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Protein A蛋白简介Protein A作为抗体亲和捕获配基，得到广泛关注和竞相开发，它是金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureu) 细胞壁的组分，和胞壁的肽聚糖共价结合，简称为SpA[1, 2]。分子量42 KD，为单条多肽链分子，天然序列中不含半胱氨酸，因此人为在末端加入Cys后，可用于定向偶联[3]。SpA有5个高度同源的IgG结合结构域，从N端始记为E-D-A-B-C，分别含有51, 61, 58, 58和58个氨基酸残基[4]，每个结构域均由3个α螺旋和之间的2个loop环组成，helix II和III反向平行，helix I和前者之间存在夹角，domain B为30度，domain D和E均为15度[5]。A、B、C结构域同源性高达90%，domain D因多了三个氨基酸的插入以及其它位点突变造成同源性约80%， domain E的同源性约为70%差异更大[6]。图1：SpA的5个IgG结合结构域序列比对[7]SpA的C末端还有一个X结构域，由8个氨基酸、重复12次组成[6]，用于将SpA锚定到细胞壁上。因此，SpA完整序列为EDABCX（部分文献还会备注一个跨膜区M）。图2：A) Protein A基因组成。B) IgG的Fc区域的3个β-turn（灰色）和SpA B domain的前2个α-helix（红色）互作[8]SpA对多种类型的IgG具有高亲和力，对IgG1、IgG2、IgG4的亲和力为10^8 (M-1) [9]，但是对IgG3（约占总IgG的8%）的亲和力则非常弱。目前，大部分的抗体药物是基于IgG1或IgG4开发。表1：Protein A和Protein G与人不同类型抗体的亲和力[10]虽然Protein G也能和大部分抗体亲和（表1），但其和Fab-CH1以及Fc均有互作，结合强度高，洗脱pH低，更容易造成不稳定的抗体发生聚集，而Protein A则“主要”和Fc区域互作，洗脱pH更高，因此，大部分商业化使用的亲和层析是基于Protein A开发的[11]。SpA IgG结合结构域命名为何是EDABC而不是ABCDE？简言之，和基因的发现顺序有关，顺次命名，过程曲折励志。最初，1975年，H Hjelm和J Sjödahl等[12]，使用溶葡球菌酶 (Lysostaphin) 消化细胞壁，从S. aureus strain（菌株Cowan I）胞壁中释放Protein A，并通过IgG Sepharose 4B亲和层析柱（Cytiva，当时的GE Healthcare）分离。为了获得具有亲和力的最小片段，纯化后的蛋白继续使用胰酶进行部分消化以及IgG再次捕获，然后用离子交换 (Phosphocellulose，Whatman) 进行纯化及序列分析。获得至少3个高度同源的Fc结合区，每个大约由60个氨基酸残基组成，说明Protein A存在结合IgG的重复单元结构。一年后，1976年，前述文章的2作J Sjödahl，独立发表文章，继续求证[13]。将纯化后的Protein A蛋白，使用胰酶进行降解，根据降解片段在离子交换层析上的出峰顺序（8个组分），结合氨基酸组成序列分析和功能检测结果，将和Fc区域有亲和力的片段分为A、B和C三个区域，其各自具备抗体结合能力并高度同源 (80%) 。但是否还有活性区域被胰酶降解而丢失，或从未被分离到，以及是否有更大的片段以便对三个区域进行位置排序，仍待研究。如果使用胰酶直接降解金黄色葡萄球菌（非纯化后的Protein A蛋白），A和B区对应的片段仍在，而C区则没有被检测到，提示C区接近细胞壁，存在酶解的空间位阻[13, 14]。1977年，J Sjödahl继续独立研究并发表结果，用实验证实第4个互作区域的存在[14]，使用胰酶直接降解金黄色葡萄球菌（菌株Cowan I）： 1 通过调整酶解条件而产生更大的Protein A片段，经过前述同样的亲和及离子交换层析，分离出6个组分（数量更少、片段更长），并使用DEAE离子交换进一步分离，根据氨基酸组成以及末端序列分析，并和之前的A、B、C区域进行对照，D结构域被发现。 2 通过对比更长的片段序列（如AB和DAB）以及N端测序证明其排序为D-A-B-C，并且连续。 3 对胰酶消化后，剩余的胞壁组分继续使用溶葡球菌酶处理，经过亲和以及一步离子交换进行分离，得到的片段进行氨基酸组成以及N末端序列分析，找到了Protein A碳末端缺失的X区域（酶消化后和C区连在一起，即CX区）。注意：如果先用溶葡球菌酶处理菌体，再用胰酶消化，那么C和X之间的连接会断开，因此早期研究中丢掉了X这部分。至此，D、A、B和CX 4个IgG结合结构域被发现。但是，就像之前分离的C区还存在一个嵌入细胞壁内的X区域一样，作者也推测在D区的N端很可能也存在类似区域未被发现。图3：J Sjödahl文章（1977年）中推测的Protein A（或部分）结构图[14]Domain E的晚发现：得益于基因测序技术的进步，开始从基因角度来解析Protein A序列。1983年S Löfdahl等[2]分离金黄色葡萄球菌（菌株8325-4，遗传信息比Cowan I更清晰）的染色体DNA并进行酶切，跑胶鉴定8-10 Kb的片段并克隆到pBR322载体（宿主E.coli）上，表达后，使用ELISA筛选和抗体具有亲和作用的克隆及更小的亚克隆。使用化学测序法对启动子区以及5'末端结构基因进行测序，翻译成氨基酸序列后，和前述J Sjödahl研究[14]中的序列进行比对，在N端发现了信号肽 (S，Signal) 区域以及紧挨着的、顺次命名为E的区域，E区和之前报道的D-A-B-C高度同源，由50个氨基酸组成，其中42个和D区一致。1984年[6]，同一个团队继续通过合作对菌株8325-4 的Protein A进行全基因测序，进一步验证了E区的存在。1986年，Tomas MOKS等[15]发表文章，对E区进行克隆表达，证明domain E和抗体单价结合，从亲和力上，D、A、B、C和抗体结合的亲和力差异不大，但是domain E的亲和力弱一些。至此，SpA的E-D-A-B-CX序列结构才算完成。从进化角度，SpA的5个IgG结合结构域氨基酸序列高度同源，并且存在同源梯度 (homology gradient) ，即相邻的两个区域，同源性更高（如图1）。说明原始祖先基因，在进化过程中被复制多次，并存在点突变，体现出stepwise multiple DNA duplications特征[16]。另外，在同源区域存在大量同义突变，说明存在进化压力以维持氨基酸序列高度保守，其中B区的密码子突变最少，也被认为是最接近祖先序列的[15]。SpA其实可以和Fab和Fc区域同时互作SpA通过和IgG的两个不同的位置即Fab以及Fc区域结合，以尽可能逃避或切断宿主的免疫系统[17]。目前认为，A、B、C三个高度同源的结构域，主要通过和IgG的Fc区域进行结合；由于D和E区在helix III区域存在序列差异，二者主要通过Fab和Fc与IgG互作[18]。 Helix I&II主要负责和IgG-Fc互作图4：SpA的domain B和抗体CH2-CH3之间区域互作示意图[19]SpA和抗体Fc之间的互作主要是疏水作用驱动的，另外有部分氢键以及盐桥[20, 21, 22, 23]：互作位置：IgG的CH2-CH3连接处（elbow region，3个β折叠）和SpA domain B的前两个α螺旋helix I和II发生互作。互作位点#1：由SPA-helix I的二肽疏水核心（苯丙氨酸和酪氨酸），和IgG的CH2-CH3之间的3个β折叠区组成，并通过4个氢键进行稳定。互作位点#2：SPA的helix II和Fc的CH3区域的氨基酸残基组成。互作主要通过23个氨基酸残基进行，如下表。序号基于SpA domain B在PDB数据库的序列(https://www.rcsb.org/structure/1BDC) [8]。表2：参与Protein A和IgG-Fc之间互作的氨基酸残基[8]Helix II&III主要负责和Fab区互作天然的SpA中，每个IgG结合结构域都可以和Fab区发生互作[9]，但强弱有差异：SpA的domain D[5]和domain E[24]与Fab区互作更为明显。A、B、C domain和Fab区的互作则较弱[25]。互作结构解析，最经典当属M Graille等于2000年发表的文章[5]，IgM主要通过Fab区和Protein A互作（Fc互作则缺失）因此适合用于此类研究[26]。文章通过domain D和VH3–30y1.9III编码2A2 IgM被酶切后产生的Fab区互作，解析晶体结构，要点如下：SpA domain D通过Helix II和III，与Fab-VH3的4条β链（B、C’’、D和E）发生互作（图5）。图5：SpA domain D（红色）和人IgM- Fab 2A2互作示意图。Fab-VH3重链的框架区（青色cyan）参与互作，VL区不参与互作（深蓝色）。互作区远离和抗原互作的CDR loops区（酒红色），尤其是和最常用于抗原特异性识别的CD3较远（相距10 Å以上）[5]SpA domain D中参与互作的11个氨基酸，分布在：helix II（6个）、helix II和III之间的loop环（2个），以及helix III（3个），如图6。图6：SpA domain D（棕色）和Fab 2A2-VH3（蓝色）互作氨基酸展示图。注意G29，文献报道中domain Z为了提高耐碱性，将G29突变为丙氨酸而失去了和Fab区的结合（更利于用更高的pH洗脱）[5]Fab中参与互作的区域主要在VH3框架区(framework region, FR) ，距离IgG轻链以及重链恒定区远，并区别于和抗原互作的CDR区。主要有13个氨基酸（如图6和表3），其中6个在β strands的框架区，7个位于框架区的链间loops（和抗原结合口袋最远）。SpA不和IgG的抗原结合区竞争，被认为是SpA能够和最大的VH基因家族-VH3互作的基础之一。互作结构中，主要由极性氨基酸侧链组成，包括domain D的3个带负电的侧链残基以及IgM-Fab区2个带正电的残基，提示2个分子之间的互作主要通过静电吸附发生，且5个极性互作中，3个发生在氨基酸侧链基团。其次为氢键互作，包括Tyr-H59和Asp-37、Asn-H82a和Ser-33、Gly-H15 carbonyl 和Gln-26，以及Lys-H57和Asp-36 carbonyl之间，其中后两个发生在主链原子和侧链原子之间。另外，Arg-H19和Asp-36之间形成盐桥。综上，domain D和Fab之间的互作，是以氨基酸序列特异性为主导的。SpA和Fab以及Fc的互作是否互相干扰呢？实则不然。SpA和Fc的结合主要发生在helix I和II，其中以helix I为主，疏水互作为主导；helix II以另外一面 (opposite face) 以及helix III又和Fab区发生互作，主要为极性作用，包括静电、氢键和盐桥。两个结合结构域之间各自独立、互不影响：除了domain D的Gln-32被认为较弱的、同时参与了SpA同Fab和Fc的互作，其它氨基酸均无重叠[IgM]。SpA domain B和Fc互作面积 (1,320 Å2) ，与SpA domain D与IgM-Fab互作面积 (1,220 Å2) 相似。为了进一步了解SpA和Fab-Fc之间的空间关系，结合此文以及之前domain B和Fc互作的结构解析结果[21]，通过模型模拟，如图7，抗体的Fab和Fc区形成了一个三明治结构，各自朝向Helix II的两侧，将SpA domain D夹在其中，互不干扰。 图7：SpA domain D（红色）和VH3 Fab（青色）以及Fc区（灰色）形成复合物示意图[5]其它SpA结构域，是否也能够和Fab区发生互作？通过将domain D的结构，和已发表文献中的其它IgG结合结构域进行比对，发现domain E的相似度最高（很多文献中提到D和E主要负责和Fab区互作）。如图8所示，domain D中参与Fab区互作的氨基酸残基（青色背景），在所有的SpA IgG结合结构域中高度保守（在domain E、A和B中完全一致），说明每一个结构域都能以类似方式和Fab区互作（但强度有差异）。图8：SpA的5个抗体结合区的序列示意图。domain D中参与Fab 2A2互作的氨基酸残基用青色背景表示，参与Fc互作的氨基酸残基[22]用灰色背景表示。粉色为domain D的Gln-32，同时较弱的参与Fab和Fc互作再说VH3SpA被报道可以和B细胞表面的VH3家族抗体的Fab区结合，并介导细胞凋亡，用于逃逸免疫监视[27, 28]，大约有一半的人IgM以及32–54%的人外周血B淋巴细胞 (BCR) 能够和SpA发生结合[29]，互作被严格限定在VH3基因家族（占VH基因型的50%以上）或者其它哺乳动物中的VH3同源基因家族。为何呢？表3：VH基因家族和domain D互作的13个氨基酸序列展示[5]根据前述M Graille等[5]的研究，从序列上看，和SpA互作的13个氨基酸中（图6和表3），考虑到VH3基因的种系序列多样性，只有第57位有多个突变的可能性，而其在互作结构中并不是核心氨基酸残基。另外12个直接参与domain D互作的功能氨基酸则高度保守，其中，只有2个氨基酸存在种系可变性，即19位的Lys (K) 和82位的Gly (G) ，但是这两个突变氨基酸在成年VH3 Ig表达谱中发生的可能性只有不到2%（因此，也并不是所有的VH3基因家族都能和SpA的Fab区结合）。而其它无法结合SpA的VH家族，在13个互作氨基酸残基中，至少含有2个或更多的氨基酸残基差异。作者又从结构角度，给出了7个氨基酸组成的核心关键残基 (Arg/Lys-H19, Gly-H65, Arg-H66, Thr-H68, Ser-H70, Gln-H81, Asn-H82a) ，奠定了VH3特异性结合的基础。 关于商业化配基改造针对Protein A或其单个抗体结合结构域，主要发生的改造类型：① 高耐碱性：利于低成本、方便的进行NaOH在位清洁CIP。Cytiva的多款明星抗体亲和产品，为基于domain B开发，如MabSelect SuRe和PrismA，除了和祖先序列最为相似以外，domain B还被证明对于溶剂和温度变性更加稳定[30]，并且对不同种属抗体的结合范围最广。Domain Z最初是为提高耐碱性而生（注意Z有很多不同突变的变体），将domain B中在高pH条件下会发生降解（如脱氨化）的氨基酸残基进行突变，如天冬酰胺Asn等，并进一步优化为MabSelect SuRe以及MabSelect SuRe LX填料，耐受0.1-0.5M NaOH，Sure LX载量为60 mg 人lgG/mL填料。MabSelect PrismA则进一步优化了耐碱和载量，可以耐受1M NaOH CIP，载量提升至80 mg 人lgG/mL填料。图9：对Protein A进行定点突变，产生耐碱稳定的四聚体变体[3]② 提高洗脱的pH条件：Protein A序列中的组氨酸残基His 137，有一个在IgG-Fc中高度保守的、位于互补位置的组氨酸残基His 435，在中性pH条件下两个氨基酸不带电，Protein A和IgG的互作正常发生；在低pH条件下，两个组氨酸残基被质子化而同样带上正电荷，因此互斥造成结合减弱，促进样品洗脱[31]。如果样品不稳定，需要更高的洗脱pH，也可以通过减弱或去除Protein A和Fab之间的互作达成。例如，去掉和Fab区主要发生互作的domain D和E，转而使用单独的domain B（或Z）、domain C等进行配基开发，可以将洗脱的pH提高。报道中，domain Z的29位甘氨酸突变（如G29A），使其失去了对Fab区的亲和力，从而提高洗脱pH[7, 18, 32]。另外，并不是所有的Fab区都不能和domain Z（或MabSelect SuRe）互作，在极罕见的情况下也会发生结合，但比全长Protein A更弱[26]。图10：MabSelect SuRe对于多个人抗体和Fc融合蛋白的洗脱pH分布，相较于MabSelect填料（重组Protein A配基），MabSelect SuRe洗脱pH更高也更窄[33]③ 更高载量： 1 对改造后的单一结构域，重复多次，使用同源多聚体或异源多聚体[25]。 2 优化linker设计：避免被蛋白酶降解（减少由此造成的配基脱落），同时提高配基和IgG的结合和利用率[18]。 3 基架相关：如基架材质、配基密度、粒径大小、孔径大小、化学偶联方式等。④ 针对特定区域的结合，Cytiva专门开发了多种填料例如针对VH3基因家族，专门开发了耐碱的MabSelect VH3填料[34]，也可以测试MabSelect PrismA。针对轻链的结合，Cytiva还开发了耐碱的MabSelect VL（结合Kappa轻链可变区）[35]以及LambdaFabSelect（结合Lambda轻链恒定区）以及KappaSelect填料（结合Kappa轻链恒定区）[36]。参考文献[1] J Sjöquist, J Movitz, I B Johansson, H Hjelm. 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Data File, CY13476-30Jul20-DF.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

天然的蛋白A（Staphylococcal Protein A，SPA）是分离自金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白质。其含有E、D、A、B、C共5个同源性较高的抗体IgG结合结构域，以及1个胞膜结合结构域。 蛋白A与抗体IgG的Fc段特异性结合，与抗体IgG的Fab段有较弱结合。利用蛋白A与抗体Fc段的高亲和力，将蛋白A通过共价偶联结合于纯化介质之上，制备的蛋白A亲和层析填料广泛地应用于抗体类产品的生产纯化过程中。上图引用自文献 Amritkar V , Adat S , Tejwani V ,et al.Engineering Staphylococcal Protein A for high-throughput affinity purification of monoclonal antibodies[J].Biotechnology Advances: An International Review Journal, 2020(44-):44.检测必要性  NECESSITY OF DETECTION蛋白A作为抗体类药物生产时多用到的纯化柱填料，其不可避免会有蛋白A配基脱落，导致抗体药物中蛋白A的残留。这些微量残留对抗体药物的安全性（引起机体副反应）和有效性（影响药效和药代动力学）具有潜在的隐患，使其成为工艺相关杂质。相关法规  REGULATIONS012020版《中国药典》第三部《人用重组单克隆抗体制品总论》3.2.4 工艺相关杂质章节中提出“采用适宜的方法对供试品宿主蛋白质、宿主细胞和载体DNA、蛋白A及其他工艺相关杂质进行检测。供试品测定结果应在规定的范围内。”022020版《中国药典》第三部《尼妥珠单抗注射液》3.1.3.3 蛋白质A残留量中提出“用酶联免疫吸附法（通则3429）测定，蛋白质A残留量应不高于蛋白质总量的0.001%”。03美国 FDA美国FDA提出在定量检测蛋白A时，应尽可能使用高度灵敏的分析方法，并且结果应低于该方法可检测水平。04美国 USP130USP130《PROTEIN A QUALITY ATTRIBUTES》表示，“在纯化人用抗体时应清除滤出的蛋白A，并相应验证生产工艺。基于酶联免疫吸附试验(ELISA)的残留检测通常用于工艺开发和验证，以确保在蛋白A亲和层析后的工艺步骤中有效去除残留蛋白A”。君研 Protein A ELISA KIT君研生物自主研发生产的蛋白A（Protein A）残留检测试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，可定量检测各种生物制品中蛋白A的残留量。具有通用性高、操作简便等优势，并经过了全面的性能验证。该试剂盒遵循ISO13485质量管理体系进行研发生产。产品优势 | PRODECT ADVANTAGE 通用性高：可以检测国外主流的4种标准品，以及国内多种天然、重组、耐碱型蛋白A标准品（MabSelect SuRe（Cytiva） 、MabSelect PrismA（Cytiva）、TOYOPEARL AF-rProtein A(HC)-650F（Tosoh） 、Eshmuno A（Merck） ） 操作简便：37℃静置反应，无需振荡。步骤简便，实验操作时间短 性能优异：检测限低至5.12pg/mL，准确度高，重复性好性能指标 | PERFORMANCE INDEX验证数据 | VALIDATION DATA 标准曲线验证：标准曲线是经4-PL拟合得到，P0111A-96检测范围在5.12-500pg/mL，R2可达到0.99。 试剂盒通用性：君研生物蛋白A（Protein A）残留检测试剂盒（P0111A-96）可检测的蛋白A类型有MabSelect SuRe（Cytiva）、MabSelect PrismA（Cytiva）、Eshmuno A（Merck）、TOYOPEARL AF-rProtein A（HC）-650F（Tosoh）、重组耐碱蛋白A（杭州纽龙）、重组金黄色葡萄球菌蛋白A（杭州纽龙）、rProtein A（楚天微球）等。  试剂盒准确度： 经验证，君研生物蛋白A（Protein A）残留检测试剂盒（P0111A-96）检测高、中、低浓度质控品，测量偏差绝对值均≤15%   样品加标回收率检测：经验证，君研生物蛋白A（Protein A）残留检测试剂盒（P0111A-96）实际样品高、中、低浓度加标回收率均在70%~130%范围内。 君研产品推荐 JUNYAN PRODUCTSEND关于君研生物ABOUT JUNYANBIO君研生物科技（山西）有限公司成立于2021年，作为独立创新的研发、生产和销售一体型企业，君研专注于为生物医药产业提供符合国际标准的质量安全检测产品和服务。公司位于山西省太原市综改示范区，由海归科学家与业内资深专家领队，建设有 ~3200 平米符合 cGMP 标准和 ISO 13485:2016 体系要求的研发生产基地。君研生物致力于在CGT药企、抗体药、疫苗等领域提供专业合规的工艺杂质残留、宿主细胞核酸及蛋白残留、含量测定、外源污染物检测等产品和服务。结合医药产业发展需求，公司特色的快速即用型检测开发技术已经覆盖20多种检测试剂盒系列产品，拥有专利类知识产权 10 余项。作为助力您成功的生物安全检测合作伙伴，君研生物始终坚持生物原料中国造，为生物医药安全提供国际品质的产品和专业的技术服务。君研生物科技（山西）有限公司经专业机构 北京国医械华光认证有限公司 评审专家的严格审核后，顺利通过GB/T 42061-2022 idt ISO13485:2016医疗器械质量管理体系认证，体系覆盖产品设计开发、生产和服务全过程，并且获得认证证书。国医械华光认证证书联系方式CONTACT INFORMATIONCONTACTNFORMATIN销售电话15234188795技术支持18734150104/19503412257联系邮箱junyans21@163.com公司官网www.junyanbios.cn识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。