Haemophilus b conjugate (meningococcal protein conjugate) and Hepatitis B (recombinant) vaccine(Merck & Co.)

1.什么是外源因子？世界卫生组织将外来物定义为"污染细胞培养物或来源材料的微生物，这些微生物无意中被引入生物制品的制造过程中。这是一个相当宽泛的定义，因此，可以被视为非确定因素的范围相当大。外来因子是复制因子，如真核生物、原核生物或病毒，另外还有朊病毒。不存在复制因子的污染毒素不被认为是外源性因子。外来因子不需要是已知的人类病原体，许多外来因子是通常被认为对人类无致病性的动物病原体。为了使产品安全不受外来剂的影响，任何存在的外来剂都需要灭活，如果产品不能灭活，则必须采取预防措施以确保不会发生污染。不确定因素对药品的污染会产生许多负面影响。最直接的影响是有人因受污染的产品而患病或受伤。污染可能导致药物或疫苗短缺，因为受污染的产品必须从市场上撤下，例如，由于检测到一种外源性病毒，唯一的轮状病毒疫苗被从市场上撤下了。从实际的角度来看，制药公司无法从受污染的、不安全的产品中获利。此外，需要建立公众对药品的信任，因为之前的外源性药物污染事件导致了消费者的不信任，因为质疑疫苗安全性的父母不太可能给孩子接种疫苗。甚至有一种被驳斥的阴谋论，认为脊髓灰质炎疫苗被一种外源性病毒污染，导致了人类免疫缺陷病毒(HIV)的大流行。2.被外源因子污染但放行的产品在许多情况下，在药品中发现了外来剂。本节旨在重点介绍一些特别有影响力的事件，或者让人们深入了解法规是如何制定的。这些污染事件的摘要包括在图1。图1 外源因子污染的时间轴本文按时间顺序列出了所讨论的每一个外源因子污染事件，并以检测到污染的年份为日期。2.1脊髓灰质炎疫苗中猴病毒40的检测1955年，美国采用了由默克公司生产的Salk灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)。用福尔马林灭活脊髓灰质炎病毒在恒河猴肾(RMK)细胞中培养产生IPV。1959年Eddy等人发现RMK细胞的裂解物中含有一种在仓鼠体内引起肿瘤发生的因子。基于这一研究，默克公司的研究人员在开发腺病毒疫苗的过程中，发现了一种IPV污染剂，可在非洲绿猴肾(AGMK)细胞中引起细胞病变，并将其鉴定为猿猴病毒40号(SV40)。到SV40被发现时，多达9800万美国人接种了可能受污染的IPV疫苗，尽管研究估计只有10 - 30%接种了IPV疫苗的人接种了受污染的剂次。有证据表明，IPV的福尔马林灭活程序能够灭活SV40，尽管效率不如RMK细胞，但默克公司开始使用AGMK细胞生产IPV，因为SV40不是AGMK细胞的内源性污染物。到1961年，美国政府要求所有脊髓灰质炎疫苗不含SV40，尽管没有官方召回被污染的IPV剂量。进一步的研究发现恒河猴是SV40的天然载体，因此在IPV的生产过程中，外源病毒在RMK细胞的整个培养过程中都存在。这种污染的影响已经得到了高度的研究。SV40是一种多瘤病毒，与人BK和JC病毒有亲缘关系。在实验室中，SV40引起肿瘤，并能使其T抗原蛋白细胞系永生化，这引起了人们对IPV污染导致疫苗接受者发生癌症的主要担忧。已经从多种人类癌症中分离出SV40抗原和DNA，这表明这些实验室发现具有潜在的临床相关性。尽管有证据表明SV40具有致癌能力，但许多关于IPV疫苗接种后癌症发病率的综述并未发现接种受污染的疫苗与癌症之间存在联系。Strickler等人进行了一项着眼于SV40相关癌症风险的回顾性队列研究，将暴露于受污染IPV的个体与未暴露于受污染IPV的个体进行了年龄比较，发现暴露于受污染疫苗与癌症发病率增加无关。瑞典一项针对70万人的研究测量了骨原性肉瘤、脑室管膜瘤和胸膜间皮瘤的发病率，发现暴露于受污染IPV的个体发病率没有增加[。美国国家科学院医学研究所2003年发表的一篇免疫安全评论得出结论，目前尚不清楚IPV中SV40的存在是否会直接导致任何疫苗接种者的癌症。然而，有证据表明，接种IPV的人血清转化为SV40，但尚不清楚这是由于病毒感染还是暴露于疫苗中存在的福尔马林灭活病毒抗原。IPV被SV40污染是确定一种新型内源性动物病毒可从细胞系制备过程携带到药品生产过程的首批实例之一。这导致政府监管机构要求对特别确定的外来病毒进行筛选，制造商改变了用于继续生产疫苗的细胞系。虽然污染的影响尚未完全了解，但它似乎没有对数千万受污染人口的健康产生可衡量的影响。2.2 减毒活疫苗中噬菌体的检测1973年，美国食品和药物管理局(FDA)报告称，多种减毒活疫苗(包括腮腺炎、麻疹和风疹(MMR)疫苗和口服脊髓灰质炎疫苗)中都存在噬菌体，即在细菌内感染和复制的病毒。这种污染最初是通过对胎牛血清(FBS)的不相关研究确定的，进一步的研究确定了使用胎牛血清进行细胞培养的疫苗的污染。最初，FDA的回应是成立了一个委员会，决定在确定噬菌体是否可以从疫苗生产中去除之前，允许受污染的疫苗继续在市场上销售。对从MMR疫苗中分离的噬菌体φV-1的研究没有发现该噬菌体对动物模型的影响，也没有发现接种后噬菌体的持久性。在非人灵长类动物中接种φV-1，尽管缺乏病毒持久性，但仍产生了强烈的血清抗体反应。当时，FBS的采集是在没有采用无菌技术的屠宰场进行的。从胎儿采集的血液通常被细菌污染，并使用过滤去除细菌。这种过滤能够去除相对较大的细菌，但允许噬菌体污染最终的FBS产品。在细胞培养中使用这种受污染的胎牛血清制备减毒活疫苗，导致给人接种的疫苗受到污染。在疫苗中发现噬菌体两年后，美国食品和药物管理局(FDA)推进了相关法规，要求用于细胞培养的FBS不含任何污染噬菌体，这导致屠宰场行业修改了他们的做法。当时人们还没有完全了解疫苗中噬菌体污染的影响。目前尚不清楚有多少人接触过受污染疫苗中的噬菌体，因为在发现这一发现时，减毒活疫苗已经使用了十多年。众所周知，噬菌体可以将毒素转移到细菌中，使其更具致病性，也有发表的研究证实了噬菌体在培养中能够将基因传递到细胞中。现在，虽然我们的疫苗被要求不含噬菌体，但噬菌体的生物学已经得到了更好的了解，并且被认为对人类的危害较小。最近，噬菌体甚至被FDA批准用于治疗严重的细菌感染。目前没有证据表明任何噬菌体污染直接对人类造成伤害，而且过去的疫苗污染很可能没有直接导致不良事件。2.3 减毒活疫苗中逆转录酶的检测1995年，在鸡胚成纤维细胞中培养了MMR减毒活疫苗和黄热病减毒活疫苗。当时，人们知道禽类逆转录病毒在鸡蛋中存在风险，FDA对疫苗中禽类逆转录病毒的检测有要求。Prya等人于1994年开发的一种方法能够检测逆转录酶活性，其灵敏度提高了106倍，称为PERT试验。PERT试验用于测试疫苗，它能够检测到传统方法无法检测到的逆转录酶的存在。具体而言，MMR和YF减毒活疫苗被发现具有逆转录酶活性，而在鸡细胞和鸡蛋中培养的灭活疫苗，如流感疫苗，未被发现具有逆转录酶活性。逆转录酶与鸡胚成纤维细胞有关，这是一种从鸡群中收获的原代细胞。进一步研究发现，逆转录酶活性与内源性禽逆转录病毒(EAV-0)和禽白血病病毒(ALV)核酸和颗粒的存在有关。尽管检测到逆转录病毒核酸，但进一步的研究未能从鸡胚成纤维细胞中分离出感染性病毒[26]。疫苗接种者的试验显示，原病毒没有整合到外周血淋巴细胞中，也没有ALV的血清转化。由于检测到逆转录病毒相关的逆转录酶，减毒活疫苗没有从市场上撤下。世卫组织的一个委员会指出，“疫苗可预防疾病的风险是真实的和可量化的，而鸡细胞衍生颗粒造成的风险是理论上的和遥远的。总的结论是，PERT试验能够检测出鸡胚成纤维细胞内源性的非传染性逆转录病毒的存在。此外，大多数人作为食物链的一部分暴露于禽类逆转录病毒，从健康家禽工人收集的血清已被证明具有抗禽类逆转录病毒的血清学活性。使用替代细胞系，如人类细胞，可以完全避免引入这些禽逆转录病毒成分，但鸡细胞衍生疫苗的长期安全记录允许继续使用含有低水平逆转录酶活性的产品。2.4 羊痒病疫苗污染传染性海绵状脑病(TSE)是一种由一种叫做朊病毒的传染性蛋白质引起的疾病。绵羊暴露于朊病毒可导致痒病，一种神经退行性疾病。有两例欧洲兽医疫苗导致痒病在接种过疫苗的绵羊中传播的记录。1946年Gordon报道了一例痒病感染病例。1934年，一种由福尔马林灭活的受感染绵羊组织组成的娄平病疫苗被开发出来，以保护绵羊免受蜱传黄病毒的侵害。接种疫苗两年后，英国的羊群开始出现痒病的症状，戈登接着得出结论，疫苗制备中的几只羊处于痒病的早期阶段，但没有出现症状。当时，痒病的致病因子尚不清楚，戈登能够使用受污染的疫苗确定痒病的感染因子在受感染羊的大脑和脊柱内。1997年，意大利也遇到了类似的情况，当时人们了解了痒病的致病因子。人们开发了一种疫苗，以保护绵羊免受传染性无乳症的侵害。无乳症是绵羊和山羊的一种疾病，由无乳支原体感染引起，影响产奶量。该疫苗是通过实验性地用无乳分枝杆菌感染绵羊，采集受感染的组织，然后用福尔马林灭活细菌来生产的。对于两种被痒病污染的疫苗，污染只能通过观察接种疫苗的动物的疾病来检测，之后不再接种疫苗。一项回顾性队列研究发现，在意大利接种受污染疫苗的省份，由于存在该病的继发性传播，瘙痒病发病率增加。这些痒病污染的实例突出了在药品中检测朊病毒污染的重要性。2.5 Hib疫苗中蜡样芽孢杆菌的检测2007年，由于在生产设备中检测到蜡样芽孢杆菌，超过100万剂b型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗被召回。这次召回导致Hib疫苗短缺，导致疫苗接种计划建议发生改变。Hib疫苗由默克公司生产，分别为PedvaxHIB和Comvax。PedvaxHIB是一种Hib荚膜多糖与脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白相连，以增加抗原性。Comvax是PedvaxHIB的一种配方，也包括乙肝抗原。PedvaxHIB是由Hib和脑膜炎奈瑟菌在发酵培养基中培养，然后纯化所需抗原生产的。在生产设备中检测到土壤细菌蜡样芽孢杆菌，但在最终疫苗产品中未检测到任何污染。此外，Huang等人的研究追踪了疫苗不良事件的报告，并没有发现默克公司召回批次与未召回批次相比，不良事件有任何增加。Hib疫苗批次的潜在蜡样芽孢杆菌污染不是源于动物制品的污染，而是由于设备缺乏消毒。这是一个例子，说明如何有许多途径，外源因子可以进入药品中。2.6 轮状病毒疫苗的PCV1污染2004年和2005年，两种轮状病毒疫苗——葛兰素史克(GSK)生产的Rotarix和默克(Merck)生产的RotaTeq被批准使用。疫苗是减毒活疫苗，病毒在AGMK和Vero细胞中连续传代，然后冻干。这两种疫苗都是给儿童口服的。Victoria等人在2010年的一项研究使用下一代测序(NGS)研究了包括Rotarix在内的多种疫苗的组成。Rotarix的测序没有在疫苗中发现任何少数病毒变体，但是有序列读数归因于猪圆环病毒-1 (PCV1)。聚合酶链反应(PCR)和芯片技术证实了轮状病毒体内存在PCV1。在这项研究发表后，GSK对用于制造疫苗的材料进行了进一步的调查。在生产过程的每个阶段都检测到PCV1 DNA，包括用于培养轮状病毒的初始Vero细胞库，这些细胞库是造成污染的原因。除了检测到PCV1 DNA外，在轮状病毒收获液和纯化原液中均检测到传染性PCV1，但在最终灌装的西林瓶中未检测到。疫苗的最终污染被认为是从Vero细胞库携带的，细胞库被来源于猪的胰蛋白酶污染，因为1983年最初生产细胞库时使用的胰蛋白酶没有进行常规辐照。基于GSK疫苗被污染的调查结果，默克公司进一步调查了他们的RotaTeq库存。默克公司在RotaTeq的原液和成品疫苗中发现了PCV1和PCV2 DNA的存在。仅有DNA片段被鉴定出来;在原液和成品中均未检出感染性病毒。默克公司得出结论，PCV DNA来自用于培养疫苗Vero细胞的辐照胰蛋白酶。在疫苗中检测到PCV1时，全世界已接种了超过1亿剂Rotarix或RotaTeq，导致严重的安全问题。PCV1是1974年首次报道的猪常见病毒，与任何兽医学疾病无关。PCV2于1998年首次分离出来，与猪的消瘦综合征有关。已知PCV1和PCV2都是细胞培养的常见污染物，但PCV1和PCV2都不会在人类中引起任何疾病。尽管如此，在发现PCV污染后，FDA暂时将rottarix和RotaTeq这两种唯一可用的轮状病毒疫苗从市场上撤下了大约两个月。FDA允许恢复疫苗的使用，并更新了标签，包括PCV1的存在，因为这两种疫苗都有很强的安全记录，没有证据表明PCV会导致人类疾病，而且疫苗的益处是巨大的。对接种疫苗的儿童的研究发现，接种疫苗后，PCV在一些儿童的粪便中排出，但接种疫苗并不导致PCV1的血清转化。Rotarix和RotaTeq仍然与PCV1列为成分一起使用。3.易受外来物质污染的产品类型所有制品都有来自环境、实验室或操作人员污染的外来物质污染的风险。随着这类污染的普遍风险，一些制造方法具有更高的风险，导致某些类型的产品更容易受到污染。在细胞培养中生产的产品，需要以动物为基础的试剂生产的产品，以及需要直接使用动物的产品，受到外源因子污染的风险最高。虽然许多制品是使用这些方法生产的，但疫苗、重组蛋白和单克隆抗体是广泛使用的产品，通常也是使用这些方法生产。在不使用细胞培养的情况下生产的疫苗、重组蛋白和单克隆抗体受到外来病原体污染的风险较低。重组蛋白可以通过发酵酵母产生，由于酵母不能支持病原体，因此被认为被外源因子污染的风险相当低。目前有研究使用发酵技术生产复杂的人类蛋白质，如单克隆抗体，在未来的许多实施确实降低了污染的风险。疫苗的生产方式多种多样，具有不同的病原体污染风险。有些疫苗是通过培养细菌生产的，这种方法和酵母发酵一样，具有较低的外来病毒污染风险。一般来说，减毒活疫苗比灭活疫苗更容易受到外来病原体污染，因为灭活的步骤也可以使外来病原体不具有传染性。然而，有些病毒和朊病毒对福尔马林灭活具有抗性，因此灭活产品仍然存在污染风险。活细胞产品，如嵌合抗原受体T细胞，由于最终材料的稳定性要求，也面临高风险的外源因子污染。由于细胞需要活给药，因此很难去除可能存在的任何外源因子，因为大多数纯化方法都会损害所需的细胞。活细胞产品的另一个复杂之处在于它们必须从宿主处收集，这导致了一个额外的潜在的外源性病原体污染源。4.外源因子污染的来源4.1 使用内源性外源因子的细胞系所有细胞系都是在某一时刻从宿主身上采集的，一些用于培养这些细胞系的细胞在采集时含有内源性的外源因子。在药物产品开发中使用这些细胞系可能导致外源因子污染最终产品。以这种方式引入的外源因子往往是收集细胞的物种的原生因子。例如，RMK细胞天然含有SV-40，多种用于重组蛋白表达的昆虫细胞系天然含有sf -横纹肌病毒，一种用于产生虫媒病毒的蚊子细胞系被蚊子细小病毒污染。原代细胞，如用于生产含有EAV-0和ALV的MMR疫苗的鸡胚成纤维细胞，也是一个潜在的外源因子污染来源。4.2 动物产品在细胞培养中的应用细胞培养需要复杂的材料，如生长因子、必需氨基酸和酶，由于成本或生产困难，这些材料都是从动物身上采集的。细胞培养中最常用的动物产品是从胎牛身上采集的胎牛血清和从猪胰腺中采集的胰蛋白酶。胎牛血清与牛病毒污染有关，如牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、有蹄类四细小病毒2型和牛肝病毒。胎牛血清收集方法不当也会导致细菌污染和噬菌体污染。已发现胰蛋白酶含有多种不同的猪源病毒，如PCV1和经典猪瘟病毒。动物产品收集技术的改变，以及使用前的过滤和辐照等处理，降低了外来物质污染的风险。4.3 利用动物直接生产一种产品有些产品不使用体外细胞培养，而是直接依靠动物或动物产品来生产药品。然后，这些动物的内源性传染因子会污染最终的药品。一个常见的例子是使用鸡蛋来培养用于疫苗的病毒。在鸡蛋中培养的产品中检测到禽类逆转录病毒。动物的另一个用途是通过实验性感染培养微生物。这可能导致动物感染的任何其他微生物以及可能存在于动物体内的任何朊病毒的传播。20世纪50年代至80年代的天花疫苗生产方法涉及收集牛痘病毒感染的动物皮肤，这使得产品具有较高的外源因子污染风险。4.4 环境污染实验室环境也可能是一个外来因素的来源。如果没有消毒，大多数表面上都有细菌。此外，实验室人员也可能是外源因子的来源，因为源自人体的微生物通常可以在细胞培养中复制。环境污染的一个常见例子是支原体，这是一种细菌污染物，通常来自实验室人员。在生产的各个阶段都需要适当的无菌技术，以防止环境的污染因子进入药品。5.常见的污染物有各种各样的因子可以作为外源因子。下面将讨论不同类型的污染剂，以及它们对药品的潜在影响。表1列出了选定的外源因子。5.1 细菌污染由于细胞培养基中含有细菌生长所必需的营养物质，因此细胞培养物经常会被细菌污染。细菌在环境中和实验室工作人员身上都很常见，如果不保持无菌条件，来自环境的细菌会污染细胞培养物或用于细胞培养的制品。有许多不同类型的细菌可以引起污染。通常，被污染的细菌在显微镜下可以看到，在宏观上可以看到浑浊的上清，或者通过培养基pH指示剂的变化可以检测到。支原体是细胞培养中非常常见的细菌污染物，对数千个细胞系的研究发现，约25%的细胞系被支原体污染。支原体属革兰氏阴性菌，基因组长度和尺寸都很小，大多数支原体基因组长度小于1mb，呈球形，长1 - 2 μm，宽0.1-0.2 μm。支原体的小尺寸允许它们通过0.2 μm的过滤器。通常支原体污染不能通过显微镜检测，因为细菌太小而无法观察，因此需要分子技术。市面上有许多用于检测细胞培养物中支原体的PCR检测方法。药品的细菌污染会对服用者造成有害影响。致病菌污染药品可直接导致感染。即使细菌被灭活方法杀死，细菌产生的毒素仍然可以保有毒性，导致不良反应。5.2 真核生物的污染物像细菌污染物一样，环境中也有真核生物可以在细胞培养条件下复制。由于细胞培养条件是为真核细胞系的复制而设计的，因此外源性的真核因子通常也可以复制。此外，虽然许多类型的细菌污染可以通过在培养基中添加抗生素来预防，但大多数杀死真核污染物的化合物也会杀死培养物中的目标细胞，尽管有可用的抗真菌化合物可用于细胞培养条件。最常见的真核污染物是真菌，但寄生虫如单细胞原生动物也可以污染细胞培养物。像细菌一样，真核生物的污染通常来自环境，由于真核生物的体积很大，因此通常可以通过显微镜检查检测到污染。真核生物污染药品可导致严重疾病。例如，大量被真菌污染的醋酸甲基强的松龙导致服用该药的患者出现真菌性脑膜炎。5.3 病毒污染物与可以在环境中发现的细菌和真核污染物不同，病毒污染物必须来自宿主。虽然实验室工作人员可能是污染病毒的源头，但大多数病毒是通过其他污染产品进入细胞培养的;从动物中分离出来的产品往往是病毒污染的来源。此外，有许多带有内源性病毒的细胞系可能导致污染。通常，这些内源性病毒在细胞系的永生化中起作用，并可整合到细胞基因组中。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和小鼠杂交瘤已被证明含有内源性逆转录病毒和病毒样核酸。由于污染病毒通常来自细胞培养中使用的动物产品，许多常见的外源性病毒来自生物制造中常用的动物物种。牛病毒很常见，因为使用血清;猪病毒很常见，因为使用胰蛋白酶;禽病毒很常见，因为在生物制造技术中使用鸡蛋。人类和非人类灵长类动物的病毒也是常见的污染物，通常起源于用于生产的细胞系的初始收集。人们还担心源自人类的病毒会污染医药产品。人类相关病毒可以通过使用人类来源的产品或通过受感染的实验室工作人员的污染进入细胞培养。由于其独特的生物学特性，在细胞培养中需要特别考虑逆转录病毒和逆转录病毒元件。逆转录病毒可以作为含有RNA的包膜病毒粒子存在，也可以作为整合到宿主细胞基因组中的DNA的原病毒存在。逆转录病毒也有致病的风险，因为它整合在宿主基因组的重要基因内，即使是具有整合酶的非复制性逆转录病毒制剂也有潜在的危险，尽管没有报道发生这种情况的实例。人们经常在环境和饮食中接触病毒，大多数病毒对人类没有影响;只有一小部分已知病毒对人类具有传染性。有证据表明，人们通过食物链或通过农业工作接触到多种动物病毒而没有任何疾病。尽管如此，大多数病毒在人类中的感染潜力尚不清楚，因此在评估药物产品的病毒污染时非常谨慎。5.4 朊病毒污染物朊病毒是一种完全由蛋白质组成的传染性非生物媒介。大多数哺乳动物产生一种叫做朊病毒蛋白(PrP)的蛋白质，它可以折叠成两种结构变体:PrPC和PrPSc。PrPC存在于健康个体中，而PrPSc存在于朊病毒疾病患者中。当PrPC暴露于蛋白质的PrPSc异构体时，PrPC可以转变为高度稳定的PrPSc异构体。当PrPSc在大脑内积累时，被称为TSE的神经系统疾病就会进展。PrPSc对热、清洁剂、福尔马林和高压灭菌具有很强的抗性，因此很难使感染蛋白失活。朊病毒存在于受感染动物的神经组织中，因此，无论何时将动物组织用于制药产品，都存在被污染的风险。暴露于朊病毒的人有患库鲁病、克雅氏病(CJD)、变异型CJD、致命性家族性失眠症和Gerstmann-Sträussler-Scheinker等TSE的风险，这些疾病每年在美国导致多达300人死亡。6.外源因子的检测方法基于能污染产品的外源因子的范围，有许多种类的实验通常都能用于外源因子的检测。下面描述了这些检测方法，以及它们通常使用的情况。表2列出了这些试验的摘要。表2 一种用于检测外源因子的测定方法的选择6.1 目视及显微检查虽然它们很小，但用肉眼或显微镜都可以观察到微生物的生长。细胞培养物被细菌或真菌污染可导致培养瓶内可见的生长，而浑浊的培养基通常是污染的迹象。在细胞培养过程中经常使用目视检查，因此它是一种廉价而快速的检测外源因子的方法。并非所有的外源因子都能在显微镜下看到;如果没有定向染色或使用电子显微镜，病毒甚至某些细菌都无法直观地观察到。尽管无法检测到许多类型的外源因子，但显微筛选仍然是检测外源因子的有用工具。6.2 培养细胞病变效应的检测虽然病毒太小，无法直接目测到，但可以观察到病毒复制对细胞的影响。通常，感染病毒的细胞会表现出某种形式的细胞病变效应(CPE)，这是由病毒引起的细胞形态变化。对于典型的体外CPE试验，将各种细胞系置于烧瓶中，然后用待测样品对每个细胞系进行挑战。在这一挑战之后，观察细胞，并可能进行继代培养，在大约一个月的时间内观察任何CPE的出现。CPE的常见例子包括合胞体的形成(细胞融合导致单个细胞具有多个细胞核)、细胞形状的改变、包涵体的发育、细胞变圆、细胞结块以及完全或次完全破坏。筛选CPE以检测外来病毒的优点是，该程序相对简单，费用低廉，并且不针对特定病毒，因为各种各样的病毒都可能导致某种形式的CPE。使用CPE试验的主要缺点是，一些外源性病毒只在可能不用于试验的特定细胞系中引起CPE，而其他病毒在细胞内复制时不会引起任何CPE。Berting等人报道了多种重要的外源病毒，包括牛病毒性腹泻病毒、柯萨奇病毒B3、鼠肝炎病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒和副流感病毒3，在CHO细胞中不会引起CPE。虽然大多数这些病毒不能在CHO细胞内复制，但副流感病毒3能够在CHO细胞内适度复制，而不产生任何CPE。然而，如果用小鼠星形胶质细胞代替CHO细胞，柯萨奇B3病毒能够复制并引起CPE，如细胞变圆、细胞质起泡和单层脱离，这表明需要用合适的细胞系进行测试。在筛选减毒活疫苗时，很难区分由疫苗的病毒成分引起的CPE或由污染剂引起的CPE，因此也有必要考虑正在测试的产品。此外，CPE试验只能筛选病毒的存在，而不能筛选其他类别的外来因子。与CPE检测类似的一种体外检测方法是血凝试验。许多病毒具有附着在红细胞表面的蛋白质，带有这些蛋白质的病毒悬浮液具有使红细胞聚集或凝集的能力。在血凝试验中，细胞被病毒感染，然后将红细胞加入悬浮液中。如果添加的红细胞凝集，则认为培养物血凝阳性，因此认为孔内有病毒。该试验能够在没有CPE的情况下检测病毒复制，但它需要在易感细胞系中培养一种外源性病毒。此外，并不是所有的病毒都有血凝作用，所以这种检测方法不能检测到所有类型的外源病毒。6.3 动物注射由于已知外源因子只能在高度特异性的体外条件下培养，因此体内动物试验已被用于筛选外源因子的污染。体内试验的主要优点是，试验是完全非靶向的，任何分类的外源因子都应该能够在动物体内引起疾病;动物试验是为数不多的能够检测朊病毒污染的方法之一。动物试验的主要缺点包括高成本和观察动物所需的大量时间。并非所有的外源因子都能在实验动物中引起疾病。许多危险的人类病原体，如艾滋病毒，由于其发病机制的高度特异性，无法在动物中引起疾病。此外，减少和替代动物的使用是科学的总体目标，因此使用数十只动物进行筛选在伦理上是不理想的。美国食品药品监督管理局(FDA)已经提出了使用动物进行外源性病毒检测的建议。建议使用成年小鼠、乳鼠、豚鼠、兔子和有胚胎的鸡蛋。每一种动物都被推荐用于检测不同类型的外源因子。对于成年小鼠，至少20只小鼠应腹腔和脑内接种该产品，并监测至少21天。如果低于80%的小鼠保持健康，则该产品不能使用。乳鼠的使用与成年小鼠相似，不同之处在于，乳鼠应观察14天，并将存活小鼠的组织传代到另外5只乳鼠中进行观察。对胚胎卵，接种10个卵，孵育3天。孵育后，应收集尿囊液，然后将其注射到一组新的卵中，再孵育3天。胚胎应在孵化后进行检查，卵的内容物应进行血凝试验，其中80%的卵应表现正常，不含血凝剂。还应完成对胚胎卵的额外筛选，其中另外10个卵接种该产品，然后孵育9天。胚胎在孵化后进行检查，产品通过测试，至少80%的胚胎正常。一般来说，每只在试验中死亡的动物都必须通过二次手段检测其组织中是否存在外源因子。Gombold等人对体内检测外源病毒的方法与体外方法进行了比较。用连续稀释的病毒培养液接种成年小鼠、乳鼠和有胚胎的鸡蛋，并确定体内技术能够检测到病毒的稀释度。在使用体内方法测试的11种外源病毒中，仅检测到6种。有趣的是，使用多种体外技术，所有11种外源病毒都被检测到，通常浓度远低于体内检测。这项研究对典型体内检测方法的敏感性提出了质疑，并强调了对潜在的替代筛选方法的需求。另一种可以使用的体内试验是抗体产生试验。在这个测试中，特定的无病原体动物接种被测试的产品。接种后，从这些动物身上收集血清，然后检测是否存在针对选定的外来因子的抗体。这种方法不需要动物受到外源因子的影响，因为抗体反应可以在不复制外源因子的情况下发生，但是由于抗体筛选是以有针对性的方式进行的，因此可以检测到的外源因子的数量是有限的。6.4 逆转录酶活性检测逆转录病毒的决定性特征是它能够将其RNA基因组逆转录为DNA，以便整合到宿主基因组中。负责这个过程的蛋白质叫做逆转录酶。通过检测RNA到DNA的转化，已经开发出检测逆转录酶存在的检测方法。如果检测到逆转录酶活性，则假定样品中存在逆转录病毒或逆转录病毒样元素。这些检测方法非常敏感，可以检测到低水平的逆转录病毒污染，但它们无法检测到其他形式的外源性病原体污染。一种检测逆转录酶存在的检测方法是产物增强逆转录酶(PERT)检测。在PERT分析中，将噬菌体RNA和互补引物添加到产物中并孵育。样品中的任何逆转录酶都会将噬菌体RNA转录成互补DNA (cDNA)。在孵育之后，进行PCR以充实任何存在的cDNA。添加到产物中的初始RNA将不会在此PCR步骤中被扩增。PCR扩增后，用Southern blot检测噬菌体cDNA的存在。随着方法的发展，荧光PERT (f-PERT)被开发出来，它使用qPCR检测cDNA以提高灵敏度。6.5 核酸靶向检测PCR是检测外源因子存在的一种高度敏感的方法。大多数外源因子具有可检测的核酸成分，因此PCR可用于检测病毒、细菌以及真核生物。要用PCR检测外源因子，首先必须从被测材料中提取核酸。提取后，加入目标引物和酶，然后在热循环器中孵育样品。所使用的引物的设计可以允许检测生物体的特定菌株，或者用于检测在生物体家族中保守的核酸序列。逆转录酶可以用来产生cDNA的PCR反应，允许PCR实验检测DNA或RNA。DNA通常通过扩增过程中探针水解产生的荧光来检测，这使得无需凝胶检测即可进行有效的DNA检测。从理论上讲，PCR方法能够检测到目标核酸的单个拷贝。在实践中，虽然不完美，但PCR能够以令人难以置信的高灵敏度检测外源因子核酸。Bae等建立了小鼠微小病毒、牛细小病毒和牛疱疹病毒的PCR检测方法，灵敏度分别为6.49 × 101、7.23 × 102和5.8 × 101 TCID50/mL，证明了PCR检测方法的高灵敏度。同样，Oh等人建立了逆转录酶PCR检测呼肠孤病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛副流感病毒的方法，报道的灵敏度分别为7.76 × 102、7.44 × 101和6.55 × 101 TCID10/mL。PCR通常用于检测细胞培养物的支原体污染，因为基于培养的方法可能需要长达两周的时间才能完成，而且由于细菌的大小，很难用显微镜方法检测。有许多支原体菌株可以污染细胞培养物，因此PCR测定的设计必须考虑到不同菌株之间序列的潜在差异。对于支原体的检测，引物可以瞄准基因组的保守区域，或者使用多个引物集来确保检测的敏感性。这些PCR方法已被证明是高度敏感的，Sung等人报道，他们开发的PCR方法能够在细胞培养基中检测到10 CFU/mL支原体。该方法具有灵敏度高、成本低、可在一天内完成的特点，是目前检测外源因子的首选方法之一。最近，多路复用技术的进步使得在一次PCR反应中可以检测到多种外源病毒，从而提高了样品筛选的速度。6.6 下一代测序外源因子核酸可以通过下一代测序(NGS)技术和PCR技术检测。由于NGS技术成本低、运行时间快、能够检测多种外源因子，因此目前正被探索作为检测外源因子的主要方法。由于NGS不需要靶向引物，它可以检测以前未识别的病毒，就像在环境筛选研究中经常做的那样，而且单一的NGS测定可以用来代替大量的PCR测定。NGS是指在传统Sanger测序方法之外发展起来的核酸测序方法，如杂交测序、合成测序、纳米孔测序、长读区测序等。这些方法在读取长度、读取次数和运行时间方面不断得到改进。NGS方法通常包括核酸的制备，核酸的测序，然后进行生物信息学分析。在文库制备方面，已经测试了许多选择，包括靶向DNA或RNA，富集外源因子核酸或耗尽宿主核酸的步骤。如果有特定的序列需要测序，则可以使用预定的引物进行靶向测序，或者对所有存在的核酸进行非靶向测序。有许多测序平台可以使用，包括Illumina, Oxford Nanopore Technologies, PacBio和Ion Torrent。生物信息学分析可以根据测序是否有针对性，或者你是否有针对性来修改。此外，还有一些序列数据库正在开发中，用于通过生物信息学分析检测外源病毒，如参考病毒数据库。Victoria等人完成了NGS在检测不定因子方面最值得注意的应用之一，当实验的计划目标是评估疫苗的序列时，NGS技术能够检测到外源病毒的存在。Victoria等人也对多种减毒活疫苗采用了类似的测序技术，并发现了禽白血病病毒和猿类逆转录病毒的污染。在这篇论文发表之后，许多其他研究小组已经证明了NGS技术检测外源病毒的能力。对于采用NGS平台来检测非确定因子，有一些需要克服的障碍。在大多数产品中，任何污染物都可能以极低的水平存在，特别是在含有细胞产物的产品中，并且可能需要排除宿主读取或富集污染物的方法来确保检测的灵敏度。另一个需要克服的挑战是一些测序技术所需的时间。虽然测序可以比传统的体内方法快得多，但一些NGS方法可能需要数天时间进行测序和分析，这限制了操作员的实用性。6.7 在检测外源因子时出现假阳性由于用于检测外源因子的检测方法的高灵敏度，假阳性是进行检测的小组主要关注的问题。由于额外的测试或增加的监管障碍，假阳性可能导致成本增加，因此希望确保低假阳性率。Nims等人强调，测试本身可能受到测试设备、测试试剂、测试操作人员或环境的污染。在许多研究领域中，有各种各样的实验室检测试剂污染导致假阳性的报道。与受污染的动物产品可能导致药品污染类似，使用受污染的牛血清可能导致BVDV血清学或分子检测的假阳性。如上所述，在细胞培养中生产的产品受到外源因子污染的风险较高，并且这种趋势持续到实验室试剂的生产。测试程序中使用的单克隆抗体的生产通常没有被测试的药品严格，因此可能出现假阳性。在没有污染的情况下，外源性试剂测试也可能产生假阳性。Talarico等人描述了一个假阳性检测事件，其中流感疫苗中包含的蛋白质能够引起哺乳动物红细胞的凝血。这一发现花了5个多月的时间才得到充分证实，导致疫苗生产的延误，而这本来可以通过更好地了解检测程序来避免。在检测外源因子时，有必要使用强有力的控制措施来避免检测的假阳性。7.防止外源因子污染的方法虽然本文描述了如何在药品中检测到外源因子，但最好是防止这些外源因子污染产品。这可以通过从产品中去除潜在的污染物或通过使用低风险的外源因子污染的制造方法来实现。7.1 灭活污染物传染性生物体易受各种灭活方法的影响，如热、辐射或化学处理。这些灭活方法通常用于原材料，以确保其安全，但偶尔也会用于产品本身。对原材料进行灭活的一些常见例子包括对牛胎牛血清和胰蛋白酶进行γ辐照，这是由生产材料的制造商进行的，并已被证明可以灭活污染病毒。除用于原材料外，辐照和热处理等灭活方法已被证明可有效地灭活生产过程中的外源因子。用高温短时间处理产品可以在不降解培养基结构的情况下使外源因子失活。同样，研究表明，紫外线辐射可以有效地使外源性因子失活，而培养基在培养CHO细胞时不会失去其有效性。另一种灭活外源性病原体的方法是将最终产品作为灭活产品，特别是福尔马林灭活疫苗交付。疫苗生产的一种常见做法是培养和纯化病毒，然后用福尔马林灭活病毒，作为疫苗使用。这种福尔马林灭活方法还可以灭活疫苗中可能存在的任何污染的外源因子。以前，当发现SV-40污染了一种灭活的脊髓灰质炎疫苗时，有证据表明甲醛也灭活了SV-40。7.2 采用cGMP生产程序FDA要求药品按照现行良好生产规范(cGMP)生产，以确保使用安全的生产方法。cGMP涵盖了人员、设施、设备、控制和记录等广泛的主题，并要求在产品生产的每个步骤都遵循安全的标准操作程序。不符合cGMP程序会导致产品被认为是掺假的。cGMP反映了安全生产的最低标准，是广泛的指导方针，每个工厂都可以根据需要进行调整。一般来说，使用cGMP保护产品在生产过程中不受外源因子的污染，并确保在污染发生时适当的检测方案到位。7.3 避免使用污染的试剂以前使用试剂的经验已经确定了避免污染的方法。在用于物料生产之前，可以对动物进行筛选，以确定是否存在针对常见外源因子的抗体，或者在使用前对物料进行分子方法筛选。可检测牛血清中是否存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体，该抗体的存在表明牛曾暴露于BVDV。物料也可以来自某些病毒没有自然传播的国家或地区。传统上，从新西兰和澳大利亚分离出来的FBS被认为比来自世界其他地区的FBS含有更少的外源因子。然而，最近的研究未能确定特定地理来源的FBS的优势，这表明这种做法不足以防止污染。7.4 避免使用动物/动物产品由于许多意外病原体污染的情况是通过使用受污染的动物产品发生的，因此避免使用动物产品可以降低意外病原体暴露的风险。这可以通过对制造过程进行轻微改变来实现:如果使用非贴壁细胞系，则不需要猪源性胰蛋白酶传代细胞。通过修改培养基也可以避免在培养中使用FBS，尽管所需的修改取决于所培养的细胞系。这种培养基被称为无动物源性培养基(AOF)、无血清培养基(SFM)或无异种培养基。目前受益于AOF或SFM的主要领域之一是间充质干细胞的培养，FDA已批准在涉及间充质干细胞培养的临床试验中使用SFM。使用无血清细胞培养技术是一种新兴的方法，随着成本的降低和方法的改进，它可能会被广泛采用。或者，如果产品可以设计成在非哺乳动物细胞培养中生产，那么外源因子污染的风险就会降低。与哺乳动物细胞培养相比，酵母或细菌的发酵受到外源因子污染的风险较小，因为酵母的病原体通常不是人类的病原体。通过对分泌的胰岛素原分子进行修饰，可以利用酿酒酵母发酵产生胰岛素。这种修改允许在发酵培养中生产重组人胰岛素，而不是从屠宰动物的胰腺中分离胰岛素。最近，在单克隆抗体生产领域也取得了类似的进展，允许通过毕赤酵母培养生产单克隆抗体。目前的努力集中在确保酵母产生的抗体的适当糖基化，以允许充分的功能，但进步可能导致单克隆抗体治疗生产不需要哺乳动物细胞培养。8.结语随着新疗法的发展，为了保证药品的安全性，需要有效地检测出外源因子。没有一种现有的方法能够持续地检测大范围的潜在污染外源因子。需要安全的生产过程和有效的样品筛选，以确保在人们面临不良健康事件风险之前预防或发现外来物质污染。原文来源：A history of adventitious agent contamination and the current methods to detect and remove them from pharmaceutical products识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

Merck & Co’s week of woe has continued with the news that US regulators have told the firm to correct what are described as “numerous manufacturing deficiencies” at its main vaccines plant. The US Food and Drug Administration has issued a warning letter to Merck having conducted an inspection of the firm’s West Point, Pennsylvania facility between November 26, 2007 and January 17 this year. The agency’s investigators say they documented “significant deviations from current good manufacturing practice” at the plant in the manufacture of vaccine products, bulk drug substances and drug components. The products manufactured at the West Point site include Merck & Co’s cervical cancer vaccine Gardasil and ProQuad, its combination jab against measles, mumps, rubella and chicken pox. Also produced at the facility are the Haemophilus influenzae type B vaccine PedvaxHIB and ComVax for haemophilius b and hepatitis B and 1.2 million doses of these two jabs were voluntarily recalled in December because Merck said it could not assure sterility of those specific vaccine lots. The warning letter, which is posted on the FDA’s website in a heavily edited form, has been issued because Merck's response to the FDA’s initial inspection report was "inadequate to address the serious deviations noted”. Most of the myriad complaints appear to deal with procedural errors but the agency stresses it "does not believe that the issues identified will affect the safety of the vaccines" made at the facility. Merck says that it is committed to working with the FDA to address these issues, adding that it does not distribute contaminated products and is confident in their “quality, effectiveness and safety”. The letter comes in a week when Merck’s stock has taken a bashing after the FDA rejected applications firstly for a proposed fixed combination of Singulair (montelukast) and S-P’s Claritin (loratadine) as a treatment for allergic rhinitis and secondly for its new cholesterol compound MK-0524A (extended-release niacin/laropiprant).