Dachaihu Qu Dahuang Decoction

摘要:基于抗体的免疫检查点阻断（ICB）治疗已成为癌症的有效临床应用。将单克隆抗体（mAbs）应用于去活化PD-1-PD-L1途径，可以有效地逆转耗竭的活化胸腺细胞（T细胞）的表型，恢复其抗肿瘤活性。治疗性单克隆抗体与PD-1或PD-L1复合物的高分辨率结构揭示了关键的分子间相互作用，并为这些抗体如何抑制PD-L1-PD-1结合提供了宝贵的基本机制见解。每种抗PD-1 mAb都显示出独特的阻断机制，例如干扰大的PD-1-PD-L1接触界面，通过重叠该位点的一个小区域来产生空间障碍，或结合到一个N-糖基化位点。相比之下，所有治疗性抗PD-L1 mAbs都结合到PD-L1的一个相似区域。在这里，我们总结了针对PD-1或PD-L1的商业mAbs复合物结构表征的进展。特别是，我们关注了这些mAb结构、表位和阻断机制的独特特性。众所周知，最近作为抗肿瘤药物的抗体使用有所增加，PD-1和PD-L1作为来自新技术的抗体靶点已经吸引了大量关注。通过专注于结构表征，本综述旨在帮助未来针对PD-1或PD-L1的新型抗体的开发。 1.引言 免疫检查点阻断（ICB）基础的癌症治疗方法的引入，导致了临床治疗模式的实质性变化。ICB治疗的关键分子机制之一是靶向免疫抑制PD-1-PD-L1途径。PD-1定位于活化免疫T细胞的细胞表面，而其天然配体PD-L1在肿瘤细胞表面高度表达。PD-1和PD-L1之间的识别激活PD-1/PD-L1途径，减少T细胞的活性。许多类型的癌症利用这些相互作用逃避免疫监视。结合PD-1或PD-L1的单克隆抗体（mAbs）已成功用于抑制癌细胞逃避免疫监视的能力。mAbs结合PD-1或PD-L1，阻断它们的识别，从而重新激活肿瘤特异性T细胞杀死癌细胞。截至2022年中期，已有16种针对PD-1-PD-L1途径的mAbs获得美国食品药品监督管理局（FDA）或中国国家药品监督管理局（NMPA）批准作为癌症治疗药物。其中，11种是抗PD-1 mAbs，5种是抗PD-L1抗体。除了envafolimab（KN035），它是一种源自骆驼的单域抗体（即纳米体），所有其他上述治疗性抗体都是全长mAbs。这些抗体的更多细节，包括它们的制造商和它们被批准的适应症，列在表1中。PD-1或PD-L1上的表位的结构表征，这些表位是PD-1-mAb和PD-L1-mAb复合物的基础，为这些抗体阻断PD-1和PD-L1的抑制信号通路的机制提供了宝贵的见解。已经获得了mAbs与PD-1或PD-L1复合物的高分辨率结构，以揭示这些抗体的机制。机制包括mAb的结合平面阻断PD-1的PD-L1结合位点的大区域，或mAb通过重叠该位点的一个小区域产生空间障碍，或结合到N-糖基化位点。相比之下，大多数获批的抗PD-L1 mAbs在非常相似的位点（在前β-片上）结合PD-L1，并且它们都直接与PD-1竞争。上述结构发现将有助于未来合理设计新型且更有效的抗体。在这里，我们回顾了FDA或NMPA批准的抗体与PD-1或PD-L1形成的复合物的结构研究进展。我们专注于PD-1-PD-L1相互作用的性质，稳定每个mAb与PD-1或PD-L1之间相互作用的关键接触点，以及每个mAb阻断PD-1–PD-L1相互作用的机制。2019年发表的早期工作已经回顾了PD-1-PD-L1复合物的结构以及mAbs与PD-1或PD-L1复合物的结构。由于2019年至2021年中期期间又有更多针对PD-1或PD-L1的抗体获得批准，我们收集了所有这些新批准抗体的数据，并提供了更全面的总结，关于mAbs与PD-1或PD-L1的复合物结构。 2.抗PD-1/PD-L1抗体 2.1.PD-1–mAb或PD-L1–mAb复合物结构表征的样品准备 大多数FDA和/或NMPA批准的专门结合PD-1或PD-L1用于癌症治疗的治疗性抗体是全长免疫球蛋白G（IgG）mAbs（表1）。这里包括的每种mAb的亚型（IgG1或IgG4）在表2中总结。已经报告了PD-1或PD-L1与一系列获批抗体的复合物的晶体结构。由于全长抗体通常太灵活而无法结晶，通常使用mAbs的Fab或scFvs与PD-1或PD-L1结合以获得可结晶的复合物。Fab区域由四个折叠域组成：来自轻链和重链的可变域（VL和VH），以及来自轻链和重链的恒定域（CL和CH1）。scFv是VH和VL的融合蛋白，是一个完整且最小的功能单元。通常有三种方法准备mAbs的Fab区域或scFvs。Fab区域是通过全长抗体的酶消化来准备的。例如，木瓜蛋白酶将IgG降解成两个Fab区域和一个Fc区域，然后可以进一步纯化Fab区域进行结构研究。刘和他的同事使用这种方法结晶了toripalimab的Fab区域与PD-1的复合物，从而确定了复合物结构。mAb的VH和VL的重组共表达是Fab准备的另一种方法。编码VH和VL的DNA序列构建在不同的质粒中，然后共转染到表达宿主中，后者随后共表达VH和VL域。这产生了VH和VL域的随机组合，形成VH–VL复合物的库，筛选以确定结构表征的最佳构建。这种方法已用于确定pembrolizumab-Fab、nivolumab-Fab、tislelizumab-Fab和atezolizumab-Fab与PD-1的复合物结构。使用第三种方法，构建scFv重组表达质粒以包含抗体的VL和VH域的基因，这些基因通过寡肽连接形成scFv（图1）。这种方法已用于表达和结晶camrelizumab、avelumab和durvalumab。第二和第三种方法在从原核表达系统（即大肠杆菌表达系统）获得Fab区域或scFv方面具有明显优势，并且已成为获得Fab区域或scFvs进行结构研究最常用的方法。 图1. 单克隆抗体和scFv片段的拓扑结构。图中指示了Fab和scFv域。 3.PD-1与PD-L1复合物的结构 PD-1和PD-L1相互作用并形成稳定的复合物。mAb与PD-1或PD-L1的界面部分或全部与PD-1-PD-L1复合物的界面重叠，导致界面冲突和部分空间障碍，扰乱PD-1对PD-L1的识别。图2显示了已报告结构的示例。 图2. PD-1-PD-L1复合物和PD-1抗体复合物的结构展示。每个结构下方提供了复合物名称和PDB代码。PD-1和PD-L1分别以深蓝色和浅蓝色显示。mAb的Fab或Fv域分别以黄色和绿色显示。 3.1.PD-1–PD-L1的结构 PD-1具有由九个β-链（A、A'、B、C、C'、D、E、F、G）组成的细胞外结构域，折叠成β-三明治Ig拓扑结构。它还有连接β-链的八个环，以及N-末端的一个柔性环。PD-1包含多个N-糖基化位点，这些位点影响某些抗体的结合。与PD-1类似，PD-L1也有九个β-链（A、B、C、C'、C''、D、E、F、G）和连接它们的环，折叠成细胞外Ig V结构域。已使用不同物种的PD-1和PD-L1确定了PD-1–PD-L1复合物的结构。这些结构揭示了PD-1和PD-L1几乎垂直于彼此的方向。PD-1和PD-L1主要通过两个蛋白质前表面的残基之间的疏水相互作用相互结合。分子间的氢键和π-π堆叠是稳定PD-1–PD-L1复合物的其他关键驱动力。mAbs主要在该界面内竞争，以阻断PD-1-PD-L1相互作用。 图3. PD-1-PD-L1的结构。(a) PD-1-PD-L1复合物的结构（PDB:4ZQK）。PD-1和PD-L1分别以深蓝色和浅蓝色显示。进行分子间接触的残基以蓝色（PD-1）和浅灰色（PD-L1）棒状图突出显示。(b) 稳定复合物的相互作用残基的细节。形成分子间氢键和疏水接触的残基以棒状图显示。分子间氢键用虚线连接。 3.2.PD-1–camrelizumab-scFv的结构 由江苏恒瑞医药股份有限公司开发的抗PD-1 camrelizumab已获得NMPA批准，用于治疗经典霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、食管鳞状细胞癌、鼻咽癌和非鳞状非小细胞肺癌。高和同事使用camrelizumab的VL-(甘氨酸)4–丝氨酸-VH构建体确定了PD-1-camrelizumab-scFv复合物的结构。Camrelizumab的所有三个重链互补决定区（HCDRs）和两个轻链（LC）CDRs中的两个与PD-1形成接触。PD-1的三个环构成复合物稳定性至关重要的几个分子间氢键，例如camrelizumab的LCDR3与PD-1的FG环之间，以及camrelizumab的HCDR2与PD-1的BC环之间的氢键。PD-1和camrelizumab-scFv之间的界面部分与PD-1和PD-L1的界面重叠，表明camrelizumab阻止了PD-L1-PD-1相互作用。PD-1包含几个N-糖基化位点，可以被修饰为含有两个NAGs、两个MANs和一个FUC的糖链。PD-1上的N-糖基化修饰对camrelizumab结合有显著影响。发现N58的糖基化增强了camrelizumab-PD-1结合。通过PD-1的N58A单点突变消除N-糖基化位点，大大减少了其与camrelizumab的结合亲和力。PD-1–camrelizumab-scFv的结构展示了N58上的糖链链与camrelizumab的几个残基之间的范德华接触，例如HCDR1的S30和HCDR2的G54和A56。此外，糖链中的FUC和MAN与HCDR1的S31和HCDR2的G53形成氢键。这些糖链与PD-1之间的接触对PD-1–camrelizumab-scFv复合物的稳定性做出了重要贡献。Camrelizumab对其他人源受体显示出一些低亲和力结合，导致临床试验中的副作用，例如反应性毛细血管内皮增殖。Camrelizumab与其他受体之间的低亲和力结合可能与其依赖糖基化的高亲和力结合PD-1有关。除了camrelizumab，最近的一项出版物表明，PD-1的糖基化也影响其与cemiplimab的结合，cemiplimab是一种针对PD-1的人IgG4 mAb，由Sanofi和Regeneron开发。PD-1-cemiplimab-scFv的相互作用表面与PD-1-camrelizumab-scFv非常相似。PD-1中N58的糖基化也促进了PD-1-cemiplimab-scFv的结合。Cemiplimab的HCDR2与PD-1的N58糖基化相互作用。 图4. 展示PD-1的糖基化在与camrelizumab和cemiplimab结合中的重要性。(a) PD-1-camrelizumab-scFv的结构（PDB:7CU5）。PD-1以蓝色显示。camrelizumab以绿色和黄橙色显示。三个HCDRs分别以粉红色、柠檬色和浅洋红色着色。轻链的三个LCDRs分别以碧绿色、深青绿色和浅蓝色显示。(b) 稳定PD-1-camrelizumab-scFv复合物的相互作用残基的细节。形成分子间氢键的残基用虚线连接并标记。(c, d) cemiplimab (c)与不同PD-1突变蛋白的SPR分析和camrelizumab (d)与不同PD-1突变蛋白的SPR分析。图4(c, d)转载自《免疫学前沿》。 3.3.PD-1–toripalimab-Fab的结构 由上海君实生物医药科技股份有限公司开发的toripalimab于2018年获得NMPA批准。Toripalimab目前被指示用于治疗黑色素瘤、鼻咽癌、尿路上皮癌和NSCLC。PD-1–toripalimab-Fab结构表明，toripalimab的VH域有一个异常长的HCDR3（18个氨基酸），这比任何其他已表征的抗PD-1 mAb的HCDR3都长。这个长HCDR3和toripalimab的LCDR1和LCDR3与PD-1的FG环上的残基形成多个氢键，作为关键的结合因素。此外，toripalimab的HCDR1、HCDR2和LCDR1与PD-1的FG之间的范德华相互作用对复合物稳定性至关重要。像camrelizumab一样，PD-1–toripalimab-Fab的相互作用位点部分与PD-1–PD-L1复合物的位点重叠，因此抗体空间阻碍了PD-1-PD-L1结合。与camrelizumab不同，toripalimab与PD-1的结合与糖基化无关。值得注意的是，这种与糖基化无关的toripalimab-PD-1结合使toripalimab不太可能受到PD-1糖基化修饰失调的影响。 图5. PD-1-toripalimab-fab的结构（PDB:6JBT）。(a). PD-1以深蓝色显示。toripalimab-Fab以绿色和黄橙色显示。三个HCDRs分别以粉红色、柠檬色和浅洋红色显示。三个LCDRs分别以碧绿色、深青绿色和浅蓝色显示。(b) PD-1和toripalimab-Fab之间接触的细节。分子间的氢键以棒状显示并标记。 3.4.PD-1–nivolumab-Fab的结构 Nivolumab由Bristol Myers Squibb开发。自2014年首次获得FDA批准以来，目前已上市用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤、晚期肾癌、头颈鳞状细胞癌、晚期经典霍奇金淋巴瘤和膀胱癌。PD-1–nivolumab-Fab的两个结构已存入蛋白质数据库（PDB：5GGR，PDB：5WT9）。该复合物的结合界面包括nivolumab的LCDR2、LCDR1以及全部三个HCDRs，以及PD-1的N-末端、FG和BC环。 PD-1–nivolumab-Fab结合的一个关键因素是nivolumab对PD-1 N-末端残基的识别。PD-1 N-末端的截断取消了其与nivolumab的结合。PD-1的N-末端与nivolumab的HCDR1–2之间的氢键是形成复合物的主要驱动力。其余关键因素是PD-1的FG和BC环与nivolumab之间的相互作用。特别是，FG与HCDR3和LCDR2形成五个氢键，而BC环只与nivolumab的HCDR1有一个分子间氢键。 Nivolumab通过其VL域与PD-L1之间的空间障碍干扰PD-1-PD-L1接触，从而拮抗PD-1-PD-L1结合。然而，nivolumab-PD-1结合区域与PD-L1-PD-1的重叠区域远小于camrelizumab或toripalimab在PD-1上与PD-L1-PD-1的重叠区域。这三种mAb的共同特征是它们都与PD-1的FG环相互作用，这表明FG环在mAb识别中的重要性，正如最近研究所建议的。此外，nivolumab结合PD-1 N-末端的独特能力表明，PD-1的柔性片段也是药物设计的有希望的靶点。 图6. PD-1的N-末端在稳定PD-1-nivolumab-fab复合物中的重要性。(a) nivolumab-Fab的结构（PDB:5WT9）。nivolumab-Fab以黄橙色和绿色显示。PD-1以深蓝色显示。三个HCDRs分别以浅洋红色、柠檬色和粉红色着色。轻链的三个LCDRs分别以碧绿色、深青绿色和浅蓝色显示。(b) PD-1-nivolumab-Fab接触的细节。(c) nivolumab和不同构建的PD-1的SPR结果。 3.5.PD-1–pembrolizumab-Fv的结构 Pembrolizumab于2014年获得FDA批准，是首个达到这一里程碑的抗PD-1 mAb。最初用于治疗晚期黑色素瘤，随后获得NSCLC、转移性头颈鳞状细胞癌、难治性经典霍奇金淋巴瘤和肝细胞癌的批准。已经确定了全长pembrolizumab（PDB：5DK3）和PD-1–pembrolizumab-Fv复合物（PDB：5JXE，PDB：5B8C）的晶体结构。 PD-1–pembrolizumab-Fv的整体拓扑结构不寻常，涉及与PD-1结合的关键氨基酸残基数量多于其他mAb（图7）。Pembrolizumab-PD-1结合界面涉及pembrolizumab的21个氨基酸残基，而camrelizumab、nivolumab和toripalimab与PD-1接触的氨基酸残基数量为10–13。Pembrolizumab的所有LCDRs和HCDRs与PD-1的β-片层相互作用，主要是通过亲水相互作用，即氢键和盐桥。PD-1–pembrolizumab结合界面与PD-1–PD-L1的大部分结合界面重叠，表明pembrolizumab空间上阻止了PD-L1-PD-1接触。由于广泛的亲水分子间相互作用，pembrolizumab与PD-1的结合亲和力高于PD-L1与PD-1的结合亲和力。 图7. PD-1对pembrolizumab、PD-L1、camrelizumab、nivolumab和toripalimab的结合位点比较。(a) pembrolizumab在PD-1上的相互作用表面。PD-1的结构以深蓝色显示。PD-1上的相互作用区域分别以黄橙色(pembrolizumab)、浅蓝色(PD-L1)和酸橙色(重叠表面)显示。(b) PD-L1与PD-1的接触区域以浅蓝色显示，其他mAb，即camrelizumab、nivolumab和toripalimab的接触区域为黄色。mAb名称和PD-1-mAb复合物的PDB代码列在每个结构下方。 3.6.PD-1–tislelizumab-Fab和PD-1–serplulimab-Fab的结构 由百济神州有限公司开发的tislelizumab于2019年获得NMPA批准。它的开发目的是减少与Fc-γ受体1的结合，这些相互作用对抗癌活性有负面影响。Tislelizumab用于治疗肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌和NSCLC。Heo和同事解析了PD-1–tislelizumab-Fab结构，揭示了与其他识别PD-1环区的mAb不同，tislelizumab主要与PD-1的β-片层结合，密切模仿PD-L1-PD-1结合。特别是，三个LCDRs和HCDR3通过几个氢键和许多范德华接触与PD-1结合。Tislelizumab与PD-1的结合空间上阻碍了PD-L1与PD-1的结合。Serplulimab由上海复宏汉霖生物技术有限公司开发，于2022年获得NMPA批准，用于治疗不可切除、转移性和高度微卫星不稳定的实体瘤。Issafras和同事确定了PD-1–serplulimab-Fab的结构。PD-1的三个柔性环和serplulimab的所有六个CDRs构成了复合物的界面。发现PD-1的Arg86残基对复合物形成至关重要，它与serplulimab的HCDR3中的残基形成多个接触，包括与Asp104的盐桥、与残基Ser98和Tyr99的氢键，以及与Tyr323的π–π相互作用。复合物的结构数据表明，许多由serplulimab结合的PD-1表位也是与PD-L1接触的表位。此外，发现serplulimab结合触发了PD-1的CC’环的结构变化。 4.PD-L1–mAb的结构 如上所述，不同的抗PD-1抗体与PD-1的结合拓扑结构有显著差异。相比之下，mAb与PD-L1的界面相似，通常位于β-片层上（图8）。 图8. PD-L1抗体复合物的结构拓扑。每个结构下方列出了复合物的名称和结构的PDB代码。PD-L1以灰色显示。mAb以黄色和绿色着色。KN035以黄色显示。 4.1.PD-L1靶向的全长mAb结构 市场上有四种全长mAb靶向PD-L1：atezolizumab、avelumab、durvalumab和sugemalimab。Atezolizumab由Genentech开发，并于2016年获得FDA批准，avelumab由Merck KGaA开发，durvalumab由AstraZeneca开发，两者均于2017年获得FDA批准，而sugemalimab由Cstone开发，于2021年在中国获批。这些mAb的适应症列在表2中。除了sugemalimab外，所有这些抗PD-L1 mAb与PD-L1的复合物结构都已确定。Zhang和同事确定了PD-L1–atezolizumab-Fab复合物的晶体结构，显示VH域主导结合。所有三个HCDRs参与与PD-1的结合，而VL的LCDR3也参与结合，但另外两个LCDRs不参与。Atezolizumab通过其LCDR3和全部三个HCDRs与PD-L1的前β-片层（C链、C’链、F链和G链）、C’C环和FG环相关联。Atezolizumab-Fab和PD-L1结合界面由13个氢键和大约82个其他相互作用（极性相互作用、疏水相互作用和π–π堆叠相互作用）组成。Liu和同事确定了PD-L1–avelumab-scFv的结构，类似于atezolizumab，它主要使用VH域结合PD-L1。所有三个HCDR环都参与结合，而VL域仅使用LCDR1和LCDR3形成部分接触。PD-L1的表位包括β-片层的部分和其CC’环。PD-L1的CC’环与avelumab的HCDR3和LCDR3形成多个氢键，而后者环占据PD-L1的四条链的结合表面（图9）。 图9. PD-L1-avelumab-scFv的结构。(a) avelumab的scFv片段和PD-L1以带状模式显示。avelumab-scFv以绿色和黄色着色。三个HCDRs分别以浅洋红色、柠檬色和粉红色显示。LCDRs以碧绿色、深青绿色和浅蓝色着色。(b) 稳定PD-L1-avelumab-scFv的关键片段。形成分子间氢键的残基用虚线黑色线条连接。 与atezolizumab和avelumab所展示的VH主导相互作用不同，Tan和同事确定了PD-L1–durvalumab-scFv的结构，并确定durvalumab的VL和VH对其结合PD-L1的贡献相等。此外，Heo和Lee也报告了PD-L1-durvalumab-Fab的结构。Durvalumab的三个HCDRs以及LCDR1和LCDR3参与PD-L1结合；LCDR1和HCDR2分别与PD-L1的A链和F链接触，而HCDR3、HCDR2和LCDR3与PD-L1的G链形成多个氢键。mAbs和PD-1在PD-L1上的结合表面高度重叠，导致mAbs和PD-1之间的竞争机制。 4.2.PD-L1–KN035的结构 纳米抗体在简单的细菌表达系统中易于生产且产量高，稳定性高，使其成为研究和治疗的有前途的工具。Envafolimab（KN035）由Alphamab Oncology开发，并于2021年获得NMPA批准用于晚期胆道癌和软组织肉瘤。这是第一个也是目前唯一一个作为癌症治疗药物获批的纳米抗体。Zhou和Alphamab Oncology的同事通过对骆驼进行人PD-L1免疫并筛选VH-only纳米抗体噬菌体库获得了KN035。随后，确定了KN035-PD-L1复合物的结构。它揭示了KN035具有三个CDR环（CDR1、CDR2和CDR3），CDR1折叠成短α螺旋，而CDR3包含短α螺旋和310螺旋。一个二硫键将CDR3的短α螺旋连接到CDR1，另一个二硫键连接KN035的B和F链（图10）。 图10. PD-L1-KN035-scFv的结构。(a) PD-L1-KN035-scFV复合物结构（PDB:5JDS）。KN035的scFv片段和PD-L1分别以黄橙色和浅蓝色显示。KN035的三个CDRs分别以浅洋红色、酸橙色和粉红色显示。(b) PD-L1-KN035-scFV的结合界面细节。形成氢键的残基以棒状显示并标记。 KN035和PD-L1的界面由KN035的CDR1和CDR3以及PD-L1的CC’FG链组成，主要通过亲水相互作用，即氢键和盐桥（图10）。KN035在PD-L1的前β-片层上结合PD-L1，与PD-1-PD-L1类似，这表明KN035通过空间障碍机制阻断PD-1-PD-L1结合。 5.总结与展望 这篇综述总结了FDA和/或NMPA批准的识别PD-1或PD-L1的抗体的结构。这些复合物的结构揭示了稳定相互作用的关键驱动力，并提供了抗体影响PD-1–PD-L1识别的机制的见解。尽管抗PD-1 mAbs主要结合PD-1的前β-片层和环，但每种mAb都表现出独特的结合模式，干扰PD-1-PD-L1相互作用。相比之下，所有抗PD-L1 mAbs几乎识别PD-L1的相同位点。除了上述临床批准的抗体外，还有其他批准的抗PD-1 mAbs（sintilimab、penpulimab、dostarlimab和zimberelimab）和一种抗PD-L1 mAb（sugemalimab），它们的结构以及与PD-1或PD-L1的界面尚未揭示。 将针对PD-1或PD-L1的mAbs的结构与相同的表位进行比较，发现表位内的氨基酸残基的理化性质决定了与这些表位相互作用的CDRs中残基的类型。具体来说，表位内的极性残基倾向于识别CDRs中的极性或带电残基。有趣的是，不同的mAbs可以利用不同的CDRs与相同的表位相互作用，尽管它们具有相同类型的氨基酸残基来识别表位。因此，收集更多的结构数据以阐明CDR序列和复合物结构之间的相关性是有价值的。这些知识可以应用于新型mAbs的设计或mAb-抗原结构的预测。此外，它可以与mAb发现方法相结合，得出全面的结论。 mAbs与PD-1或PD-L1的结构数据也促进了通过基于结构的突变来优化抗体。这种优化旨在提高抗体与PD-1或PD-L1的亲和力，以及它们的溶解度和稳定性。例如，Bullock和同事分析了nivolumab的结构，并确定了可能影响mAb溶解度的特定氨基酸残基。这一分析导致了一种增强溶解度的nivolumab突变体的产生。Horita和同事利用pembrolizumab-PD-1复合物的结构数据设计了能够结合PD-1的环肽衍生物。 这里描述的所有抗体结构都不包含Fc区域。Fc区域应对抗体的整体结构产生影响。Scapin和同事发现了pembrolizumab的CH2域独特的120°旋转，并将其作为众多构象中的一种可能性。通过分析获得的晶体结构是瞬时状态的结果，而铰链区域具有很大的灵活性。Fc区域对上述mAbs与PD-1或PD-L1复合物的整体结构的具体影响仍然不清楚。Fc区域主要介导抗体的功能性效应，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。Fc区域如何影响mAbs的整体结构将揭示抗PD-1和抗PD-L1 mAbs的新结构-功能关系。这对于IgG1型抗PD-L1 mAbs尤为重要，它们作用于肿瘤细胞表面，并利用Fc功能诱导靶细胞的吞噬作用。 临床抗PD-1或抗PD-L1 mAbs的另一个研究视角涉及复杂生理环境（例如血液）或肿瘤微环境中的结构。最近，已经显示膜环境对PD-L1活性有深远影响。然而，这里描述的所有结构都是在晶体中获得的。因此，预计使用整合结构生物学方法，即核磁共振波谱学和冷冻电镜，对mAbs与PD-1或PD-L1的复合物结构进行结构表征，以更接近天然条件的方式揭示，这可能为抗PD-1或抗PD-L1 mAbs的机制的新方面提供启示。