前 2 周 Primocin）、每周留样检测。10.3 常见问题排查表 表 10-1 类器官培养常见问题与排查 现象 可能原因 排查与解决 接种后 24 h 无囊泡闭合 干细胞受损/密度过低/消化过度 缩短酶解、提高密度、补 Y-27632 长期无出芽（实心球） Wnt/BMP 信号失衡、基质胶批次 复检因子活性（Wnt3a/Rspo/Noggin）、换批验证 出芽后快速分化脱落 干细胞耗竭、EGF 失效 提前传代、新配   EGF、降低换液间隔 中心发黑坏死 直径过大、换液不及时 提前传代、增加换液频率 胶滴坍塌/漂起 基质胶未凝固、加液过猛 延长凝胶时间、沿壁缓慢加液 类器官贴壁逃逸 基质胶被蛋白酶降解、胶滴破裂 补种新胶、调整传代消化程度 生长停滞+液色微浑 支原体污染 PCR 检测、清除或废弃 复苏后不成活 DMSO 残留、降温过快、代次过老 二次洗涤、复核降温曲线、复苏种子库 传代后大量碎片死亡 消化过度、Y-27632 遗漏 缩短 TrypLE 时间、48 h 内维持 Y-27632 批间药敏结果漂移 基质胶/培养基批次、代次差异 锁定批次与代次、内部参考株标定10.4 数据记录与电子化 类器官实验的数据维度多（观察记录、图片、冻存库、组学、药敏），建议从第一天起使用电子实验记录（ELN）或 LIMS：统一命名规则（项目-体系-代次-日期-操作）、图片自动编号与生长曲线脚本化分析、冻存库位置管理、药敏数据按“剂量-反应-IC50-AUC”四联表存档。2025 年《Nature Methods》“数字化类器官”工作流与 2026 年 SWIFT 单类器官成像追踪框架，标志着从“人工观察”到“可追溯数字孪生”的行业趋势，入门者可从免费工具（ImageJ/Fiji、CellProfiler、QuPath）开始建立自己的图像分析管线。第十一章从入门到精通：体系优化与进阶技术11.1 培养基的“加减法”：干性维持与定向分化 精通的第一个标志是能主动操控“自我更新↔分化”的天平。以肠类器官为例：Wnt3a/CHIR99021 增强干细胞扩增；撤除 Wnt 并添加 Notch 抑制剂 DAPT 可富集分泌谱系；添加 BMP4 可诱导肠上皮向黏液分泌方向倾斜。以肝类器官为例：在扩增培养基中去分化因子、加入 Oncostatin M 与地塞米松，可推动肝类器官向成熟肝细胞分化，白蛋白与 CYP 酶活性显著上升。这类“配方开关”使同一株类器官既能建库扩增、又能产生功能成熟细胞，是药筛与毒理实验的常用设计。11.2 基质的工程化：从 Matrigel 到设计者基质 Matrigel成分不明、批间波动、含小鼠来源蛋白，是产业化与临床转化的痛点。2016 年 Gjorevski 等证明 PEG 基合成水凝胶通过调节基质硬度和降解性即可支持肠类器官生长；2022 年同一团队在《Science》进一步阐明“组织几何形状决定类器官命运图式（fate patterning）”；2021 年 Rezakhani 等在《Biomaterials》系统综述了胃肠类器官的基质需求；2023 年《Bioactive Materials》综述了定义水凝胶的进展。工程化基质的价值不只是“替代 Matrigel”，更在于获得可调刚度、可控降解与可定义的生物活性配体，从而把类器官变成“可编程”的实验系统。11.3 共培养：重建微环境 类器官最大的短板是“只有上皮”。共培养策略按复杂度递进：①上皮-间质共培养——类器官与成纤维细胞（如肠道肌成纤维细胞）共培养可增强出芽与成熟；②上皮-免疫共培养——肿瘤类器官与外周血单个核细胞（PBMC）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或工程化 T 细胞共培养，可评估免疫杀伤与 T 细胞双特异性抗体的效果（Cattaneo 等 Nat Protoc 2020；Dekkers 等 Nat Biotechnol 2023）；③上皮-微生物共培养——类器官与共生菌/致病菌共培养（Puschhof 等Nat Protoc 2021）；④多类器官融合——类组装体，如皮层-纹状体、皮层-脊髓融合模型（Pasca 等2022 年命名共识）。共培养的核心技巧：培养基需兼顾双方（折中配方）、细胞比例与接种时序需要滴定、杀伤读出指标（活细胞成像、LDH、流式）需提前设计。11.4 气液界面（ALI）与类器官芯片 ALI 培养将组织片段或类器官置于 Transwell 膜上，顶端暴露空气、基底接触培养基，天然保留间质与免疫细胞。Neal 等（Cell 2018）用 ALI 建立了保留肿瘤微环境（含肿瘤浸润淋巴细胞）的肺癌类器官，可直接用于 PD-1/PD-L1 抑制剂药敏。类器官芯片则进一步引入流体：上皮通道与血管通道由多孔膜分隔，蠕动泵驱动培养基与血流样剪切力，可模拟机械刺激、营养梯度与跨内皮迁移（图 11-1）。2026 年《Bioactive Materials》报道的“血管化多器官芯片”把心脏类器官与胰岛类器官串联，在糖尿病心肌病模型中再现了心-胰岛轴互作；2025 年《Advanced Materials》报道了个体化血管化肿瘤类器官芯片用于转移与靶向治疗评估。芯片体系的关键参数：流速（剪切力 0.01-10 dyn/cm²）、膜孔径（3-10 μm）、溶氧与温度控制、在线传感器集成。 图 11-1 类器官芯片（Organoid-on-a-Chip）结构示意11.5 PSC 类器官的分化与成熟化 PSC 类器官的核心矛盾是“发育保真”与“成熟度”。精通级技巧包括：①时序信号微调——以肾类器官为例，CHIR99021 脉冲时长决定中胚层-后肾命运比例（Takasato 等 2016 方案）；②代谢成熟——切换线粒体氧化代谢培养基（如补充脂肪酸、减少葡萄糖）可促进肝、心类器官成熟；③机械与电刺激——流体剪切促进肾血管化（Homan 等 Nat Methods 2019），电刺激促进脑类器官网络成熟；④体内移植催熟——将脑类器官移植入小鼠脑内，可获得成熟星形胶质细胞形态与功能（Nat Biotechnol 2025报道的人星形胶质细胞成熟研究）；⑤多细胞组装——iPSC 小胶质细胞经胆固醇转移促进脑类器官成熟（Park 等 Nature 2023）。11.6 基因组编辑与研究基因工程 类器官与 CRISPR 技术的结合是机制研究的利器：在类器官中序贯敲入 APC/KRAS/TP53/SMAD4 突变，可在体外重演结直肠癌的多步发生（Drost 等 2015 年在人肠类器官中的经典工作）；研究基因株（如 Lgr5-GFP、MUC2-RFP、OLFM4-mCherry）使干细胞与分化细胞实时可视化；碱基编辑与同源重组修复（HDR）策略可构建患者突变等基因系。技术要点：电穿孔或核转染递送优于脂质体；单细胞克隆需 Y-27632 支持；编辑后必须做靶点验证与脱靶筛查；肿瘤类器官的编辑效率显著低于正常类器官，需增大 sgRNA 筛选量。11.7 高通量与自动化 精通阶段的实验室会把类器官推向“工业级”：类器官微阵列（如 384 孔超低吸附板）、自动化液体工作站、高通量成像与表型量化（Beghin 等 Nat Methods 2022的自动化高速 3D 成像；2025 年《Nature Methods》数字化类器官管线）、自动化药敏研究生成。自动化不是简单替代人工，而是通过“标准化动作”压缩批次差异——先手工建立稳定体系，再逐步自动化，是务实的进阶路径。第十二章从精通到应用：肿瘤类器官与药敏检测12.1 肿瘤类器官（PDO）建系要点 肿瘤类器官建系成功率因瘤种而异：结直肠癌与胃癌可达 70%-90%，胰腺癌、肝癌、肺癌约 40%-60%，需特别处理坏死与纤维化组织。要点：①取材多点、避开坏死，尽量在 1 小时内开始处理；②消化温和（胶原酶+Dispase+DNase I），保留细胞团；③培养基添加肿瘤体系定制因子（如 ROCK 抑制剂、p38 抑制剂 SB202190、TGFβ抑制剂 A83-01 与低浓度 Wnt3a 组合）以抑制正常上皮竞争；④建系后必做三件事——组织病理比对（类器官重现患者肿瘤形态）、全外显子/靶向测序（关键驱动突变一致）、STR 或 SNP 指纹（确认患者来源）；⑤低代次（P2-P5）冻存种子库，药敏实验控制在 P10 以内。12.2 药敏检测的标准化流程 标准化药敏流程（PDO-DST）分五步：①制备单细胞/小片段悬液并计数；②接种 96/384 孔板（每孔 2000-5000 细胞，基质胶包被或包埋）；③设置 8-10 个剂量梯度（覆盖临床 Cmax 上下两个数量级）、平行复孔与质控（阳性杀伤对照、溶剂对照）；④连续培养 72-120 小时，用 CellTiter-Glo 3D 或活细胞成像定量；⑤计算 IC50、AUC 与药敏分级，输出研究并与临床结局比对。2024 年《Theranostics》发表的国际共识建议统一研究“IC50+AUC+临床可及浓度比值”，并强调基质与培养基批次锁定。2018 年 Vlachogiannis 等的里程碑数据显示，类器官药敏预测化疗效果的敏感度约 100%、特异度约 93%、阳性预测值约 88%；后续多个前瞻队列（荷兰 TUMOROID、欧洲 SENSOR 等）正在确证这一结论。 图 12-1 肿瘤类器官药物敏感性检测（PDO-DST）标准管线与量效曲线示意12.3 免疫治疗共培养药敏 常规 PDO 缺失免疫细胞，无法直接评价免疫治疗。解决方案：①ALI 培养保留 TIL（Neal 2018）；②PBMC/TIL 与 PDO 短期共培养（Cattaneo 2020 方案），读 T 细胞活化（IFN-γ、CD107a）与杀伤（类器官凋亡/Caspase-3/7）；③工程化 T 细胞（CAR-T、双特异性抗体）杀伤实验（Dekkers 2023 阐明作用模式）；④人源化小鼠移植重建系统免疫。2025 年《Cell Stem Cell》肺癌类器官共培养模型与 2026 年《OncoImmunology》原位类器官模型均指向同一趋势：免疫微环境重建是下一代药敏检测的核心方向。12.4 从药敏到临床决策的证据链 表 12-1 类器官药敏指导临床的代表性研究与试验方向 研究/试验 年份 瘤种 关键结论/设计 Vlachogiannis   et al., Science 2018 胃肠癌 PDO 预测化疗疗效，阳性预测值约 88% Kopper   et al., Nat Med 2019 卵巢癌 56 株生物银行，药敏反映患者异质性 肝癌 399 株生物银行,   Cancer Cell 2024 肝癌 药敏图谱与瘤内异质性药敏分层 胃癌 PDO 药筛,   Cell Rep Med 2024 胃癌 PDO 药筛与患者临床结局相关性 胰腺癌多组学生物银行, Cell Stem Cell 2025 胰腺癌 多组学-药敏关联+他汀联合疗法临床评估 TUMOROID   / SENSOR 等前瞻队列 2019-2026 多瘤种 前瞻验证   PDO 指导二线及以上用药的价值 需要清醒认识：类器官药敏是“参考工具”而非“绝对答案”。药代动力学、肿瘤异质性取样偏差、微环境与基质效应都会造成体外-体内差异；药敏结果必须与分子检测（NGS、IHC）及临床证据联合解读，其最终价值由前瞻性临床试验定义。第十三章从精通到扩展：2023-2026 前沿全景13.1 脑类器官与神经科学 脑类器官是 2023-2026 年最活跃的方向之一。里程碑工作包括：Li 等（Nature 2023）用单细胞测序对脑类器官进行大规模 CRISPR 筛查，鉴定出自闭症相关发育缺陷；Park 等（Nature 2023）证明 iPSC 来源小胶质细胞通过胆固醇转移促进脑类器官成熟；Schafer 等（Cell 2023）将脑类器官移植入小鼠脑内，建立了含人类小胶质细胞的体内神经免疫模型；2025 年《Nature》发表人早期脑类器官形态动力学研究，把类器官褶皱形成与力学-生化耦合联系起来；2025 年《Cell Stem Cell》发表神经发育障碍表型脑类器官图谱与生物银行；2025 年《Nature Methods》与《Nature Protocols》系列方案推动脑类器官多重化与标准化；2025 年《Science》政策评论呼吁建立全球神经类器官与类组装体研究治理框架。伦理层面，脑类器官“意识边界”讨论持续升温，国际干细胞研究学会（ISSCR）指南建议对具有神经活动复杂化的模型建立分级审查机制。13.2 肿瘤类器官：多组学、免疫与临床试验 2024 年《Cancer Cell》发表 399 株肝癌类器官大型生物银行的药敏基因图谱，系统刻画了瘤内异质性对药敏分层的影响；2024 年《Cell Stem Cell》发表淋巴瘤类器官模型，可在体外保留并靶向滤泡性淋巴瘤的肿瘤免疫微环境；2025 年《Cell Stem Cell》连续发表胰腺癌类器官多组学生物银行（关联药物响应并临床评估他汀联合疗法）与肠神经元-胃肿瘤类器官共培养（揭示胃癌代谢脆弱性）；2024年《Cell Reports Medicine》报道胃癌 PDO 药筛与患者临床结局的相关性；2024 年《Advanced Science》报道胰腺癌活检样本微流控类器官用于化疗与免疫治疗个体化检测；2025 年《Nature Biomedical Engineering》发表胰腺癌分支类器官模型刻画异质性驱动的表型可塑性与治疗响应。临床转化层面，PDO 指导用药的前瞻性试验（荷兰 TUMOROID、SENSOR 等）进入入组高峰，PDO 数据开始被写入药物注册申报材料。13.3 AI 与类器官智能（Organoid Intelligence） AI 与类器官的融合在 2024-2026 年形成完整链条。上游——图像与表型：2025 年《Nature Methods》数字化类器官管线实现高速 3D 结构分割与细胞拓扑分析；2025 年《Cellular Oncology》OrganoIDNet用深度学习从时间序列成像识别 PDAC 类器官-PBMC共培养中的治疗效应；2026 年《Communications Biology》SWIFT 工作流实现单类器官成像分类与追踪。中游——药筛与预测：2024 年《Bioengineering & Translational Medicine》综述 AI-类器官整合系统；2026 年《Bioactive Materials》AI集成平台高通量评价生物活性金属离子。下游——类器官智能（OI）：2024 年《Med Nov Technol Devices》系统阐述 OI 概念，即利用脑类器官的网络计算能力结合脑机接口发展新型生物计算。此外，2026 年《Biosensors & Bioelectronics》报道了“生物杂交类器官-机器人嗅觉智能”系统，标志类器官开始作为传感器与执行器组件进入机器人学。13.4 工程化与冷冻保藏新进展 2026 年《Biopreservation and Biobanking》发表类器官冻存原理、新兴策略与工程创新综述，把“冻存”从操作细节提升为系统工程：纳米线加热快速复温、磁性纳米颗粒防冰晶、玻璃化技术逐步应用于类器官；2026 年《New Biotechnology》报道结直肠癌“组织到类器官”玻璃化冻存工作流；2025 年《Nanoscale Advances》综述纳米材料在类器官培养与冻存中的应用。基质方面，2025 年《Journal of Translational Medicine》综述可重复细胞外基质用于肿瘤类器官培养的挑战与机会；2025 年《Molecular Medicine》综述水凝胶刚度与粘弹性对类器官培养的影响。这些进展共同指向“规模化的可制造性”——让类器官从科研工具变成可运输、可存储、可审计的工业产品。13.5 器官芯片与多系统建模 多器官串联芯片是 2025-2026 年的标志性方向：2026 年《Bioactive Materials》血管化多器官芯片重建心-胰岛轴用于糖尿病心肌病研究；2026年《Bioactive Materials》实时传感集成类器官芯片综述梳理了“芯片+传感器”的技术版图；2025 年《Advanced Materials》个体化血管化肿瘤类器官芯片用于转移与靶向治疗评估。多系统建模的深层逻辑是：疾病往往是器官间对话的失调（心-肾-肝轴、肠-脑轴、心-胰岛轴），单器官模型无法回答，多器官芯片+患者来源类器官是最有希望的中尺度解决方案。13.6 再生与移植走向临床 2023 年《Nature Communications》软骨类器官灵长类移植、2025 年《Protein & Cell》皮肤类器官冻伤修复、2026 年《Experimental & Molecular Medicine》胸膜类器官移植、2026 年《Bioactive Materials》骨膜类器官修复大段骨缺损与毛囊类器官微针（毛发生长）等研究，显示类器官移植正从“软上皮”扩展到“硬组织与皮肤附属器”。GMP 生产、免疫原性与植入后追踪是进入临床前的三大关口；中国、日本、荷兰的多家机构已启动类器官移植治疗炎症性肠病、胆道疾病与骨关节炎的探索性临床研究。13.7 产业、标准与监管 产业化层面：上游（基质胶国产替代、重组生长因子）、中游（建库与药敏服务、自动化工作站、AI 分析软件）、下游（医院精准用药、药企研发外包）三条赛道并行扩张；类器官已被写入多国监管科学路线图。标准化层面：2024 年《Theranostics》肿瘤类器官药敏共识、2024 年《Stem Cell Reports》脑类器官严谨性与可重复性共识、2022 年 Pasca 等类组装体命名共识构成行业“通用语言”；国内《肿瘤类器官药敏检测专家共识》及团体标准陆续发布。监管层面：FDA 现代化法案 2.0 后，类器官数据在 IND/IDE 申报中的使用比例上升，类器官作为“伴随诊断”的注册路径正在探索。可以预期，2026-2030 年将是类器官“从论文走向处方”的关键窗口期。 图 13-1 2023-2026 八大前沿方向活跃度（同图 5-1，供本章对照） 图 13-2 类器官研究论文发表趋势（2009-2026，PubMed/Europe PMC 标题检索）13.8 未来十年展望 · 类器官+AI 数字孪生：患者类器官的形态、组学与药敏数据进入统一数字模型，实现“先算后试”。 · GMP 级类器官工厂：标准化、自动化、封闭式生产，支撑再生医学产品注册。 · 多器官人源系统：芯片上再现心-肝-肾-肠-脑轴，成为毒理学新金标准。 · 类器官智能：脑类器官与脑机接口融合，探索生物计算与神经修复。 · 全球生物银行网络：跨国共享的类器官-临床数据联盟，推动真实世界证据生成。第十四章实验方案速查手册14.1 小鼠小肠类器官速查卡 表 14-1 小鼠小肠类器官速查卡（经典 ENR 体系） 步骤 操作 关键参数 取材 取十二指肠/空肠 5-10 cm，纵剖刮绒毛 冰上，含双抗 PBS 螯合 2-5   mM EDTA-PBS，4℃ 摇   30-45 min 释放隐窝至上清 富集 70   μm 滤网，300 g×5 min，洗 1-2 次 隐窝 100-300/50 μL 胶 接种 隐窝+Matrigel 种胶，37℃   15-30 min 24 孔板   50 μL 胶滴 培养 ENR+EGF+Noggin+Rspo1，500 μL/孔 前 48 h 加   Y-27632 10 μM 维护 每日观察，每   2-3 天换液（本研究常规方案 5-7 天） D3-D7 出芽 传代 TrypLE   5-10 min，1:2-1:6 直径 100-300 μm 时 保种 90%   FBS+10% DMSO（或 CS10+Y-27632） -1℃/min→液氮14.2 患者肿瘤类器官速查卡 取材（多点、避坏死、1 h 内处理）→ 清洗（3 次，Primocin）→ 剪碎 1 mm³ → 胶原酶+Dispase+DNase I 消化30-60 min → 70/100 μm 过滤、离心洗涤 → Matrigel 包埋（2000-5000细胞/50 μL）→肿瘤定制培养基（含 A83-01、SB202190、低剂量 Wnt 与 Y-27632）→ 每日观察、2-4 天换液 → 2-4 周建系→ 病理/测序/STR 三鉴定 → P2-P5 冻存种子库 → 药敏板检测（72-120 h，IC50+AUC研究）。参考文献（2015-2026 年逐年精选，均经数据库校验） 奠基文献（2009-2014） [1] Sato T, Vries RG, Snippert HJ, et al. 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DOI: 10.1016/j.stem.2026.08.003.附录 A 术语表 表 A-1 类器官领域术语表（20 个核心术语） 术语 定义 3D 培养 在三维基质或悬浮体系中培养细胞，重建细胞极性、基质互作与组织结构 ALI 培养 气液界面培养：组织/类器官置于膜上，顶面接触空气、底面接触培养基 ASC / PSC 成体干细胞 / 多能干细胞（ESC  胚胎干细胞、iPSC 诱导多能干细胞） AUC（药敏） 剂量-反应曲线下面积，综合评价药物敏感性的指标 BME / Matrigel 基底膜提取物基质胶，类器官最常用三维支架 CFTR / FIS 实验 囊性纤维化跨膜电导调节因子；毛喉素诱导肿胀实验功能读出 CFTR 活性 出芽（Budding） 类器官表面萌发新腺体样结构的形态发生事件 传代（Passage） 解离类器官后重新包埋接种，实现扩增与维持 程序降温 以约 -1℃/min 的速率缓慢降温至   -80℃，减少冰晶损伤 类组装体（Assembloid） 多个类器官或类器官与其他细胞群融合形成的复合结构 类球体（Spheroid） 细胞聚集形成的简单三维球体，无明确自组织层次 生态位（Niche） 干细胞赖以生存与自我更新的微环境（细胞、基质与信号因子） 失巢凋亡（Anoikis） 细胞脱离基质后发生的程序性死亡；Y-27632 可抑制 IC50 半数抑制浓度，药物杀伤/抑制效应的核心指标 Lgr5 Wnt 靶基因，肠道等多种上皮成体干细胞的标志物 Noggin / R-spondin1 BMP 抑制剂 / Wnt 信号增强剂，类器官培养基关键成分 PDO / PDO-DST 患者来源类器官 / 基于患者来源类器官的药敏检测 Primocin 广谱抗细菌/真菌/支原体抗生素，组织初代培养常用 STR 鉴定 短串联重复序列分型，确认类器官与患者的身份一致性 TrypLE 重组胰蛋白酶类似物，温和解离类器官的常用酶 Wnt3a 经典 Wnt 通路配体，结肠/肿瘤类器官培养的补充因子 Y-27632 ROCK 抑制剂，抑制失巢凋亡，接种/传代/复苏时使用