E7 toxoid

关注并星标CPHI制药在线       目前，预防性人乳头瘤病毒(HPV)疫苗研发技术日趋成熟（相关阅读：《预防性人乳头瘤病毒（HPV）疫苗研究应用现状》），随着疫苗覆盖率的提高， HPV 相关疾病的发病率也逐步减少。不过，晚期和复发的宫颈癌患者预后仍然较差，死亡率较高，开发HPV的治疗性疫苗并用来治疗HPV 感染导致的宫颈上皮内损害以及宫颈癌成为当前研究的热点。       治疗性疫苗不同于预防性疫苗，其旨在诱导细胞介导的免疫反应，而不是产生中和抗体。HPV治疗性疫苗是一类打破慢性感染者体内免疫耐受，重建或增强免疫应答从而治疗 HPV 感染，阻断由 HPV引起的癌前病变和促进病变组织消退的新型疫苗。一般来说，治疗性疫苗以多种形式包含E6、E7抗原，并将这些抗原传递给局部抗原递呈细胞（APCs），进一步通过MHCⅠ类和MHCⅡ类分子刺激抗原表达，从而产生CD8+细胞毒性T细胞（CTL）或CD4+辅助T细胞（Th）反应。E6、E7抗原在被APCs 的MHCⅠ类分子识别之前，先在 APCs被蛋白酶加工、消化成更小的肽段。重要的是，并不是所有的这些肽段都能成功加载到 MHC分子进而被特异性的T 细胞识别。只有一些含有特定抗原表位的肽段能高亲和力地结合到MHC分子，并与能引起免疫反应的特异性T 细胞的受体（TCR）发生相互反应。目前，大多数治疗性HPV疫苗致力于诱导E7抗原的免疫反应，因为在临床前模型中，E7抗原免疫反应性比E6抗原更好。       治疗性HPV疫苗研究现状       在HPV慢性感染导致宫颈上皮内损害以及癌变的过程中，通常存在致癌蛋白E6、E7的持续表达。所以目前存在多种针对靶抗原E6、E7的治疗性疫苗，其疫苗类型包括活载体疫苗、蛋白或多肽疫苗以、核酸疫苗以及细胞疫苗等，且不少疫苗的研发工作已进入临床前模型和临床试验阶段。       1、活载体细菌减毒疫苗       活载体疫苗分为细菌或病毒载体疫苗。这些载体在机体内复制，促进了抗原的传播。活载体疫苗有很高的免疫原性，可以产生强烈的细胞和体液免疫反应。他们还可以将E6、E7抗原递呈给抗原递呈细胞（APCs），促进主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ和Ⅱ类分子识别抗原。但是，活载体疫苗有潜在的安全风险，尤其是在免疫力低下的人群中。此外，重复接种相同的活载体疫苗后，产生的免疫反应疗效是有限的。       细菌载体主要包括单核细胞增多性李斯特菌( Listeria monocytogenes，Lm) 、乳杆菌属和沙门菌等。李斯特菌是一类革兰阳性胞内病原体，可诱发固有免疫和获得性免疫，对病毒和寄生虫的感染起到保护机体的作用，作为载体在免疫治疗中具有以下优势：其一可感染巨噬细胞而不被其捕获，具有在 MHC I 和 MHC II 途径中递送抗原的能力，其二通过分泌李斯特菌溶血素( listeriolysin，LLO) 来逃脱吞噬体的吞噬作用。Lm 是一类应用广泛和具有代表性的载体，目前基于Lm 的疫苗已经在大量的临床试验中开展，ADXSⅡ-001 是一种基于HPV16 E7抗原的灭活减毒李斯特菌载体疫苗，可用于治疗HPV相关的口咽癌、宫颈癌和高级别宫颈上皮内瘤变患者。干酪乳酸杆菌( Lactobacillus casei，L. casei) 是另一种常见的细菌载体，在疫苗制备过程中，编码 HPV-E7 的基因被转导至L.casei 表达 E7 蛋白，可被黏膜中APCs识别并递呈给CTLS而诱发细胞免疫。       病毒载体主要包括腺病毒、腺相关病毒、α病毒、慢病毒和牛痘病毒等，通过基因工程方法担载编码HPV E6 /E7 的基因序列而发挥递送靶抗原的作用。TG4001 是一种基于重组修饰牛痘病毒( modified vaccinia virus Ankara，MVA) 为载体的疫苗，在一项临床试验中被用于治疗 HPV-16相关性 CIN2/3的患者。RNA 复制子疫苗的制备是利用 RNA α 病毒作为载体，该类病毒包括辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SIN)、委内瑞拉猪脑炎病毒( Venezuelan equine encephalitis virus，VEE) 和塞姆利基森林病毒( Semliki forest virus，SFV)。RNA 复制子能够自我复制，从而诱发抗原的持续表达和增加免疫原性。       2、蛋白或多肽疫苗       多肽和蛋白质疫苗中的多肽和蛋白质组分是从HPV 抗原分离出来的，经由树突状细胞（DCs）处理后，被递呈给 MHCⅠ或Ⅱ类分子，能有效刺激CD8+或CD4+T细胞的免疫应答。多肽和蛋白质疫苗安全稳定，易于生产，显示了巨大的应用前景。       蛋白疫苗免疫原性较弱，主要通过 MHC II 路径递呈抗原诱发抗体产生，而不是产生 CTL 的免疫应答。近几年来开展的研究主要关注TA-CIN、GTL001( ProCervix) 和 TVGV-1 等蛋白疫苗。TACIN 是一种 HPV-16-E6 /E7 /L2 融合蛋白疫苗，通过联合使用佐剂( GPI-0100) 和顺铂，在 HPV-16 E6 /E7阳性的小鼠模型中诱导了治疗性免疫应答。GTL001 是一种将重组 HPV-16/18-E7 蛋白融合至无催化活性的百日咳博德杆菌CyaA中的治疗性疫苗。一项 I期试验结果表明，在具有正常细胞学形态的 HPV-16/18 感染的女性患者中，间隔6周皮内注射一次 600μg GTL001，并在注射部位联合局部使用咪喹莫特软膏，经过两次治疗能有效清除 HPV-16 /18。TVGV-1 是一种基于HPV-16 E7 抗原的融合蛋白，在临床前试验中联合佐剂( GPI-0100 和 CpG 寡聚核苷酸) 诱导了强烈的抗原特异性 T 细胞免疫应答。       多肽疫苗免疫原性弱，常需借助一些免疫佐剂或脂质体来增强其治疗效能。多肽类疫苗呈MHC特异性，在治疗之前需确定患者抗原的特定表位。肽类疫苗种类繁多，其核心是使用HPV-16 E6和/或E7的多肽作为抗原，代表性的疫苗主要包括 PepCan、HPV16-SLP、GL-0810、PDS0101 和 DPX-E7 等。PepCan 包含四种合成性多肽，并添加了白色念珠菌提取物作为佐剂，可通过皮内注射进行接种。HPV16-SLP 是一种合成的长肽链疫苗，研究认为，在 HPV-16 E6 /E7 阳性的 CC 患者中，使用卡铂-紫杉醇化疗以后再进行该疫苗接种可促进疫苗诱导的 T 细胞反应。GL-0810 是一种 HPV-16 特异性多肽疫苗，制备过程中添加了粒-巨噬细胞集落刺激因子和Montanide 佐剂，用于皮下接种治疗头颈部复发/转移性鳞状细胞癌。PDS0101是基于 HPV-16 E6 /E7 多肽开发，其在高危型 HPV 感染和CIN 1女性患者中的治疗安全性和耐受性正在评估中( NCT02065973，I 期)。此外，DPX-E7 也正应用于HPV-16 E7和 HLA-A*02 阳性的口咽癌、CC 和肛门癌( NCT02865135，Ib /II期) 患者的临床试验中。       3、核酸疫苗       核酸疫苗包括DNA 和RNA 疫苗，可以多次接种。DNA 疫苗的优点是安全、稳定及易批量生产，比RNA 疫苗在细胞内的抗原表达持续时间更长，常用于肌肉注射。其缺点主要是在肌注过程中，容易被心肌细胞摄取，阻断了诱导持续的免疫原性。此外，递送的DNA体内转染效率有限，故免疫原性较弱。随着基因工程技术的发展，可以在载体抗原序列上加上辅助因子促进序列的有效表达。趋化性抗原DNA疫苗是一种新型DNA肿瘤疫苗。将HPV16E7基因与趋化因子SLC和IgG的Fc片段融合表达，SLC可吸引DC，T、B 淋巴细胞，并且 DC 细胞通过 Fc 受体可高效捕获融合抗原，促进抗原提呈作用。该DNA疫苗能通过CD4+和CD8+T细胞依赖途径诱发强烈的抗肿瘤免疫反应。另一种pNGVL4a-CRT/E7 疫苗由编码HPV16 E7与钙网蛋白Calreticulin(CRT)序列的 pNGVL4a 表达载体构成。CRT 是热休克蛋白家族成员之一。该疫苗可用于治疗高级别宫颈上皮内瘤变，32例HPV16阳性的CIN2/3患者参加的初步研究显示该疫苗具有可行性、安全性、良好的耐受性和潜在的临床价值。此外，在 HPV16 和 HPV18 阳性 CIN2/3 期患者中开展的随机双盲Ⅱb临床试验显示，编码HPV16和HPV18 E6和E7基因片段的DNA疫苗VGX-3100是第一个对HPV16 和HPV18 阳性CIN 2/3 期患者有效的治疗性疫苗，可用于CIN2/3患者的非手术治疗。       与DNA 疫苗相比，RNA 疫苗不会被整合到宿主的染色组中，亦不会诱导细胞转化， 但是其不够稳定。目前，尚未有开展RNA 疫苗治疗HPV 相关性疾病的临床试验相关报道。       4、细胞疫苗       基于HPV16/18 E7抗原的树突状细胞疫苗的安全性和免疫原性在Ⅰ期临床试验得到证实，已进入Ⅱ期临床试验阶段。有学者给予10例IB或ⅡA的宫颈癌患者重组的HPV16/18 E7抗原冲击致敏的自体DC，免疫后发现在受试者体内均产生了 E7 的特异性CD4+T 细胞反应并产生了抗体反应。此外，过继细胞免疫治疗技术也不断发展，研究结果显示，9例转移性宫颈癌患者注入肿瘤浸润性T淋巴细胞后，有2例患者病变完全消退。       用疫苗进行免疫治疗是一种很有前景的癌症治疗方法，在宫颈病变及宫颈癌患者中，治疗性疫苗的使用与癌变前损害的转归以及临床预后密切相关。与传统治疗相比，治疗性疫苗有巨大优势和可行性，具有良好的发展前景。HPV治疗性疫苗研究进展相对缓慢，还处于动物实验或临床试验研究阶段。治疗性疫苗的机制比较复杂，例如肿瘤患者往往免疫功能低下，疫苗可能难于有效激活免疫系统，另外疫苗的安全性，肿瘤细胞和受 HPV感染细胞的免疫逃逸也是必须考虑的问题。       参考资料       [1]封婕,高玲娟,许豪勤,吴玉璘,林宁,闫林萍,钟天鹰.HPV治疗性多肽疫苗的研究进展[J].中国计划生育学杂志,2018,26(01):63-69.       [2]曾明,邓列华.HPV感染治疗性疫苗新进展[J].皮肤科学通报,2020,37(04):369-374+4.       [3]赵爽, 赵方辉. HPV治疗性疫苗研究进展[J]. 中华预防医学杂志, 2018, 52(5):5.         作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。智药研习社近期课程报名来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~

提到 HPV 疫苗，相信大家首先想到的是预约难，接种难。尽管 HPV 预防性疫苗经过数十年的商业化，已经成为全球最畅销的非新冠疫苗单品，但是，国内 HPV 疫苗接种率普遍较低，供不应求，需求市场非常广阔。目前，国内已经获批上市 5 款预防性 HPV 疫苗：2016 年，GSK 的 2 价 HPV 疫苗成为国内首个获批上市的 HPV 疫苗；2017-2018 年，默沙东的 4 价/9 价 HPV 疫苗相继获批上市；2019 年和 2022 年，万泰生物和沃森生物的国产 HPV 疫苗分别获批上市。大部分人乳头瘤病毒（HPV）的感染是暂时性的，机体免疫系统能够快速清除病毒，但是，在 5%-10%女性感染者中，HPV 会变为持续性感染，从而触发癌变。HPV的持续性感染与宫颈癌的发生密切相关，而宫颈癌在女性最常见的癌症类型中位列第四。HPV 的感染还与其他类型的癌症发生有关，包括外阴、阴道、肛门、阴茎的肿瘤以及头颈部癌症。E6 和 E7 蛋白是人乳头瘤病毒感染细胞后在感染早期阶段产生的具有致癌作用的 2 种蛋白质。高危型 HPV 主要通过性传播而引起生殖部位及其他部位的恶性肿瘤，其致癌机制主要是 HPV 病毒 DNA 整合入细胞基因组，由于其 E2 基因表达障碍不能有效抑制 E6、E7 基因转录而持续高表达 E6 和 E7 2 种癌蛋白，扰乱细胞周期、抑制细胞凋亡并活化端粒酶使细胞永生化，以上机制最终导致受感染细胞发生恶性转化或癌变。因此，当前许多处于临床前或者临床试验中的针对 HPV 的治疗性疫苗将靶点锁定在 E6 和 E7 上。早在 2019 年，BioNTech 研究团队 Ugur Sahin 等人就设计出 E7 RNA-LPX HPV 治疗性疫苗，当 HPV 16 阳性小鼠接种 E7 RNA-LPX 疫苗后，能够完全清除肿瘤组织，建立保护性的 T 细胞记忆反应。到 2021 年，Moderna 研究团队 Eric Huang 等人又构建出能够充当基因佐剂的编码 STINGV155M 的 mRNA，用来增强编码 E6/E7 癌蛋白的 mRNA-LNP 疫苗的抗肿瘤效果，抑制 HPV TC-1 肿瘤细胞的生长，延长疫苗接种小鼠的存活时间。治疗HPV-16阳性的头颈部鳞状细胞癌的编码anti-CD40的mRNA疗法正处于临床1/2试验中。2023 年 3 月 3 号，巴西圣保罗大学 Luís Carlos de Souza Ferreira 教授、宾州大学 Norbert Pardi 教授、BioNtech 团队成员以及 Acuitas Therapeutics 团队成员联合在 Science Translational Medicine 发表文章：Single immunizations of self-amplifying or non-replicating mRNA-LNP vaccines control HPV-associated tumors in mice，他们设计出编码 HPV-16 E7 癌蛋白和 HSV1 疱疹病毒糖蛋白 gD7 融合蛋白 gDE7 抗原的 mRNA-LNP 疫苗，包括修饰/非修饰常规 mRNA(nr-RNA)以及自复制 mRNA（saRNA）3 种 mRNA 疫苗类型，在荷瘤小鼠模型和原位肿瘤小鼠模型中对 gDE7 mRNA-LNP 疫苗的免疫原性和抗肿瘤效果展开研究，并且与重组蛋白疫苗和 DNA 疫苗进行了头对头比较。👀   比较常规 mRNA 与自复制 mRNA 翻译性能研究人员发现，在 HEK293T 细胞中，编码 Luciferase 或者 gDE7 蛋白的未修饰尿嘧啶核苷酸-自复制 mRNA（sa-mRNA）的蛋白翻译能力要优于编码相应蛋白的未修饰或者修饰尿嘧啶核苷酸-常规 mRNA(nr-mRNA)；相反，在 DC 细胞中，修饰尿嘧啶核苷酸-常规 mRNA 的蛋白翻译能力要明显好于未修饰尿嘧啶核苷酸-常规 mRNA 或者自复制 mRNA，而且，未修饰尿嘧啶核苷酸-自复制 mRNA 在 DC 细胞中基本无法表达蛋白。比较未修饰/尿嘧啶核苷酸-常规 mRNA(nr-mRNA)与自复制 mRNA(sa-mRNA)在不同细胞中的蛋白翻译效率。在小鼠体内，肌肉注射 LNP 包封的编码 luciferase 的常规 mRNA 或者自复制 mRNA，未修饰/修饰尿嘧啶核苷酸-常规 mRNA 在小鼠体内第一天的荧光信号最强，随后逐渐衰减，到第七天时，荧光信号已经将至极低，但是，修饰尿嘧啶核苷酸-常规 mRNA 所翻译出来的荧光蛋白量要比未修饰尿嘧啶核苷酸-常规 mRNA 高出 10 倍。与常规 mRNA 相比，编码 luciferase 的自复制 mRNA 所翻译出来的荧光蛋白量要低很多，但是荧光信号可以一直持续到第 23 天。比较 LNP 包封未修饰/尿嘧啶核苷酸-常规 mRNA(nr-mRNA)与自复制 mRNA(sa-mRNA)在小鼠体内的荧光蛋白翻译动力学特征。👀   gDE7 mRNA-LNP 疫苗触发特异性的 CD8+T 细胞反应研究人员发现，在皮下荷瘤模型中，3 种类型的 gDE7 mRNA-LNP 疫苗能够触发强烈的 E7 特异性的 CD8+T 细胞反应，从而表现出明显的抗肿瘤活性。与接种 Luc mRNA-LNP 空白对照组相比，CD8 敲除的小鼠接种 gDE7 mRNA-LNP 疫苗展现出活跃的肿瘤组织生长，没有任何小鼠能够在肿瘤压力测试中存活下来。相反，CD4 敲除的小鼠接种任意类型的 gDE7 mRNA-LNP 疫苗均能展现出部分的肿瘤生长抑制效果，70%的疫苗接种小鼠在肿瘤压力测试中可存活至第 90 天。总的来说，gDE7 mRNA-LNP 疫苗的抗肿瘤治疗效果依赖于 CD8+T 细胞，而特异性的 CD8+T 细胞的诱导则通过 CD4+T 细胞依赖/非依赖途径。gDE7 mRNA-LNP 疫苗触发的抗肿瘤效过由 CD8+T 细胞介导。👀   皮下荷瘤模型TC-1 细胞为含有 HPV16 型 E6 / E7 基因的小鼠肺上皮细胞,通过接种 TC-1 细胞也可以构建进行肿瘤实验研究的宫颈癌动物模型。当研究人员给皮下移植 12mm2TC-1 细胞的小鼠接种 5ug Luc-m1Ψ -nr-mRNA 后，可观察到肿瘤组织的持续增殖，小鼠在 35 天时全部死亡。相反，当小鼠接种 5ug 3 种任意类型的 gDE7 mRNA-LNP 疫苗后，60%的小鼠出现肿瘤细胞的清除，并且可以存活至少 100 天。令人欣喜的是，当 gDE7 mRNA-LNP 疫苗的接种剂量降低至 1ug 或者 0.1ug 时，依然可以延缓肿瘤生长，延长小鼠存活时间，小鼠存活率（接种疫苗后的第 100 天）可分别达到 40%和 20%。在小鼠体内接种单剂量 gDE7 mRNA-LNP 疫苗可清除已形成的肿瘤细胞，并且呈现剂量效应。👀   叶鞘和舌下原位肿瘤模型与皮下荷瘤模型相比，将肿瘤细胞直接注射到相关的生理部位构建肿瘤模型，要比皮下荷瘤模型能更好地反应肿瘤在体内的发展以及转移过程。当 TC-1-luc 细胞注射到小鼠叶鞘部位 3 天后，开始注射 5ug gDE7 mRNA-LNP 疫苗进行治疗。接种 gDE7 U nr-mRNA-LNP 疫苗和 gDE7 sa-mRNA-LNP 疫苗展现出强烈的抗肿瘤效应，在接种疫苗后的第 14 天，所有小鼠的肿瘤组织均出现消退。gDE7 m1Ψ nr-mRNA-LNP 疫苗在原位肿瘤模型中触发的肿瘤治疗效果要比皮下荷瘤模型中弱，80%接种该类型疫苗的小鼠出现了肿瘤组织的完全消退。gDE7 mRNA-LNP 疫苗的抗肿瘤效果与其触发的分泌 IFN-γ CD8+ T 细胞密切相关。在舌下原位肿瘤模型中，接种 5ug gDE7 U nr-mRNA-LNP 疫苗和 gDE7 sa-mRNA-LNP 疫苗也呈现出相似的结果，60%的 gDE7 m1Ψ nr-mRNA-LNP 疫苗接种小鼠出现肿瘤组织的完全消退。gDE7 mRNA-LNP 疫苗在原位肿瘤小鼠模型中具有抗肿瘤保护效果👀   与 DNA 或者重组蛋白 HPV 疫苗相比在皮下荷瘤小鼠模型中，研究人员给小鼠分别接种 5ug 3 种类型的 gDE7 mRNA-LNP 疫苗、30ug gDE7 重组蛋白疫苗以及 5ug 编码 gDE7 的质粒 DNA 疫苗。所有接种疫苗的小鼠均能触发 E7 特异性的分泌 IFN-γ的 CD8+ T 细胞，并且在接种疫苗 2 周后达到峰值。然而，接种 gDE7 mRNA-LNP 疫苗触发的特异性的 CD8+ T 细胞比例要比接种重组蛋白疫苗或者 DNA 疫苗更高。80%接种 gDE7 mRNA-LNP 疫苗的小鼠出现肿瘤组织的完全消退，并且可以存活到第 90 天（移植肿瘤后），与此相反，接种单剂重组蛋白疫苗或者 DNA 疫苗的小鼠均出现死亡，无法存活到第 90 天。比较 gDE7 mRNA-LNP 疫苗、重组蛋白疫苗以及 DNA 疫苗的免疫原性以及抗肿瘤效果。👀   结论这篇文章最吸引人的地方在于接种单剂量的 gDE7-mRNA-LNP 疫苗能触发 E7 特异性的 CD8+ T 细胞，防止肿瘤组织的进一步恶化。而且，在皮下荷瘤模型和原位肿瘤模型中，接种单剂量的 gDE7-mRNA-LNP 疫苗能够完全消退肿瘤组织，展现出强烈的抗肿瘤效果。此外，在免疫原性和抗肿瘤效果上，gDE7-mRNA-LNP 疫苗要明显优于接种重组蛋白疫苗或者 DNA 疫苗，为 gDE7-mRNA-LNP 作为一款治疗性 HPV 疫苗的进一步临床试验奠定坚实的基础。此外，研究人员还比较了修饰/未修饰常规 mRNA 和未修饰自复制 mRNA 在不同细胞中的蛋白翻译效率。3 种类型的 mRNA 在 HEK293 细胞中均能够高效翻译蛋白，然而，在拥有多种 RNA sensor 的 DC 细胞中，翻译效率展现出明显的差异。纤维素纯化已经去除掉 IVT 反应产物中的双链 RNA，但是，未经修饰的 mRNA 依然能够被细胞的 Toll 样受体 7/8 识别。因此，与修饰 mRNA 相比，未经修饰的常规 mRNA 或者自复制 RNA 在 DC 细胞的蛋白翻译能力要减弱很多。尽管 m1Ψ nr-mRNA 在原代细胞中具有非常高效的翻译效率，但是肌肉注射后触发的免疫效果同 U-sa-mRNA 或者 U-nr-mRNA 是相似的。总体来说，mRNA 疫苗触发的免疫反应的强弱取决于接种路线、转染细胞类型、抗原表达持续时间等多种因素。