Protamine Sulfate

摘要：嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已显示出强大的治愈潜力，并成为一系列B细胞恶性肿瘤治疗的关键组成部分。CAR-T细胞疗法成功用于治疗血液癌和实体癌以及自身免疫性疾病等其他适应症，取决于有效的CAR-T细胞生产，这不仅会影响产品的安全性和有效性，还会影响有需要的患者的整体可及性。这篇综述讨论了自体CAR-T细胞生产的主要工艺参数，以及监管考虑因素和正在进行的发展，这些因素将使下一代CAR-T细胞疗法成为可能。【NO.1】介绍文中描述了几种FDA批准的CAR-T细胞产品的生产工艺，具有广泛的相似性和独特性（表1）。整个过程包括从白细胞分离法产物中分离起始细胞群、T细胞活化、基因修饰、离体扩增、最终产品配方和产品放行测试（图1）。本综述旨在概述每个关键生产步骤中的工艺参数如何影响所得细胞产品，并讨论有可能在治疗效果和患者可及性方面显着改变CAR-T细胞疗法格局的下一代生产策略。表1.FDA批准的CAR-T细胞产品生产总结【NO.2】选择起始细胞群选择CAR-T细胞生产的起始细胞群是一个早期决策点，对生产过程和最终产品有重大影响。自体CAR-T细胞生产过程通常从纯化形式的成熟T细胞开始，或作为外周血单核细胞（PBMC）群体的一部分。成熟T细胞从初始（TN）表型分化为干细胞记忆（TSCM）、中枢记忆（TCM）、效应记忆（TEM）、效应（TE）和耗竭（TEXH）细胞。此外，T细胞可分为CD8+细胞毒性T细胞、CD4+辅助性T细胞和CD4+调节性T细胞。在辅助性T细胞类别中，可以进一步识别亚群，例如Th1、Th2、Th17和滤泡辅助细胞。T细胞表型的多样性使起始细胞群的选择成为CAR-T细胞生产中的主要工艺参数。然而，生物学并不是影响起始材料选择的唯一因素，因为患者的临床病史和健康状况也对可以获得的细胞生产材料施加了实际限制。图1.自体CAR-T细胞生产过程示意图，自体CAR-T细胞生产通常涉及初始细胞分离、T细胞活化、CAR转基因（或mRNA）的引入、细胞扩增和最终制剂。大多数产品在输注到患者体内之前在床边冷冻保存和解冻。传统的制造工艺通常涉及1-2周的离体细胞作和扩增，而简化的制造工艺可以将离体时间缩短到24-72小时。然而，由于运输、产品放行测试和患者临床护理考虑所需的时间，实际的静脉到静脉时间可能会长得多。【NO.3】CD4+与CD8+T细胞CAR-T细胞通过CAR抗原结合直接激活，无需辅助受体与MHC分子结合。因此，CAR-T细胞功能原则上不需要CD4和CD8分子作为辅助受体。CAR-T细胞的早期开发工作考虑了选择性富集CD8+T细胞以最大限度地提高细胞毒性的优势。然而，CD4+辅助性T细胞在促进CD8+T细胞的效应功能、扩增和持久性方面也起着关键作用，并且已经表明CD4+T细胞在肿瘤微环境中的存在导致CD8+细胞毒性T细胞的募集、增殖和功能增加。因此，目前批准的CAR-T细胞产品都含有CD4+和CD8+T细胞，尽管采用了不同的生产方法。细胞分离通常通过基于磁珠的细胞分选来实现。CD4+和CD8+细胞的混合物可以通过去除非T细胞或使用CD4和CD8结合微珠的组合进行阳性选择来分离。分离混合T细胞群的过程相对简化，与平行生产单独的CD4+和CD8+细胞培养物相比，可以以更低的成本完成，但它排除了在最终产品中精确控制CD4：CD8比率的可能性。或者，CD4+和CD8+T细胞可以单独分离和培养，从而可以配制具有精确CD4：CD8比率的最终产品。但是，这种方法的代价是增加劳动力、时间和生产成本。此外，最佳的CD8+T细胞扩增需要CD4+T细胞的存在，这使得分离的CD8+T细胞的生产容易出现生产失败。应对这一挑战的一个潜在解决方案是分别分离CD4+和CD8+T细胞，但以规定的起始比例共培养，目的是产生具有大致所需比例的CD4：CD8T细胞的最终细胞产品。这种策略已被证明可以克服CD8+T细胞扩增的困难，导致与单独培养的CD4+和CD8+T细胞相比，小鼠的产物具有更高的细胞毒功能。然而，这种“定义”的生产方法并不能完全防止生产失败。重要的是，在产品中产生所需的最终比例所需的起始CD4：CD8比率可能因供体而异，因此这种方法仍然难以实现精确的产品特征。【NO.4】T细胞分化状态除了CD4：CD8比率之外，T细胞产物的分化状态已被证明与抗肿瘤疗效特征相关。在抗原刺激后，T细胞经历克隆扩增，一个亚群分化成TE细胞，TE细胞具有强大的细胞毒性和细胞因子产生能力，但寿命相对较短，相比之下，活化的T细胞亚群变成记忆T细胞，这些细胞寿命长，响应继生抗原攻击而迅速激活。与终末分化的TE细胞相比，TN、TSCM和TCM细胞具有更大的长期持续潜力并产生较低水平的炎性细胞因子，它们可以共同实现持久的抗肿瘤反应，同时避免严重的急性毒性，如细胞因子释放综合征（CRS）。这些发现支持了对从富集幼稚和记忆T细胞开始的生产过程的探索，早期证据表明此类产品可以实现强大的疗效和良好的安全性。CD45RA、CD45RO、CD62L和CCR7的表面表达通常用于识别T细胞亚型，并且可以通过选择CD62L+细胞从白细胞去除术产物中分离出幼稚和记忆T细胞。然而，CD62L+选择可同时导致同样表达CD62L的CD14+髓系细胞和CD25+Treg的意外富集。髓系细胞已被证明会显着降低T细胞活化和随后的病毒转导的效率，这可能是由于用于激活T细胞的抗CD3/CD28磁珠的吞噬作用。此外，据报道，CAR-T产品中存在Tregs与抗肿瘤疗效差相关。这些发现表明，CAR-T产品可能受益于CD14+和CD25+细胞类型在CD62L+细胞富集之前耗尽，并且在多项临床试验（例如，NCT02208362和NCT04007029）中评估了使用CD14-/CD25-/CD62L+细胞作为CAR-T细胞生产的起始材料。出乎意料的是，一项试验（NCT04007029）的数据显示，在CD62L富集之前未耗尽CD14+和CD25+细胞的起始群体制成的CAR-T细胞产物与由CD14/CD25耗尽的起始群体制成的产品相比，具有相似的活化、转导、扩增和最终CD3+纯度水平。由非CD14/CD25耗尽细胞制成的产品在细胞生产结束时显示CD4+T细胞中明显富集，但基于该1期试验中的少量患者，由CD14/CD25耗尽或未耗尽起始细胞群制成的细胞产品之间未观察到治疗结果的显着差异。值得注意的是，该特定临床试验中使用的细胞生产过程使用聚合物纳米基质T细胞兴奋剂而不是基于磁珠的激活试剂，并且髓系细胞对不同大小和刚度的激活试剂表现出的差异吞噬反应可能在所得细胞产物的行为中发挥了关键作用。【NO.5】T细胞活化方法T细胞活化对于细胞生产过程的成功至关重要，因为它直接影响CAR转基因整合的效率以及离体培养期间的T细胞扩增。T细胞活化通常是通过刺激CD3和CD28结合细胞因子支持来实现的。CD3信号传导（信号1）触发T细胞活化，而CD28信号传导提供必要的共刺激（信号2）以避免无反应。此外，细胞因子混合物（信号3）——最常见的是IL-2、IL-7和/或IL-15——用于支持T细胞扩增。目前，生产方案通常使用涂有抗CD3和抗CD28抗体的磁珠或胶体聚合物纳米基质来提供信号1和2。磁珠提供固体支持，模拟呈递肽-MHC复合物和共刺激配体的靶细胞以进行T细胞结合，抗CD3/CD28磁珠可同时用作基于磁性的细胞分选的T细胞分离剂。然而，磁珠容易被髓细胞吞噬，因此使用抗CD3/CD28珠子进行细胞分选存在CD14+细胞富集的风险，同时减少了可用于刺激T细胞的激活试剂的数量。此外，在回输之前，需要通过磁分离进行去珠步骤以生成纯CAR-T细胞产物。相比之下，胶体聚合物纳米基质似乎不太容易被髓系细胞消除，并且可以通过简单的离心去除。然而，尚未报道这些试剂的头对头比较，无法对所得细胞产物进行严格比较。无论形式如何，市售活化剂都是以固定磁珠：细胞比例或每体积稀释比例应用的标准化产品。最近的发展探索了根据患者的疾病类型为每种产品量身定制的个性化T细胞活化试剂的可能性。例如，利用涂有脂质双层的介孔二氧化硅微棒，Mooney及其同事开发了APC模拟支架，该支架不仅可以提供抗CD3和-CD28信号，还可以实现IL-2的持续释放。可以精确调整抗CD3和-CD28抗体的密度，以提供最佳刺激强度，从而最大限度地提高T细胞适应性。实施经过微调、高度个性化的试剂必须与生产通量和工艺稳健性的实际考虑相平衡。尽管如此，可以适应不同产品要求的“智能”材料的出现可以显着提高生产过程的灵活性和质量。应该注意的是，尽管T细胞活化是当今CAR-T细胞生产中不可或缺的步骤，但下一代生产工艺正在考虑消除T细胞活化的可能性。例如，最近的一份报告描述了慢病毒载体成功转导未活化的T细胞。【NO.6】CAR转基因CAR转基因递送方法可以显着影响CAR转基因表达水平以及遗传毒性，进而影响所得CAR-T细胞产品的安全性和有效性。在本节中，我们广泛评估了CAR-T细胞生产的病毒和非病毒基因递送方法。6.1病毒基因递送目前，所有FDA批准的CAR-T细胞产品都使用慢病毒或逆转录病毒转导来实现CAR转基因整合。病毒转导受益于相对较高的整合效率，表达稳定整合的CAR构建体的T细胞已被证明在T细胞输注后持续>10年。然而，病毒整合的转基因缺乏插入位点特异性，存在插入诱变的理论风险。一项全基因组分析研究比较了用γ逆转录病毒载体与慢病毒载体制成的CAR-T细胞产品中的转基因整合位点，结果表明，与逆转录病毒相比，慢病毒载体更有可能整合到内含子和基因间区域;相比之下，逆转录病毒整合到启动子、非翻译区和外显子区的频率更高，导致对mRNA转录水平的影响更大。值得注意的是，迄今为止还没有报道病毒整合导致CAR-T细胞致癌转化的实例。相反，一项案例研究报告了一名患者，其对CD19CAR-T细胞疗法的反应似乎与单个CAR-T细胞克隆的扩增相关，该克隆的CAR转基因随机插入TET2基因座，从而敲除唯一功能性的TET2拷贝，因为该患者在另一个TET2等位基因中具有先天性错义突变。同样，在B细胞急性淋巴细胞白血病患者（B-ALL）。尽管这些病例表明随机插入可能会偶然导致积极的治疗结果，但插入到不需要的基因座的风险仍然是探索可以确保位点特异性的替代转基因整合策略的动机。除了整合位点的考虑外，病毒载体还以具有复制能力的逆转录病毒（RCR）和慢病毒（RCL）的形式存在另一种潜在风险。因此，FDA要求对病毒载体以及病毒转导的细胞产品进行RCR/RCL检测测定。然而，迄今为止，尚未在临床CAR-T细胞产品中检测到RCR和RCL的报道，并且平衡RCR/RCL测试造成的成本和潜在延迟与此类分析的实际好处仍然是一个积极科学探索的话题。尽管病毒转导原则上可以实现高转导效率，但在患者细胞产品中实现一致水平的转基因整合是一项技术挑战。事实上，10%或更低的CAR阳性率——基于转导细胞在抗原暴露后将在体内扩增的前提设定的水平——作为临床试验中使用的细胞产品中转导效率的最低阈值并不少见。为了最大限度地降低由于转基因表达不良而导致生产失败的风险，生产方案可以结合转导增强剂的使用，例如硫酸鱼精蛋白、retronectin和泊洛沙姆。病毒转导中的限速步骤是病毒颗粒最初附着在细胞膜上，这一过程可以通过使用retronectin进行逆转录病毒转导和聚阳离子（如硫酸鱼精蛋白）进行慢病毒转导来促进。聚阳离子充当将病毒连接到细胞表面的静电桥。然而，硫酸鱼精蛋白对T细胞的毒性与提高转导效率的好处相抵消。相比之下，retronectin不会导致T细胞毒性，但其使用仅限于逆转录病毒载体。已经开发了具有更有利毒性特征的专有转导增强剂，尽管它们的高成本和专有访问可能会阻碍广泛使用。除了病毒转导的生物学特性外，实际考虑也会影响病毒在CAR-T细胞生产中的使用。能够生产临床级病毒的认证设施数量仍然有限。因此，病毒生产所需的时间和财务成本可能成为研究药物开发和商业CAR-T细胞生产的瓶颈，突出了可能更灵活且更具成本效益的替代非病毒递送系统的吸引力。6.2非病毒基因递送在CAR-T细胞生产的背景下，已经探索了几种不同的非病毒基因递送方法，包括CRISPR/Cas9、转座子和mRNA转染。CRISPR/Cas9作为一种有效的基因组修饰方法已被广泛采用，其增强CAR-T细胞疗法的潜力并未被忽视。为了实现位点特异性基因修饰，Cas9核酸酶与单向导RNA（sgRNA）复合，通过与sgRNA的序列互补性识别基因组DNA上的靶位点，并引入双链DNA断裂。接下来，通过编码所需转基因（例如CAR）和基因组切割位点的DNA模板之间的同源重组来促进转基因插入。指定转基因整合位点的能力为工程化具有所需功能的T细胞开辟了新的可能性。已经通过计算确定了许多基因外“安全港”位点并进行了实证测试，以支持T细胞的精确基因改造以实现治疗功能。特别是，已经表明CAR转基因可以使用腺相关病毒载体作为同源定向修复模板有效地整合到编码内源性TCRα链的TRAC基因座中。这种策略征用了响应T细胞激活状态动态控制TCR表达水平的内源性基因调控机制，数据表明所得的CAR-T细胞可能比病毒整合的CAR-T细胞更有效。此外，基于非病毒CRISPR/Cas9的基因编辑策略也被用于用肿瘤特异性TCR取代内源性TCR，从而能够开发高度个性化的T细胞疗法。作为另一个例子，上述涉及TET2突变的案例研究激发了随后对有意将CAR转基因整合到TET2位点作为增强CAR-T细胞增殖和持久性的一种手段的评估。有趣的是，结果表明，TET2破坏对体内抗肿瘤疗效的益处因表达的特定CAR构建体而异，这与CAR整合到TRAC基因座中的类似发现相呼应，并强调了确定CAR转基因最佳整合位点的非平凡性质。除了促进位点特异性转基因整合外，CRISPR/Cas9还与病毒整合结合使用，以敲除不需要的内源性基因，同时非位点特异性整合编码肿瘤靶向受体的转基因。例如，第一个涉及CRISPR/Cas9编辑的T细胞的FDA批准的临床试验利用了一种生产工艺，该工艺用CRISPR/Cas9敲除PD-1和内源性TCR，同时慢病毒整合了靶向NY-ESO-1的转基因TCR。值得注意的是，据观察，输注后PDCD1基因座突变的NY-ESOTCR表达细胞的频率随着时间的推移而降低，这表明PD-1编辑的T细胞可能缺乏形成长期记忆的能力。在另一项1期临床研究中，CRISPR/Cas9用于敲除PD-1和TCRα链，同时慢病毒整合靶向间皮素的CAR。尽管两项研究都显示出可接受的安全性，但都没有导致疗效的显着改善，突出了持续改进的必要性。此外，CRISPR/Cas9介导的双链DNA断裂带来了意外基因组变化的重要风险，需要仔细分析和质量控制，最近的一项研究揭示了Cas9工程CAR-T细胞中染色体丢失的可能性。有趣的是，同一项研究观察到，特定的作顺序会影响染色体丢失的频率，如果在T细胞被激活之前进行Cas9介导的双链断裂，则可以减少染色体丢失的频率。作为CRISPR/Cas9的替代品，转座子也被用于实现CAR转基因稳定整合到T细胞产品中。特别是，piggyBac和睡美人（SB）转座子系统已在临床环境中进行了评估。转座子系统执行“剪切和粘贴”过程，其中转座酶与靶基因元件两侧的末端反向重复序列（即转座子）结合，通过双链DNA断裂切除转座子，并将转座子重新整合到合适的基因组位点（例如，在SB转座子的情况下，包含AT二核苷酸的回文序列）。通过这种方式进行的转基因整合不是位点特异性的，据报道，piggyBac转座酶表现出类似于逆转录病毒的优先插入转录起始位点，再次增加了插入诱变的潜在风险。在一项1期临床试验中，两名接受piggyBac转座子系统产生的同种异体CD19CAR-T细胞产品治疗的患者患上了CAR-T细胞衍生的淋巴瘤，导致一人死亡。事后分析表明，恶性CAR-T细胞不包含转基因插入已知的致癌位点，但显示出多条染色体的显着拷贝数增加和丢失以及来自转基因启动子的转录通读。重要的是，导致恶性转化的产物具有异常高的载体拷贝数（VCN），其中一种产物的VCN为25。相比之下，在没有产品特定理由的情况下，FDA推荐的病毒转导细胞产品的最大拷贝数为每个转导细胞5个拷贝。消除致癌插入风险的一种策略是避免编码CAR的转基因的稳定整合，而是从mRNA模板瞬时表达CAR。除了消除遗传毒性的风险外，mRNA的瞬时CAR表达也被探索为降低潜在毒性的一种手段，特别是当CAR靶向也存在于健康组织中的抗原时。编码转基因的mRNA模板通常通过电穿孔递送到T细胞中，转基因表达持续约1周，电穿孔后表达水平每天下降。因此，瞬时基因表达的潜在安全优势必须与治疗的短暂性质相平衡。临床评估表明，mRNA编码的CAR-T细胞是安全的，并且可以表现出抗肿瘤功效，但实现完全和持久的肿瘤控制的能力仍然是一个研究领域。【NO.7】离体细胞扩增一旦T细胞被修饰以表达CAR转基因，产物必须扩增到足够大的数量，以满足给药所需的剂量。此扩展期的持续时间因不同的方案而异，但典型的过程从T细胞活化到细胞收获持续1-2周。扩增条件针对T细胞生长进行了优化，具有细胞因子支持，如IL-2、IL-7和/或IL-15。虽然扩增期的主要目的是增加T细胞数量，但它也通过将非T细胞暴露于不如其他细胞类型的培养条件来消除非T细胞，因此即使生产过程从混合PBMC开始，也能产生高度富集的T细胞产品。除了细胞因子外，FBS等培养补充剂在支持T细胞扩增方面也起着关键作用，尽管能够实现更精确配方和降低人畜共患病原体风险的确定培养基成分正在迅速取代FBS等成分。最后，最近的研究探索了使用各种药物补充剂来促进理想的T细胞表型并增强所得CAR-T细胞产品的治疗潜力。例如，酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼已用于CAR-T细胞生产，以抑制CAR强直信号传导（即在没有抗原刺激的情况下的受体信号传导），从而防止T细胞过早耗竭并增加CAR-T细胞功能。该策略用于生产靶向GD2的CAR-T细胞——已知这些细胞具有强烈的强直信号并表现出耗竭倾向——用于1期试验，早期结果显示多名H3K27M突变弥漫性中线神经胶质瘤患者有显着改善。由于对参加该试验的每位患者进行了多剂量的CAR-T细胞给药，因此关于达沙替尼是否能防止耗竭和/或实现持续T细胞功能的明确结论仍然难以捉摸。尽管如此，这个例子证明了药理学调节CAR-T细胞生产过程以产生用于临床转化的功能性CAR-T细胞产品的可行性。【NO.8】产品放行测试利用CAR-T细胞在2017年治疗血液系统恶性肿瘤方面的突破性成功，全球正在进行1000多项活跃的CAR-T细胞临床试验，集中在北美和欧亚大陆。临床研究的热潮加深了对成功CAR-T细胞产品相关参数的理解。与任何拟议的疗法一样，寻求临床评估的CAR-T细胞必须满足与安全性、纯度、效力、特性和稳定性相关的既定产品特性。所有FDA批准的CAR-T细胞产品使用以下指标的组合来衡量商品特征：•安全性：支原体、无菌、内毒素、残留病毒试剂定量、活力和CAR转基因定量•纯度：T细胞纯度、活力、残留试剂定量、转导效率和是否存在污染肿瘤细胞•效价：抗原刺激后转导效果、活力、CAR表达、细胞毒性或细胞因子（如IFN-γ）的产生•鉴定：CAR表达、观察外观、清晰度、剂量和活力•稳定性：配方、运输和储存。FDA最近起草了CAR-T细胞产品的标准化期望。特别是，早期研究性新药申请提交的批次放行标准不需要经过验证的效价测定和规格，但在生成支持生物制品许可申请的数据时必须包括此类测定。根据正在进行的临床试验和实际经验的积累数据，还提出了额外的参数，以推动未来开发更具可重复性、更有效和安全的治疗方法。例如，鉴于证据表明分化较少、记忆样表型较多的CAR-T产品更有可能实现持久的肿瘤清除，未来的商业产品可能会受益于设置一个功效特征指标，该指标指定产品中有利T细胞亚群的比例。然而，更改和收紧产品规格必须以严格的科学证据和基本的生物学理解为指导，以避免引发不必要的生产失败，从而可能减少患者获得治疗的机会。在某些涉及非危及生命的批次放行标准（例如剂量、转导功效、细胞因子产生水平或CAR表达）的产品失败的情况下，在获得必要的监管批准后，可以向患者施用不合格产品。在扩大访问方案中，患者收到了不合格的商业和临床试验产品，并经历了与接受标准产品治疗的患者相当的临床结果。在现实世界环境中积累CAR-T细胞产品的临床经验对于了解哪些产品特性真正影响患者安全性和治疗效果非常宝贵，并可能作为进一步完善CAR-T细胞产品放行测试监管指南的指南。【NO.9】CAR-T细胞生产的下一代策略迄今为止讨论的生产策略支持了迄今为止多种CAR-T细胞产品的开发，并展示了CAR-T细胞疗法克服晚期恶性肿瘤的潜力。然而，FDA批准后CAR-T细胞疗法的实际经验也凸显了传统细胞生产工艺的局限性，这些工艺通量低且资源密集，导致患者获得可能挽救生命的疗法的机会有限。截至2023年初，90%的MM患者出现疾病进展，25%的患者在等待BCMA定向的CAR-T细胞产品插槽时死于疾病，在接受单采术之前等待时间从1到10个月不等。单采术后，细胞必须经过往返生产地点的运输、离体修饰和扩增以及严格的质量控制测试。大多数患者需要桥接疗法来对抗细胞生产过程中的进一步临床恶化，这可能导致出现与桥接相关不良反应的患者进一步延迟输注。即使在静脉到静脉期间没有医疗并发症的情况下，4-7%的患者也因生产失败而无法接受他们的CAR-T细胞产品，风险因素包括多线治疗后患者T细胞的健康状况降低和漫长的生产过程本身。产品生产失败后的治疗选择包括重复单采术或过渡到替代疗法，尽管这两种情况下的生存结果都很差。总而言之，导致生命损失的多种延误来源强调了及时获得CAR-T细胞产品的重要性。在这里，我们讨论了正在开发的下一代策略，以应对CAR-T细胞生产中的关键挑战（表2）。表2.下一代CAR-T细胞生产策略9.1加速细胞生产为了应对CAR-T细胞生产中的这些挑战，已经开发了新策略来显着缩短细胞生产的持续时间，从而降低生产成本，生产造失败的可能性和静脉到静脉的时间。这些下一代生产工艺可以在短短24小时内形成最终产品配方（图1），从而有可能显著加快患者获得治疗的机会。大部分时间节省是由于离体扩增期的显着缩短，从而限制了可以实现的细胞计数的倍数增加。然而，离体细胞分裂次数的减少也可能导致T细胞群分化程度降低，输注后具有更大的长期增殖潜力。事实上，早期结果表明，在早期时间点收获的产物表现出更大比例的TCM细胞（CD45RO+CD62L+）和TN/TSCM细胞（CD45RO-/CCR7+），据报道，它们表现出治疗上有利的表型和功能。使用加速生产的CAR-T细胞产品的一个例子是使用“T-Charge”平台生产的CD19定向YTB323细胞，该平台需要<2天的离体培养。据报道，与使用传统CAR-T细胞生产工艺生产的等效产品（tisa-cel）。值得注意的是，2期试验的初步结果表明，YTB323在复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中可以产生与tisa-cel相当的疗效，但剂量低25倍，这表明减少的离体培养时间可能产生了功能优越的产品。另一个例子是，在复发/难治性MM患者的1期试验中，使用相同的T-Charge平台生产的BCMA定向PHE885细胞实现了98%的总体缓解率。值得注意的是，93%（13/14）的患者在输注后6个月可检测到CAR-T细胞，在71%（5/7）的患者在12个月时可检测到CAR-T细胞，表明体内T细胞具有强大的持久性。另一个名为FasTCAR-T的加速生产平台已被用于为B-ALL患者生成“CD19F-CAR-T”细胞，其中92%（23/25）的患者实现了最小残留病阴性完全缓解。该试验中的大多数（20/25）患者继续接受同种异体造血干细胞移植，因此无法评估对CAR-T细胞治疗反应的长期持久性。随着来自多项试验的临床数据不断成熟，通过不同生产平台产生的CAR-T细胞产品诱导的反应的相对持久性将是一个重要的关注点。与加速细胞生产过程相关的理论问题是，在离体激活后不久冷冻保存的CAR-T细胞可能表现出过度刺激的表型。此外，特别是在血液系统恶性肿瘤的情况下，来自高度简化的生产工艺的产品增加了包含肿瘤细胞的可能性，否则这些细胞在针对T细胞生长优化的条件下，在延长的离体培养期间会被耗尽。然而，现有的临床数据表明，通过这些缩短方案生产的CAR-T细胞产品的安全性在临床上仍然是可控的。YTB323治疗DLBCL的1期研究结果显示，33%（15/45）的患者经历过CRS，伴有1例4级事件，11%（5/45）出现免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），伴有2例3级事件。在B-ALL患者中，CD19F-CAR-T细胞表现出更大的毒性，CRS的发生率增加了两倍（总体为96%，≥级为24%），ICANS的发生率增加了一倍（28%，均为≥3级）。25名患者中有21名在CRS发作期间需要介入性皮质类固醇，尽管治疗并未消融CAR-T细胞扩增峰值。来自正在进行的临床试验的额外数据将有助于建立我们对通过不同平台生产的CAR-T细胞产品之间生物学差异的理解。最后，需要注意的是，关于产品放行测试的监管要求仍然适用于采用加速工艺生产的产品，并且在估计静脉到静脉的时间时，仍需要考虑此类放行测试所需的时间。9.2流程自动化改进商业CAR-T细胞生产的另一种途径涉及生产过程的自动化，这有可能降低生产成本、人为错误导致生产失败的可能性以及接触点的污染。在某些司法管辖区（例如美国），一些自动化系统被视为全封闭系统，允许在符合良好生产规范标准的设施外部运行。此外，自动化可以显着减少生产人员所需的数量和经验水平。反过来，这些因素支持了现场生产的可能性，从而为患者提供新鲜、非冷冻保存的产品。在一项针对非霍奇金淋巴瘤患者的1期试验中，患者接受了CD19/CD20双特异性CAR-T细胞，这些细胞要么新鲜给药，要么从冻存的等分试样中解冻，早期数据显示新鲜CAR-T细胞产品具有更高的活力（93%新鲜对63%冻存）。该试验的后续报告证实，与使用冷冻保存的CAR-T细胞治疗的患者相比，接受新鲜CAR-T细胞产品治疗的患者的完全缓解率要高得多（80%新鲜对29%冷冻保存）以及更大的CAR-T细胞扩增和持久性。尽管细胞冷冻保存程序的改进仍有可能减少新鲜和冷冻保存的CAR-T细胞产品之间观察到的功效差异，但这些结果突出了现场细胞生产的潜在优势。然而，在确保产品质量始终如一的同时，将这种做法扩展到大量医疗中心仍然是一个关键挑战。重要的是，需要进行几项监管改革才能允许即时CAR-T细胞生产，而全球司法管辖区之间的差异代表了现场细胞生产实际实施的重大障碍。此外，使用新鲜细胞产品会妨碍完成需要较长潜伏期的放行测试，因此需要依赖过程中的样本测试以及应急临床管理计划，以应对在细胞产品输注后收到无菌或其他测试结果失败的情况。此外，新鲜产品的管理带来了重大的物流挑战，因为它需要细胞生产和患者接受细胞输注的准备之间密切的时间协调。最后，当需要根据患者调整最佳过程参数设置时，自动化系统的高度标准化性质可能会带来挑战。例如，来自不同患者的细胞可能具有截然不同的扩增速率，因此每天在培养物中维持适当细胞密度所需的培养基量可能因生产活动而异。为了实现最佳结果，需要配备仪器来感应关键参数并做出相应的响应。9.3体内细胞生产展望未来，下一代生产工艺可能会完全消除离体细胞作和扩增，而是在体内产生治疗性细胞群。几项临床前研究表明，能够使用慢病毒或腺相关病毒在体内转导T细胞。此外，脂质纳米颗粒（LNP）和聚合物纳米载体已被证明可以在体内将核酸有效载荷递送到T细胞。为了实现T细胞靶向，病毒颗粒、LNP和纳米载体通常用单链可变片段或其他靶向CD3、CD4或CD8的结合结构域修饰。然而，T细胞靶向的特异性可能不需要是绝对的，人们可以考虑同时生成CAR-T细胞、CAR-自然杀伤细胞和CAR-巨噬细胞的潜在优势。然而，不将转基因递送到恶性细胞中仍然至关重要，因为这样的整合事件可能导致CAR蛋白掩盖靶抗原并保护肿瘤细胞免受表达CAR的效应细胞的检测。此外，在可以实现稳定转基因整合的病毒载体的情况下，脱靶基因递送增加了遗传毒性风险。在实践中，专门针对T细胞的转基因递送载体和促进高效转基因整合的策略，而无需外部T细胞激活，对于产生能够实现持久抗肿瘤疗效的有效剂量的CAR-T细胞可能是必要的。最后，在体内CAR-T细胞生产平台的临床转化之前，需要进行深入的药代动力学和安全性验证。尽管仍然存在许多障碍，但绕过离体细胞生产的能力有可能显著降低成本，并增加需要这种治疗选择的患者获得CAR-T细胞疗法的机会。【NO.10】总结CAR-T细胞疗法已成为血液系统恶性肿瘤越来越重要的治疗选择，临床试验不断将CAR-T细胞疗法的应用扩展到实体瘤和自身免疫性疾病的治疗。因此，能够高效可靠地生产高质量细胞产品的CAR-T细胞生产工艺对于支持及时、安全和有效的患者护理至关重要。积累的临床经验、真实世界的生产数据收集、自动化系统工程的进步以及对T细胞生物学的基本理解都在自体CAR-T细胞生产工艺的持续改进中发挥着关键作用。此外，同种异体细胞疗法的快速发展前景涉及额外的免疫效应细胞类型以及干细胞群产生的T细胞，在未来几年将继续成为有趣的科学问题和实际工程挑战的来源。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关［摘要］多肽药物是一类重要而特别的药物。但相比普通小分子化学药，目前各国监管机构和国际组织对多肽化学药物的技术要求尚不完善。本文就多肽化学仿制药质量研究的一些特殊技术要求进行探讨，通过一些案例分析提示应采用不同原理的分析方法并结合品种特点全面说明仿制药与参比制剂的一致性及杂质控制策略的合理性，以提高多肽化学仿制药的研究水平和通过率。多肽药物为氨基酸通过肽键连接而成的一类化合物（见图１） ，目前尚无法准确定义，通常具有明显的生物活性的多肽都可视为多肽药物。多肽药物可通过从天然物质中提取、化学合成、天然微生物发酵及生物重组表达等手段制备得到。从药品注册的角度讲，各国监管部门均按照多肽的制备方法对这类药品进行分类，如化学合成肽均按照化学药品进行管理，重组表达肽均按照生物制品进行管理等。此外，美国FDA进一步细分不超过４０个氨基酸组成的多肽及 ４１~９９ 个全合成多肽为多肽化学药物，４１～９９个非化学合成多肽或１０0个以上氨基酸组成的多肽为多肽类生物制品［１］，其他监管机构尚未见相关表述。目前全球已批准上市多肽的药物有 １００ 种以上，并有多种药品已在国内上市［２］，涉及生殖、消化、血液、妇科、外科、神经、肿瘤、内分泌等各适应证领域，且不乏利拉鲁肽、格拉替雷、戈舍瑞林这样的重磅品种，说明国内外医药企业对多肽药物的研发和申报充满热情。但与普通小分子药物相比，多肽药物具有分子结构复杂、活性高、特异性强的特点，同时稳定性相对较差，并可能存在诸如免疫原性等的特殊安全性问题。 这种情况下，对该类药物的研发及监管提出了更高挑战。 本文参考现有技术法规，特别是国际监管同行的研究及审评经验，结合相关文献案例，对一些多肽化学仿制药质量研究过程中需要关注的一些特殊技术要求进行简介，希望为我国多肽化学仿制药的研发和监管提供一些有意义的借鉴。一多肽化学仿制药的监管现状国相比普通小分子化学药，目前各国监管机构和规际组织对多肽化学药物的技术要求尚不完善，法举文件相对缺乏，存在一定的监管空白。 表 １ 中列了各国及国际监管机构目前仅有的几个涉及多肽化学药物的官方技术支持文件。 其中国家药品监督管理局（以下简称国家局） 早在 ２００７ 年就出台了《合成多肽药物药学研究技术指导原则》，说明我国很早就开始重视这类药物的研发和监管问题，同时在《化学药物原料药制备和结构确证研究技术指导原则》中也提到了关于多肽药物的一些关键技术要求。 上述指导原则在出台后的 １０ 多年间对我国多肽化学药物的发展起到了一定的促进作用， 但由于种种原因未能及时升级更新，已不能充分满足目前多肽药物研究与审评的需要，且在我国仿制药一致性评价的大背景下，考虑到多肽药物的复杂性，上述指导原则在评价仿制药与参比制剂的一致性方面还有进一步完善的空间。 最近，国家药品监督管理局药品审评中心为进一步指导化学合成多肽药物的药学研究，提供可参考的技术标准，于 ２０２３ 年 ２ 月发布了《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》［３］，为未来一段时间内我国多肽仿制药的研发和监管提供了依据。 国外监管机构中，ＩＣＨ Ｑ系列指导原则中的 Ｑ３Ａ 和 Ｑ３Ｂ 明确不适用于肽类药物；Ｑ６Ａ 显示适用于小于 １０ 个氨基酸的低分子量合成肽，但不适用于高分子肽和多肽，且并未就多肽化学药物的特殊要求进行专门阐述；Ｑ６Ｂ 明确不适用于合成肽。 欧盟未曾发布专门针对多肽化学药物的指导原则，仅在抗生素药物杂质限度指导原则及欧洲药典药用物质通则中提到了多肽药物杂质控制的一般要求。 美国 ＦＤＡ 曾于 １９９４ 年颁布过关于递交合成多肽原料药申请药学资料的相关要求，但目前该文件已失效。 不过美国 ＦＤＡ 近期就多肽化学仿制药的研究公布了多个复杂多肽仿制药的个药指南，并在 ２０２１ 年颁布了《仿制重组 ＤＮＡ 来源药物的高纯度合成多肽药物指导原则》［４］，说明国际监管机构也开始逐渐致力于完善多肽仿制药监管体系的建设工作。二多肽化学仿制药质量研究的特殊技术要求多肽化学仿制药的药学研究首先应遵循国家局已经发布的关于化学仿制药一致性评价相关技术指南的一般要求，在此不过多赘述。 但由于多肽主要由氨基酸构成，其中化学合成肽还会引入很多非天然氨基酸，这使得这类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面均存在与一般化学小分子药物不同的问题。在线直播｜液体制剂在研发生产与注册申报中最容易被忽视的点首先多肽为氨基酸组成的链状、分支状或环状结构，因此结构确证时除运用元素分析、光谱、质谱等常规方法外，需要结合结构特点采用一些不同于小分子化学药的分析手段，包括但不限于：采用氨基酸组成和手性分析、序列分析或肽图测绘等方法确定一级结构，采用圆二色散、荧光光谱、光散射、Ｘ⁃射线衍射等确定高级结构等，仿制药除一级结构氨基酸序列必须与参比制剂相同外，高级结构也需要与后者保持一致。 另外，需要关注的是有些多肽药物存在超分子聚集为寡聚物或多聚物的现象，该性质与多肽药物的活性及体内药动学行为均有较大关系，如何表征仿制药与参比制剂聚集特性和聚集动力学的一致存在一定难度，现有的研究方法包括分子排阻色谱法、光散射法、荧光分析法、分析超速离心法、凝胶电泳法、场流分离法、核磁共振法等。 同时，也应关注仿制药与参比制剂在一些特殊物化特性（如分子量分布、表面电荷分布、黏度、光密度等）上的一致性。在确保仿制药与参比制剂结构或物质基础等同的前提下，二者的降解杂质谱应无较大差异，但由于仿制药的制备工艺往往不可能完全等同于参比制剂，导致工艺杂质可能明显不同，特别是一些结构相似的肽类杂质，这些杂质的定性与定量研究成为多肽化学仿制药质量能否合理控制的关键，同时考虑到肽类杂质可能存在与一般小分子化药不具有的异常毒性和免疫原性，因此杂质限度的确定更应有充分依据。 此外聚合物杂质为多肽药物中普遍存在的一种杂质，在工艺及贮藏过程中均可能产生，考虑到这种杂质更易引起特殊安全性，因此对仿制药与参比制剂聚合物杂质的对比研究应加以重视。三多肽化学仿制药质量研究的案例分析３.１硫酸鱼精蛋白注射液该品种于２０ 世纪 ８０年代之前已在美国上市，用于因注射肝素过量引起的出血。 目前国内有 ３ 家仿制药上市，但获批时间均较早，且尚未进行一致性评价。 其原料药为从大马哈鱼体内提取的一种碱性蛋白质的硫酸盐，为多肽混合物，其中 ４ 种主要多肽（见表 ２）总含量超过９０％ ，剩余由次要多肽组成。 由于含有多个成串的精氨酸，且 ４ 种主要多肽氨基酸序列非常相似，因此分离纯化和质量分析均存在难度。 考虑到鱼源及提取工艺的不同可能会造成仿制药的原料药多肽组成与参比制剂的差异，因此应采用适当的方法全面定性及定量分析产品组成并与参比制剂对比，以确保仿制药质量符合要求。原研公司曾报道［４］，使用 ｐＨ ＝ ２ 的磷酸盐缓冲液和低含量的乙腈作为洗脱剂对原料药各组分进行液相分离再进行序列分析的方法，可确定本品中 ４个主要多肽的氨基酸组成和比例，并推测是二级结构中转角处脯氨酸周围残基的差异导致了结构相似组分间色谱行为的不同，同时提示该方法也有望用于本品的大规模生产。 除色谱方法外，美国 ＦＤＡ 认为仿制药的研究还需要有更多的考量。 他们曾以５种不同厂家的硫酸鱼精蛋白为对象进行研究［６］，初步结果表明，不同厂家原料药表现出一定的热力学性质（如失水量、玻璃转化温度、熔点等）的差异，但谱学性质（如红外、圆二色谱、一维核磁等） 差异不明显，均显示出该原料药在溶液中呈现一种无规则卷曲加少量 β 片层的构象形态，同时基于 ＱｂＤ 原则所建立的色谱方法也可有效表征不同厂家原料药 ４种主要多肽组分及含量上与参比制剂的一致性。 但随后美国 ＦＤＡ 研究人员重新审视了研究方法的合理性，进一步认为由于该原料药缺乏明显的二级结构，红外和圆二色谱方法可能对序列的微小变化较不敏感，因此利用核磁共振谱和质谱作为与色谱方法的正交分析手段重新进行了评估，以提供进一步的支持［７］。 通过测定１ＨＮＭＲ 中 Ａｒｇ，Ａｌａ 和 Ｇｌｙ 等关键氨基酸相应特征信号的积分比值，并分析质谱中主成分特征峰的质荷比和相对含量，再次确认了前次研究的结论。 此外，采用核磁同核或异核二维相关谱还可建立用于本品质控的指纹图谱。 上述方法的综合运用，对有效鉴别不同来源硫酸鱼精蛋白间的定性及定量差异有一定的参考意义，而且还可有效区分正品与假劣产品（如鲱鱼来源的鱼精蛋白或哺乳动物来源的蛋白等）。３.２ 醋酸地加瑞克该品种分别于 ２００８ 和 ２００９年在美国和欧洲上市，于 ２０１８ 年批准进口我国，为第 ３ 代促性腺激素释放激素（ＧｎＲＨ） 受体阻断剂，对雄激素依赖性肿瘤有治疗作用，适用于需要雄激素去势治疗的前列腺癌患者，目前国内外均无仿制药上市。 其原料药为化学合成线性十肽（图 ２），含７ 个非天然氨基酸。原料药易溶于水，但室温下在０.１ ～ １０ ｍｇ·ｍＬ－１浓度的水溶液中会自发聚集，４ｈ后呈凝胶状。 该过程受浓度、时间、温度、盐含量和蛋白质等因素的影响，因此其制剂冻干粉复溶后虽在体外 １ ｈ 内稳定性良好，但皮下给药接触体液后立即形成凝胶，药物从凝胶中缓慢释放，从而起到长效给药的作用［８］。目前发现ＧｎＲＨ类似物在水溶液中均有自聚集现象，聚集体的结构和形成凝胶的性质因化合物而异。 地加瑞克由于为两性分子，主要是通过亲水端和疏水端相互结合，并延长聚集形成纤维网络最终形成凝胶。 原料药的这种有条件聚集的特性对制剂最终的安全有效性影响极大，药学研究与评价均存在一定的难度。原研公司对地加瑞克的聚集状态进行了结构表征［８］，结果表明其聚合物呈纤维状，纤维直径为５～１５ ｎｍ，且典型的 Ｘ⁃射线衍射图中呈现 ４.６ ～ ４.８ Å的子午线方向衍射，提示了在纵向上的有序性。 红外图谱显示，无论在体内还是体外，所形成的淀粉样聚合纤维均显示出明显的 β 折叠结构，但最大吸收峰波数略有不同，提示体内外纤维的高级结构在微观上略有差异。 Ｍａｊｉ 等［９］ 通过生化染色（如硫磺素Ｔ 染色、刚果红染色等）及电镜观察，进一步证实了地加瑞克在体外的聚集性质，并通过透析试验定量证明了本品的释药方式（即从形成的淀粉样纤维末端逐渐释放药物单体）。 原研品欧盟审评报告［１０］及原研公司公开专利［１１］均显示，基于原料药的此种聚集特性，结合统计分析说明制剂体外加速释放度试验与光密度和黏度的实测值间具有相关性，原研公司在制剂标准中仅通过对成品部分物化性质（如复溶溶液的黏度和光密度等） 进行相应控制，就可确保原研品在体内释放行为的批间一致。但仿制药证明自身与参比制剂的一致仅此还不够充分。 美国ＦＤＡ于２０２１ 年３ 月提出了该品种的个药指南草案稿［１２］，明确本品的仿制药首先需满足与参比制剂 Ｑ１ 和 Ｑ２ 的要求（即注射剂中辅料种类和用量应与参比制剂相同），其次需证明原料药一级和二级结构及聚集性质与参比制剂的一致性，并需要对制剂的必要物化性质（如复溶时间、乙酸含量、外观、光密度、黏度、ｐＨ 等）、聚集动力学和体外释放行为进行全面对比研究，其中聚集动力学应在适当的条件如缓冲溶液或模拟体内介质中进行，体外药物释放试验应说明试验设计的合理性，并提供必要的方法学研究和验证资料。各项要求中，聚集特性和聚集动力学为研究的重点及难点。除可采用上文已提及的生化方法进行评价外，美国 ＦＤＡ 研究人员还建立了一种基于核磁共振的试验方法［１３］。该方法提示，实时１ＨＮＭＲ中高场区０～２ ｐｐｍ间特征烷基信号的展宽可定性说明溶液中聚集结构正逐渐形成，且峰面积的变化与地加瑞克早期纳米尺度下体外聚集的速率间存在数量关系，该方法对地加瑞克的一些体外聚集特征（如浓度、ｐＨ 值、盐和温度对聚集的影响）均可进行合理解释，因此有望用于评价仿制药与参比制剂的一致性。 随着技术的进步，相信仍会有更多更好的研究方法不断涌现。３.３ 醋酸格拉替雷该品种于 １９９６ 和 ２００１ 年分别在美国和欧洲上市，且已有多个仿制药获批，用于治疗多发性硬化症，但在我国原研及仿制药均未上市。 其原料药为由谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸以一定比例（约 ０． １４∶ ０． ３４∶ ０． ４３∶ ０． ０９）组成的肽段共聚 混 合 物， 其 结 构 为： （ Ｇｌｕ， Ａｌａ， Ｌｙｓ， Ｔｙｒ ）ｘ·ｘＣＨ３ＣＯＯＨ，平均分子量为 ５ ～ ９ ｋＤａ。 文献［１４］显示，其合成步骤首先为单个氨基酸活化并与引发剂结合，其次在一定条件下 ４ 种氨基酸以近乎随机方式发生聚合，形成多肽混合物，再在一定条件下发生部分解聚，考虑到各氨基酸反应活性存在差异，因此反应条件的选择对最终产品的物质组成有较大影响，原研原料药在批与批之间也存在一定范围内的差异，仿制药与参比制剂质量一致性比较上如何要求也具有相当的挑战。对于本品这样的复杂药物，采用多肽药物质量研究的一般方法不足以比较仿制药和参比制剂的质量。 为此，美国 ＦＤＡ 专门发布了个药指南［１５］，明确在确保仿制药组成及理化性质与参比制剂一致的基础上，还需要结合制备工艺、起始原料和过程控制及生物活性测试结果进行综合评价。 首先，仿制药的制备工艺应与参比制剂一致或相当，特别强调了起始原料氨基酸活化形式和聚合反应引发剂及酸裂解反应试剂应等同；其次，产品物化性质需一致，包括４ 种氨基酸的含量和光学纯度、分子量分布、指纹图谱特征（如红外、圆二色散、核磁共振等）；再次，聚合和解聚的反应特征应相当，应对聚合开始、聚合过程中链增长、部分解聚裂解过程中的物料结构进行详细研究并与参比制剂具有可比性；最后，典型体外动物模型上表现出的生物活性应等效。 不过值得注意的是，考虑到参比制剂本身的复杂性，在与其进行充分对比研究的基础上，该指南允许仿制药的相关特性在一定范围内发生变动。有部分文献探讨了如何在该指南的基础上去评价仿制药与参比制剂的一致性。 其中，对于物质基础的等同，美国 ＦＤＡ 的研究人员提供了一种解决方案［１６］。 采用包括核磁共振、非对称性场流多角度光散射分离检测和液质联用等不同分析方法的组合，对比研究 ３ 批参比制剂及 １ 批各氨基酸比例（酪氨酸和赖氨酸比例与参比制剂有 ２％ 的出入）与分子量（远高于参比制剂）均与参比制剂不同的工具化合物。 结果显示所用方法可有效检测出 ２ 种药物的分子量及氨基酸比例及序列的差异，且具有统计学意义。 该研究提示，若干高灵敏度的正交分析方法的组合运用，可能是分析这类极其复杂的原料药的一种解决之道。此外，从 Ｍｙｌａｎ 公司在欧盟获批上市的本品仿制药审评报告［１７］ 也可以看出欧盟对该品种的审评思路。 仿制药药企首先通过严格控制合成工艺参数及合理拟定放行标准确保了仿制药批间的一致性；其次采用经验证的方法说明仿制药与参比制剂一级及高级结构的相似，并证明了该方法对具有相似组成但不同工艺制备样品的区分力；再次分别对仿制药与参比制剂中的 ９ 个主要成分进行分离，通过多种化学和生物学手段构建了用于评价一致性或相似性的指纹图谱，最后借助成品及各主要成分体内外生物学研究及临床研究进一步说明了仿制药与参比的相似性。 体外药学部分整体评价思路与美国ＦＤＡ 基本一致，但欧盟认为如此复杂仿制药的批准可能仍需要临床试验数据的支持。原研公司采用 ７ 种物理化学方法及 ７ 种生物学方法综合评价了美国和欧洲上市仿制药与参比制剂的相似性［１８-１９］。 采用低灵敏度的理化方法（如分子量分布、考马斯亮蓝染色等） 检测结果显示二者之间无明显差异，但采用高灵敏度的方法（如反相色谱多角度光散射法、阳离子交换色谱法等） 检测结果显示仿制药组成和比例均与参比制剂略有不同，此外，仿制药细胞体外试验活性要略高于参比制剂，而动物体内研究则显示仿制药在给药部位局部毒性的出现频率也高于参比制剂。 原研公司的研究结果进一步印证了这类品种的极端复杂性，无论研发或是监管均需特别审慎。３.４鲑降钙素该品种于２０ 世纪 ８０ 年代前在美国上市，用于治疗骨质疏松。 其原料药为来源于大马哈鱼体内的一种 ３２ 肽，结构中含 １ 个二硫键（图３），目前上市品来源多为化学合成或生物重组。 目前已有多个仿制药在我国上市，但上市时间均较早，且尚未进行一致性评价。 该品种结构或物化特性相对并不复杂，但由于仿制药制备工艺与原研药明显不同，因此更需关注杂质控制的合理性，特别是来源于制备工艺的特有杂质。 对于多肽化学药物杂质研究来说，通常需同时综合应用不同原理的方法进行交叉研究，重点关注方法对肽类杂质的分离和检出能力。美国药典（ＵＳＰ）鲑降钙素原料药各论推荐采用高效液相色谱法控制合成来源鲑降钙素原料药中的有关物质，但未规定特定杂质，仅控制一般单杂与总杂；制剂各论中未对有关物质进行控制。 美国 ＦＤＡ结合审评经验，建立液质联用方法对已上市某种鲑降钙素鼻腔喷雾剂进行研究［２０］，检测到该产品中总杂水平要远高于 ＵＳＰ 推荐的有关物质方法的检出水平，同时新方法还可对各已知杂质及１０个未知杂质进行定性和定量，表明新方法较药典方法具有更高的杂质分离和检出能力，也印证了采用不同原理的方法进行多肽药物杂质研究工作的必要性。 美国ＦＤＡ 利用该方法对已上市的 １３ 种鲑降钙素鼻喷剂进行检验，结果表明不同来源制剂的质量参差不齐，为进一步加强监管及提升行业总体研究水平提供了依据。 此外，Ｗｉｎｄｉｓｃｈ 等［２１］报道鲑降钙素在高温条件下的降解实验中有明显的二聚物或多聚物杂质生成，这类聚合物杂质在工艺过程中，特别是当仿制药原料药制备工艺或制剂所用辅料与参比制剂有较大差异时，都有可能产生。 这类杂质对多肽药物的安全性有较大影响，因此需要特别关注。从上面几个例子可以看到，对于复杂多肽药物，特别是涉及多组分、存在高级结构或具有聚集特性的多肽，在进行仿制药研发时，应采用不同原理的分析方法并结合品种特点对比参比制剂进行研究，以全方位说明仿制药与参比制剂的一致性，必要时还应选择合适的指标在质量标准中进行相应控制。 另外，在仿制药研发早期即应对工艺可能引入的杂质包括聚合物杂质采用适宜方法进行充分研究，根据研究结果制定合理的控制策略，杂质的限度应以参比制剂杂质实际水平为依据，并参照相关指南合理拟定，必要时关注杂质的特殊安全性。 还应注意的是，有些原研多肽由于上市较早，当时研究手段有限，质量研究和控制标准放在当下可能并不充分，在进行仿制药开发时还应基于产品的结构特点以及结构与疗效、安全性的关系，建立新的质量研究方法、调整控制策略。四结语综上所述，多肽仿制药的研究应符合仿制药研究的一般要求，同时要考虑其技术上的特殊性，仿制药结构和物化特性与参比制剂的等同及对杂质的合理控制是获得成功的关键，应结合品种特点科学制定研究方案。 目前市场上多肽药品数量很多，但质量良莠不齐，多肽药物的研发和监管水平均亟须提升。 ２０１８ 年国务院办公厅发布了《关于改革完善仿制药供应保障及使用政策的意见》［２２］，提出要制定鼓励仿制的药品目录，目前已发布的２批目录［２３-２４］共计５０个品种中，就包括了格拉替雷和普卡那肽等多个多肽药物品种，说明国家非常重视多肽仿制药的发展。同时该文件还要求健全产学研医用协同创新机制，建立仿制药技术攻关联盟，发挥企业的主导作用和医院、科研机构、高等院校的基础支撑作用，加强仿制药的技术攻关。 希望通过本文与业界对多肽化学仿制药进行交流，并促进更多更好的多肽仿制药加快上市，提高我国患者的用药可及性。文章信息源于公众号药研，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读