Epoetin alfa biosimilar(United Biomedical, Inc.)

必须对生物制品进行严格的物理化学和生物方法分析，以确保它们含有最低水平的宿主细胞蛋白 (HCP) 和其它与工艺相关的杂质。在此前的文章中，我们调查了有关 HCP 的相关文献、其免疫原性背后的机制，以及它们对患者安全的最终影响。这里，我们将重点介绍已发表的案例研究，以探讨检测、识别和量化此类杂质的挑战。这些例子表明，关于 HCP 如何与免疫反应相关以及如何预测免疫原性潜力，还有很多方面有待了解。体外试验的新信息和改进可以加强对现在无法检测到的安全问题的预防。治疗性蛋白质和 HCP 的首次关联HCP 仍然是生物制品开发中的一个重要问题。尽管商业可用性已近 40 年，但生物制品仍然缺乏 HCP 限制的官方范围。仔细研究有助于理解此类担忧的根源。图 1：重组人生长激素 (rhGH) 产品中大肠杆菌多肽 (ECP) 的存在与治疗患者体内抗 rhGH 抗体的诱导相关，并有佐剂作用的证据。上图绘制了用 somatren 和 ECP（S1、S2 和 Somatonorm）制剂治疗的患者的抗 ECP 抗体数量，以 Z 分数表示。每个 Z 分数是治疗患者中抗 ECP 抗体除以标准血清中抗 ECP 抗体的商。下图显示了每种制剂的最后有效血清稀释度的 log10 值。Bierich 的团队于 1986 年对重组蛋白药物产品中的 HCP 进行了初步分析。他们研究了三种用于垂体低下儿童的重组人生长激素 (rhGH) 制剂。样品含有不同量的称为大肠杆菌多肽 (ECP) 的 HCP：190–1400 ng ECP/小瓶 (S1)、30–170 ng/小瓶 (S2) 和 2–10 ng/小瓶 Somatonorm（somatren、Kabi Vitrum）（S3）。研究小组确定抗 ECP 抗体主要在接受 S1 和 S2 制剂的儿童中产生。在给药后六个月，S1 的抗 ECP 抗体数量最多，Z 分数 > 0.7。因此，结果表明 ECP 浓度与抗 ECP 和抗 rhGH 抗体的产生相关（图 1）。含有最高 ECP 浓度并在给药后产生最大数量抗 rhGH 抗体的制剂 S1 在接受治疗的儿童中诱导了最高的生长率。它还记录了比 S2 略低的标准偏差 (SD)（但仍显示出比 somatrem 产品更高的 SD）。正如该团队在研究中报告的那样，“制剂 S1 显示了最好的结果。”然而，在短期 1 期临床试验期间，科学家注意到在接受 S1 治疗的 28 名患者中，有两名患者在注射部位（肌肉注射）出现严重的过敏性皮肤反应。在 S2 或 S3 的实验期间没有报告过敏反应。已知细菌蛋白，如肽聚糖、鞭毛蛋白、菌毛和菌毛蛋白，在与 toll 样受体 (TLR) 结合时会诱导强烈的免疫原性反应。Palm 和 Medzhitov 研究表明，与脂多糖 (LPS) 混合的非免疫原性蛋白质人血清白蛋白 (HSA) 可以通过 TLR4 信号转导诱导免疫原性抗体反应。值得注意的是，半抗原化蛋白可以诱导独立的 T 细胞反应。在同一组实验中，Palm 和 Medzhitov 证明半抗原化 HSA 可以诱导对二硝基苯化 HSA (DNP-HSA) 而非标准 HSA 的强烈 CD4+ T 细胞和抗体 IgG1 和 IgG2c 反应。关于 Bierich，目前尚不清楚抗 rhGH 抗体是否是由蛋白质聚集体、N-末端甲硫氨酸或 ECP 通过 TLR 诱导的。此外，这些实验不包括相同数量的患者：12 名儿童（而不是 28 名）接受了制剂 S2，9 名儿童接受了 S3。无法消除招募患者中过敏诱导的偏倚，因为预计此类反应会在大量人群样本中发生。当代关于蛋白质免疫原性的研究指出，聚集是引发针对 rhGH 和其它生物治疗药物的免疫反应和抗药抗体 (ADA) 的主要因素。该声明的实验基础在于 Mitchinson 的观察，其将牛血清白蛋白 (BSA) 溶液高速离心过夜，次日取上清液给家兔静脉注射，结果免疫耐受。随后，将沉淀重新悬浮并注射到兔子体内，诱导强烈的抗 BSA 反应。无法验证 Bierich 研究中的样品是否纯化了 HCP 和/或聚体。然而，值得注意的是，那些大肠杆菌衍生的 rhGH 制剂是 N-末端甲酰甲硫氨酸-GH 分子。已知此类蛋白质具有免疫原性，并对蛋白质稳定性构成威胁。因此，在使用各种蛋氨酸肽酶、氨肽酶或亮氨酸氨肽酶的制造过程中，N 末端氨基酸通常会从治疗性蛋白质上剪下。Bierich 研究的另一个有趣考虑是 somatrem 产品 (S3) 不会诱导中和 ADA。研究作者认为，ECP 可能通过类似于活疫苗的佐剂活性诱导免疫原性反应。实际上，弗氏佐剂（冻干结核分枝杆菌的乳剂）、单磷酰脂 A (MPL-A)、LPS、解毒 LPS 和脂肽都可以诱导与非免疫原性蛋白质的强烈免疫原性交叉反应。那么，也许我们有一个新的免疫原性诱导模型。此外，HSA 和 LPS 被不完全弗氏佐剂（缺乏结核分枝杆菌）乳化，这有助于辅助反应。其它疫苗研究指出，要有效诱导与免疫原性蛋白的交叉反应，需要该蛋白存在于与聚（乳酸-乙醇酸共聚物）(PLGA) 混合的纳米颗粒中，有或没有 MPL-A （TLR4 的诱导剂），以及可以激活多个 TLR 的整个抗原（例如，TLR4 和 TLR7）。否则，抗体滴度不显著。Huang等描述了一种生物分析方法，其中人类胚胎肾 (HEK) 细胞（具有活性 TLR）被未说明的样本激活，诱导白细胞介素 (IL)-8 和 IL-6 的表达水平与加入鞭毛蛋白的样本相似。该结果表明 TLR 可以被 HCP 激活。这只是一种推测，但在 Bierich 的研究中，折叠/展开/聚集的 rhGH 与 ECP 的相互作用可能会形成复合物，进而刺激结合抗体的产生。事实上，错误折叠的蛋白质和聚体总是会诱发免疫原性反应。尽管该途径还不是很清楚，但边缘区 B (MZB) 细胞与这种 T 细胞非依赖性反应有关。最终，ECP 的性质对于诱导抗 rhGH 抗体至关重要。对 ECP 身份、中和抗体 (NAb) 和 rhGH 复合物和/或聚体的进一步研究将有助于阐明 HCP 与免疫反应的关系。Somatrem 产品在很大程度上已被与天然激素几乎相同的 rhGH 所取代。根据此处提供的证据，HCP 的免疫原性似乎在 Bierich 案例中发挥了关键作用。但除了特应性过敏反应外，患者没有报告对各自治疗的其它不良反应。非格司亭产品中的 HCPWadhwa 和合作者研究了两种非格司亭（filgrastim）产品的成分。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 的重组版本，非格司亭用于增强造血祖细胞的增殖和分化，并调节单核细胞、中性粒细胞和单核细胞的效应功能。该蛋白质在大肠杆菌细胞中过表达。Wadhwa 的团队确定，一种产品诱导了约 95% 的 NAb，而另一种则诱导了约 74%。用来自接受过治疗的患者的抗血清对第二种 GM-CSF 产品进行体外预处理，产生了针对与 GM-CSF无关的蛋白质的抗体。因此，在这种情况下，NAb 似乎与 HCP 相关。杂质经测定具有约 20 kDa 和 30 kDa 的分子量。研究人员还发现，这两种大肠杆菌衍生蛋白对 GM-CSF 性能没有影响；相反，只有中和 GM-CSF 的抗体才会影响产品的临床反应。尽管研究中未提及，但产品可能含有 N 末端甲硫氨酸，这可能是诱导 NAb 的主要原因。此外，由于缺乏糖基化，在大肠杆菌中表达的蛋白质可能不溶或无活性。这些因素会导致 GM-CSF（一种不稳定的蛋白质）聚集。Wadhwa 等人未观察到过敏样不良反应。那篇文章经常在文献中被引用，它与 HCP 免疫原性的佐剂理论相矛盾。然而，HCP 在诱导 ADA 的辅助作用中的作用可能是一个有趣的研究领域。生物仿制药中的 HCP在开发 Sandoz 的 Omnitrope 产品（一种rhGH生物仿制药）的早期，临床数据显示接受该产品的患者中有 57% 产生了非中和抗体，并且所有患者都产生了抗 HCP 抗体。随后为降低 HCP 水平所做的努力被证明成功地将 ADA 降低至 2%，这一水平与创新产品辉瑞的 Genotropin（somatropin）相当。佐剂效应归因于通过液相色谱串联质谱法 (LC-MS/MS) 鉴定的核糖磷酸异构酶的存在，估计水平为 1,400 ng/mg 蛋白质。免疫印迹仅显示一条带，暗示存在单一杂质。然而，当时无法遵循官方参考，也没有官方指南来了解如何执行分析和免疫学方法。同样，HCP 对 N-末端甲硫氨酰-rhGH 的辅助作用尚不清楚。扩展纯化方案可以消除 rhGH 聚体；氧化、环化或消除反应以及rhGH 片段的展开结构 - 它可以像 HCP-rhGH 复合物/聚体一样诱导 ADA，尽管这在研究中没有得到证实。（LPS 和 CpG DNA 也是如此，它们不是蛋白质）。Omnitrope 研究的作者提到执行了完整的表征，他们得出结论，免疫原性和优化（非免疫原性）制剂之间的关键区别在于 HCP 的存在量。但是，无法验证该信息或重现这些实验。事实上，没有发现 HCP 和治疗性蛋白质之间的 NAb 交叉反应的其它例子。在这里，值得一提的是 Jones 等人的研究结果。在研究 N 末端甲硫氨酸 hGH 时，他们发现在产品制造过程中引入额外的纯化步骤后，患者的免疫原性反应减弱，没有与抗体形成相关的安全后果。该研究支持“免疫原性不是由于 N 末端甲硫氨酸或大肠杆菌蛋白质杂质，而是少量具有细微结构改变的 rhGH”。该结论表明治疗性蛋白质聚体与免疫原性问题相关。治疗性蛋白质的聚体可以诱导独立的 T 细胞反应。正如 Palm 和 Medzhitov 所表明的那样，宿主细胞和治疗性蛋白质的聚集复合物可能具有高度免疫原性。但据我们所知，还没有进行任何调查来直接证明辅助 HCP 假说。然而，前面引用的文章有一些共同的关键信息。有关源自大肠杆菌表达系统的 rhGH 的报告表明，HCP 会产生 ADA，而对在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中表达的产物的研究显示免疫原性诱导较低，但具有生物活性。这些观察结果表明，大肠杆菌 HCP 比真核宿主更“容易”诱导免疫反应。T 细胞增殖研究有关宿主细胞和治疗性蛋白质之间相互作用的潜在辅助作用的信息仍然是推测性和难以捉摸的。因此，安进的一组科学家设计并执行了专注于 HCP 和治疗性蛋白质相互关系的实验。抗原 (Ag) 在称为克隆扩增的过程中通过自分泌和旁分泌信号诱导 T 细胞增殖。T 细胞增殖与适应性细胞反应和炎症过程直接相关。Jawa等人使用体外比较免疫原性评估 (IVCIA) 测定法诱导 T 细胞增殖，使用三种不同的 MAb 混合不同的 HCP，数量范围从 4,258 ppm 到 396 ppm。这些杂质代表了来自 CHO 细胞的 139 种蛋白质。使用疏水相互作用层析纯化 MAb，HCP 水平降至 44 ppm 至检测不到的水平。IVCIA 测试表明，具有高和低 HCP 浓度的 MAb 样品之间没有差异的 T 细胞增殖（图 2）。即使是 ~4,300 ng HCPs/mg MAb 的水平也没有比治疗性蛋白质本身观察到的更明显的免疫反应。图 2：在用不同单克隆抗体 (MAb) 治疗 5 至 8 天后，健康人的体外比较免疫原性评估 (IVCIA)；下面的曲线表示在与混合了不同水平宿主细胞蛋白 (HCP) 的“MAb 2”样本孵育后，T 细胞捕获的氚化胸苷信号。该实验堪称典范；然而，它并没有对特定的 HCP 进行鉴定 - 而且，正如我们所知，特定杂质的存在对于诱导免疫原性反应至关重要。此外，由于人类受试者在典型条件下不会暴露于 CHO 细胞，并且因为 CHO 细胞不是表面存在病原体相关分子模式分子 (PAMP) 的感染性生物体。安全 HCP 的示例人们普遍认为，原料药中的 HCP 水平必须降至 1–100 ppm。然而，例外情况是可能的。Epoetin Hospira 是 Epogen 产品（一种重组人促红细胞生成素 (rhEPO)）的生物仿制药。美国食品和药物管理局 (FDA) 于 2018 年 5 月批准了该生物仿制药的商业化。HCP 含量占药品的 0.2–0.3%，反相高效液相色谱 (RP-HPLC)报告为约 2,000–3,000 ppm（ng HCPs/mg rhEPO）。FDA 要求 Hospira 提供有关药品中 HCP 的身份以及分析方法准确性和再现性验证的信息。制造商使用 RP-HPLC-MS 和基于胰蛋白酶消化的肽图分析将一种杂质鉴定为“嗅觉受体蛋白”。该机构要求在 Epoetin 产品标签上应用适当的警告，包括关于“严重过敏反应”和“严重皮肤反应”可能性的注释。FDA 还要求制定关于药品引起的不良事件的后续记录（药物警戒）。然而，从那以后，没有关于 Retacrit 类过敏反应的报告被提交，这表明 HCP 可能不会对患者造成危险。磷脂酶 B 样蛋白 2 (PLBL2)已知该蛋白质可与几种人源化抗体结合并共纯化。撰写了 lebrikizumab 产品中 HCP 问题 的基因泰克（现为罗氏子公司）科学家提到，尽管在早期临床测试期间使用该产品会产生针对 CHO 蛋白 PLBL2 的抗体反应，但未在患者中引起有害的免疫相关类过敏反应或过敏反应。尽管如此，在临床 2 期之后，基因泰克改进了产品的纯化工艺，以进一步降低 PLBL2 水平。在 2b 期研究期间，试验参与者暴露于约 9.1–82 µg/剂量（37.5–250 mg lebrikizumab/月）。这样的水平显示对 lebrikizumab 免疫原性没有影响，并且没有来自已鉴定的抗 PLBL2 抗体的后续影响。根据作者的说法，这里特别有趣的是，PLBL2 杂质无法通过酶联免疫吸附测定 (ELISA) 检测到。原文: V.P.M.Martínez, C.E.E.Garza, N.O.Pérez, Opportunities in the Field of Host Cell Proteins Part 3: Case Studies in Impurity Detection and Identification, Bioprocess International, 2022.在抗体圈微信公众号回复“JPM23”可下载60 家药企PPT合集。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

工艺相关杂质，如宿主细胞蛋白（HCP），可能会引起对生物药功效、质量和安全性的担忧，具体取决于其性质和水平。这里，我们将回顾有关HCP与患者安全性的相关文献，包括有关HCP相关免疫反应和不良临床事件的信息。HCP 对患者安全的影响至少5种HCP诱导的因素可以影响治疗性蛋白质的安全特性：免疫原性 - 在注射部位激活先天性或诱导适应性免疫反应，形成结合和/或中和抗体（分别为IgM和IgG），释放促炎细胞因子（例如肿瘤坏死因子α，TNFα）致敏性 - 与 IgE 诱导相关的早期过敏反应（例如过敏反应）和 IgE 非依赖性反应（例如，与细胞毒性 T 细胞 CD8+ 诱导相关的晚期反应），以及组织损伤的后果与治疗性蛋白质（折叠/未折叠/聚集）相互作用或结合的可能性，诱导与佐剂作用相关的结合和中和抗药物抗体（ADA）与重复模式相关的聚集潜力，可激活边缘区 B 细胞 （MZB） 激活生物活性潜力 - 例如，单核细胞化学吸引蛋白 1（MCP-1） 和转化生长因子 β1（TGFβ-1）。HCP诱导的免疫反应HCP本身可以产生极端的免疫反应。特别值得关注的是细菌HCP，如鞭毛蛋白和肽聚糖。来自E.Coli的HCP可以引起直接免疫反应，因为该物种是我们微生物群的一部分，并且广泛存在于人类周围的环境中。强烈且持续的免疫反应：要了解HCP如何诱导免疫反应，请考虑旨在诱导持续且强烈免疫反应的生物制剂：佐剂疫苗。没有佐剂，纯化的抗原（Ag）不会导致有效、持久的免疫。纯化的Ag通常与氢氧化物或磷酸铝、角鲨烯、CpG B类非甲基化DNA或脂质A单磷酸（MPL）混合，以诱导预期的反应。也有其它佐剂正在研究当中。氢氧化铝Al(OH)3是证明佐剂如何诱导免疫反应的一个很好的例子。它表现为微米级颗粒的聚集。巨噬细胞将这些微粒与针状细菌（2-10μm）混淆并吞噬它们。当疫苗皮下注射时，巨噬细胞迁移到注射部位并吞噬铝-Ag颗粒，然后在注射部位持续数月。研究还表明，巨噬细胞在疫苗注射后在其溶酶体中保留铝沉积物。含铝的骨髓细胞系和抗原呈递细胞（APC）分化成具有典型形态的成熟CD83 +树突状细胞（DC）。该过程是由白细胞介素（IL）4和12的自分泌以及调节性T（Treg）细胞的旁分泌诱导的。铝通过引起细胞坏死，激活溶酶体中的组织蛋白酶B，进而诱导炎性小体组装来激活巨噬细胞。炎性小体招募酶源-1，其寡聚并经历自蛋白水解。形成的半胱天冬酶-1消化pro-IL-1b和pro-IL-18。然后激活的IL促进基于2型辅助性T（Th2）细胞的炎症和适应性免疫反应。这一系列事件将更多的T细胞、DC、嗜碱性粒细胞和肥大细胞招募到创伤部位。嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒可增加细胞通透性、血球渗出和血管活性胺的分泌。通过自身，APC分泌IL，如前列腺素E2（PGE2），其诱导淋巴细胞T CD4 +分化和DC活化。一些T细胞成为记忆细胞，针对一些Ag提供持久的免疫。其它疫苗含有用变性剂（如甲醛）处理的活的和/或减毒的病毒或细菌成分。减毒疫苗可含有来自靶病毒的单链或双链 RNA、非甲基化 CpG DNA 或来自细菌的鞭毛蛋白、皮林蛋白、肽聚糖、外膜孔蛋白 （Omp）C、OmpF 和脂多糖 （LPS）。这些分子是免疫反应的强诱导剂。病原体相关分子模式 （PAMP） 在被 APC 吞噬后（通过角质形成细胞、成纤维细胞或 APC）在注射部位诱导应激信号。在通过模式识别受体（PRR）检测后，APC分泌干扰素（IF），并通过趋化性将更多的免疫细胞招募到该位点。与先天免疫应答相关的 PRR 包括C型凝集素受体核苷酸结合和寡聚结构域样受体（NODL）gxv视黄酸诱导基因I样受体Toll样受体（TLR）后一受体可以迅速触发强烈的免疫反应。例如，TLR4识别细菌LPS，触发转导信号，这些信号进入免疫细胞内的炎性小体机制组装，而在小鼠中TLR11可以检测鞭毛蛋白和profilin样蛋白。总之，为了引发免疫反应，APC必须吞噬HCP，然后在组织蛋白酶B、尿酸释放或其它免疫反应介质促进的应激后，处理并向主要组织相容性复合物II类（MHC II）分子（或人白细胞抗原（HLA）系统）递呈其Ag。减毒活疫苗药物产品不是用佐剂分子（例如铝）或其它增强免疫反应的物质制造的。美国药典-国家处方集第34章<1132>关于“生物制药中残留宿主细胞蛋白的测量”指出，对具有人源化HCP的动物的免疫必须使用适当的佐剂进行，可以是不完整或完整的弗氏佐剂，以引起足够的免疫反应。此外，强反应的剂量必须在每剂量5μg - 50μg之间，并存在佐剂。浓度低于该范围可导致无效，其中反应性T细胞耗尽，诱导耐受性。在此过程中，由于没有危险相关分子模式（DAMP）或自然发生的感染，克隆扩增受到抑制。不在药物配方中添加佐剂时，一些Ag不能在7.5μg的剂量下引起持续的免疫反应（因此炎症和/或过敏反应）。Ag被认为抗原性不足。也许 - 这是一种观点 - PAMP和DAMP的缺乏是一些药物产品仅显示结合抗体存在的原因。这也可以解释为什么一些产品产生T细胞依赖性反应（主要是IgG反应）或T细胞依赖性（IgM）反应，但没有中和抗体。HCP可以作为诱导剂吗？这似乎取决于它们的性质。值得一提的是，HCP相关免疫反应的所有报告都来自使用传统纯化工艺制备的E.Coli衍生产品。该表达系统产生所有上述分子信号，可以引发强烈的免疫反应。研究表明，E.Coli HCP 可通过 TLR 诱导免疫应答（例如，对 CpG DNA、甲酰基甲硫酰蛋白、LPS、肽聚糖和鞭毛蛋白）。此外，由于过表达的蛋白质形成包涵体，因此来自这些颗粒的杂质在纯化后很容易残留在药物底物/产品中。事实上，纯化过程不能完全去除HCP。与小蛋白质相关的免疫原性：现有数据与Janeway的理论相矛盾，即纯蛋白质在没有佐剂的情况下不会诱导免疫反应。如果重组治疗性蛋白质与天然蛋白质不一致，则它们可能具有免疫原性。在免疫治疗的早期，鼠单克隆抗体（mAb）被设计用于肿瘤治疗。美国食品和药物管理局（FDA）于1986年批准了第一个这样的产品，Orthoclone OKT3（Muromonab-CD3，Janssen- Cilag），用于治疗急性同种异体移植排斥反应。MAb与ADA发展相关的不良超敏反应有关。构建体的小鼠起源引起免疫反应。因此，使用常规杂交瘤技术开发了抗CD3小鼠抗体（Ab）的人源化版本。新结构12F6被证明比其原始结构的免疫原性要小。随后，研究人员过渡到开发嵌合、人源化和完全人化的mAb。一些产物保留了其免疫原性特征，即使它们是完全人源化的mAb。但并非所有的治疗方法都遇到过这样的困难。Amgen的Enbrel（依那西普）是TNF受体2（TNFR2）及其Fc结构域的融合蛋白，不会诱导免疫原性。对这一结果的解释是，这两个结构域都是100%人源的。虽然后来的例子提供了相互矛盾的数据，但mAb的免疫原性似乎与Ab的互补性决定区（CDR）有关，CDR诱导抗特异型抗体或具有非天然表位的蛋白质。这些例子引起了对治疗性mAb的严重关注。然而，对外来蛋白（例如，来自E.Coli、酵母或非人类哺乳动物细胞）的免疫原性似乎不是问题，除非它引起极端炎症或 IgE 反应。此外，免疫原性的研究表明，聚体对于诱导这种反应是必要的，并且诱导剂或“超级抗原”（如LPS）的存在可能是高度免疫原性的。世界各地的研发（R&D）部门都在努力克服这些问题。目前的纯化工艺可以将关键杂质降低到非常低的水平。然而，问题仍然存在：HCP-治疗性蛋白质复合物的形成能否加速免疫原性反应？与注射PAMP、DAMP和蛋白质-杂质混合的强烈免疫反应能否引发交叉反应？这些问题的答案一直难以捉摸。与IgE诱导和过敏反应相关的不良反应：预计会出现全身性过敏反应。HCP和治疗性蛋白质不是内源性的，因此可以诱发高血压、水肿、疲劳、虚弱、呼吸困难、头痛、恶心、呕吐、胸痛、皮肤反应、癫痫发作和其它过敏反应。一些针对Epoetin（epoetin alfa，Amgen）的临床研究表明，安慰剂诱导的注射部位过敏反应（12%，皮下注射）比参考产品（7%）更高。值得一提的是，其中一些反应与治疗性蛋白质本身有关，而不是与药物产品中存在的杂质有关。然而，生物制品可引起过敏反应等不良事件，在美国每年造成500 -1,000人死亡，在英国估计，每年每百万人有0.33人，在澳大利亚为每年每百万人约0.66人。过敏反应的主要原因包括药物（44%）、食物（31%）和昆虫叮蛰（23%）。因此，检测生物制药产品中的HCP水平至关重要。Ag必须具有特定的特征才能被视为过敏原。它们必须：稳定的蛋白质具有酶活性（例如蛋白酶活性）在低剂量下诱导反应（例如，IL-4感应器）具有高溶解度分子量低与 MHC II/HLA 系统有效交互必须吸入许多过敏原才能引起反应；然而，食物中的某些蛋白酶会在肠道中变得过敏。房屋尘螨粪便颗粒中的蛋白酶可以诱导具有相关过敏反应的IgE特异性信号。在小鼠中，注射活性蛋白酶，如木瓜蛋白酶，可以触发IgE反应。过敏原可能成为食品行业员工的职业危害，他们使用含有菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的肉类嫩化剂。过敏根据其免疫反应途径可分为4种类型：1 型 - 由肥大细胞的 IgE 激活介导2型 - 由针对细胞表面和基质的IgG抗体介导3 型 - 由 Ag–Ab 复合物介导4型 - 由T细胞介导过敏反应是加重的 1 型反应。Ag以低浓度通过某些途径（例如，在食品和小分子药物的情况下，口服或通过粘膜）传播，并被APC消化。然后，它们通过MHC II呈递给Treg细胞，诱导Th2表型的表达以及激活后IL-4，IL-13和CD154的分泌。在B细胞中，初始刺激触发从IgG到IgE产生的转换。浆细胞（分化的B细胞）释放的 Ab 与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和力 IgE 受体 （FcεRI） 结合，然后根据受影响的器官分泌负责典型哮喘和过敏样特征的介质，并具有相应的血管舒张或支气管收缩。在“经典过敏途径”中，IL-13和IL-33也由2型先天淋巴细胞（ILC2s）分泌。这些分泌的介质 - 即组胺（主要介质）、IL-4（由嗜碱性粒细胞分泌）、白三烯、前列腺素、β胰蛋白酶、血小板激活因子、细胞因子和趋化因子 - 是IgE免疫反应的主要介质。与过敏反应相关的不良反应包括细胞通透性，即间质液向细胞外区室移动。这种运动可诱发低血容量性休克，伴有呼吸困难、瘙痒、低血压、腹痛、晕厥、支气管痉挛，甚至最终的心力衰竭和死亡FDA报告了与小分子药物相关的过敏反应，如葡萄糖酸氯己定和马来酸阿塞那平。该机构还发布了有关小蛋白质的警告，例如重组人生长激素（rhGH）：据报道，使用生长激素产品会出现严重的全身性超敏反应，包括过敏反应和血管性水肿。关于Fiasp（速效胰岛素门冬胰岛素，Novo Nordisk），该机构指出任何胰岛素（包括 Fiasp）都可能发生严重、危及生命的全身性过敏，包括过敏反应、全身性皮肤反应、血管性水肿、支气管痉挛、低血压和休克，并可能危及生命。在临床计划中，在用Fiasp治疗的成年患者中报告了全身性超敏反应（表现为全身性皮疹和面部水肿）。1.7%的成年患者在使用Fiasp后报告有过敏性皮肤表现，包括湿疹、皮疹、瘙痒、荨麻疹和皮炎。英夫利昔单抗给药可产生 IgE 和 IgM ADA。在一项研究中，不良反应很少见，在71名受试者中只有3名发生。这种反应源于产品的嵌合源性。然而，在另一项研究中，61%的受试者对该产品产生了免疫原性。Xue等人在没有已知接触过生物制剂的受试者中，检测到了抗英夫利昔单抗中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系HCP的Ab。在这些Ab中，IgG1和IgG2亚类占主导地位，分别出现在67%和60%的研究参与者中。此外，40%的受试者对IgM亚类Ab有反应，但没有显示出显著的IgE活性。3名患者报告了由于抗英夫利昔单抗IgE和皮肤反应引起的严重反应。Ingerslev等人的一项研究表明，在用重组人血因子VIII（rhFVIII）治疗之前和之后，血友病患者中存在针对CHO HCP的Ab，尽管这种Ab没有被认为应对报告的不良事件负责。然而，抗rhfVIII Ab可以中和治疗，成为一个严重的质量问题。到目前为止，所有关于HCP相关过敏反应的报道都涉及聚集蛋白。HCP与治疗性蛋白质的相互作用可以诱导ADA的产生吗？另一个重要的危险因素是产生ADA的潜力，ADA可以结合或中和Ab。当HCP表现出相似的物理化学性质（例如，相似的等电点，pI）时，HCP可以与治疗性蛋白质一起洗脱。HCP可以与药物表面的疏水性区域建立范德华相互作用。该过程可以诱导反应性（免疫原性）表位的暴露治疗性蛋白质复合物可以指导针对HCP的交叉反应性抗体。这种交叉反应可以介导自身免疫过程，其中内源性蛋白质的水平可以被耗尽。例如，促红细胞生成素消耗可导致一种称为纯红细胞再生障碍（PRCA）的严重疾病，这是一种自身免疫性疾病，其特征为严重贫血、骨骼中红细胞前体缺失、促红细胞生成素无反应性，以及ADA的形成，这些ADA也中和了内源性促红细胞生成素1998年至2002年间，发生了12例严重的Ab介导的PRCA病例，其中11例涉及皮下注射Eprex（epoetin alfa，Johnson & Johnson），这是一种无血清白蛋白的促红细胞生成素制剂。这些病例与预装注射器中未涂覆橡胶柱塞的析出物有关。析出物产生乳浊液，形成促红细胞生成素聚集体，皮下注射诱发自身免疫性疾病。在塞子涂覆聚四氟乙烯后，PRCA的发生率降低了约90%。这个例子表明，涉及析出物、乳液和聚集体的相互作用可以诱发自身免疫性疾病。2017年的一项研究在128名接受重组人促红细胞生成素（rhEPO）治疗的患者中检测了ADA。只有3名受试者显示出贫血与ADA之间的相关性。现有数据显示一些可触发抗 rhEPO ADA的因素，包括胶束形成、析出物释放、制剂中存在甘氨酸和皮下注射，这与接受促红细胞生成素治疗的患者的 PRCA 事件有关。在疫苗中诱导免疫反应的实验表明，为了诱导对蛋白质的强烈反应，制剂必须包括LPS；其解毒对应物，单磷酸脂质A（MPL）；或至少一种合适的佐剂。自20世纪80年代以来，许多生物技术产品已经开始销售，从那时起的几年里提供了大量数据。可以随时使用监管机构的网站进行查询。在分发治疗产品后，严格的药物警戒方案有助于早期发现不良反应，例如由于生物治疗药物批次间的差异、特殊的患者反应以及患者亚群之间的差异（例如，临床试验中未评估的种族和其它因素）。在临床设施中，“过敏反应性测试”可以防止最严重的IgE介导和过敏样反应。从业者可以使用皮下穿刺进行此类测试，以获得快速的IgE反应或由于抗原阈值增加而导致的缓慢T细胞（CD8 +）反应性。早期过敏样追踪可以帮助确定对治疗性蛋白质的反应性，并追踪药物产品中存在的HCP、DNA或RNA。值得注意的是，目前还缺乏关于细菌蛋白（或来自其它表达系统的蛋白质）是否可以触发ADA以响应与治疗性蛋白质直接相互作用的研究。然而，研究人员已经开始将ADA与HCP和治疗性蛋白质络合引起的药物产品功效损失联系起来。生物活性：Beatson等人的一项研究表明，TGFβ-1在CHO-K1细胞中的组成性表达。该蛋白在低浓度下显示出生物活性。在这项研究中，它还与融合到粘蛋白1（MUC1）外胚层的小鼠IgG2 Fc区域组成的融合蛋白共洗脱，表明2种蛋白质具有相似的pI（~5.5）。TGFβ-1以每毫克治疗蛋白19.4ng的比例存在。研究小组还发现，MUC1的免疫调节作用至少部分归因于样品中发现的细胞因子杂质，并且可以使用抗TGFβ-1中和Ab来抑制这种作用。这样的活性对于HCP来说是意想不到的。对培养基进行TGFβ-1检测，酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒返回阴性结果。使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），研究小组在表达系统中发现了细胞因子基因。他们最终确定TGFβ-1来源于宿主细胞，并且它作为213-275 kD的大型潜伏复合物（LTBPx-LAP-TGFβ-1）的一部分存在于上清液中，如超滤（100 kD）。特别令人感兴趣的是，尽管细胞因子起源于仓鼠，但细胞因子在人体细胞中具有生物活性，这是由使用水貂肺上皮细胞（Mink-PAI-1-Luc）的纤溶酶抑制剂1启动子-荧光素酶测定的。尽管Beatson等人报告说，仅在80°C下孵育10分钟后，鉴定的细胞因子才具有活性，但另一项研究发现接受静脉注射免疫球蛋白的患者血液中的TGFβ-1水平升高。随后的研究确定了几种激活机制，例如轻度机械搅拌、蛋白酶裂解或体内pH应激。值得一提的是，几乎所有的mAb和糖基化治疗蛋白目前都使用CHO细胞进行表达。因此，必须跟踪所有用此类产品治疗的患者的HCP-TGFβ-1活性，直到有问题的基因可以从CHO细胞表达系统中删除，或者直到纯化工艺可以将杂质去除到非常低的水平。该分子发挥重要的生物学功能，如G1细胞阻滞。在另一项研究中，Haggerty等人描述了宿主细胞源性趋化因子MCP-1的存在。杂质可诱导嗜碱性粒细胞释放组胺。在2a期临床试验中，患者在接受Orencia（abatacept，BMS）治疗后出现与组胺释放有关的严重不良事件。使用全血体外分析，研究人员检测到了释放的组胺的存在。通过反相液相色谱与串联质谱（RP-LC-MS / MS）进行杂质鉴定。HCP显示出与人类MCP-1的高度同源性。确保药物产品的安全性本文中的例子指出，必须进行严格的理化分析、杂质定量、生物分析、临床试验和药物警戒，以确保药物产品在商业化过程中的短期和长期安全性。新的信息和对体外分析的改进可以阐明并增强对现在无法检测到的安全问题的检测。原文：V.P.M.Martinez, C.E.E.la Garza, N.O.Perez, Opportunities in the Field of Host Cell Proteins: Part 2: Ensuring Patient Safety. Bioprocess International, 2022.相关阅读：19位行业专家，4场知识盛宴，抗体药物大规模高效生产系列网络研讨会盛大开启！