Trypsin

摘要：人类间充质干细胞（hMSCs）已被证明具有作为多种疾病治疗方法的巨大潜力。由于它们具有免疫特权地位，异体hMSCs治疗方法是特别有吸引力的选择，需要改进它们的规模化和制造方法。基于微载体的生物反应器系统在自动化封闭系统中提供了比传统平面培养更高的体积hMSCs产量。然而，需要更复杂的生物工艺来成功地从平面培养转换到微载体。本文总结了从种子训练、接种、扩展和收获的平面培养到微载体hMSCs制造方案中涉及的关键步骤。还讨论了重要的生物反应器参数，如温度、pH值、溶解氧（DO）、混合、喂养策略和细胞计数技术。 1.引言  人类间充质干细胞（hMSCs）被认为对治疗许多类型的疾病具有开发前景。这些疾病（包括神经、骨骼和关节以及心血管疾病）大多数缺乏改变疾病进程的治疗选择。除了经典的研究表明hMSCs具有多系分化能力以及它们能够归巢或迁移到损伤部位之外，更近期的研究表明它们具有旁分泌和免疫调节效应。自1995年首次报道以来，hMSCs已在临床上进行了越来越多的测试，迄今为止在clinicaltrials.gov上注册的临床试验超过1100项。在这些试验中，使用自体和异体hMSC的试验数量直到2015年都是相当的，之后异体hMSC试验的数量超过了自体hMSC试验。这种趋势可能源于免疫调节的好处，这使得hMSCs具有免疫特权，因此不太可能触发细胞移植引起的免疫排斥，这在基于细胞的治疗中始终是一个关键问题。另一个好处是与自体细胞产品相比，异体细胞产品的制造成本降低：（每剂1490-1830美元）与自体细胞产品（每剂3630-4890美元）相比，基于一些假设。到目前为止，13个获批的基于hMSC的产品中有9个使用异体细胞。根据临床试验数据，移植效果依赖于一定数量的合格细胞（典型剂量范围从7000万到1.9亿个细胞，中位数为1亿个细胞）成功地被输注到受体。从原始细胞中获得足够的细胞数量需要大规模体外扩增方案。对于即将到来的后期临床试验和未来商业化的需要，持续增长的需要是一致地放大大量高质量hMSCs的高效系统。出于明显的经济原因，有效的制造规模化是一个理想的尝试，以增加异体hMSC治疗的可行性。为了在规模化制造中扩展依赖锚定的细胞，如hMSCs，有效利用可访问的表面决定了最大的体积生产力和制造批量大小。制造hMSCs的最常见现代方法依赖于多层容器，这些容器设计为在一个室内堆叠的层，以同时处理所有层，提供更高的空间效率和比常规T-瓶更经济的生物过程。尽管它们在传统培养器具上有所改进，但在这些多层容器中的hMSCs扩展几乎达到了临床相关所需的阈值细胞数量。为了进一步扩大过程，微载体系统提供了更高的表面积与体积比，最大化了空间效率。自1967年以来，微载体已在各种迭代中用于人类细胞培养。先锋研究表明，在完全可控的升规模生物反应器中hMSCs在微载体上的扩展。由于最近对制造经济学的增加兴趣，将hMSCs的使用从研究和开发阶段扩展到标准治疗的商业制造，工业经验研究报道，微载体生物反应器培养可以达到近80倍的体积细胞产量，同时仅占用当前良好生产规范（cGMP）制造空间的10%，制造成本降低（每平方厘米0.044美元）与多层容器培养（每平方厘米0.061美元）相比。基于这些原因，hMSC在微载体生物反应器系统中的生产开发代表了该领域的宝贵进展。总而言之，基于微载体的生物反应器系统是有利可图地制造商业化hMSC产品的一种新兴方法。 尽管微载体生物反应器培养在理论上只是改进的方法，用于生成足够的细胞进行移植，但其固有的制造过程与标准、成熟的平面培养有显著不同。例如，微载体培养需要动态流动来悬浮微载体并使大量培养基均匀化。这使得氧气、营养物质和细胞代谢物主要通过对流进行质量传递，这比平面培养所需的扩散要有效得多。同时，动态流动本身会对细胞产生剪切应力，细胞-微珠和细胞-细胞碰撞的频率，加上hMSCs对机械和物理力的敏感性，都被认为是影响细胞生长和质量的因素。另一个重要的不同是，微载体培养中的细胞生长表面与T-瓶或培养皿提供的平坦表面非常不同。在平面培养中，细胞本能地附着在平坦表面上，由于重力的作用，在接种后几小时内；相反，微载体上足够的细胞附着是由细胞-微珠碰撞决定的，除了粘附之外，可能需要超过一天。此外，与平面培养中的完整表面相比，微载体提供的表面是孤立的，这阻止了微珠之间的细胞迁移。换句话说，观察到细胞主要在单个微载体内增殖和扩散，强调了初始殖民效率的重要性，在2D平面培养中并不是一个关键因素。不完全的液体移除是微载体基础生物处理的另一个障碍。例如，完全的培养基更换对于T-瓶或多层容器来说是一个简单的常规程序。相比之下，微载体基础培养的典型培养基更换体积大约是25%到50%（表1），这取决于微载体床深度一旦所有微载体沉降到生物反应器底部。一个相关的障碍复杂化了细胞收获过程中的多个步骤是不完全的液体移除。因此，微载体生物反应器细胞收获过程的每一步，包括洗涤、细胞脱落、微载体过滤和细胞悬浮液浓度，都涉及特别的考虑和相应的策略，以最大限度地移除液体，而不对细胞质量或产量产生负面影响。此外，微载体生物反应器过程的规模化需要在非常大的规模上使用专业设备。由于典型的细胞过滤器只能通过几十毫升的细胞悬浮液，实验室规模的离心机限于升体积，两者都不是高效收获生物反应器体积的可行选择，这些体积可以扩展到几十甚至几百升的细胞悬浮液。因此，尽管这些新发展起来的生物反应器过程参数在细胞生长阶段改善了规模化过程，但它们为基于微载体的hMSCs生产创造了额外的下游体积相关挑战。需要进一步改进下游设备设计，以完全实现成功的过程开发。微载体悬浮在生物反应器中的优势，如易于扩展的容器设计、均匀的营养和氧气获取、细胞和培养基的实时在线/离线监测、喂养策略的多样化操作（即批处理、补料批处理和灌注）等，是显而易见的，过程（动态细胞附着、独特的扩展和原位收获）必须从平面培养的原始方法适应到微载体悬浮培养的需求。美国食品药品监督管理局（FDA）推荐实施过程分析技术（PAT），以阐明旨在促进创新和基于风险的监管决策的过程，在开发、制造和质量保证中。筛选关键过程参数并理解偏离过程对最终产品质量的影响至关重要。我们之前的研究表明，hMSCs属性和治疗效果的变化源于从平面培养到微载体之间的微环境差异，包括不连续的表面、凸曲率、微载体刚度、剪切应力、碰撞和聚集。在这里，我们提供了一个全面的审查，当在基于微载体的生物反应器中制造hMSCs时，生物处理变化的需要。大规模准备的过程也进行了讨论。 表 1.基于hMSC微载体的生物反应器工艺参数。 缩写：微载体（MC）、间充质干细胞（MSC）、人脂肪组织来源的MSC（hAD-MSC）、人骨髓来源的MSC（hBM-MSC）、人胎盘来源的MSC（hPL-MSC）、人脐带来源的MSC（hUC-MSC）、人脐带基质来源的MSC（hUCM-MSC）、人胎儿骨髓来源的MSC（hF-MSC）、人沃顿氏果冻来源的MSC（hWJ-MSC）。α：这些数字是根据作者的信息计算的。 2. 微载体基础hMSC制造的生物加工  可扩展性是微载体基础悬浮培养相对于传统平面培养的最大优势。开发基于微载体的hMSC制造面临的第一个挑战是微载体的选择。在生物反应器系统中的hMSC生产中已使用了多种类型的微载体，包括聚苯乙烯、明胶、右旋糖酐等。已有几项研究报告了筛选微载体用于hMSC生产的评估，主要关注三个关键培养步骤：(1) 粘附效率，(2) 生长速率和细胞扩展，(3) 脱落的便利性。Rafiq等人系统评估了13种商业微载体用于生物反应器中骨髓来源hMSC生产的适宜性，并确定塑料微载体是最优化的。Loubière等人比较了5种商业微载体用于脐带来源hMSC扩展，并证明尽管Cytodex-1展示了更高的细胞粘附效率和更好的细胞扩展性能，Star-Plus和Plastic-Plus分别在轨道和机械搅拌模式下被认为是更好的折衷选择。Leber等人筛选了6种商业微载体用于骨髓来源hMSCs和永生化细胞系hMSC-TERT的扩增，并在含血清或化学定义的培养基(Stem Cell 1)中进行了比较。他们的结果表明，玻璃涂层微载体支持含血清培养基中hMSC-TERT的生长和微珠间的转移，而增强粘附微载体在化学定义培养基中增强了细胞生长。综合来看，微载体的选择可能因不同系统和特定细胞类型而异。 尽管有多种微载体选择，它们共享相似的几何圆形形状，直径范围在100-300微米。在这个范围内，微载体提供了足够的体积表面积，而不影响细胞粘附和增殖支持。旨在最大化空间的微载体设计与精确控制培养环境的生物反应器系统特别有前景。例如，一升Synthemax II微载体培养，装载密度为16克/升，提供5760平方厘米，接近CellSTACK®-10提供的6360平方厘米。 将进一步讨论与接种、喂养和收获培养相关的生物工艺改进，以克服使用基于微载体的生物反应器系统所面临的挑战。 2.1. 种子培养 在大规模hMSC制造（>50升）中，直接将细胞库瓶中的细胞接种到生产规模的生物反应器中是不现实的，也不经济。因此，从冷冻瓶中解冻细胞，通过种子培养逐步传代到越来越大、体积更大的容器中，是制造过程的必要阶段。为了获得足够的生物反应器接种细胞，已经开发了种子培养过程，以从一规模高效地生成活细胞到随后更大的规模，最终接种生产规模的生物反应器。每个种子培养必须可靠地生成所需的预定细胞数量，同时始终维持细胞质量。因此，除了确保倍数扩展外，种子培养的质量最终决定了hMSC生产的下游成功。影响种子培养质量优化的最重要因素是时间框架，因为hMSC过度生长可能导致细胞-细胞接触抑制，延长的传代过程施加了不当的细胞压力，对下游生产阶段产生负面影响。 大多数先前的研究使用平面培养进行hMSC制造，因为其相对简单，处理时间较短，细胞扩展的差异较小，且细胞数量产量一致。然而，如果目标接种量超过了平面培养所能实现的规模，微载体培养也可以纳入种子培养。一个简化过程的有趣替代方案是直接将种子微载体从种子培养阶段转移到规模化的生物反应器中，使用新鲜培养基和空微载体。这种方法需要满意的细胞从种子微珠迁移到未种子微珠，但跳过了传代过程，如酶处理、机械力脱落、离心和细胞沉淀物的重悬。几项研究还证明了使用新鲜解冻细胞的接种准备的实用性，从而证明了用微载体完全替代平面培养是可行的。由于微载体培养的传代过程复杂性增加，种子培养更倾向于使用平面培养。 2.2. 接种 对于批量系统，需要更多的努力来建立设定点的培养条件。在细胞接种之前，微载体应充分水合并用培养基平衡，整个培养环境应在优化的温度、pH值和溶解氧(DO)下稳定，以便在接种引起的必要的干扰之后立即恢复培养条件。细胞接种后，hMSCs倾向于像在平面培养中一样粘附到表面上。然而，微载体上的细胞粘附比平面培养中的粘附更加困难，不仅是因为动态环境，还因为微载体表面的曲率。因此，大多数工艺开发研究最初都集中在实现高细胞粘附效率上。粘附效率可以通过微载体上粘附的细胞比例和/或与悬浮在上清中的细胞相比，与初始接种数量相比来确定，假设在分析时间框架内没有细胞生长或死亡。18到24小时是细胞粘附容易测量和可以忽略细胞增殖的公认时间框架。 除了细胞粘附之外，殖民效率也很重要。由于单个微载体表面提供的可扩展表面的不连续性，细胞传播被限制在被殖民的微载体内，无论微珠间的转移如何。殖民效率决定了微载体表面利用率，这可能影响最终的细胞产量。一般来说，微载体的细胞殖民效率是通过基于细胞对微珠比例的泊松分布估算的，假设细胞-微载体碰撞和成功粘附的事件是随机的、独立的和恒定的。例如，细胞对微珠比例为3时，被占据的微载体的理论预测为95%，而细胞对微珠比例为6时为99.8%。因此，通常使用3到6的细胞对微珠比例（表1）。实际上，微载体的数量是根据达到目标细胞数量所需的表面积来选择的，细胞接种密度是根据之前的平面培养经验和通常在3000到5000个细胞/平方厘米来计算的（表1）。为了提高细胞对微珠比例以获得更高的殖民效率，增加接种细胞数量通常比减少装载的微载体更有利。尽管殖民效率和细胞粘附同等重要，但很少有研究全面评估了两者的影响。 间歇性搅拌已被实施以增强微载体悬浮培养中的细胞粘附。Yuan等人在转瓶中的实验结果表明，在细胞接种后24小时，使用间歇性搅拌（3分钟以60转/分钟的搅拌，然后不搅拌27分钟）比连续以60转/分钟的搅拌增强了1.5到2倍的细胞粘附效率。对于间歇性搅拌，静止期增强了细胞粘附，而搅拌期增加了细胞殖民。如果静止期太长，增加的细胞粘附导致初始增长更高，但可能不是最高的最终细胞产量，因为微载体的利用有限。此外，由于依赖锚定的hMSCs的活性随着它们未附着在表面上的时间越长而降低，间歇性搅拌模式的平衡必须仔细优化以适应规模。 已经开发了几种方法来提高细胞粘附而不损害殖民效率。成功的hMSC粘附需要细胞-微载体碰撞和在碰撞期间细胞对微载体的充分结合。针对这一点的一种方法是增加碰撞的概率。增加碰撞概率的一种简单方法是在细胞粘附阶段减少工作体积。增加搅拌速度也可以提高碰撞频率；然而，由于碰撞期间的接触时间减少和由于更高的动能而加剧的流体剪切应力，最终可能会减少成功粘附。生物材料生物技术的进步也提高了结合力，例如涂有蛋白质或正电荷增强细胞粘附的微载体。例如，Shekaran等人研究了涂有纤维连接蛋白和/或聚-L-赖氨酸的聚己内酯微载体对hMSC粘附效率的影响，发现纤维连接蛋白和聚-L-赖氨酸的顺序涂层将总细胞粘附提高了约69.4%到78.3%。此外，也研究了培养基的影响。与血清补充培养基相比，在无血清和异种培养基中观察到降低的细胞粘附和增加的滞后阶段，证明了血清在细胞粘附中的基本作用。在另一项研究中，Gadelorge等人成功地使用0.5%的血小板裂解物(PL)在最初的24小时内增强细胞粘附，而不是在扩展阶段使用的5% PL。尽管取得了一些进展，但在微载体悬浮培养中提高细胞粘附效率的策略仍然是一个挑战。 2.3. 细胞扩展 当hMSCs牢固地粘附在微载体上后，细胞开始扩展。为了最大化细胞产量，必须维持一个优化的环境。在平面培养中，温度由孵化器控制，pH值通过培养基中的碳酸氢钠和CO2浓度保持平衡，氧气由环境空气供应，几乎完全的培养基更换提供营养替换和废物清除。在微载体培养中，这些参数都由生物反应器系统控制，保持优化的温度、pH值、溶解氧(DO)，执行控制搅拌、营养喂养（例如，葡萄糖和谷氨酰胺）和废物清除（例如，乳酸和氨）。与每批只需要喂养一次或两次的平面培养不同，基于微载体的生物反应器培养需要更复杂的生物工艺，以实现实时监测和控制，并采用适当的喂养策略，以动态维持最佳细胞生长。为了增加最终产量，细胞培养系统旨在扩大工作体积和细胞浓度，因此需要开发支持细胞数量最大倍数增加的喂养方案。 2.3.1. 搅拌（搅动和摇摆） 在悬浮培养中在微载体上培养细胞需要某种形式的搅拌。先前的报告总结了搅拌引起的流体剪切应力和动态环境引起的碰撞以及随后的聚集对hMSCs治疗潜力的影响。研究的结论是保持搅拌尽可能低的速度，仅满足质量传递的需求，并避免微载体在死角的积累。搅拌槽式生物反应器已广泛用于微载体悬浮培养。通过可视化或粒子图像测速可以轻松估计维持微载体悬浮所需的最低搅拌速度。NS1和NS1u是常用的标准，代表搅拌器速度。NS1定义为完全悬浮所有微载体的阈值搅拌，但不保证均匀的微载体分散。NS1u定义为确保即使微载体与容器底部接触也没有静止微载体的最小搅拌。当考虑使用基于微载体的生物反应器系统进行hMSCs规模化生产时，混合的一个重要因素是体积能量耗散。这表明了维持微载体悬浮所需的每单位体积的功率输入，与搅拌速度成正比。因此，搅拌速度通常随着培养时间的增加而增加，以抵消装载有增殖细胞的较重微载体、较大的工作体积或多微载体聚集。与混合有关的另一个因素是搅拌器尖端速度，在这一点上是整个生物反应器中剪切应力最高的地方，因此对细胞的潜在损伤最严重。因此，搅拌器的尺寸和几何形状可能对活性至关重要。可能的情况是，一小部分细胞暴露在局部高剪切应力下，但平均剪切应力暴露仍然很低。 为了绕过剪切应力的潜在风险，其他类型的生物反应器，包括固定床生物反应器、中空纤维生物反应器和波纹运动生物反应器，也已用于扩展hMSCs。在波纹生物反应器中的微载体悬浮已显示出显著较低的剪切应力。然而，在这些系统中进行原位细胞收获时可能会遇到挑战，因为需要更高的剪切应力才能将细胞从微载体上分离。特定类型的微载体，如可溶解微载体，代表了克服这个问题的一个选择。 2.3.2. 控制系统（温度和pH值和DO） 无论培养类型如何，hMSC培养的最佳温度设定点为37°C。生物反应器通常配备有温度控制单元，该单元接收来自温度传感器的信号，并根据需要控制加热或冷却系统的能力。在生物反应器培养中调节温度有两种方式。一种是维持生物反应器的水套或附着在生物反应器袋上的金属板的温度，另一种是直接通过热电偶或温度传感器测量大体积培养的温度，然后用加热毯或垫加热生物反应器。前者可能由于间接测量而有一些偏差，而后者需要更多关注以了解温度传感器和加热源的相对位置。虽然在搅拌模式下，热传递和温度分布应该在整个培养中均匀，但在培养不处于搅拌状态时（例如，当沉降微载体进行培养基更换时）可能并非如此。由于整个培养过程中热传递效率低下而产生的任何温度梯度可能导致特定区域过热。因此，当搅拌关闭时，加热功能也应该关闭。 平面培养中的pH值通过孵化器中的5% CO2浓度和培养基中的NaHCO3平衡。尽管没有直接控制，但在平面培养中，高表面积-体积比率容易维持pH值在一定范围内。相反，含有高细胞密度的动态微载体培养需要更具体的pH值控制。如表1所示，pH设定点在7到7.5之间，pH可以通过稀释的碱（例如，NaOH，NaHCO3）和稀释的酸（例如，H2SO4）或CO2气体控制。两项研究已成功地仅通过使用5% CO2气体维持pH值。尽管每次使用前都必须校准在线pH探头，但离线校准（即，立即用离线pH计测量的培养样品）提高了细胞扩展期间的测量精度，特别是对于长期培养。 溶解氧（DO）是维持代谢活动和细胞生长的必需因素。向生物反应器培养供应氧气有两种方式：覆盖通气和鼓泡通气。对于覆盖通气，气体不断被泵入顶部空间以调节影响培养基中溶解气体的分压。概念是将纯氧泵入覆盖层可以加速氧气的溶解性。鼓泡通气通过在底部产生小气泡将氧气供应到培养基中，从而增加气液（氧-培养基）界面面积和气体滞留时间。由于hMSCs的低氧需求（1.2–3.8 × 10^−17 mol氧气s−1 cell−1）与细菌和酵母相比，DO通常可以通过覆盖通气来维持。迄今为止，很少有研究在基于微载体的hMSC生产中实施鼓泡。然而，如果细胞密度达到一定水平，气液表面积与体积比太低，可以应用鼓泡。一个考虑因素是，因为鼓泡可能会增加细胞的剪切力，并可能导致气液界面起泡，可能需要添加消泡剂。 氧气传递速率，表示生物反应器中氧气质量传递的熟练程度，由界面面积、质量传递系数和氧气浓度梯度决定。界面面积由几何参数决定，包括生物反应器的形状和尺寸以及鼓泡气泡的大小。因此，气泡尺寸越小，界面面积就越大，从而增强了氧气传递。氧气质量传递系数受培养基配方、混合、能量耗散、暴露时间等的影响。例如，Shah等人的实验结果表明，当在气流速率为0.05 vvm的2升旋转运动生物反应器中将搅拌速度从6提高到20 rpm时，体积氧气质量传递系数（kLa）从2提高到3.4 h−1，这表明较高的搅拌速度提高了氧气传递效率。氧气浓度梯度取决于溶解氧浓度与培养基中饱和浓度之间的差异。因此，顶部空间中的纯氧导致这个梯度的增加并加速氧气输送。 2.3.3. 培养基和喂养策略 与平面培养类似，用于基于微载体的生物反应器中hMSC扩展的最常见培养基是添加了FBS的DMEM或αMEM。最近对追求无异种培养的兴趣，以减少未定义的动物来源成分的影响，已测试并证明了人血清或血小板裂解物成功替代了FBS用于无异种微载体悬浮培养的生物反应器。此外，这些培养物用于治疗目的的潜力，导致开发了几种专门用于微载体基础培养系统中hMSC扩展的商业化培养基，包括MesenCultTM-XF、PRIME-XV MSC Expansion SFM、StemPro® MSC SFM XenoFree、MSCGMTM BulletKitTM。 一些因素被添加到生长培养基中以实现特定目的。例如，添加聚合物如0.1% Pluronic F68有助于通过减少细胞的疏水性来保护细胞，从而减少剪切诱导的损伤，并促进hMSC粘附到微载体上。这在用气体鼓泡培养时特别有益，并使气泡破裂。实际上，培养基的选择应该根据适当的喂养策略进行优化，并由各个培养系统决定。 由于培养基是hMSC生产的主要成本来源，明智的喂养计划将使用最少的培养基体积，以获得最大的细胞产量，而不会对细胞质量产生负面影响。培养基使用效率可以表示为每百万细胞的培养基消耗量（mL/10^6 cells）。使用这个描述符，可以比较不同研究之间的培养基成本。批处理培养是过程开发的便利和经济参考。优点包括操作简便、污染风险低和培养基用量减少。由于营养的限制，无法实现高细胞培养密度，因此批处理培养不理想用于hMSC制造评估。然而，批处理培养非常适合与最终产量无关的过程开发，如细胞系筛选、微载体筛选、细胞粘附改进、营养限制确定、生物反应器参数优化、批处理间变异性澄清等。 常见的hMSC微载体基础培养通常实施补料批处理作为喂养策略，以避免与营养相关的生长抑制，包括培养基添加和培养基更换。培养基添加同时补充营养和稀释代谢废物。由于这种方法缺乏排水程序，因此不必停止搅拌。这种方法的另一个好处是保留了hMSC分泌的细胞因子，并且在扩展过程中没有细胞损失。不幸的是，这种策略所需的增加工作体积导致每单位体积的细胞产量减少。部分培养基更换在补充培养基之前从生物反应器培养中去除代谢废物，并保持最大体积生产力。这个培养基去除步骤需要不搅拌10到20分钟以使微载体沉降。所需的确切时间可能因微载体密度、生物反应器规模、细胞聚集程度或其他影响微载体从培养基上清中沉降的能力的因素而异。通过离线培养基分析优化交换培养基的频率和部分，以防止营养耗尽和废物积累。大多数研究选择的培养基交换量等于或小于工作体积的50%（表1）。这既减少了排水过程中的微载体损失，也保留了已知可以增强扩展的hMSC分泌的细胞因子。在某些情况下，如果离线培养基分析推断特定已知营养组分的耗尽将很快发生（根据细胞生长曲线），可以提供更高浓度的这种组分作为添加剂来补偿短缺并维持细胞增殖速率。 连续交换模式（连续培养基交换）稳定地向生物反应器提供新鲜培养基，并同时将用尽的培养基泵出培养。这种策略可以比未修改的培养物实现更高的细胞密度。Cunha等人利用相同的培养基用量在基于微载体的搅拌槽式生物反应器中比较了每天20%工作体积的连续培养与每2.5天50%工作体积的补料批处理培养的性能。他们的结果表明，连续培养可以达到更高的细胞浓度，达到3.7 × 10^5 cell/mL的14.6倍扩展，与补料批处理培养的2.9 × 10^5 cell/mL的11.5倍扩展相比。连续流速可以根据生长和离线培养基分析进行调整，以补充必要的营养，最小化培养基波动。 2.3.4. 微载体添加 除了培养基补充外，一些研究还测试了添加新鲜、裸露的微载体作为一种方法，为现有细胞提供更多的扩展表面并稀释细胞密集度。这种方法依赖于高效的微珠间的细胞迁移。即使在各种培养系统和几种培养基中使用恒定搅拌维持的培养中，微珠间转移的可行性也得到了很好的证明。先前的一项研究建立了一种方法，在第6天向搅拌槽式生物反应器中添加新鲜微载体，然后从第6天到第9天进行间歇性搅拌（即，15转/分钟5分钟，静止55分钟），以实现更好的细胞从微珠到微珠的迁移，从而最大限度地提高微载体的殖民。这可能是一种创新技术，为高细胞密度培养提供增加的体积表面积并减少聚集程度。尽管有希望，但该过程需要优化以确定微载体添加的理想时间框架、新鲜微载体的数量以及整体提高细胞微珠间转移。 2.4. 收获 一旦生物反应器控制系统和优化的培养基喂养策略显示出扩展hMSCs的能力，下一步就是确定收获这些细胞作为最终产品的最佳时间。与平面培养不同，基于微载体的培养提出了hMSC收获的挑战。在收获时，hMSCs通常占据了大多数微载体，微载体聚集的程度非常高，可能会进一步增加与收获细胞相关的困难。使用从平面培养中修改的程序作为指南，微载体培养中的整个收获过程从微载体上的细胞分离开始。这包括排干培养基、添加并用PBS洗涤、排干PBS、添加解离缓冲液进行培养和用培养基熄灭。然后，包括以下步骤，以有效地去除微载体并浓缩大量细胞悬浮液，以便进行后续的下游生物过程。从培养系统移除液体的每个步骤都不可避免地会导致一些细胞的损失。例如，排干废培养基或洗涤缓冲液也可能去除一些带有粘附hMSCs的微载体，微载体去除和细胞悬浮液/浓缩步骤都涉及一些细胞的损失。分离效率可能是降低总细胞产量的另一个因素。因此，已经开发了许多方法来提高hMSC收获效率。 收获效率最关键的部分是细胞分离程序。Nienow等人报告了在15毫升ambrTM和100毫升DASGIP生物反应器以及100毫升转瓶中使用解离试剂Trypsin-EDTA、TrypLE Express和Accutase优化hMSC微载体培养中的分离效率的21种组合。从本质上讲，他们的方案利用了解离试剂的短暂强烈搅拌期，结合了达到最大分离效率所需的化学反应和物理力。分离效率可以随时通过在显微镜下检查样品来检查，看看微载体是否仍然附着在细胞上。此外，一旦细胞被分离成单个细胞或大小小于湍流的Kolmogorov尺度的小簇，细胞将不再受到流体剪切应力的影响。细胞分离后，需要去除微载体以获得纯净的细胞悬浮液。可以使用无菌筛子过滤掉微载体。为了适应大规模制备的高容量，市售的一次性滤袋也可用。例如，Thermo Fisher Scientific的Harvestainer™ BioProcess容器旨在封闭系统中将微载体珠子与收获肉汤分离，包括3升、12升、25升和50升的不同尺寸，应该能够覆盖迄今为止开发的大多数规模。这涉及在无菌容器内组装一个微筛袋，以允许微载体被截留在筛袋中，而分离的细胞将通过它。EMD Millipore的OptiCap® XL 1胶囊还提供了有效的过滤，以将细胞与微载体分离。筛网尺寸必须在微载体直径和细胞直径之间，范围从60到100微米（表1）。 无论采取哪种方法，收获过程都需要几个复杂的步骤，必须及时进行。为了减少复杂性，已经开发了创造性的微载体类型，以简化程序并提高生产速度和效率。可溶解微载体是一种创新的方法，可以轻松地检索所有细胞，而不需要进一步的过滤，并且在升规模的生物反应器培养中已经使用。热响应微载体也已测试用于热提升收获。尽管取得了这些进展，但仍有改进的空间，以加速收获过程。 去除微载体后，经过澄清的hMSC悬浮液通常包含的体积（>20升）大于来自可比平面培养的体积。实验室升规模的离心机缺乏处理这些大体积的能力。已经开发了用于高效细胞浓缩的最新连续流技术。切向流过滤，也称为交叉流过滤，是一种通过将流动方向设置为垂直于过滤方向（顾名思义）来提高渗透流速的设计。有许多商业产品可用，包括Pall Corporation的Cadence™ Single-Pass和PallSep™系统，Millipore的Cogent M1 TFF系统，Cytiva的UniFlux和ÄKTA flux等。另一种设计是逆流连续离心。这些系统可以利用流体流与离心力相反的平衡将细胞保留在流化床上，例如Sartorius Stedim的kSep®系统或Terumo BCT的Elutra®细胞分离系统。这些方法加速了从大规模体积中浓缩细胞的处理时间，并减少了细胞暴露于离心力的时间。仍然需要进一步优化以获得最大的hMSC产量。 3. 取样和细胞计数  这些细胞作为治疗药物的效力取决于能否获得大量健康活性的hMSCs。因此，准确和一致地计算悬浮细胞的方法非常重要。此外，由于微载体的干扰以及它们在培养中的固有聚集，基于微载体的生物反应器培养中的细胞计数变得更加具有挑战性。与消耗营养物质和积累废物相比，确定细胞数量被视为支持和确认成功细胞扩展的最直接证据，因此也指导未来过程开发的决策和方向。从本质上讲，细胞计数是整个生物过程的关键参考。在计数细胞之前，必须收集代表性样品。取样口位置、取样时的搅拌速度、处理样品的过程，所有这些因素都可能改变计数的细胞数量。优化取样方法是第一步，尤其是对于细胞培养的后期阶段，当hMSCs在多微载体聚集体中生长时，这可能是一个挑战。 细胞计数是一个相对直接的过程，已经为来自平面培养的均匀细胞悬浮液建立了许多方法。方法是计算固定体积内的细胞数量，然后将该数量转换为样品大小，再转换为整个培养系统。当使用聚集的微载体工作时，需要修改方法。 一般来说，在微载体培养中计算细胞的方法有几种：(1) 细胞从微载体上分离后的计数；(2) 微载体溶解后的细胞计数；(3) 细胞溶解后微载体的核计数；(4) DNA定量；(5) 代谢测定。具有简单步骤和高通量的计数方法理想且比基于测定的方法更受欢迎。此外，由于可溶解微载体并不总是可行的，细胞从微载体上分离和细胞溶解微载体通常是更合适的选择（图1）。 图 1.细胞解离和细胞裂解方法。基于微载体的生物反应器培养物的细胞计数方法。 除了使用血细胞计数器进行手动细胞计数外，自动细胞计数器已广泛用于hMSC制造，以快速测量复制样品中的细胞数量。尽管理论只是计算所有细胞并由细胞膜的完整性确定活性，不同的自动细胞计数器可能会产生不同的结果。台盼蓝增强了带有活性信息的细胞计数，而荧光染料，如吖啶橙、钙黄绿素、DAPI、碘化丙啶等，可以通过自动细胞和核计数器显示更高的颜色对比度，用于计算有或没有裂解缓冲液的活细胞和死细胞。这些自动计数器主要分析染色细胞/核的图像并计算颗粒数量。重要的是，应根据细胞/核大小设置门限，以排除样品中可能存在的无关细胞碎片或破裂的核。自动计数器的典型认证范围是10^4到10^7，因为这提供了足够的颗粒进行计数，但并不过于拥挤，以至于设备无法识别单个颗粒。值得注意的是，对于来自平面培养的细胞工作良好的自动细胞计数器在计数来自微载体培养的细胞时可能效率较低，因为有微载体堵塞装载工具的风险。 4. 结论  我们先前的研究检查并总结了当从平面培养转换到微载体时微环境变化导致的hMSC治疗潜力的改变。发现成骨和软骨系的分化潜力显著增加，而脂肪系的分化潜力减少。还观察到迁移能力、抗炎和免疫调节能力的改善。我们也承认了来自微载体培养的不足之处——主要是由不连续生长表面和生物反应器内剪切应力分布不均匀引起的异质性。然而，尽管存在局限性，基于微载体的生物反应器系统仍然是生产hMSC产品商业化最有前途和盈利的方法。本综述着重于微载体基础生物反应器的发展，这些反应器最有潜力用于规模化过程。我们还讨论了微载体培养所需的生物加工变更，包括种子培养、接种、扩展、收获和细胞计数。还回顾了生物反应器参数，如温度、pH值、DO、混合和喂养。最后，我们详细介绍了在hMSC微载体培养中应用的各种细胞计数方法。

1.什么是外源因子？世界卫生组织将外来物定义为"污染细胞培养物或来源材料的微生物，这些微生物无意中被引入生物制品的制造过程中。这是一个相当宽泛的定义，因此，可以被视为非确定因素的范围相当大。外来因子是复制因子，如真核生物、原核生物或病毒，另外还有朊病毒。不存在复制因子的污染毒素不被认为是外源性因子。外来因子不需要是已知的人类病原体，许多外来因子是通常被认为对人类无致病性的动物病原体。为了使产品安全不受外来剂的影响，任何存在的外来剂都需要灭活，如果产品不能灭活，则必须采取预防措施以确保不会发生污染。不确定因素对药品的污染会产生许多负面影响。最直接的影响是有人因受污染的产品而患病或受伤。污染可能导致药物或疫苗短缺，因为受污染的产品必须从市场上撤下，例如，由于检测到一种外源性病毒，唯一的轮状病毒疫苗被从市场上撤下了。从实际的角度来看，制药公司无法从受污染的、不安全的产品中获利。此外，需要建立公众对药品的信任，因为之前的外源性药物污染事件导致了消费者的不信任，因为质疑疫苗安全性的父母不太可能给孩子接种疫苗。甚至有一种被驳斥的阴谋论，认为脊髓灰质炎疫苗被一种外源性病毒污染，导致了人类免疫缺陷病毒(HIV)的大流行。2.被外源因子污染但放行的产品在许多情况下，在药品中发现了外来剂。本节旨在重点介绍一些特别有影响力的事件，或者让人们深入了解法规是如何制定的。这些污染事件的摘要包括在图1。图1 外源因子污染的时间轴本文按时间顺序列出了所讨论的每一个外源因子污染事件，并以检测到污染的年份为日期。2.1脊髓灰质炎疫苗中猴病毒40的检测1955年，美国采用了由默克公司生产的Salk灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)。用福尔马林灭活脊髓灰质炎病毒在恒河猴肾(RMK)细胞中培养产生IPV。1959年Eddy等人发现RMK细胞的裂解物中含有一种在仓鼠体内引起肿瘤发生的因子。基于这一研究，默克公司的研究人员在开发腺病毒疫苗的过程中，发现了一种IPV污染剂，可在非洲绿猴肾(AGMK)细胞中引起细胞病变，并将其鉴定为猿猴病毒40号(SV40)。到SV40被发现时，多达9800万美国人接种了可能受污染的IPV疫苗，尽管研究估计只有10 - 30%接种了IPV疫苗的人接种了受污染的剂次。有证据表明，IPV的福尔马林灭活程序能够灭活SV40，尽管效率不如RMK细胞，但默克公司开始使用AGMK细胞生产IPV，因为SV40不是AGMK细胞的内源性污染物。到1961年，美国政府要求所有脊髓灰质炎疫苗不含SV40，尽管没有官方召回被污染的IPV剂量。进一步的研究发现恒河猴是SV40的天然载体，因此在IPV的生产过程中，外源病毒在RMK细胞的整个培养过程中都存在。这种污染的影响已经得到了高度的研究。SV40是一种多瘤病毒，与人BK和JC病毒有亲缘关系。在实验室中，SV40引起肿瘤，并能使其T抗原蛋白细胞系永生化，这引起了人们对IPV污染导致疫苗接受者发生癌症的主要担忧。已经从多种人类癌症中分离出SV40抗原和DNA，这表明这些实验室发现具有潜在的临床相关性。尽管有证据表明SV40具有致癌能力，但许多关于IPV疫苗接种后癌症发病率的综述并未发现接种受污染的疫苗与癌症之间存在联系。Strickler等人进行了一项着眼于SV40相关癌症风险的回顾性队列研究，将暴露于受污染IPV的个体与未暴露于受污染IPV的个体进行了年龄比较，发现暴露于受污染疫苗与癌症发病率增加无关。瑞典一项针对70万人的研究测量了骨原性肉瘤、脑室管膜瘤和胸膜间皮瘤的发病率，发现暴露于受污染IPV的个体发病率没有增加[。美国国家科学院医学研究所2003年发表的一篇免疫安全评论得出结论，目前尚不清楚IPV中SV40的存在是否会直接导致任何疫苗接种者的癌症。然而，有证据表明，接种IPV的人血清转化为SV40，但尚不清楚这是由于病毒感染还是暴露于疫苗中存在的福尔马林灭活病毒抗原。IPV被SV40污染是确定一种新型内源性动物病毒可从细胞系制备过程携带到药品生产过程的首批实例之一。这导致政府监管机构要求对特别确定的外来病毒进行筛选，制造商改变了用于继续生产疫苗的细胞系。虽然污染的影响尚未完全了解，但它似乎没有对数千万受污染人口的健康产生可衡量的影响。2.2 减毒活疫苗中噬菌体的检测1973年，美国食品和药物管理局(FDA)报告称，多种减毒活疫苗(包括腮腺炎、麻疹和风疹(MMR)疫苗和口服脊髓灰质炎疫苗)中都存在噬菌体，即在细菌内感染和复制的病毒。这种污染最初是通过对胎牛血清(FBS)的不相关研究确定的，进一步的研究确定了使用胎牛血清进行细胞培养的疫苗的污染。最初，FDA的回应是成立了一个委员会，决定在确定噬菌体是否可以从疫苗生产中去除之前，允许受污染的疫苗继续在市场上销售。对从MMR疫苗中分离的噬菌体φV-1的研究没有发现该噬菌体对动物模型的影响，也没有发现接种后噬菌体的持久性。在非人灵长类动物中接种φV-1，尽管缺乏病毒持久性，但仍产生了强烈的血清抗体反应。当时，FBS的采集是在没有采用无菌技术的屠宰场进行的。从胎儿采集的血液通常被细菌污染，并使用过滤去除细菌。这种过滤能够去除相对较大的细菌，但允许噬菌体污染最终的FBS产品。在细胞培养中使用这种受污染的胎牛血清制备减毒活疫苗，导致给人接种的疫苗受到污染。在疫苗中发现噬菌体两年后，美国食品和药物管理局(FDA)推进了相关法规，要求用于细胞培养的FBS不含任何污染噬菌体，这导致屠宰场行业修改了他们的做法。当时人们还没有完全了解疫苗中噬菌体污染的影响。目前尚不清楚有多少人接触过受污染疫苗中的噬菌体，因为在发现这一发现时，减毒活疫苗已经使用了十多年。众所周知，噬菌体可以将毒素转移到细菌中，使其更具致病性，也有发表的研究证实了噬菌体在培养中能够将基因传递到细胞中。现在，虽然我们的疫苗被要求不含噬菌体，但噬菌体的生物学已经得到了更好的了解，并且被认为对人类的危害较小。最近，噬菌体甚至被FDA批准用于治疗严重的细菌感染。目前没有证据表明任何噬菌体污染直接对人类造成伤害，而且过去的疫苗污染很可能没有直接导致不良事件。2.3 减毒活疫苗中逆转录酶的检测1995年，在鸡胚成纤维细胞中培养了MMR减毒活疫苗和黄热病减毒活疫苗。当时，人们知道禽类逆转录病毒在鸡蛋中存在风险，FDA对疫苗中禽类逆转录病毒的检测有要求。Prya等人于1994年开发的一种方法能够检测逆转录酶活性，其灵敏度提高了106倍，称为PERT试验。PERT试验用于测试疫苗，它能够检测到传统方法无法检测到的逆转录酶的存在。具体而言，MMR和YF减毒活疫苗被发现具有逆转录酶活性，而在鸡细胞和鸡蛋中培养的灭活疫苗，如流感疫苗，未被发现具有逆转录酶活性。逆转录酶与鸡胚成纤维细胞有关，这是一种从鸡群中收获的原代细胞。进一步研究发现，逆转录酶活性与内源性禽逆转录病毒(EAV-0)和禽白血病病毒(ALV)核酸和颗粒的存在有关。尽管检测到逆转录病毒核酸，但进一步的研究未能从鸡胚成纤维细胞中分离出感染性病毒[26]。疫苗接种者的试验显示，原病毒没有整合到外周血淋巴细胞中，也没有ALV的血清转化。由于检测到逆转录病毒相关的逆转录酶，减毒活疫苗没有从市场上撤下。世卫组织的一个委员会指出，“疫苗可预防疾病的风险是真实的和可量化的，而鸡细胞衍生颗粒造成的风险是理论上的和遥远的。总的结论是，PERT试验能够检测出鸡胚成纤维细胞内源性的非传染性逆转录病毒的存在。此外，大多数人作为食物链的一部分暴露于禽类逆转录病毒，从健康家禽工人收集的血清已被证明具有抗禽类逆转录病毒的血清学活性。使用替代细胞系，如人类细胞，可以完全避免引入这些禽逆转录病毒成分，但鸡细胞衍生疫苗的长期安全记录允许继续使用含有低水平逆转录酶活性的产品。2.4 羊痒病疫苗污染传染性海绵状脑病(TSE)是一种由一种叫做朊病毒的传染性蛋白质引起的疾病。绵羊暴露于朊病毒可导致痒病，一种神经退行性疾病。有两例欧洲兽医疫苗导致痒病在接种过疫苗的绵羊中传播的记录。1946年Gordon报道了一例痒病感染病例。1934年，一种由福尔马林灭活的受感染绵羊组织组成的娄平病疫苗被开发出来，以保护绵羊免受蜱传黄病毒的侵害。接种疫苗两年后，英国的羊群开始出现痒病的症状，戈登接着得出结论，疫苗制备中的几只羊处于痒病的早期阶段，但没有出现症状。当时，痒病的致病因子尚不清楚，戈登能够使用受污染的疫苗确定痒病的感染因子在受感染羊的大脑和脊柱内。1997年，意大利也遇到了类似的情况，当时人们了解了痒病的致病因子。人们开发了一种疫苗，以保护绵羊免受传染性无乳症的侵害。无乳症是绵羊和山羊的一种疾病，由无乳支原体感染引起，影响产奶量。该疫苗是通过实验性地用无乳分枝杆菌感染绵羊，采集受感染的组织，然后用福尔马林灭活细菌来生产的。对于两种被痒病污染的疫苗，污染只能通过观察接种疫苗的动物的疾病来检测，之后不再接种疫苗。一项回顾性队列研究发现，在意大利接种受污染疫苗的省份，由于存在该病的继发性传播，瘙痒病发病率增加。这些痒病污染的实例突出了在药品中检测朊病毒污染的重要性。2.5 Hib疫苗中蜡样芽孢杆菌的检测2007年，由于在生产设备中检测到蜡样芽孢杆菌，超过100万剂b型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗被召回。这次召回导致Hib疫苗短缺，导致疫苗接种计划建议发生改变。Hib疫苗由默克公司生产，分别为PedvaxHIB和Comvax。PedvaxHIB是一种Hib荚膜多糖与脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白相连，以增加抗原性。Comvax是PedvaxHIB的一种配方，也包括乙肝抗原。PedvaxHIB是由Hib和脑膜炎奈瑟菌在发酵培养基中培养，然后纯化所需抗原生产的。在生产设备中检测到土壤细菌蜡样芽孢杆菌，但在最终疫苗产品中未检测到任何污染。此外，Huang等人的研究追踪了疫苗不良事件的报告，并没有发现默克公司召回批次与未召回批次相比，不良事件有任何增加。Hib疫苗批次的潜在蜡样芽孢杆菌污染不是源于动物制品的污染，而是由于设备缺乏消毒。这是一个例子，说明如何有许多途径，外源因子可以进入药品中。2.6 轮状病毒疫苗的PCV1污染2004年和2005年，两种轮状病毒疫苗——葛兰素史克(GSK)生产的Rotarix和默克(Merck)生产的RotaTeq被批准使用。疫苗是减毒活疫苗，病毒在AGMK和Vero细胞中连续传代，然后冻干。这两种疫苗都是给儿童口服的。Victoria等人在2010年的一项研究使用下一代测序(NGS)研究了包括Rotarix在内的多种疫苗的组成。Rotarix的测序没有在疫苗中发现任何少数病毒变体，但是有序列读数归因于猪圆环病毒-1 (PCV1)。聚合酶链反应(PCR)和芯片技术证实了轮状病毒体内存在PCV1。在这项研究发表后，GSK对用于制造疫苗的材料进行了进一步的调查。在生产过程的每个阶段都检测到PCV1 DNA，包括用于培养轮状病毒的初始Vero细胞库，这些细胞库是造成污染的原因。除了检测到PCV1 DNA外，在轮状病毒收获液和纯化原液中均检测到传染性PCV1，但在最终灌装的西林瓶中未检测到。疫苗的最终污染被认为是从Vero细胞库携带的，细胞库被来源于猪的胰蛋白酶污染，因为1983年最初生产细胞库时使用的胰蛋白酶没有进行常规辐照。基于GSK疫苗被污染的调查结果，默克公司进一步调查了他们的RotaTeq库存。默克公司在RotaTeq的原液和成品疫苗中发现了PCV1和PCV2 DNA的存在。仅有DNA片段被鉴定出来;在原液和成品中均未检出感染性病毒。默克公司得出结论，PCV DNA来自用于培养疫苗Vero细胞的辐照胰蛋白酶。在疫苗中检测到PCV1时，全世界已接种了超过1亿剂Rotarix或RotaTeq，导致严重的安全问题。PCV1是1974年首次报道的猪常见病毒，与任何兽医学疾病无关。PCV2于1998年首次分离出来，与猪的消瘦综合征有关。已知PCV1和PCV2都是细胞培养的常见污染物，但PCV1和PCV2都不会在人类中引起任何疾病。尽管如此，在发现PCV污染后，FDA暂时将rottarix和RotaTeq这两种唯一可用的轮状病毒疫苗从市场上撤下了大约两个月。FDA允许恢复疫苗的使用，并更新了标签，包括PCV1的存在，因为这两种疫苗都有很强的安全记录，没有证据表明PCV会导致人类疾病，而且疫苗的益处是巨大的。对接种疫苗的儿童的研究发现，接种疫苗后，PCV在一些儿童的粪便中排出，但接种疫苗并不导致PCV1的血清转化。Rotarix和RotaTeq仍然与PCV1列为成分一起使用。3.易受外来物质污染的产品类型所有制品都有来自环境、实验室或操作人员污染的外来物质污染的风险。随着这类污染的普遍风险，一些制造方法具有更高的风险，导致某些类型的产品更容易受到污染。在细胞培养中生产的产品，需要以动物为基础的试剂生产的产品，以及需要直接使用动物的产品，受到外源因子污染的风险最高。虽然许多制品是使用这些方法生产的，但疫苗、重组蛋白和单克隆抗体是广泛使用的产品，通常也是使用这些方法生产。在不使用细胞培养的情况下生产的疫苗、重组蛋白和单克隆抗体受到外来病原体污染的风险较低。重组蛋白可以通过发酵酵母产生，由于酵母不能支持病原体，因此被认为被外源因子污染的风险相当低。目前有研究使用发酵技术生产复杂的人类蛋白质，如单克隆抗体，在未来的许多实施确实降低了污染的风险。疫苗的生产方式多种多样，具有不同的病原体污染风险。有些疫苗是通过培养细菌生产的，这种方法和酵母发酵一样，具有较低的外来病毒污染风险。一般来说，减毒活疫苗比灭活疫苗更容易受到外来病原体污染，因为灭活的步骤也可以使外来病原体不具有传染性。然而，有些病毒和朊病毒对福尔马林灭活具有抗性，因此灭活产品仍然存在污染风险。活细胞产品，如嵌合抗原受体T细胞，由于最终材料的稳定性要求，也面临高风险的外源因子污染。由于细胞需要活给药，因此很难去除可能存在的任何外源因子，因为大多数纯化方法都会损害所需的细胞。活细胞产品的另一个复杂之处在于它们必须从宿主处收集，这导致了一个额外的潜在的外源性病原体污染源。4.外源因子污染的来源4.1 使用内源性外源因子的细胞系所有细胞系都是在某一时刻从宿主身上采集的，一些用于培养这些细胞系的细胞在采集时含有内源性的外源因子。在药物产品开发中使用这些细胞系可能导致外源因子污染最终产品。以这种方式引入的外源因子往往是收集细胞的物种的原生因子。例如，RMK细胞天然含有SV-40，多种用于重组蛋白表达的昆虫细胞系天然含有sf -横纹肌病毒，一种用于产生虫媒病毒的蚊子细胞系被蚊子细小病毒污染。原代细胞，如用于生产含有EAV-0和ALV的MMR疫苗的鸡胚成纤维细胞，也是一个潜在的外源因子污染来源。4.2 动物产品在细胞培养中的应用细胞培养需要复杂的材料，如生长因子、必需氨基酸和酶，由于成本或生产困难，这些材料都是从动物身上采集的。细胞培养中最常用的动物产品是从胎牛身上采集的胎牛血清和从猪胰腺中采集的胰蛋白酶。胎牛血清与牛病毒污染有关，如牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、有蹄类四细小病毒2型和牛肝病毒。胎牛血清收集方法不当也会导致细菌污染和噬菌体污染。已发现胰蛋白酶含有多种不同的猪源病毒，如PCV1和经典猪瘟病毒。动物产品收集技术的改变，以及使用前的过滤和辐照等处理，降低了外来物质污染的风险。4.3 利用动物直接生产一种产品有些产品不使用体外细胞培养，而是直接依靠动物或动物产品来生产药品。然后，这些动物的内源性传染因子会污染最终的药品。一个常见的例子是使用鸡蛋来培养用于疫苗的病毒。在鸡蛋中培养的产品中检测到禽类逆转录病毒。动物的另一个用途是通过实验性感染培养微生物。这可能导致动物感染的任何其他微生物以及可能存在于动物体内的任何朊病毒的传播。20世纪50年代至80年代的天花疫苗生产方法涉及收集牛痘病毒感染的动物皮肤，这使得产品具有较高的外源因子污染风险。4.4 环境污染实验室环境也可能是一个外来因素的来源。如果没有消毒，大多数表面上都有细菌。此外，实验室人员也可能是外源因子的来源，因为源自人体的微生物通常可以在细胞培养中复制。环境污染的一个常见例子是支原体，这是一种细菌污染物，通常来自实验室人员。在生产的各个阶段都需要适当的无菌技术，以防止环境的污染因子进入药品。5.常见的污染物有各种各样的因子可以作为外源因子。下面将讨论不同类型的污染剂，以及它们对药品的潜在影响。表1列出了选定的外源因子。5.1 细菌污染由于细胞培养基中含有细菌生长所必需的营养物质，因此细胞培养物经常会被细菌污染。细菌在环境中和实验室工作人员身上都很常见，如果不保持无菌条件，来自环境的细菌会污染细胞培养物或用于细胞培养的制品。有许多不同类型的细菌可以引起污染。通常，被污染的细菌在显微镜下可以看到，在宏观上可以看到浑浊的上清，或者通过培养基pH指示剂的变化可以检测到。支原体是细胞培养中非常常见的细菌污染物，对数千个细胞系的研究发现，约25%的细胞系被支原体污染。支原体属革兰氏阴性菌，基因组长度和尺寸都很小，大多数支原体基因组长度小于1mb，呈球形，长1 - 2 μm，宽0.1-0.2 μm。支原体的小尺寸允许它们通过0.2 μm的过滤器。通常支原体污染不能通过显微镜检测，因为细菌太小而无法观察，因此需要分子技术。市面上有许多用于检测细胞培养物中支原体的PCR检测方法。药品的细菌污染会对服用者造成有害影响。致病菌污染药品可直接导致感染。即使细菌被灭活方法杀死，细菌产生的毒素仍然可以保有毒性，导致不良反应。5.2 真核生物的污染物像细菌污染物一样，环境中也有真核生物可以在细胞培养条件下复制。由于细胞培养条件是为真核细胞系的复制而设计的，因此外源性的真核因子通常也可以复制。此外，虽然许多类型的细菌污染可以通过在培养基中添加抗生素来预防，但大多数杀死真核污染物的化合物也会杀死培养物中的目标细胞，尽管有可用的抗真菌化合物可用于细胞培养条件。最常见的真核污染物是真菌，但寄生虫如单细胞原生动物也可以污染细胞培养物。像细菌一样，真核生物的污染通常来自环境，由于真核生物的体积很大，因此通常可以通过显微镜检查检测到污染。真核生物污染药品可导致严重疾病。例如，大量被真菌污染的醋酸甲基强的松龙导致服用该药的患者出现真菌性脑膜炎。5.3 病毒污染物与可以在环境中发现的细菌和真核污染物不同，病毒污染物必须来自宿主。虽然实验室工作人员可能是污染病毒的源头，但大多数病毒是通过其他污染产品进入细胞培养的;从动物中分离出来的产品往往是病毒污染的来源。此外，有许多带有内源性病毒的细胞系可能导致污染。通常，这些内源性病毒在细胞系的永生化中起作用，并可整合到细胞基因组中。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和小鼠杂交瘤已被证明含有内源性逆转录病毒和病毒样核酸。由于污染病毒通常来自细胞培养中使用的动物产品，许多常见的外源性病毒来自生物制造中常用的动物物种。牛病毒很常见，因为使用血清;猪病毒很常见，因为使用胰蛋白酶;禽病毒很常见，因为在生物制造技术中使用鸡蛋。人类和非人类灵长类动物的病毒也是常见的污染物，通常起源于用于生产的细胞系的初始收集。人们还担心源自人类的病毒会污染医药产品。人类相关病毒可以通过使用人类来源的产品或通过受感染的实验室工作人员的污染进入细胞培养。由于其独特的生物学特性，在细胞培养中需要特别考虑逆转录病毒和逆转录病毒元件。逆转录病毒可以作为含有RNA的包膜病毒粒子存在，也可以作为整合到宿主细胞基因组中的DNA的原病毒存在。逆转录病毒也有致病的风险，因为它整合在宿主基因组的重要基因内，即使是具有整合酶的非复制性逆转录病毒制剂也有潜在的危险，尽管没有报道发生这种情况的实例。人们经常在环境和饮食中接触病毒，大多数病毒对人类没有影响;只有一小部分已知病毒对人类具有传染性。有证据表明，人们通过食物链或通过农业工作接触到多种动物病毒而没有任何疾病。尽管如此，大多数病毒在人类中的感染潜力尚不清楚，因此在评估药物产品的病毒污染时非常谨慎。5.4 朊病毒污染物朊病毒是一种完全由蛋白质组成的传染性非生物媒介。大多数哺乳动物产生一种叫做朊病毒蛋白(PrP)的蛋白质，它可以折叠成两种结构变体:PrPC和PrPSc。PrPC存在于健康个体中，而PrPSc存在于朊病毒疾病患者中。当PrPC暴露于蛋白质的PrPSc异构体时，PrPC可以转变为高度稳定的PrPSc异构体。当PrPSc在大脑内积累时，被称为TSE的神经系统疾病就会进展。PrPSc对热、清洁剂、福尔马林和高压灭菌具有很强的抗性，因此很难使感染蛋白失活。朊病毒存在于受感染动物的神经组织中，因此，无论何时将动物组织用于制药产品，都存在被污染的风险。暴露于朊病毒的人有患库鲁病、克雅氏病(CJD)、变异型CJD、致命性家族性失眠症和Gerstmann-Sträussler-Scheinker等TSE的风险，这些疾病每年在美国导致多达300人死亡。6.外源因子的检测方法基于能污染产品的外源因子的范围，有许多种类的实验通常都能用于外源因子的检测。下面描述了这些检测方法，以及它们通常使用的情况。表2列出了这些试验的摘要。表2 一种用于检测外源因子的测定方法的选择6.1 目视及显微检查虽然它们很小，但用肉眼或显微镜都可以观察到微生物的生长。细胞培养物被细菌或真菌污染可导致培养瓶内可见的生长，而浑浊的培养基通常是污染的迹象。在细胞培养过程中经常使用目视检查，因此它是一种廉价而快速的检测外源因子的方法。并非所有的外源因子都能在显微镜下看到;如果没有定向染色或使用电子显微镜，病毒甚至某些细菌都无法直观地观察到。尽管无法检测到许多类型的外源因子，但显微筛选仍然是检测外源因子的有用工具。6.2 培养细胞病变效应的检测虽然病毒太小，无法直接目测到，但可以观察到病毒复制对细胞的影响。通常，感染病毒的细胞会表现出某种形式的细胞病变效应(CPE)，这是由病毒引起的细胞形态变化。对于典型的体外CPE试验，将各种细胞系置于烧瓶中，然后用待测样品对每个细胞系进行挑战。在这一挑战之后，观察细胞，并可能进行继代培养，在大约一个月的时间内观察任何CPE的出现。CPE的常见例子包括合胞体的形成(细胞融合导致单个细胞具有多个细胞核)、细胞形状的改变、包涵体的发育、细胞变圆、细胞结块以及完全或次完全破坏。筛选CPE以检测外来病毒的优点是，该程序相对简单，费用低廉，并且不针对特定病毒，因为各种各样的病毒都可能导致某种形式的CPE。使用CPE试验的主要缺点是，一些外源性病毒只在可能不用于试验的特定细胞系中引起CPE，而其他病毒在细胞内复制时不会引起任何CPE。Berting等人报道了多种重要的外源病毒，包括牛病毒性腹泻病毒、柯萨奇病毒B3、鼠肝炎病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒和副流感病毒3，在CHO细胞中不会引起CPE。虽然大多数这些病毒不能在CHO细胞内复制，但副流感病毒3能够在CHO细胞内适度复制，而不产生任何CPE。然而，如果用小鼠星形胶质细胞代替CHO细胞，柯萨奇B3病毒能够复制并引起CPE，如细胞变圆、细胞质起泡和单层脱离，这表明需要用合适的细胞系进行测试。在筛选减毒活疫苗时，很难区分由疫苗的病毒成分引起的CPE或由污染剂引起的CPE，因此也有必要考虑正在测试的产品。此外，CPE试验只能筛选病毒的存在，而不能筛选其他类别的外来因子。与CPE检测类似的一种体外检测方法是血凝试验。许多病毒具有附着在红细胞表面的蛋白质，带有这些蛋白质的病毒悬浮液具有使红细胞聚集或凝集的能力。在血凝试验中，细胞被病毒感染，然后将红细胞加入悬浮液中。如果添加的红细胞凝集，则认为培养物血凝阳性，因此认为孔内有病毒。该试验能够在没有CPE的情况下检测病毒复制，但它需要在易感细胞系中培养一种外源性病毒。此外，并不是所有的病毒都有血凝作用，所以这种检测方法不能检测到所有类型的外源病毒。6.3 动物注射由于已知外源因子只能在高度特异性的体外条件下培养，因此体内动物试验已被用于筛选外源因子的污染。体内试验的主要优点是，试验是完全非靶向的，任何分类的外源因子都应该能够在动物体内引起疾病;动物试验是为数不多的能够检测朊病毒污染的方法之一。动物试验的主要缺点包括高成本和观察动物所需的大量时间。并非所有的外源因子都能在实验动物中引起疾病。许多危险的人类病原体，如艾滋病毒，由于其发病机制的高度特异性，无法在动物中引起疾病。此外，减少和替代动物的使用是科学的总体目标，因此使用数十只动物进行筛选在伦理上是不理想的。美国食品药品监督管理局(FDA)已经提出了使用动物进行外源性病毒检测的建议。建议使用成年小鼠、乳鼠、豚鼠、兔子和有胚胎的鸡蛋。每一种动物都被推荐用于检测不同类型的外源因子。对于成年小鼠，至少20只小鼠应腹腔和脑内接种该产品，并监测至少21天。如果低于80%的小鼠保持健康，则该产品不能使用。乳鼠的使用与成年小鼠相似，不同之处在于，乳鼠应观察14天，并将存活小鼠的组织传代到另外5只乳鼠中进行观察。对胚胎卵，接种10个卵，孵育3天。孵育后，应收集尿囊液，然后将其注射到一组新的卵中，再孵育3天。胚胎应在孵化后进行检查，卵的内容物应进行血凝试验，其中80%的卵应表现正常，不含血凝剂。还应完成对胚胎卵的额外筛选，其中另外10个卵接种该产品，然后孵育9天。胚胎在孵化后进行检查，产品通过测试，至少80%的胚胎正常。一般来说，每只在试验中死亡的动物都必须通过二次手段检测其组织中是否存在外源因子。Gombold等人对体内检测外源病毒的方法与体外方法进行了比较。用连续稀释的病毒培养液接种成年小鼠、乳鼠和有胚胎的鸡蛋，并确定体内技术能够检测到病毒的稀释度。在使用体内方法测试的11种外源病毒中，仅检测到6种。有趣的是，使用多种体外技术，所有11种外源病毒都被检测到，通常浓度远低于体内检测。这项研究对典型体内检测方法的敏感性提出了质疑，并强调了对潜在的替代筛选方法的需求。另一种可以使用的体内试验是抗体产生试验。在这个测试中，特定的无病原体动物接种被测试的产品。接种后，从这些动物身上收集血清，然后检测是否存在针对选定的外来因子的抗体。这种方法不需要动物受到外源因子的影响，因为抗体反应可以在不复制外源因子的情况下发生，但是由于抗体筛选是以有针对性的方式进行的，因此可以检测到的外源因子的数量是有限的。6.4 逆转录酶活性检测逆转录病毒的决定性特征是它能够将其RNA基因组逆转录为DNA，以便整合到宿主基因组中。负责这个过程的蛋白质叫做逆转录酶。通过检测RNA到DNA的转化，已经开发出检测逆转录酶存在的检测方法。如果检测到逆转录酶活性，则假定样品中存在逆转录病毒或逆转录病毒样元素。这些检测方法非常敏感，可以检测到低水平的逆转录病毒污染，但它们无法检测到其他形式的外源性病原体污染。一种检测逆转录酶存在的检测方法是产物增强逆转录酶(PERT)检测。在PERT分析中，将噬菌体RNA和互补引物添加到产物中并孵育。样品中的任何逆转录酶都会将噬菌体RNA转录成互补DNA (cDNA)。在孵育之后，进行PCR以充实任何存在的cDNA。添加到产物中的初始RNA将不会在此PCR步骤中被扩增。PCR扩增后，用Southern blot检测噬菌体cDNA的存在。随着方法的发展，荧光PERT (f-PERT)被开发出来，它使用qPCR检测cDNA以提高灵敏度。6.5 核酸靶向检测PCR是检测外源因子存在的一种高度敏感的方法。大多数外源因子具有可检测的核酸成分，因此PCR可用于检测病毒、细菌以及真核生物。要用PCR检测外源因子，首先必须从被测材料中提取核酸。提取后，加入目标引物和酶，然后在热循环器中孵育样品。所使用的引物的设计可以允许检测生物体的特定菌株，或者用于检测在生物体家族中保守的核酸序列。逆转录酶可以用来产生cDNA的PCR反应，允许PCR实验检测DNA或RNA。DNA通常通过扩增过程中探针水解产生的荧光来检测，这使得无需凝胶检测即可进行有效的DNA检测。从理论上讲，PCR方法能够检测到目标核酸的单个拷贝。在实践中，虽然不完美，但PCR能够以令人难以置信的高灵敏度检测外源因子核酸。Bae等建立了小鼠微小病毒、牛细小病毒和牛疱疹病毒的PCR检测方法，灵敏度分别为6.49 × 101、7.23 × 102和5.8 × 101 TCID50/mL，证明了PCR检测方法的高灵敏度。同样，Oh等人建立了逆转录酶PCR检测呼肠孤病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛副流感病毒的方法，报道的灵敏度分别为7.76 × 102、7.44 × 101和6.55 × 101 TCID10/mL。PCR通常用于检测细胞培养物的支原体污染，因为基于培养的方法可能需要长达两周的时间才能完成，而且由于细菌的大小，很难用显微镜方法检测。有许多支原体菌株可以污染细胞培养物，因此PCR测定的设计必须考虑到不同菌株之间序列的潜在差异。对于支原体的检测，引物可以瞄准基因组的保守区域，或者使用多个引物集来确保检测的敏感性。这些PCR方法已被证明是高度敏感的，Sung等人报道，他们开发的PCR方法能够在细胞培养基中检测到10 CFU/mL支原体。该方法具有灵敏度高、成本低、可在一天内完成的特点，是目前检测外源因子的首选方法之一。最近，多路复用技术的进步使得在一次PCR反应中可以检测到多种外源病毒，从而提高了样品筛选的速度。6.6 下一代测序外源因子核酸可以通过下一代测序(NGS)技术和PCR技术检测。由于NGS技术成本低、运行时间快、能够检测多种外源因子，因此目前正被探索作为检测外源因子的主要方法。由于NGS不需要靶向引物，它可以检测以前未识别的病毒，就像在环境筛选研究中经常做的那样，而且单一的NGS测定可以用来代替大量的PCR测定。NGS是指在传统Sanger测序方法之外发展起来的核酸测序方法，如杂交测序、合成测序、纳米孔测序、长读区测序等。这些方法在读取长度、读取次数和运行时间方面不断得到改进。NGS方法通常包括核酸的制备，核酸的测序，然后进行生物信息学分析。在文库制备方面，已经测试了许多选择，包括靶向DNA或RNA，富集外源因子核酸或耗尽宿主核酸的步骤。如果有特定的序列需要测序，则可以使用预定的引物进行靶向测序，或者对所有存在的核酸进行非靶向测序。有许多测序平台可以使用，包括Illumina, Oxford Nanopore Technologies, PacBio和Ion Torrent。生物信息学分析可以根据测序是否有针对性，或者你是否有针对性来修改。此外，还有一些序列数据库正在开发中，用于通过生物信息学分析检测外源病毒，如参考病毒数据库。Victoria等人完成了NGS在检测不定因子方面最值得注意的应用之一，当实验的计划目标是评估疫苗的序列时，NGS技术能够检测到外源病毒的存在。Victoria等人也对多种减毒活疫苗采用了类似的测序技术，并发现了禽白血病病毒和猿类逆转录病毒的污染。在这篇论文发表之后，许多其他研究小组已经证明了NGS技术检测外源病毒的能力。对于采用NGS平台来检测非确定因子，有一些需要克服的障碍。在大多数产品中，任何污染物都可能以极低的水平存在，特别是在含有细胞产物的产品中，并且可能需要排除宿主读取或富集污染物的方法来确保检测的灵敏度。另一个需要克服的挑战是一些测序技术所需的时间。虽然测序可以比传统的体内方法快得多，但一些NGS方法可能需要数天时间进行测序和分析，这限制了操作员的实用性。6.7 在检测外源因子时出现假阳性由于用于检测外源因子的检测方法的高灵敏度，假阳性是进行检测的小组主要关注的问题。由于额外的测试或增加的监管障碍，假阳性可能导致成本增加，因此希望确保低假阳性率。Nims等人强调，测试本身可能受到测试设备、测试试剂、测试操作人员或环境的污染。在许多研究领域中，有各种各样的实验室检测试剂污染导致假阳性的报道。与受污染的动物产品可能导致药品污染类似，使用受污染的牛血清可能导致BVDV血清学或分子检测的假阳性。如上所述，在细胞培养中生产的产品受到外源因子污染的风险较高，并且这种趋势持续到实验室试剂的生产。测试程序中使用的单克隆抗体的生产通常没有被测试的药品严格，因此可能出现假阳性。在没有污染的情况下，外源性试剂测试也可能产生假阳性。Talarico等人描述了一个假阳性检测事件，其中流感疫苗中包含的蛋白质能够引起哺乳动物红细胞的凝血。这一发现花了5个多月的时间才得到充分证实，导致疫苗生产的延误，而这本来可以通过更好地了解检测程序来避免。在检测外源因子时，有必要使用强有力的控制措施来避免检测的假阳性。7.防止外源因子污染的方法虽然本文描述了如何在药品中检测到外源因子，但最好是防止这些外源因子污染产品。这可以通过从产品中去除潜在的污染物或通过使用低风险的外源因子污染的制造方法来实现。7.1 灭活污染物传染性生物体易受各种灭活方法的影响，如热、辐射或化学处理。这些灭活方法通常用于原材料，以确保其安全，但偶尔也会用于产品本身。对原材料进行灭活的一些常见例子包括对牛胎牛血清和胰蛋白酶进行γ辐照，这是由生产材料的制造商进行的，并已被证明可以灭活污染病毒。除用于原材料外，辐照和热处理等灭活方法已被证明可有效地灭活生产过程中的外源因子。用高温短时间处理产品可以在不降解培养基结构的情况下使外源因子失活。同样，研究表明，紫外线辐射可以有效地使外源性因子失活，而培养基在培养CHO细胞时不会失去其有效性。另一种灭活外源性病原体的方法是将最终产品作为灭活产品，特别是福尔马林灭活疫苗交付。疫苗生产的一种常见做法是培养和纯化病毒，然后用福尔马林灭活病毒，作为疫苗使用。这种福尔马林灭活方法还可以灭活疫苗中可能存在的任何污染的外源因子。以前，当发现SV-40污染了一种灭活的脊髓灰质炎疫苗时，有证据表明甲醛也灭活了SV-40。7.2 采用cGMP生产程序FDA要求药品按照现行良好生产规范(cGMP)生产，以确保使用安全的生产方法。cGMP涵盖了人员、设施、设备、控制和记录等广泛的主题，并要求在产品生产的每个步骤都遵循安全的标准操作程序。不符合cGMP程序会导致产品被认为是掺假的。cGMP反映了安全生产的最低标准，是广泛的指导方针，每个工厂都可以根据需要进行调整。一般来说，使用cGMP保护产品在生产过程中不受外源因子的污染，并确保在污染发生时适当的检测方案到位。7.3 避免使用污染的试剂以前使用试剂的经验已经确定了避免污染的方法。在用于物料生产之前，可以对动物进行筛选，以确定是否存在针对常见外源因子的抗体，或者在使用前对物料进行分子方法筛选。可检测牛血清中是否存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体，该抗体的存在表明牛曾暴露于BVDV。物料也可以来自某些病毒没有自然传播的国家或地区。传统上，从新西兰和澳大利亚分离出来的FBS被认为比来自世界其他地区的FBS含有更少的外源因子。然而，最近的研究未能确定特定地理来源的FBS的优势，这表明这种做法不足以防止污染。7.4 避免使用动物/动物产品由于许多意外病原体污染的情况是通过使用受污染的动物产品发生的，因此避免使用动物产品可以降低意外病原体暴露的风险。这可以通过对制造过程进行轻微改变来实现:如果使用非贴壁细胞系，则不需要猪源性胰蛋白酶传代细胞。通过修改培养基也可以避免在培养中使用FBS，尽管所需的修改取决于所培养的细胞系。这种培养基被称为无动物源性培养基(AOF)、无血清培养基(SFM)或无异种培养基。目前受益于AOF或SFM的主要领域之一是间充质干细胞的培养，FDA已批准在涉及间充质干细胞培养的临床试验中使用SFM。使用无血清细胞培养技术是一种新兴的方法，随着成本的降低和方法的改进，它可能会被广泛采用。或者，如果产品可以设计成在非哺乳动物细胞培养中生产，那么外源因子污染的风险就会降低。与哺乳动物细胞培养相比，酵母或细菌的发酵受到外源因子污染的风险较小，因为酵母的病原体通常不是人类的病原体。通过对分泌的胰岛素原分子进行修饰，可以利用酿酒酵母发酵产生胰岛素。这种修改允许在发酵培养中生产重组人胰岛素，而不是从屠宰动物的胰腺中分离胰岛素。最近，在单克隆抗体生产领域也取得了类似的进展，允许通过毕赤酵母培养生产单克隆抗体。目前的努力集中在确保酵母产生的抗体的适当糖基化，以允许充分的功能，但进步可能导致单克隆抗体治疗生产不需要哺乳动物细胞培养。8.结语随着新疗法的发展，为了保证药品的安全性，需要有效地检测出外源因子。没有一种现有的方法能够持续地检测大范围的潜在污染外源因子。需要安全的生产过程和有效的样品筛选，以确保在人们面临不良健康事件风险之前预防或发现外来物质污染。原文来源：A history of adventitious agent contamination and the current methods to detect and remove them from pharmaceutical products识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。