TetraVax-DV-TV003(Instituto Butantan)

蚊媒传播是自然界传染病的一种十分重要且常见的传播方式。科学家们为了减轻这类传播造成的疾病负担，不惜在局部地区尝试各种方法对蚊子进行绝育，但目前仍旧处于试验阶段，部分地区的试验也取得阶段性结果。比如2020年，在印度尼西亚进行的一项为期三年的试验结果表明，在登革热流行的 Yogyakarta市，在释放了受沃尔巴克氏菌感染的埃及伊蚊地区，与没有释放受感染蚊子的地区相比，登革热病例数量显著下降[1]。对于蚊子传播的疾病，大家听到更多的可能是疟疾——一种主要在非洲的确流行的寄生虫病，而疟疾目前的确仍旧是一项全球重要的疾病负担，全球超过2亿例病例，且还未有有效的预防性疫苗。实际上全球由蚊子造成的疾病负担还有很多，比如黄热病毒（YFV）、乙脑病毒（JEV）、西尼罗河病毒（WNV）、寨卡病毒（ZIKV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、登革热病毒（DENV）等等。其中黄热病毒、乙脑病毒已经有成熟的疫苗。如果有去过非洲的朋友，去之前基本上都可能接种过黄热病毒疫苗，我国主要是北生所的黄热减毒活疫苗，皮下注射，毒株为“YF-17D”，一针不到200元，年批签发量约30万支，属于小众但不可或缺的疫苗产品，也属于针对旅行者的疫苗。也正因为小众，黄热病毒疫苗从上世纪30年代研发以来，一直也没有进行过特别重大的迭代替换开发。黄热病毒毒株是由鸡胚扩增培养，赛诺菲巴斯德在尝试用细胞系替换鸡胚，但开发速度也非常缓慢。也正是由于市场需求不多，年生产规模小，导致在部分黄热病毒爆发年份和地区，疫苗不够用。在这些蚊媒传播传染病原中，登革热病毒可能是由蚊子传播造成的最大的疾病威胁了。WHO网页上是这样描述的：登革热病毒有四种血清型，这意味着一个人可能感染四次，是亚洲和拉丁美洲一些国家严重疾病和死亡的主要原因。近几十年来，全球登革热发病率急剧上升。世界上大约一半人口有患病风险。每年估计有1亿至4亿人感染。从全球登革热病毒的流行趋势来看，与蚊子的适宜生存区域也是高度重合，主要集中在赤道南北10℃温差以内区域（下图）。其中东南亚和南亚地区约占全球疾病负担的70%。登革热和重症登革热从全球登革热病毒的流行趋势来看，与蚊子的适宜生存区域也是高度重合，主要集中在赤道南北10℃温差以内区域（下图）。其中东南亚和南亚地区约占全球疾病负担的70%。Maria G Guzman and Eva Harris. Lancet, 2015.登革热病毒四种血清型（DENV-1/2/3/4）的流行在各个地区也有所差别，但总体上，DENV-1、DENV-2在东南亚、太平洋地区主要流行、DENV-2、DENV-3在南亚和中南美主要流行（下图）。https://gph.niid.go.jp/genepid-j/dgv从上面的流行区域分析可以明显看出，非洲似乎登革热病毒比较少。WHY? 非洲地区的蚊子不在少数，种类也特别匹配登革热病毒，比如大名鼎鼎的埃及伊蚊，就起源于非洲.但非洲的蚊子似乎主要造成全球疟疾负担，对于登革热病毒的传播和中南美、南亚、东南亚似乎不在一个量级。有人猜测，难道是非洲人种对于登革热病毒有天然的抵御能力？比如非洲地区极少有重症 登革出血热/登革热休克综合征（DHF/DSS）的报道；一项在古巴的流行病学调查结果显示， 在1981年和1997年古巴登革热流行期间，黑人因登革出血热/登革休克综合征住院的比例低于白人（下图）。G P Kouri, … C Triana, Dengue haemorrhagic fever/dengue shock syndrome: lessons from the Cuban epidemic, 1981. Bull World Health Organ, 1989.另外，2011年发表的综述论文（下图）也综述了一些别的可能的解释：比如有证据显示，虽然蚊子的品种一样，但非洲地区的蚊子对登革热病毒的敏感度似乎更差一些，不易感染；非洲的确普遍流行的黄热病毒、西尼罗河病毒等，可能感染后会在机体形成对登革热病毒形成交叉保护等。但可能最靠谱的解释是：Dengue is likely underrecognized and underreported in Africa because of low awareness by health care providers, other prevalent febrile illnesses, and lack of diagnostic testing and systematic surveillance.Ananda Amarasinghe, … Harold S Margolis, Dengue virus infection in Africa, Emerg Infect Dis, 2011.简单来说，不是非洲没有登革热病毒，而是其流行性相关数据不足，诊断不足，报道不充分，很多发热疾病很可能都被简单归结于其他非登革热病毒原因，比如部分地区对疟疾的过度诊断等。从目前的少量地区性调查结果推断，非洲主要地区的登革热病毒流行程度可能和中南美地区相当。不过庆幸的是，登革热病毒目前是有上市预防性疫苗的，即赛诺菲巴斯德公司开发的全球唯一一个上市登革热疫苗Dengvaxia®（CYD-TDV），于2015年12月获得许可，现已被20个国家的监管机构批准。登革热疫苗Dengvaxia®（CYD-TDV）2017年11月，公布了在疫苗接种时通过回顾性分析确定血清状况的补充分析结果。分析显示，与未接种疫苗的参试者相比，在第一次接种疫苗时被视为血清阴性的试验参与者感染较严重登革热和因感染登革热而住院的风险较高。因此，疫苗的使用对象是生活在登革热流行地区、年龄在9至45岁之间、以前至少有1次登革热病毒感染记录的人。2015年上市时，这款疫苗的受试者范围可比现在的限制少太多，而后来根据三期临床试验持续的每年跟踪结果所限制的疫苗使用范围，也直接将这款“重磅产品”打入冷宫。菲律宾反赛诺菲登革热疫苗抗议活动下面我们就来看看登革热疫苗Dengvaxia®（CYD-TDV）的疫苗设计和临床三期数据，也借此想告诉大家，疫苗研发远没有想象中那么容易，2020年一年开发出新冠疫苗，it's really lucky for us.CYD-TDV疫苗全称是"Chimeric Yellow fever-Dengue, Tetravalent Dengue Vaccine"，从名称就可以看出，这是一个黄热病毒和登革热病毒嵌合设计的减毒活疫苗，其设计原理如下图所示。简单来说，登革热病毒和黄热病毒的病毒基因组结构类似，其中 prM-E 是主要的抗原蛋白，将四个登革热病毒血清型的 prM-E 抗原基因分别替换黄热病毒疫苗毒株 YF17D 相对应的基因位置，构建四个以黄热病毒基因组骨架为基础，嵌合了登革热病毒 prM-E 抗原蛋白在表面的4个嵌合病毒，再利用成熟的黄热病毒减毒活疫苗制备工艺体系制备出四价登革热病毒减毒活疫苗CYD-TDV。Dengvaxia®（CYD-TDV）疫苗设计2011年，赛诺菲巴斯德分别在亚太地区和拉美地区分别开展了两个极具代表性的关键大规模III期临床试验（下表），其主要临床终点是完成三针免疫后28天内对登革热病毒感染（virologically confirmed dengue，VCD）的保护率[2,3]。揭盲后分析的临床III期结果也还是非常令人鼓舞的，虽然两个临床中心分析后，疫苗针对DENV-2的保护率都偏低，低于50%，但整体保护率还是可以接受的。因此，这款疫苗也毫无悬念地很快获得监管上市批准。但是，对于登革热病毒疫苗研发来说，最大的挑战还在于ADE的存在，即抗体依赖性疾病增强反应。也正是可能因为登革热病毒ADE的现象显著，当初直接开发四价疫苗的原因就希望可以同时诱导相对平衡的针对四种血清型病毒的抗体反应，从而无论后期感染哪个型别，都可以以保护为主而避免增强感染副作用。但从保护率的分布也可以明显看出，疫苗对四种血清型的保护其实是不那么均衡的。对于ADE的作用过程，我觉得这句话可以很好地概括：DENV is believed to primarily infect cells of the DC/macrophage/monocyte lineage via receptor-mediated endocytosis and/or enhanced uptake via antibody–virus complexes attached to Fc-gamma receptors (FcγR).病毒首先通过受体感染单核系细胞，比如DC细胞表面就有病毒受体DC-SIGN，这一步和别的病毒没什么两样；但病毒还能通过结合抗体，而抗体结合单核系细胞表面的抗体Fc端受体进一步被细胞吞噬，从而相当于有直接和间接两种感染方式。其间接感染的途径，原本是机体通过抗体低于外界入侵的一种方式：抗体Fab端结合病毒后，通过另一端Fc结合细胞（如吞噬细胞 ，Phagocyte）表面的Fc受体，激活细胞吞噬抗体-病毒复合物。只不过登革热病毒、寨卡病毒等，可以在吞噬后在胞内释放，并进一步感染这些免疫细胞。而至于登革热病毒为什么能顺利从吞噬过程中释放感染细胞的机制，目前还不算特别清楚。其实有很多别的病毒也或多或少有一些ADE作用，但都不如登革热病毒明显，可能一方面登革热病毒的宿主细胞本身包含了这类具有很多FcR受体的细胞类型，因此一旦在胞内释放后可以迅速增殖；另一方面，登革热病毒或一些黄病毒类，本身有一些机制，可以抑制吞噬后的进一步途径，而这种机制在别的病毒类别中作用并不那么显著，比如激活FcR抑制性受体LILRB1，导致下游ISG通路的抑制，从而有利于病毒的复制[4]。也可能正是由于ADE的存在，在免疫了疫苗的人群体内，就会存在针对登革热病毒的抗体，而这种抗体很可能在后续感染时，说不定就会起到反作用，以至于帮助病毒建立感染。尤其是随着疫苗接种后时间推移，机体内抗体的量越来越低，抗体起到的中和作用就未必能起到决定性的作用。这也很好理解，首先疫苗诱导的针对登革热病毒的总抗体中，不是所有的抗体都具有中和作用，绝大部分抗体是只结合不中和。总抗体和中和抗体的比例由于其检测方法不一致，因此不能很好地定量比较，但总之是一个包含关系。而上述ADE的途径只需要能结合就行，假如中和抗体只占总抗体的1%，在疫苗免疫后初期，由于总抗体量还很多，因此中和抗体的绝对量也很多，此时抗体主要是中和性作用，保护机体免受感染；但后期总抗体量逐渐下降，以至于中和抗体的量也更少，此时ADE的作用可能就更明显。因此，2015年，虽然Dengvaxia®（CYD-TDV）疫苗已经获批上市，但临床试验跟踪也一直需要进行，以便进一步收集更多疫苗相关保护性数据。截至2021年发表的文献，已经持续获得大部分受试者免疫后6年的跟踪数据。临床试验跟踪收集安全性数据设计在2015年发表第三年数据时，实际上已经显示出一定的趋势[5]，以三期临床CYD14跟踪数据为例：从上表可以看出，免疫后三年，9岁以上和以下人群保护率出现了明显的分化，9岁以上人群总体保护率还能保持在50%以上，和免疫后28天相差不大；但9岁以下人群疫苗保护率显著下降，总体有效率低于50%；此外，在所有人群中，通过回溯疫苗接种前受试者是否曾既往感染过登革热病毒，将受试者进一步分组为接种前阴性和阳性的组别，数据也显示，对于疫苗接种前原本是阴性的人群，即既往未感染过登革热病毒的受试者，尤其是9岁以下，保护率已经掉到14.4%，因此疫苗的接种获益消失。在第四年的数据总结中，这种趋势得到进一步验证和拉大（下图）。途中的风险指数指的是疫苗免疫组年年感染发生率/安慰剂组年感染发生率，因此风险指数越小，说明接种疫苗是获益越多的；如果接近1.0，说明疫苗接种无获益，和安慰剂组感染发生率差不多；如果大于1.0，则说明疫苗接种可能带来增强感染的风险。从下图中可以看出，仅有9岁以上接种前既往感染阳性的受试者群体，还能保持相对较低的风险指数。因此，WHO也根据持续获得的跟踪数据，及时对上市的登革热疫苗使用范围进行了建议。J L Arredondo-García, … CYD-TDV Dengue Vaccine Study Group. CMI, 2018.到第六年，趋势就更加显著了（↓）：Rémi Forrat, … Fernando Noriega. Clin Infect Dis. 2021.Rémi Forrat, … Fernando Noriega. Clin Infect Dis. 2021.当然，整个Dengvaxia®（CYD-TDV）疫苗的临床数据中，还能挖掘出更多，对后续疫苗开发更有指导性意义的数据，也正是这些关键临床数据的积累，让我们离成功的疫苗可能才会更近一步。比如，在针对四种血清型登革热病毒的疫苗有效性评估中，DENV-2似乎总是靠后，而DENV-4总是靠前，这说明在后续的疫苗设计中，似乎可以增加DENV-2的抗原含量，或者想办法利用DENV-4的优势去弥补DENV-2可能的劣势。于是，在后续的登革热疫苗研发中，就有了下面两种"升级版"疫苗设计策略：日本制药企业Takeda公司开发的"TAK-003"：TAK-003美国NIAID研究所、巴西布坦坦研究所和台湾高端疫苗公司联合开发的"TV003/TV005"：TV003/TV005目前，TAK-003疫苗在2016年开展了其大规模临床III期研究（NCT02747927），试验在亚洲和拉丁美洲多个国家和地区总共招募了20,099名受试者，4-16岁，按2:1分组比例分别接种疫苗和安慰剂。和此前赛诺菲巴斯德开发的疫苗接种有所不同，TAK-003通过皮下免疫总共只免疫2次，间隔3个月时间。（在回溯赛诺菲疫苗数据时，发现其两针和三针免疫抗体水平相差不大）。TAK-003的三期临床结果也有很多非常有意思的数据[6]，也同时回答了很多此前困扰的科学问题，我们一一分析：首先，有效率上，在两针接种完成后30天内分析病毒感染，总体有效率结果显示如下表。如果全部合在一起分析，总体有效率可达73.3%，比赛诺菲巴斯德Dengvaxia®（CYD-TDV）疫苗的56.5%-60.8%总体有效率高一些；其次，既往感染阴性和阳性群体的有效率仍旧有所差异，疫苗针对既往感染阳性的受试者有效率依旧高约10个百分点；由于TAK-003疫苗四个型别均使用了 DENV-2 的基因组骨架，因此四个型别中，针对DENV-2的有效率明显高于另外三个型别，高达95.1%；在不同年龄段中，TAK-003疫苗的保护率也同Dengvaxia®（CYD-TDV）疫苗趋势保持一致，即较高年龄段有效率由于较低年龄段；此外，不同试验地区由于流行的病毒血清型比例可能有所差异，但不同地区整体有效率差别并不显著；由于此前有科学家假设，在非洲地区可能由于黄热病毒（YFV）、乙脑病毒（也叫 日本脑炎病毒，JEV）等的流行，可能对登革热病毒造成交叉保护，导致登革热病毒在非洲地区流行度较低。在TAK-003的三期临床实验中，也专门分析了此前已免疫过黄热病毒疫苗或乙脑病毒疫苗的受试者，以观察其他黄病毒属疫苗是否可能对登革热病毒疫苗造成一定的加强免疫效果，从而提升疫苗保护率（下表）。结果显示：黄热病毒疫苗接种与否，与TAK-003有效率无明显相关性；而乙脑病毒疫苗接种过受试者，TAK-003疫苗免疫后有效率显著高于未接种者。这说明乙脑病毒疫苗可能对登革热病毒存在一定的交叉保护性。但JEV主要在亚太地区流行，似乎并不能解释非洲的情况。不过值得注意的是，TAK-003持续跟踪临床试验受试者2年的数据也发表了[7]。其各个组别有效率数据也同样随着时间发生了显著的下降，有的甚至下降了50%不止，尤其是4-5岁低年龄组，总体有效率已经下降至24.5%；更让人担忧的是，在4-5岁年龄组中的既往感染阴性的亚群中，有效率竟然为 “-23.7%”，说明接种TAK-003疫苗非但不能提供保护，反而增加了患病风险；这无疑也为 TAK-003 能否顺利上市增加了很多不确定性。在面对随时间逐渐下降的保护率，以及在不同亚群中可能出现增强疾病风险的担忧，或许监管部门会要求提供更长时间跟踪的临床数据，以支持疫苗在部分人群中的有限使用吧。2021年7月份，欧洲药监局 EMA 将Takeda的TAK-003疫苗上市申请由原本的快速审批变更为常规审批流程，这意味着这款疫苗的上市预期至少要推到明年上半年了。另一款减毒活登革热病毒疫苗TV003/TV005疫苗在2014年和2017年分别开了2个临床II期研究，此外，由巴西布坦坦研究所主导在2015年注册了临床III期试验（NCT02406729）。TV003和TV005以及其他TV序号的区别在于毒株改造/剂量配比不同，TV005相对TV003而言，增加了疫苗组合中 DENV-2 血清型的含量，以借此希望进一步提升针对 DENV-2的有效率。但临床III期是以 TV003 作为剂量配比选择，目前还未有临床试验结果。顺带说一句，布坦坦研究所从NIAID技术转移了TV003后在巴西重新生产和TV003同样的疫苗，取名“Butantan-DV”。Stephen S Whitehead, Development of TV003/TV005, a single dose, highly immunogenic live attenuated dengue vaccine; what makes this vaccine different from the Sanofi-Pasteur CYD™ vaccine? Expert Rev Vaccines, 2016.在登革热病毒疫苗的研发上，还远谈不上成功。基于改造的减毒活疫苗未来或许将会面临和Dengvaxia一样的窘境，而以preM-E、E80、EDDIII等不同抗原亚单位为主，结合更多更强的佐剂为主的重组亚单位疫苗，正在临床前和临床早期进行积极探索, 比如MSD的V180疫苗，即为DEN-80E亚单位联合ISCOMATRIX佐剂: 10 μg DEN1-80E, 10 μg DEN2-80E, 10 μg DEN3-80E, and 20 μg DEN4-80E。未来或许更有基于mRNA技术的登革热疫苗进入临床试验。但登革热病毒疫苗开发的挑战在于，即便是获得临床三期的保护率数据，疫苗离成功依旧还有很大的距离。并且，在面对ADE的挑战下，一款有效的登革热病毒疫苗评价指标，或许不仅仅需要“针对四种血清型平衡的中和抗体反应水平”，还需要其他免疫保护机制。当一款疫苗的开发可能不仅不能带来获益，甚至会带来患病风险时，其难度是空前的。参考资料：Dengue control: three-year Indonesia trial shows promising resultsMaria Rosario Capeding, … the CYD14 Study Group. Lancet, 2014.Luis Villar, … the CYD15 Study Group. NEJM, 2014.Kuan Rong Chan, … Eng Eong Ooi, Leukocyte immunoglobulin-like receptor B1 is critical for antibody-dependent dengue. PNAS, 2014.Sri Rezeki Hadinegoro, … CYD-TDV Dengue Vaccine Working Group. NEJM, 2015.Shibadas Biswal, … TIDES study group. Efficacy of a tetravalent dengue vaccine in healthy children aged 4-16 years: a randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet, 2020.Eduardo López-Medina, … TIDES study group. Efficacy of a dengue vaccine candidate (TAK-003) in healthy children and adolescents two years after vaccination. J Infect Dis, 2020.