Phosphorylcholine monoclonal antibody (Athera Biotechnologies)

摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）结合了单克隆抗体的精确靶向优势和药物载荷的有效杀伤能力，展现出巨大的临床治疗价值。ADCs的载荷在决定ADC药物的疗效方面起着关键作用，因此在该领域受到了极大的关注。理想的ADC载荷应具有足够的毒性、低免疫原性、高稳定性和可修饰的官能团。常见的ADC载荷包括微管抑制剂和DNA损伤剂，其中微管抑制剂在临床开发中的ADC药物中占比超过一半。然而，由于传统ADC载荷的临床局限性，如疗效不足和获得性耐药的发展，正在开发具有多样化靶点和减少副作用的新型高效载荷。本文综述了传统和新型ADC载荷的最新研究进展，主要关注结构-活性关系研究、共晶结构和设计策略，并进一步讨论了ADC载荷未来的研究方向。本综述还旨在为开发具有高疗效、低毒性、足够稳定性和克服药物抗性能力的新型ADC载荷提供有价值的参考和未来方向。 1.引言 尽管免疫疗法和细胞疗法近年来取得了进展，化疗仍然是癌症治疗中最常用的策略。然而，由于其较低的治疗指数，传统的化疗药物虽然对癌细胞表现出强烈的细胞毒性，但往往对健康组织也表现出毒性作用，这显著限制了它们的临床效果。因此，开发具有高效率和有限系统毒性的药物输送系统，用于癌症治疗可能是解决这一问题的有效策略。因此，一个新概念，抗体-药物偶联物（ADCs）被构想并发展起来（图1）。通常，ADC由针对肿瘤特异性抗原或相关抗原的抗体和通过适当连接子连接的多个载荷组成。ADC结合了单克隆抗体（mAb）的高靶向能力和肿瘤组织中载荷的高效性。近年来，ADC已成为肿瘤学中发展最快的药物类别之一，因为它们的副作用更低，治疗应用更广泛，治疗指数更高。 图 1 ADCs的关键结构和作用机制。(A) ADCs的一般作用机制；(B) 作为ADC载荷的DNA抑制剂的作用机制；(C) 作为ADC载荷的剪接抑制剂的作用机制；(D) 作为ADC载荷的微管抑制剂的作用机制；(E) 作为ADC载荷的PROTAC分子的作用机制；(F) 作为ADC载荷的Bcl-xL抑制剂和蛋白酶体抑制剂的作用机制；(G) 作为ADC载荷的NAMPT抑制剂的作用机制；(H) NIR-PIT ADC的作用机制。 ADC药物的概念最早由德国诺贝尔奖获得者保罗·埃尔利希在1903年提出。但直到1975年，杂交瘤技术的发展开始用于生产单克隆抗体，ADC药物的开发时代才真正开始。ADC药物经历了三代创新，技术日益成熟（图2）。在第一代ADC药物中，传统化疗药物如甲氨蝶呤、长春新碱和多柔比星被用作细胞毒性载荷。然而，由于它们对癌细胞的细胞毒性不足，缺乏肿瘤选择性，以及在目标细胞中的积累较低，这些第一代ADCs的疗效甚至比它们的原始载荷更差，导致它们在临床上失败。随后，比第一代ADCs中使用的传统化疗药物强100至1000倍的新型高细胞毒性化合物引起了强烈兴趣。它们通常在作为单一药物用于杀死肿瘤时具有难以承受的副作用。例如，微管抑制剂美登素对肿瘤细胞表现出极其强大的抗增殖活性。然而，其毒性副作用，如神经毒性和胃肠道反应，也非常严重。因此，它没有作为单一药物被批准用于癌症治疗。有趣的是，这些高细胞毒性化合物是ADCs的理想载荷。由α-和β-微管蛋白组成的微管是细胞骨架的主要成分。微管抑制剂可以通过破坏它们的细胞骨架结构和干扰有丝分裂来杀死肿瘤细胞。因此，与正常细胞相比，分裂更快的肿瘤细胞对微管抑制剂更敏感。大多数第二代ADCs使用了显著更强的微管抑制剂作为载荷。不幸的是，虽然微管抑制剂对活跃分裂的肿瘤细胞非常有效，但对静止的癌细胞效果较差。为了可能克服这一限制，能够针对整个细胞周期的DNA损伤剂被选为大多数第三代ADCs的细胞毒性载荷。DNA损伤剂可以通过双链断裂、烷基化、嵌合体和交联来破坏DNA结构，杀死肿瘤细胞。代表性的DNA损伤载荷包括烯二炔、拓扑异构酶I抑制剂和吡咯苯并二氮杂环（PBD）。目前，已有15种ADC药物获批，大量ADC药物正在进行临床试验（表1）。它们的载荷主要是天然来源，微管抑制剂占一半以上。尽管ADC经历了三代，但目前的载荷仍然存在临床局限性，如严重的副作用和药物抗性的发展。仍然有强烈的未满足的医疗需求，需要开发更强效的ADC载荷，理想情况下具有更好的治疗指数。因此，包括RNA抑制剂、Bcl-xL抑制剂、NAMPT抑制剂和卡马霉素在内的额外新型ADC载荷正在设计中。此外，使用免疫调节剂作为载荷的免疫ADCs因其在肿瘤免疫疗法中的关键作用而受到显著关注。不是使用单一简单分子作为它们的载荷，而是出现了几种使用更复杂载荷设计ADCs的新策略。例如，使用PROTACs或光敏剂作为ADC载荷，并且开发了将具有不同靶点的几种载荷结合到单一抗体中的方法。这些开创性策略可以引领下一代ADCs。 图 2 ADCs载荷开发中的里程碑。 表 1 FDA批准的ADC药物（截至2023年3月）。 基于ADC载荷的重要性和主要特征，本综述从它们的晶体结构和ADC载荷与其靶标之间的结构-活性关系（SAR）的角度，总结了各种传统ADC载荷的发现和主要结构修饰。此外，本综述还将总结基于新药靶和创新设计策略的各种新型ADC载荷。最后，鉴于当前载荷的限制，讨论了开发未来ADC载荷的主要研究方向，希望为未来具有理想特性的新型ADC载荷的设计提供参考。 2.ADC载荷的重要性和特征  ADC药物进入血液循环并与肿瘤细胞表面的靶抗原受体结合后，新形成的ADC-抗原复合物将在内化后被溶酶体降解，释放载荷并诱导肿瘤细胞死亡（图1）。因此，载荷是ADC设计的重要组成部分。载荷的活性和物理化学性质直接影响ADC药物的抗肿瘤效果。载荷的作用机制是决定ADC性能的重要因素（例如，不良反应）。此外，ADC载荷的某些其他特征，如细胞毒性、免疫原性、制备和循环过程中的稳定性、水溶性和可修饰性也很重要。 理想载荷应具备以下特性：首先，它们应具有足够高的细胞毒性。肿瘤特异性抗原非常有限，特别是在实体瘤中。此外，由于单克隆抗体的渗透性和内化活性较低，通过抗体-抗原结合进入肿瘤细胞的ADC载荷数量非常少。第二，ADC载荷应具有足够低的免疫原性。蛋白质药物有诱发免疫原性的风险，这可能对ADC的疗效产生负面影响，甚至导致接受治疗的患者死亡。尽管ADC目前使用人源或人源化单克隆抗体和小分子载荷，它们仍可能比治疗性单克隆抗体增加免疫原性的风险。为解决这个问题，一些高毒性载荷从植物、动物或微生物中提取，确保载荷在人体的免疫原性足够小，可以忽略不计。使用较小分子载荷也是减少免疫原性风险的一种方式。第三，ADC载荷应具有高稳定性。由于抗体在循环中的半衰期较长，ADC应保持在血液循环中稳定，避免释放或分解。载荷还应在细胞质和溶酶体中保持稳定，在低pH条件下没有显著降解。第四，ADC载荷应具有可修饰的官能团，而不影响其效力。载荷必须具有可修饰的官能团或可与单克隆抗体结合的位点。修饰位点必须仔细选择，以保持原始药物的效力。更重要的是，在使用不可切割的连接子时，载荷在抗体降解后必须保持其效力。第五，ADC载荷应具有旁观者杀伤效应。一些ADC药物被内化并释放小的、未带电的、可渗透的膜脂溶性分子，这些分子通过细胞膜扩散并杀死表达相邻抗原的肿瘤细胞。这个过程被称为“旁观者杀伤效应”，对抗原表达不均匀的肿瘤细胞具有重要意义。总的来说，促进癌细胞旁观者杀伤效应的载荷更适合于目标抗原表达低或异质的癌症。为了构建具有旁观者效应的ADC药物，它们的结构必须满足连接子可以被切割，载荷可以渗透细胞膜的条件。具有良好膜穿透性的脂溶性分子具有较强的旁观者杀伤效应，但这也可能使药物容易被健康组织吸收，导致严重的系统毒性。因此，两者之间的平衡对ADC的开发非常重要。第六，ADC载荷应具有适当的水溶性。载荷必须适当水溶，以便于与抗体结合，并确保在生理条件下结合物的溶解度足够。当过量的疏水载荷结合到抗体上时，产生的ADC倾向于聚集并变得不稳定。此外，载荷的亲水性影响原始ADC或其代谢物的细胞膜渗透性，从而影响其旁观者杀伤活性。最后，载荷的目标应该是细胞内的，因为大多数ADC需要进入肿瘤细胞才能释放它们的载荷。许多来自微生物、植物和动物的强大载荷具有膜靶向作用，例如主要通过阻断离子通道或破坏凝血来工作的神经元上的载荷，不适合用作ADC载荷。在上述ADC载荷的七个特性中，高效力、低免疫原性、药物制备和血液循环中的稳定性以及可修饰的官能团是在选择ADC载荷时必须考虑的重要因素。其他特性，包括适当的水溶性或旁观者杀伤效应，虽然通常不太重要，但对ADC的有效性仍有显著影响。基于这些特性，我们总结了现有ADC载荷的有效性，包括针对微管/DNA/RNA的载荷、免疫ADC载荷、新型潜在ADC载荷，以及在各种新策略指导下用于ADC药物设计的载荷。通过分析各种载荷与蛋白质之间的结合模式和相关的SAR，我们希望阐明结构如何决定它们的生物活性和特性，并为未来更多新型ADC载荷的产生提供有价值的参考。 3.ADC的多种载荷  3.1.靶向微管的载荷  微管是真核细胞细胞骨架的重要组成部分。它们是由α,β微管蛋白异二聚体沿圆柱轴平行排列形成的动态极性聚合物。微管在维持细胞形态、信号传导、细胞器运输、细胞运动、细胞分裂和有丝分裂等细胞功能中发挥重要作用，是肿瘤治疗的重要靶点。微管蛋白是微管的组成成分，微管蛋白抑制剂通过与微管蛋白结合干扰微管的动态组装，阻止细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡。由于微管蛋白抑制剂破坏有丝分裂纺锤体并发挥抗有丝分裂作用，它们对快速分裂的癌细胞比大多数生长缓慢的正常细胞具有更强的毒性，使它们成为流行的ADC载荷。其中，微管聚合增强剂，如auristatin化合物MMAE和MMAF，作用于α,β微管蛋白二聚体的β亚基，使微管的生长不受调控。相反，微管聚合抑制剂，如美登素化合物DM1和DM4，通过抑制成熟微管的形成来阻断微管蛋白二聚体的聚合。这些微管抑制剂是许多临床ADC药物中使用的最常见的第二代载荷，并且已被多个团队作为先导化合物进行结构修饰，以进一步提高这些ADC载荷的物理化学性质，使它们更适合ADC药物的开发。 3.1.1.美登素类 美登素（1）（图3A）最初是从非洲灌木Maytenus ovatus的树皮中分离出来的，是一类结合微管蛋白并抑制微管组装的苯并桑斯内酯类抗生素。在体外细胞活性测定中，其IC50值达到皮摩尔范围，显示出其强大的抑制肿瘤细胞增殖的能力。它在其他实验中也显示出良好的稳定性和溶解性。然而，由于其治疗窗口狭窄和由于缺乏选择性而导致的神经毒性和胃肠道反应等毒性副作用，它已被临床禁止直接用于人类治疗。然而，美登素的高细胞毒性完全符合ADC载荷的要求，使美登素成为ADC载荷的强大候选者。由于美登素没有反应性官能团，它不能与抗体结合。对美登素类的结构-活性研究确定了C3 N-乙酰基-N-甲基-L-丙氨酰酯侧链、C4eC5环氧基、C9醇基功能以及共轭的C11和C13双键的位置是活性的关键要素。这使得苯环和N-乙酰基团成为化学可修饰的实体。将美登素中N-乙酰基团替换为3-甲硫代丙酰基团，可以得到含有二硫键的美登素衍生物DM1（2）（图3A）。通过在DM1二硫键周围添加两个甲基，可以得到DM4（3）。衍生的DM1和DM4，带有甲硫代丙酰基团，可以通过二硫键与连接子结合。DM1和DM4是临床实际应用中使用最广泛的两种美登素类ADC载荷，例如Trastuzumab-SMCC-DM1，是首个基于美登素衍生物的ADC药物，已获准上市（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04158947, NCT01983501, NCT02562378等）。目前，20%的在开发ADC使用美登素衍生物作为载荷。 图 3 迈坦辛类化合物的设计和SAR分析。(A) 迈坦辛类化合物1e5的化学结构；(B) 迈坦辛（1）与微管的结合模式（PDB代码4TV8）；(C) 化合物5与微管的结合模式（PDB代码5SBA）。 2014年，Michel O. Steinmetz团队35研究了美登素及其与微管的作用，并发现在β-微管蛋白上，美登素类有三个关键的与微管蛋白的相互作用点（图3B），包括美登素1位的羰基与β-微管蛋白的Asn102和Lys105残基之间的氢键；1位的羟基/羰基氧与β-微管蛋白的Val181之间的氢键；以及配体6a位的甲基与由Asn101、Asn102、Val182、Phe404和Tyr408残基形成的口袋之间的疏水相互作用。这些保守的微管相互作用点构成了一个共同的药效团。美登素是最常用的ADC载荷，但其合成、中间非对映异构体产物的分离和纯化困难。同时，它是多药耐药蛋白1（MDR1）的底物，这是一种降低某些抗体-美登素类偶联物效力的转运蛋白。因此，Jinliang Yang团队36探索了L-DM1-SMe（C3位甲基-L构型的DM1）、D-DM1-SMe（C3位甲基-D构型的DM1）和β-微管蛋白的晶体结构，并发现L-DM1-SMe酯基的羰基氧原子和C3侧链尾部的硫甲基与9位的羟基和苯环分别形成了强的分子内相互作用，这有助于提高结合亲和力。D-DM1-SMe的C3侧链向相反方向摆动，无法形成分子内相互作用，解释了C3位甲基的构性如何影响抗癌活性的详细机制。该研究为设计下一代具有新颖骨架的美登素结合位点抑制剂提供了基础，以改进合成策略并减少MDR1介导的抗性。 美登素醇（4）（图3A）最初是通过化学方法从Putterlickia verrucose提取物的C3位羟基上去除酰基得到的。它对微管蛋白聚合的抑制活性比美登素弱，暗示美登素和美登素类化合物C3位的酯基在生物活性和细胞渗透性中发挥重要作用。酯基的羰基氧原子与9位的羟基形成强的分子内相互作用，固定了生物活性构象。美登素醇被视为有价值的先导化合物。通过C3位羟基的酰化，可以容易地准备各种不同的天然和半合成美登素类化合物。Daniele Passarella团队通过美登素醇（4）的酰化获得了一种新的美登素类化合物5，它具有强大的抑制微管组装能力，在A549细胞上的IC50为0.07e1.2 nmol/L。晶体结构（图3C）显示，美登素类的结合对微管的整体构象没有影响，化合物在C1eO和Val181的主链氮原子之间以及C24eO和Lys105和Asn102的侧链之间形成氢键。此外，化合物5通过其C9eOH基团与Gly100的主链羰基建立了氢键。在研究的美登素类中，所有在C3位引入的修饰都指向溶剂，并且不干扰美登素位点的紧密环境。因此，酰化增强了美登素的全部生物活性，C3位引入的修饰不干扰化合物与微管蛋白二聚体的结合状态、亲和力或有效性。Regeneron团队研究了N-甲基丙氨酸中氮取代的影响，通过改变环上侧链的长度和通过伯胺和仲胺连接的连接体。使用化合物6作为载荷获得了靶向EGFRvIII的ADC，对HEK293、U251和MMT细胞系的IC50为0.3e0.4 nmol/L，并在U251/EGFRvIII和MMT/EGFRvIII小鼠模型中实现了肿瘤消退。 3.1.2. Auristatin Dolastatin 10（7），1987年从Dolabella auricularia中分离出来，对多种癌细胞具有强烈的抗增殖活性，并且可以强烈抑制微管组装，导致细胞周期停滞和凋亡，使其成为一种有前景的抗癌药物（图4-1A）。它的水溶性合成类似物被称为auristatin。其中，最广泛使用的是单甲基auristatin E（MMAE）（8）和单甲基auristatin F（MMAF）（9）。它们每个都包含一个功能手柄，能够进行后续的偶联，进一步提高体内效力。MMAE由四种氨基酸组成：单甲基缬氨酸（MeVal）、缬氨酸（Val）、dolasoleuine（Dil）和dolaproine（Dap），以及羧基末端胺norephedrine。在MMAF中，单甲基缬氨酸的C末端被苯丙氨酸取代，其细胞活性显著降低。Andrea E. Prota团队发现MMAF与游离微管蛋白的结合亲和力比MMAE增加了近5倍，主要是由于β1微管蛋白亚基上的关键Arg278残基，通过有序水分子对MMAF暴露。他们还表明，详细的结构相互作用将长春花域扩展到肽位点，不仅通过抑制核苷酸交换在功能上不同，而且还表明肽位点抗有丝分裂药物如何通过长春花生物碱获得增强的效力。分析可能为为什么MMAF的细胞活性降低提供结构解释。 Jinliang Yang团队通过MMAE与微管蛋白在长春花域的结合域的结构研究，定义了一个重要的药效团。药效团由两个疏水区域I和II和两个氢键区域组成，与Asp179b和Asn329a相互作用，为合理设计具有高特异性、强亲和力和高效率的ADC载荷奠定了基础。在2020年，Christopher J. O'Donnell团队设计并合成了一种N末端修饰的auristatin类似物10（IC50 Z 0.2 nmol/L），并首次通过具有更高分辨率的auristatin晶体结构对其结合模式进行了详细研究。晶体结构显示，化合物10的N末端二甲基在受体口袋中很好地契合，并不会影响分子的整体结合亲和力（图4-1B）。此外，关键的极性相互作用被识别出来，包括末端质子化氨基与位于T5环上的Asp b197和Phe a351氨基酸羰基之间的氢键网络，N-2缬氨酸与Asn a329之间的双焦相互作用，以及Tyr b224的主链酰胺与化合物10中Dap和Doe的末端羰基之间的关键氢键相互作用。后一个氢键网络将Tyr b224的芳香环排列在与GDP的核苷碱基发生π堆叠相互作用，防止其从β-微管蛋白解离。GDP的捕获被认为是auristatins发挥其干扰微管效应的关键机制。此外，所有分析的类似物在其功能相关的微管蛋白结合状态下的Val-Dil酰胺键都具有顺式构型，而在溶液中这个键完全是反式构型。这揭示了auristatin的首选结合模式，并为基于结构的药物设计提供了有价值的工具。 图 4-1 奥瑞司他汀类似物的设计和SAR分析。(A) 奥瑞司他汀类似物7e10, 21e24的化学结构；(B) 化合物10与微管复合物的结合模式（PDB代码4X1I）。 大多数auristatin类似物的研究都集中在C末端或N末端的修饰上。在C末端修饰中，Doronina等人描述了MMAF类似物11和12，其中苯丙氨酸的羧酸被四唑和膦酸盐替代。化合物11在H3396细胞上的IC50为6.0 nmol/L，化合物12在HCT116细胞上的IC50为0.09 nmol/L。11和12（游离酸型）都已经被用于通过VC-linker与针对CD70的H1F6抗体结合形成活性ADC，其效力与MMAF作为载荷相似（IC50：4e10 nmol/L）（图4-2B）。Pettit等人设计了C末端芳香磷酸和喹啉修饰的auristatin类似物13e15，它们在McF-7细胞上的IC50分别为0.81、0.19和6.35 nmol/L。其中，13具有极佳的水溶性（>236 mg/mL），两种喹啉类似物14和15显示出良好的活性，14的效力显著更高（图4-2A）。Lerchen等人进一步说明了在auristatin的C末端结合域允许的修饰程度。他们通过在C末端添加取代基获得了有效的auristatin类似物16e18，它们在768O细胞上的IC50分别为0.5、1.2和1.2 nmol/L（图4-2B）。对于N末端修饰，Satomaa等人证明了丙基醇和叠氮衍生物19和20尽管存在亲水侧链，但仍然保持了相当的细胞效力，分别为SKOV3细胞上的19和20的IC50为1.0 nmol/L和<1.0 nmol/L。它们的叠氮和炔烃可以用于后续的环化反应，形成更复杂的亲水"糖交联剂"，使其能够与各种抗体（赖氨酸、半胱氨酸、糖链和转谷氨酰胺酶偶联物）结合。基于此，制备了曲妥珠单抗和EGFR1 ADC，在体内表现良好，效力为1.5e10 mg/kg（DAR Z 3）（图4-2A）；Doronina通过将对氨基苯甲酸替代N末端氨基酸获得了auristatin类似物21，并在Karpas 299细胞上显示了0.12 nmol/L的IC50。载荷21的ADC在Karpas 299人类ALCL异种移植模型中以1 mg/kg的剂量减少了肿瘤体积。然而，这种ADC不如相关的VC-MMAE ADC有效（图4-1A）；在2020年，Svetlana O. Doronina团队设计了一系列烷基MMAF类似物，以探讨开发具有可调节膜渗透性、活性和抗泵出能力的auristatins的可能性。MMAF在N末端容忍相当大的取代基，提供了一种方便的方式来调节游离药物的疏水性，而不会显著影响细胞活性。他们选择了从C1到C12的支链和非支链脂肪族基团作为取代基，并生成了MMAF N末端烷基衍生物22。这一系列衍生物的细胞毒性随着烷基链长度的增加而增加，取代基的空间体积或疏水性的增加都没有导致活性降低。这些新型类似物结合了MMAE和MMAF的特点：高效、旁观者活性和克服MDR。这些发现进一步扩展了Auristatins作为ADC载荷的作用。Agensys最近将叠氮基团引入P2和P4亚基，产生了一种在MOLM13细胞上IC50为0.057 nmol/L的化合物23。由于P2或P4位点作为ADC药物的偶联位点，这为下一代auristatin衍生物提供了新的方向。Luke R. Odell教授团队开发了azastatin（24），一种auristatin衍生物，其细胞毒性（IC50：0.13e3.0 nmol/L）比MMAE（IC50：0.47e6.5 nmol/L）更高，表明N末端二甲胺基团增加了化合物的效力。此外，该衍生物包含一个中央胺侧链抗体结合位点，适合ADC开发。 图 4-2 奥瑞司他汀类似物11e20的化学结构。 3.1.3. Eribulin 聚醚大环内酯的天然产物Halichondrin B（25），最初从Halichondraria Okadai等人中分离出来[56]，已被证明具有良好的抗增殖活性[55]（图5A）。其结构简化的新型非紫杉醇全合成类似物eribulin mesylate（26），是一种具有抗有丝分裂效应的微管动力学抑制剂，已于2010年获批用于治疗局部晚期和转移性乳腺癌（MBC）患者。Michel O. Steinmetz团队通过晶体结构发现，eribulin与微管蛋白的结合位点由β-微管蛋白的螺旋H1、H6、H7、H6eH7环、S3eH3（T3）和S5eH5（T5）的疏水和极性残基形成（图5B）。此外，eribulin的“笼”结构与鸟嘌呤核苷酸的核糖部分接触。在微管蛋白-eribulin复合物中，配体环绕在Tyr224的侧链周围。当eribulin结合在微管中发现的两个纵向排列的微管蛋白二聚体的背景下时，来自邻近微管蛋白二聚体的α-微管蛋白的链S9、螺旋H10和环T7将与eribulin分子的主体发生碰撞。这些结果表明，eribulin可以在高浓度下将微管蛋白二聚体隔离成组装无能的微管蛋白-eribulin复合物，干扰微管末端原始线的生长，在低浓度下可以破坏微管蛋白或抑制微管蛋白动力学。 Eribulin在肿瘤生物学中的强烈抗有丝分裂活性使其作为ADC载荷具有前景。Earl F. Albone团队设计了一种以Eribulin为载荷的ADC，通过向C-35主要氨基添加连接子，对卵巢癌细胞IGBOV1有强烈效果（IC50为20 pmol/L）。在非小细胞肺癌细胞NCI-H2110异种移植模型中，5 mg/kg ADC剂量可诱导肿瘤完全消除，表明微管靶向剂eribulin可以用作ADC载荷。此外，早在2011年，Sridhar Narayan实验室合成并评估了几种具有中性C32侧链的第二代eribulin类似物。这些侧链修饰的eribulin类似物在U-251和SF-295细胞上的效果显著优于eribulin。通过在C32侧链引入低碱性胺或增加eribulin的亲脂活性，得到的化合物27对体外和体内的多种异种移植肿瘤具有抑制作用，具有口服生物利用价值。它可以增加脑脊液中的暴露量，可能为治疗脑瘤等更广泛的人类癌症提供药物候选（图5B）。 图 5 艾瑞布林类似物的设计和SAR分析。(A) 艾瑞布林类似物25e27的化学结构；(B) 艾瑞布林26与微管复合物的结合模式（PDB代码5JH7）。 3.1.4. Tubulysins Tubulysins（28）是Hofle等人从粘液菌培养液中分离出来的天然抗有丝分裂肽（图6A），是一种由N-甲基-D-哌啶酸（Mep）、Lisoleuine（L-Ile）、Tubuvaline（Tuv）和Tububealanine（Tup）或微管溶血素Tut（Tut）组成的线性四肽。它可以抑制微管蛋白的聚合并诱导细胞凋亡，对包括多药耐药KB-V1细胞（IC50 Z 0.08 nmol/L）在内的癌细胞具有强烈的抗增殖活性，是开发抗癌药物的良好前景。2018年，K. C. Nicolaou团队合成了高效力的tubulysins类似物29和30，它们对HEK293T细胞的IC50分别为6和3 pmol/L。2021年，该团队对化合物30与T2R-TTL进行了晶体学研究，发现化合物30与Vinca域结合，在b-和a-微管蛋白分子界面附近的核苷酸结合位点处形成一个延长的构象，其中酚羰胺部分定位在a2-微管蛋白亚基的氨基酸残基L248的疏水袋中（图6B）。根据结合模式，他们设计了一个在血浆中稳定性良好且对NCI-N87小鼠肿瘤模型有显著效果的ADC，这在靶向癌症治疗研究中具有潜力。 对tubulysin的SAR研究表明了tubulysin关键残基修饰的可行性：在N末端，Mep残基的6元环可以有效地被5元和非环状残基N-甲基-D-脯氨酸、N-甲基肌氨酸和N,N-二甲基-D-丙氨酸替代，在大多数情况下活性损失很小；Tuv残基的C11-乙酰修饰对活性有显著影响：乙酰水解成二级醇会导致活性丧失高达1000倍，尽管它可以容忍广泛的改变，特别是对N,O-缩醛的改变；相比之下，Tup残基是通常被靶向的剂量偶联位点，可以被修饰；C13上的取代基不容忍变化，将异丙基团替换为环己基或芳基（苯基和对甲氧基苯基）会导致活性丧失；羧酸末端是常见的偶联位点，因此经常被修饰。为了克服由tubulysin C-11乙酰化引起的不稳定性，Patrick J. Burke设计了一个C-11烷氧基类似物31，其显示出与tubulysin M相似的生物活性，并显著提高了血浆稳定性（图6A）。Chakrapani Subramanyam鉴定了一种含有α-甲基叔胺的强效tubulysin类似物32。所得ADC在体内外均显示出良好的效力。Heng Cheng准备了一种含有氨基甲酸酯的tubulysin类似物33，其氨基甲酸酯基团在体内稳定。其在OVCAR3和N87细胞上的IC50分别为0.20和0.23 nmol/L，由化合物33和抗间皮细胞抗体偶联形成的ADC在0.01 mmol/L时可显著延迟肿瘤生长。含有非水解性N-取代基的Tuv（Tub）的衍生物34，在HT-29细胞上的IC50 < 0.28 nmol/L，也具有作为ADC载荷的潜力。 图 6 管芽菌素类似物的设计和SAR分析。(A) 管芽菌素类似物28e34的化学结构；(B) 化合物30与微管复合物的结合模式（PDB代码6Y4N）。 3.1.5. Cryptophycins Cryptophycin是一种由蓝藻产生的具有16个成员环的天然大环多肽。它包含两种羟酸（A和D单元）和两种氨基酸（B和C单元）。Cryptophycin在有丝分裂期间不可逆地抑制β-微管蛋白聚合，这可能导致G2/M阶段的细胞周期阻断并激活凋亡途径，从而在体外产生皮摩尔级的抗增殖能力。第一个合成和评估的cryptophycin类似物，cryptophycin-1（35），对KB细胞的IC50为4.58 pmol/L，对LoVo细胞为7.63 pmol/L（图7A）。然而，由于大环内酯在血液循环中的不稳定性，其体内抗肿瘤活性并不显著。经过进一步的结构修饰，得到了cryptophycin-52（36），它在C单元β-丙氨酸的α位上比cryptophycin-1多一个甲基，增加了空间位阻并显著提高了体内稳定性。非常低浓度的cryptophycin-52（36）在有丝分裂期间抑制细胞增殖（IC50 Z 11 pmol/L），微管长度或质量没有显著变化。Cryptophycin-52（36）与微管蛋白的结合非常紧密，cryptophycin-52（36）-微管蛋白复合物与微管的亲和力非常高（Kd Z 47 nmol/L）。尽管cryptophycin-52有效，但由于剂量依赖性毒性，在II期被终止。使用这种化合物作为ADC的有效载荷可能会降低其毒性。最近，Paul T. Wingfield团队确定了cryptophycin-52（36）及其亲本化合物cryptophycin-1（35）在微管蛋白二聚体界面上的结合位点，与美登素部分重叠（图7B）。α-微管蛋白和β-微管蛋白的构象都发生了变化，特别是在螺旋H8和H10上。α,β单体之间以及与cryptophycin-52（36）结合的、与cryptophycin-1结合的微管蛋白之间存在显著差异。然后，分析了cryptophycin上的合适位点：在单元A中，对位取代的苯环比邻位或间位取代的类似物更强大，对位取代的苯环可以用作偶联点；单元B对微小的修饰敏感，例如苯环上的5-氟取代。在单元C中，C6位置的苯甲基或异丙基等大取代基会大大减少其效力；然而，单元D上的修饰后活性只有轻微变化，单元D中的异丁基团可以用作偶联点。单元D的异丁基偶联位点可能比单元A的更好。这一分析为后续以cryptophycin作为有效载荷的ADC设计提供了参考，以找到合适的偶联位点。 Cryptophycin-52（36）的类似物37（IC50 Z 33 pmol/L）是一个非常有前景的临床药物候选物，已被Eli Lilly专利（图7A）。Cryptophycin-52中单元A的芳香环可以被替换修饰，而不影响其生物活性。这些修饰被Sanofi-Aventis用作抗体偶联的位点。Cryptophycin 52-chlorohydrin化合物，如cryptophycin-55（38），在体内生物活性提高了100-1000倍。Cryptophycin-55甘氨酸（39）在体外显示出最高的细胞活性。Cryptophycin-55甘氨酸与通过可切割连接子靶向HER2受体的曲妥珠单抗偶联，得到的ADC对SK-BR3细胞显示出纳摩尔级活性。Genentech将cryptophycin-52中的苯环转化为苄胺，以获得适合通过氨基甲酸酯键连接的载荷40。Jinliang Yang团队将cryptophycin-55，即cryptophycin-52的前药（CR55，在生理条件下可以转化为cryptophycin-52），与曲妥珠单抗偶联。其在HER2阳性肿瘤细胞系中的IC50为低纳摩尔级（0.58e1.19 nmol/L），相应的ADC在卵巢癌（SKOV3）和胃癌（NCIeN87）异种移植模型中以10 mg/kg剂量显示出显著的抗肿瘤活性。这为基于cryptophycin-55和cryptophycin-52的ADC抗肿瘤药物的开发提供了思路。 图 7 加密霉素类似物的设计和SAR分析。(A) 加密霉素类似物35e40的化学结构；(B) 加密霉素-52(36)与微管复合物的结合模式（PDB代码7M20）。 3.1.6. EG5抑制剂 驱动蛋白（KSP/EG5/KIF11）是一种依赖ATP的蛋白质，它参与细胞周期G2/M期中心体的分离和双极纺锤体的形成，对有丝分裂起着重要作用。EG5在血液肿瘤（例如，AML母细胞和弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL））和实体瘤（例如，乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌）中的高表达与它们的不良预后相关，使其成为有吸引力的癌症治疗靶点71。几种EG5抑制剂，如SB-715992（Ispinesib）(41)和Filanesib（ARRY-520）(42)，已经在临床试验中（图8A）。然而，EG5抑制剂最常见的副作用，如中性粒细胞减少症、口腔炎和口腔溃疡，以及它们狭窄的治疗窗口，限制了它们的治疗效果。然而，通过利用ADCs，可以从细胞毒性化合物的暴露中保护健康组织，可能减少它们的整体毒性副作用，并扩大化合物的治疗窗口。Dimitrios A. Skoufias的团队72比较了Eg5 Arry-520复合物的结构与Eg5 ispinesib复合物（PDB ID:4AP0）的结构（图8B）。两个复合物的叠加显示，ispinesib的喹啉酮占据着与Arry-520的二氟苯环相似的位置，并具有相似的相互作用。在ispinesib中，两个芳香性取代基对甲苯和苄基相互堆叠，与Glu118、Arg119稳定骨架，并通过Arg119、Trp127和Asp130侧链的进一步堆叠。然而，在Eg5 Arry-520复合物中，这种骨架堆叠要弱得多。此外，对于Arry-520，二氟苯和异丁基侧链残基之间存在直接的疏水堆叠相互作用，而在ispinesib复合物中，侧链移动2埃以适应苄基和对甲苯，从而完全削弱或失去这种相互作用。Arry-520和ispinesib在Gly117的主链氧和Glu116的侧链之间形成氢键相互作用。Arry-520中甲氧基的氧可能与Tyr211的羟基（3.63埃）弱相互作用。此外，苯环中的一个氟与Gly217的主链NH（3.03埃）相互作用，并与Arg221的侧链弱相互作用（3.69埃）。总的来说，Arry-520的紧密结合是通过一系列强或弱的氢键相互作用和与抑制剂结合袋中的氨基酸侧链的疏水相互作用实现的。此外，Eg5的D130A和L214A突变在变构结合位点都可以使Array-520耐药，而ispinesib仍然对L214A突变敏感。基于此，后续的化合物修饰可能会考虑避免对某些突变的抗性，这些突变导致化合物抑制作用降低，产生能够克服这些潜在的临床相关问题的新抑制剂。诺华开发了EG5抑制剂43、44作为有效载荷，与抗体结合，使用不可裂解的连接子靶向HER2（图8A）。在表达HER2的小鼠异种移植模型（SK-OV-3ip）中，单次静脉注射ADC剂量（5 mg/kg）可以使肿瘤生长停止3周，优于Kadcyla（5 mg/kg）73。 图 8 EG5抑制剂的设计和SAR分析。(A) EG5抑制剂41e45的化学结构；(B) 伊斯匹尼布(41)与EG5复合物的结合模式（PDB代码4AP0）。 使用非细胞穿透性的EG5吡啶抑制剂作为有效载荷，Anette Sommer74开发了一种新型的IL3RA靶向ADC，显示出有效和选择性的抗增殖效果。Carsten Terjung75研究了一种新的EG5吡咯亚类抑制剂45作为ADC的新有效载荷的适用性。在尿路上皮癌（UCC）的异种移植模型中，这种ADC显示出高效能，导致肿瘤完全根除。微管的破坏可以诱导细胞周期在G2/M期停滞，这使得微管成为药物发现的有吸引力的靶点。在许多情况下，狭窄的治疗窗口和缺乏肿瘤特异性可能导致有效的微管抑制剂作为抗癌剂单独失败。然而，使用ADCs作为靶向治疗可能是解决微管抑制剂单药治疗限制的有希望的方法。目前在临床开发中的ADCs中有一半以上使用微管抑制剂（auristatins和maytansinoids）作为有效载荷。虽然微管抑制剂作为ADC有效载荷已经取得了一些商业成功，但它们在开发过程中受到各种缺点的限制。例如，它只能针对分裂期的肿瘤细胞，而不是非分裂期和静止期的细胞。此外，肿瘤细胞中的微管抑制剂有更多的靶点，这意味着需要更大的药物剂量来阻止微管。因此，这些以微管抑制剂为有效载荷的ADCs仍然远离理想的靶向治疗概念。 3.2. DNA靶向有效载荷 与微管抑制剂相比，DNA抑制剂可以通过双链断裂、烷基化、嵌合、交联等破坏DNA，对整个细胞周期起作用，引起细胞毒性效应，并对实体瘤76具有良好的治疗效果。此外，DNA抑制剂的靶点远少于微管抑制剂，当ADCs携带相同数量的有效载荷进入细胞时，DNA抑制剂可以显示出更好的杀伤效果。此外，以DNA抑制剂为有效载荷的ADCs可以针对抗原表达低的肿瘤细胞，这解释了为什么DNA抑制剂已经被选为许多下一代ADCs的有效载荷。 3.2.1. 烯二炔 从细菌来源分离的烯二炔是目前发现的最具细胞毒性的天然产物之一。其摄取会导致活细胞中DNA单链或双链断裂，从而导致细胞死亡，并且它对各种细菌和肿瘤细胞具有极强的活性。烯二炔可以分为两个亚家族：Cal类烯二炔和蒽醌融合烯二炔。这些高毒性的烯二炔化合物不适合直接作为抗癌剂使用，但这些抗肿瘤抗生素的效力和作用机制使它们成为吸引人的ADC有效载荷。最常用的天然烯二炔产品的ADC有效载荷是Cal烯二炔类的卡利霉素gI 1 (46)和蒽醌融合的烯二炔Uncialamycin (47)（图9A）。卡利霉素靶向与DNA结合的小沟，并特异性诱导DNA双链断裂，导致细胞凋亡。尽管最初的实验显示了强烈的活性，但卡利霉素对正常细胞DNA的破坏阻碍了它们的临床进展。尽管如此，高细胞毒性、小分子尺寸和明确的作用机制使卡利霉素成为吸引人的ADC有效载荷。卡利霉素gI 1 (46)是目前研究最多的卡利霉素。Dinshaw J. Patel及其团队研究了卡利霉素gI 1-DNA双链复合物的高分辨率结构，发现卡利霉素的芳基四糖深嵌入小沟中，以寡嘧啶寡嘌呤区为中心，反过来，连接的烯二炔环横跨双链，在复合物的强度细化结构中（图9B）占据两个链。烯二炔环相对于螺旋轴倾斜，采用深入小沟的方向，允许在暴露的三硫触发器激活和环芳香化后提取DNA糖-磷酸骨架质子，最终导致DNA链断裂。在药物与DNA小沟界面之间有密切的互补性，这在复合物的细化结构中横跨整个结合位点。该研究提供了一个数据库，以解决与卡利霉素类DNA的识别和切割相关的两个领域问题。 图 9 烯炔烃类药物的设计和SAR分析。(A) 烯炔烃类药物46e52的化学结构；(B) 卡利奇霉素gI 1 (46)与DNA复合物的结合模式（PDB代码2PIK）。 卡利霉素gI 1 (46)具有强烈的细胞效应，以Mylotarg为代表的ADC的出现在很大程度上依赖于卡利霉素gI 1 (46)的发现，其N-乙酰衍生物成为Mylotarg的有效载荷。Nicolaou等人合成了卡利霉素qI 1 (48)，这是卡利霉素gI 1的类似物，对各种肿瘤细胞的IC50值小于1 pmol/L，也适合用作ADC有效载荷。此外，FDA批准的Inotuzumab Ozogamicin (Besponsa)也将卡利霉素作为有效载荷。Uncialamycin是从地衣中分离出来的一种天然烯二炔产品，它可以引起DNA断裂，并显示出强烈的细胞活性。Uncialamycin的有效类似物的一个共同结构特征是在A环上存在一个初级或次级苯胺基团。如果将胺转化为相应的苯甲酰胺，并将末端苯胺引入，就可以解决不稳定性问题，并且活性保持。Sanjeev Gangwar使用酚烷基化方法设计了一个高度有效且化学稳定的Uncialamycin类似物49（图9A）。通过将有效载荷与抗间皮素（meso）抗体结合产生的ADC在H226细胞中的IC50为0.2 nmol/L，表现出在耐受剂量下具有特异性和持久的肿瘤生长抑制。Julia Gavrilyuk等人选择了甲胺类似物50作为Uncialamycin ADC的有效载荷，针对TL和CD46的ADC在HEK293T细胞中表现出低皮摩尔效力。Emmanuel N. Pitsinos修改了Uncialamycin，从分子的芳香部分去除一个碳原子，得到了化合物51（测试细胞系：IC50 (H226细胞) Z 28 pmol/L; IC50 (N87细胞) Z 11 pmol/L; IC50 (OVCAR3细胞) Z 316 pmol/L; IC50 (Adr细胞) Z 20 pmol/L)。Sanjeev Gangwar85将Uncialamycin类似物52与抗间皮素（meso）抗体结合。产生的ADC在H226肺癌细胞中的IC50值为0.98 nmol/L。 3.2.2. 拓扑异构酶I抑制剂 拓扑异构酶I（TOPO-I）是一种重要的核糖酶，对基因组稳定性和DNA结构的保持至关重要，已成为ADCs的热门靶点。TOPO-I抑制剂与先天和适应性免疫反应相关，表明靶向TOPO-I的ADCs也可能有助于抗肿瘤免疫治疗。Lance Stewart等人报道了与临床批准的抗癌药物托泊替康（53）结合的TOPO-I与双链DNA共价连接的X射线晶体结构（图10A）。托泊替康（53）和人类TOPO I-DNA共价复合物表明，托泊替康是一种非竞争性抑制剂，通过在酶诱导的切口处插入DNA两条链之间的碱基，与酶-底物复合物结合。托泊替康的结合模式是与DNA的堆叠相互作用，与Asp-533的氢键接触，以及活性位点之间通过磷酸酪氨酸和Asn-722的水桥接触。天然五环产物喜树碱（CPT）（54）（图10B），是托泊替康（53）的类似物，是一类特别吸引人的ADC有效载荷，通过与TOPO-I和DNA结合形成稳定复合物，在S期细胞中诱导双链DNA断裂，导致细胞凋亡。然而，喜树碱的极低溶解度限制了它作为癌症治疗药物的广泛使用。SN-38（56），是伊立替康CPT-11（55）的活性成分，是一种半合成喜树碱。尽管SN-38具有所需的效力，但由于其高度疏水性和可用的结合位点数量有限，制备活性缀合物具有挑战性。尽管如此，SN-38已与针对滋养层细胞表面抗原2（Trop-2）的人源化抗体结合，产生了正在临床研究中的ADC sacituzumab govitecan。Exatecan mesylate（DX-8951f）（57）是一种水溶性CPT衍生物，比其他CPT类似物具有更强的TOPO-I抑制和抗肿瘤活性。DXd（DX-8951衍生物）（58）是一种新型的高膜透性拓扑异构酶I抑制剂，细胞IC50为2.05e17。nmol/L，可以克服P-糖蛋白介导的多药耐药性，并对各种肿瘤移植模型具有更强的效力，包括体内对CPT-11耐药的肿瘤。DXd（58）具有一个包含第二个手性中心的F环，这使得它的合成和衍生化复杂化。为了简化其结构，Wayne C. Widdison的 SAR研究表明，C11位置的氟取代通常可以增加细胞毒性数倍，并且C20中心必须处于S构型才能保持分子活性。Exatecan内酯的改进稳定性归因于C11氟取代基和F环的作用。来自喜树碱衍生物58和59的ADC可以有效地释放部分含有硫醚或硫醇的喜树碱代谢物。这些代谢物对靶向Ag ++细胞具有强烈的抑制作用，并在HSC-2和H1703 EGFR ++异种移植模型中显示出相似的剂量依赖性抗肿瘤活性。有效载荷59中没有F环，但其缀合物在体外和体内的效力与含有DXd的缀合物相似。这种简化使得喜树碱A和B环的衍生化更容易用于结构-活性关系研究和有效载荷优化。Dongke Yu通过将DXd与曲妥珠单抗结合，获得了一种新型HER2靶向ADC DS-8201a。SAR表明，C-10的羟基取代可以增强CPT的抗肿瘤活性，C-7和C-10的二取代可以稳定内酯环并提高分子生物学活性。DXd在C-7和C-9位点上发生环化，从而增加抑制活性。DS-8201a避免了药物抗性，并通过旁观者杀伤效应非常有效地治疗异质性肿瘤。Scott C. Jeffrey开发了一种新型的亲水性和蛋白酶裂解性谷氨酸三肽配体，使用一种高度细胞毒性的7-氨基甲基-10,11-甲叉二氧基CPT类似物60作为有效载荷。结合的ADC在CD30高度表达的菌株和MDR阳性786-O肾细胞癌裸鼠中显示出有效的抗肿瘤活性。 图 10 拓扑异构酶I抑制剂的设计和SAR分析。(A) 拓扑替康(53)与TOPO I-DNA复合物的结合模式（PDB代码1K4T）；(B) 拓扑异构酶I抑制剂53e60的化学结构。 3.2.3. PBD 在链霉菌中发现的吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂卓(PBD)(61)是一类具有抗肿瘤活性的天然产物（图11）。这些化合物由一个芳香的A环、一个1-4-二氮-5-1 B环和一个吡咯烷C环组成。它们的作用机制是在DNA的小沟中选择性烷基化，其中鸟嘌呤的N2与PBD的亲电性N10/C11亚胺形成共价键。DNA链之间的交联导致持续的DNA损伤，这导致细胞周期在G2/M阶段停滞和细胞凋亡，从而表现出强大的细胞毒性。Klaus Weisz团队的NMR结构数据证实了PBD杂合体与DNA双链的小沟强烈结合，形成PBD部分与外环鸟嘌呤氨基组之间的共价键。PBD二聚体有潜力作为ADC有效载荷使用，例如以PBD作为有效载荷设计的针对ROR1的ADC CS5001，在多种表达ROR1的肿瘤细胞系中显示出强大的选择性，并在血液和实体瘤异种移植小鼠模型中显示出显著的体内抗肿瘤活性。目前正在进行临床试验。为了进一步扩展更多类似PBD的化合物作为ADC有效载荷，Rahman及其同事对PBD的C8位置进行了修饰，获得了化合物62，其缀合物具有临床前活性。基于化合物62，Khondaker Miraz Rahman合成了PBD核心并构建了使用苯并呋喃和N-甲基吡咯的组合的C8杂合63（图11）。随后，通过系统地缩短含有吡咯苯并呋喃基团的C8连接单体（例如，化合物64的C8连接单体通过去除酰胺被缩短）获得了一系列的化合物。研究发现，PBD的C8位置具有相对较短的侧链就足以赋予细胞毒性。因此，缩短的PBD单体可以用作新的ADC有效载荷。二氢苯并呋喃化合物64在原代CLL细胞中具有高度毒性，打开呋喃环也在原代CLL细胞和JN-3细胞系中保持了低纳摩尔活性。苯并呋喃中苯元素的变化对细胞毒性有更显著的影响，在去除环的芳香性后细胞毒性显著降低。Jagath R. Junutula鉴定了一种异喹啉苯并二氮杂卓(IQB)有效载荷65，其C6a位置的(S,S)立体化学对最佳IQB活性至关重要。这是一类新的PBD二聚体DNA损伤有效载荷，在HEPG2 A704细胞系中显示出高活性。细胞毒性的吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体分子经常用作ADCs的有效载荷。为了进一步探索这一类ADC有效载荷，Peter S. Dragovich96通过系统地在其化学结构中引入酸性和碱性基团来修改它们的物理化学性质。结果表明，含有酸性功能团的PBD二聚体有效载荷（包括高度电离的基团，如化合物66中的磺酸）能够通过抗体介导的递送，有效地从细胞溶酶体运输到细胞质和/或细胞核。修饰后的PBD二聚体化合物66与CD22抗体结合，获得了对BJAB细胞的IC50为12纳摩尔/升的ADC，显著提高了未结合PBD二聚体的抗增殖活性。PBD二聚体有效载荷66将有助于设计具有更高治疗潜力的新ADCs。Peter S. Dragovich探索了含有二硫前药的PBD二聚体作为抗体-药物偶联物的有效载荷，并发现许多含有二硫前药的PBD单体对细胞（如KPL-4细胞）表现出强大的抗增殖活性，这些细胞具有相对较高的细胞内GSH水平。多个二硫前体在生理浓度的Cys中稳定，但在肿瘤细胞中GSH存在下不稳定。增加化合物67和68的末端空间体积可以显著提高它们的稳定性。例如，所得到的含有两个甲基的化合物69和70对GSH和Cys都具有很高的稳定性。噻吩衍生的二硫的稳定性在体内得到了提高。在这些常见的PBD有效载荷中，PBD二聚体上的结合位点分为两类：C2和N10。C2结合的一个例子是有效载荷71，它包含一个附着在PBD C2位置的苯环。针对CD19的ADC T-402的有效载荷SG3199(72)通过其N10位置结合。由于PBD B环上的N10位点参与与DNA的共价结合，与N10位点的连接比与C2位点的连接更安全。在PBD有效载荷的后续工作中，其结合位点也可以作为影响修改方向的一个因素。 图 11 PBD类似物61e72的设计和SAR分析。 3.2.4. 双环霉素 双环霉素A（73）是从链霉菌中分离出的一种强DNA烷基化剂，由DNA烷基化部分和结合部分组成（图12A）。最早发现的双环霉素天然成员CC-1065（74）通过其高度活性的丙烷环与DNA微沟结合，并在N3位置烷基化腺嘌呤，最终导致细胞死亡。尽管CC-1065（74）在体外具有高效性，但在动物模型中仅显示出中等的体内活性和不可逆的肝毒性。为了改善这些化合物的生物学特性，将其用于ADC可能是一个可行的选择。Walter J. Chazin等人描述了双环霉素SA的非天然对映体和DNA加成物的结构，发现双环霉素SA的两种对映体可以共享同一结合位点，并在AATTA双链上具有相同的结合方向，但烷基化不同的位点（图12B）。两种对映体对互补链的烷基化发生在相同的结合方向上，但对非天然对映体而言，偏移了一个碱基对。这种差异对两种加成物的结构有重要的影响，因此，将影响它们相对的烷基化效率。对这种新结构的分析，结合相同的AATTA双链，解释了天然对映体与非天然对映体在DNA位点选择性方面观察到的相似之处和差异。在双环霉素/CC-1065家族的所有DNA加成物结构中都观察到了亚基间的扭转。由于DNA具有左手螺旋扭转，DSA的三甲氧基吲哚亚基自然倾向于在结合到小沟时，相对于烷基化亚基逆时针方向扭转。因此，DNA分子本身的手性对(+)对映体剂施加了一个重要的限制，而(-)对映体剂则不存在。两种DSA对映体的笨重的C24甲氧基位于小沟底部的大致相同的位置，在A16和T17碱基之间的裂缝中。这项研究为控制这些化合物DNA烷基化速率的因素以及DNA结合诱导的烷基化反应激活的重要性提供了新的理解。Patrick H. Beusker开发了一种基于双环霉素的新型载荷，用于减少链间二硫键。它与针对HER2的抗体曲妥珠单抗结合，产生了在体外和体内具有良好特性的ADC SYD985。含有咪唑[1,2-a]吡啶基的双环霉素DUBA（75）以非活性前药形式sec-DIBA（76）（75，通过76的自发螺环化形成）（图12A）被纳入到偶联药物中。化合物76包含两个羟基，每个羟基都可以通过一个连接子与抗体结合。Moana-Tercel使用Pd催化的氨基化方法将sec-CBI（sec-1,2,9,9a-四氢环丙[c]苯[e]吲哚-4-酮），双环霉素天然产物烷基化亚基的合成类似物，从酚类转化为氨基形式。然后获得酚CBI类似物77、78和氨基CBI类似物79、80。化合物77对六种人类肿瘤细胞系的IC50在0.1e2皮摩尔/升范围内。用相应的氨基CBI化合物79和80替换化合物77或78的酚CBI，会导致效力显著降低，对P-gp过表达的敏感性增加。尽管如此，化合物79在大多数测试的细胞系中保持了显著的低皮摩尔细胞毒性，并且像化合物77、78和80一样，在足够高的浓度下完全抑制了所有细胞系的增殖。 图 12 双环霉素类似物的设计和SAR分析。(A) 双环霉素类似物73e80的化学结构；(B) 双环霉素A(73)与DNA复合物的结合模式（PDB代码1DSM）。 在ADC领域，一个明显的趋势是治疗靶点从血液肿瘤转移到实体肿瘤。这一趋势可能会将有效载荷的选择从针对微管的抑制剂转移到DNA损伤剂，后者通常表现出更高的效力，并满足新一代有效载荷比当前有效载荷需要更高的治疗指数的标准。此外，使用DNA损伤剂作为有效载荷可以针对相对低水平表达的肿瘤特异性/相关表面受体。将DNA损伤剂作为ADC的有效载荷已被广泛建立。然而，由于DNA损伤难以修复，这可能导致潜在的有毒副作用。目前，只有一种以PBD作为有效载荷的ADC在临床使用中。因此，它们的安全性/药物抗性问题仍需要进一步研究，未来需要开发更多的新一代ADC有效载荷。 3.3. 靶向RNA的有效载荷 仍有许多肿瘤对ADCs没有反应或对药物产生耐药性。生长缓慢的肿瘤细胞通常不像快速分裂的细胞那样依赖于微管介导的细胞过程。因此，为了进一步扩大ADC有效载荷的范围，并确定在快速和慢速增殖细胞中都有效并且能够逃避MDR介导的抗性的其他类型的ADC有效载荷，人们将注意力转向了靶向RNA的小分子有效载荷。靶向RNA的小分子抑制剂可以杀死分裂和休眠的肿瘤细胞，作为ADC有效载荷使用，预计将解决肿瘤药物抗性问题和由无效的肿瘤休眠细胞引起的肿瘤复发和转移问题。目前有两种主要类型的RNA抑制剂可供ADC有效载荷使用：RNA剪接抑制剂（Thailanstatin及其类似物）和RNA聚合酶II抑制剂（Amatoxins）。 3.3.1. 泰兰司他汀 RNA剪接通过剪接内含子和小段外显子来控制代谢、血管生成、癌细胞增殖和转移，这些是将RNA转化为mRNA的复杂细胞机制的关键。它们还可以直接控制转录的启动、延伸和终止，这是癌症抑制的生物靶标。Abdel-Wahab等人发现，在RNA剪接调节药物的干扰下，肿瘤细胞可以产生新抗原，这些新抗原可以通过MHC I呈现为新抗原表位，从而刺激抗肿瘤免疫。研究表明，RNA剪接调节可以作为肿瘤抗原的潜在来源，有潜力应用于肿瘤免疫检查点治疗。剪接体抑制剂是针对活跃分裂和静止细胞的强效抗增殖药物，因此是一类有前景的ADC有效载荷。泰兰司他汀是一种最初从布鲁氏菌泰国msmb43分离并通过与剪接体U2 snRNA亚复合物的SF3b亚基结合而激活的天然产物。泰兰司他汀家族通过抑制真核mRNA剪接途径，对剪接体有很强的结合和抑制作用，对多种癌细胞系的IC50值低至纳摩尔级，可以作为ADCs的潜在有效载荷。Yi-Qiang Cheng报告了从MSMB43分离出的三种新泰兰司他汀化合物：泰兰司他汀A（81）、泰兰司他汀B（82）和泰兰司他汀C（83）（图13）。泰兰司他汀A（81）是一种潜在的天然抗癌药物候选物。泰兰司他汀药物的整体结构与剪接体抑制剂候选物FR901464（84）相似，除了泰兰司他汀的C1位缺乏不稳定的羟基，而C17位有一个额外的羧基，因此泰兰司他汀具有更好的稳定性。泰兰司他汀A（81）和FR901464（84）C3位的高活性环氧化物在抑制前mRNA剪接和癌细胞增殖中至关重要。对环氧化物进行卤化修饰的泰兰司他汀B（82）和泰兰司他汀C（83）的化合物活性降低。与泰兰司他汀B（82）相比，泰兰司他汀C（83）甲基的添加对化合物的生物活性没有显著影响。Stephan Rigol合成了泰兰司他汀类似物85和86，其IC50值为皮摩尔级。辉瑞公司首次探索RNA剪接抑制剂作为抗体药物偶联物的有效载荷。含有羧基的泰兰司他汀半合成类似物87直接与曲妥珠单抗表面赖氨酸偶联，获得了非常有效的泰兰司他汀ADC。化合物87及其相应的ADCs在HER2高度表达的胃癌细胞系N87和MDR1过表达细胞系中都有效（化合物87在N87细胞中的IC50为1.8纳摩尔/升）。此外，ADCs的暴露量足以在低至1.5毫克/千克的剂量下在胃癌异种移植模型中实现极佳的效力，优于临床批准的ADC T-DM1。 图 13 他兰司他汀类似物81e87的设计和SAR分析。 3.3.2. 毒伞肽 毒伞肽最初由Heinrich Wieland和Rudolf Hallermayer在1941年分离。毒伞肽是由核糖体合成的有毒二环八肽，是真核RNA聚合酶II的选择性抑制剂，可导致细胞凋亡。毒伞肽包含一个由八个L型氨基酸构成的大环，通过亚砜基团在色氨酸和半胱氨酸残基之间连接，其三个侧链被羟基化，因此具有良好的水溶性。对毒伞肽最深入研究的是含有6-羟色氨酸（Htp）、反式-4-羟脯氨酸（Hyp）和(3R,4R)-4,5-二羟油酸（Dhil）的α-鹅膏肽（88），这是迄今为止已知的最有效和特异性的RNA聚合酶II抑制剂，有潜力突破药物抗性或破坏静默期肿瘤细胞，有效防止肿瘤转移和复发（图14A）。Roger D. Kornberg的团队分析了RNA聚合酶II-α-鹅膏肽的晶体结构，发现抑制剂的位置紧挨着桥螺旋和触发环，主要稳定在远离加成位点的构象（图14B）。α-鹅膏肽环肽主链形成一个口袋，允许与Rpb1 His1085侧链咪唑环形成特定的互补氢键，为触发环创造了一个约束点。α-鹅膏肽口袋对咪唑的特异性主要是通过Gly7的酰胺NH与Rpb1 His1085 N(D1)的相互作用，以及Asn1的羰基与Rpb1 His1085 NH(E2)的相互作用实现的。研究表明，α-鹅膏肽通过直接干扰RNA聚合酶II的触发环，抑制RNA聚合酶II的延伸，并表现出缓慢降低的底物选择性。毒伞肽引起的细胞凋亡和坏死等毒性阻碍了其临床应用。但由于其分子量小、在水溶液中溶解性好，以及对RNA聚合酶II的抑制作用，近年来作为抗体-药物偶联物有效载荷在癌症研究中越来越受到关注。α-鹅膏肽ADC极有可能对增殖和静止的肿瘤细胞都起作用。在ADC领域，使用鹅膏肽作为有效载荷是一种相对较新的方法。Heidelberg Pharma开发的以毒伞肽作为有效载荷的B细胞成熟抗原（BCMA）靶向ADC HDP-101（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04879043），目前正在进行复发/难治性多发性骨髓瘤治疗的I/IIa期临床试验，并于2022年2月15日完成了首例患者给药。HDP-102是一种靶向CD37的ADC药物，针对非霍奇金淋巴瘤（NHL）。HDP-103靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA），目标适应症为转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）。Steffen Goletz113将β-鹅膏肽（89）的羧基与IgG赖氨酸的氨基偶联，得到了一种具有良好的血浆稳定性和高细胞毒性的ADC（图14A）。以泰兰司他汀和毒伞肽作为有效载荷的ADCs能够避免治疗抗性，并对静止的肿瘤细胞有效，而现有的标准疗法很少达到这种效果，常常导致肿瘤复发和药物抗性。因此，在微管抑制剂和DNA损伤剂作为有效载荷之外，新一代RNA抑制剂作为ADCs的有效载荷越来越受到关注。尽管目前市场上还没有RNA有效载荷的ADCs，但它们的巨大潜力值得进一步探索。 图 14 毒伞肽的设计和SAR分析。(A) 毒伞肽88, 89的化学结构；(B) α-鹅膏肽(88)与RNA复合物的结合模式（PDB代码3CQZ）。 3.4. 免疫ADC有效载荷 最初，ADCs仅限于肿瘤学领域。然而，它们在临床上的成功鼓励了ADCs在其他治疗领域的应用，最引人注目的是免疫学。肿瘤免疫涉及T细胞、巨噬细胞、树突细胞等，通过免疫调节将冷肿瘤转变为热肿瘤，最终增强免疫疗法的效果。免疫检查点抑制剂通过消除肿瘤对T细胞的抑制，增强T细胞的抗癌免疫反应。然而，对于没有自发T细胞反应和肿瘤周围T细胞浸润的癌症患者（通常被称为冷肿瘤），免疫检查点抑制剂效果不佳。因此，免疫疗法研究和开发的一个重点方向是开发能够刺激患者先天免疫反应并促进肿瘤特异性T细胞招募的抗癌疗法。与传统ADCs不同，免疫刺激抗体偶联物（ISACs）结合了抗体导航靶向的精确性和基于小分子的先天和适应性免疫系统调节的强大力量。一方面，抗体将免疫激动剂类型的小分子偶联起来，增强免疫反应的作用。另一方面，抗体的肿瘤靶向减少了小分子免疫激动剂的毒性。在靶点选择方面，由于有效载荷的毒性，传统ADCs必须严格限制肿瘤特异性抗原，而免疫调节ADCs可以扩展更多的肿瘤相关抗原。在内吞作用方面，传统ADCs是靶向抗原介导的内吞作用，直接杀死癌细胞。免疫调节ADCs通过免疫细胞表面的FcgR介导的内吞作用激活免疫细胞。目前，有多种免疫调节ADC药物正在开发中，新的有效载荷主要包括Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激剂（STING）激动剂，该领域具有巨大的发展潜力。 3.4.1. Toll样受体激动剂 Toll样受体（TLRs）是参与先天免疫的重要蛋白质分子类别，是身体抵抗传染病的第一道屏障。TLR受体的激活能够改善肿瘤微环境中树突细胞和巨噬细胞的抗原呈递，并促进CD8+ T细胞的增殖。Toll样受体激动剂作为免疫增强剂，诱导肺癌、黑色素瘤、白血病和胶质瘤中增强的抗肿瘤免疫反应，直接或间接地有效抑制肿瘤生长。因此，TLR激动剂在肿瘤免疫疗法中的应用预计将激活先天免疫反应，介导获得性免疫反应，使冷肿瘤变热，解决单一免疫检查点抑制剂的低反应率问题，提高免疫疗法的有效性，并实现重塑肿瘤微环境的目的。目前，TLR已成为免疫疗法领域的研究热点之一，在TLR家族成员中，研究人员更关注TLR7、TLR8和TLR9。TLR8激动剂（90）（91）激活DC细胞，并通过T细胞增强对肿瘤细胞的杀伤（图15）。然而，免疫疗法通常伴随着副作用，如细胞因子释放综合征，这是一种常见的全身性炎症状况。TLR8激动剂的全身给药也存在相关的毒性，限制了患者可以承受的TLR8激动剂的量。因此，将TLR8激动剂应用于ADC可以同时结合抗体的靶向效应和TLR8的免疫调节效应，减少毒性和副作用。Toshiyuki Shimizu的团队发现TLR7 TM螺旋与TLR7-TLR信号调节器（UNC93B1）TM3和TM6螺旋以及膜近区对齐，LRR-CT基序与UNC93B1 N末端六螺旋束的腔面相互作用。TLR7eUNC93B1复合物的二聚化由TLR7‒TLR7和UNC93B1‒UNC93B1相互作用介导，分别发生在2:2复合物的顶部和底部区域。TLR7 ECD中间区域的LRR11突出环区主要有助于TLR7的二聚化，而来自UNC93B1两个原体的连接TM6和TM7的细胞内螺旋以反平行方式相互作用。这项研究阐明了TLR与UNC93B1相互作用的结构基础，并促进了针对自身免疫病的化合物的后续设计。Silverback的SBT6050是一种抗HER2抗体偶联物，其有效载荷为TLR8激动剂91（图15），它以HER2依赖性方式在体外驱动各种抗肿瘤免疫机制，并在小鼠肿瘤模型中显示出良好的抗肿瘤效果（图15）。一类新的TLR7/8双激动剂被报道可以促进肿瘤对免疫检查点抗体的反应，特别是在冷肿瘤中。尽管团队发现的小分子具有显著的抗肿瘤效果，并且与PD-1和PD-L1抗体联合使用时可以观察到显著的协同效应，但与其他报道的TLR激动剂一样，小分子在血液中仍然过度暴露，导致更明显的免疫相关不良事件（irAEs），如体重减轻和类似流感的症状。为了避免直接给药TLR7/8激动剂可能引起的不良反应，团队于2015年开始尝试抗体偶联药物策略。 图 15 TLR激动剂90e92的设计和SAR分析。 经过几年的探索，一类新的免疫调节抗体偶联药物HE-S2成功构建，其有效载荷为TLR7激动剂（92）。动物实验结果表明，HE-S2（每只小鼠150毫克）具有非常显著的抗肿瘤效果，大多数结肠癌细胞肿瘤在接受治疗后基本消失，在黑色素瘤模型中，HE-S2治疗效果也优于对照组。重要的是，HE-S2治疗组没有明显的体重减轻。此外，尽管小鼠的肿瘤在接受治疗后缩小，但肿瘤细胞表面和肿瘤微环境中的免疫细胞PD-L1的表达显著增加，这可能有助于提高后续HE-S2治疗的靶向性。新型ADC HE-S2不仅通过阻断PD-1/PD-L1相互作用和激活TLR7/8信号通路诱导强大的抗肿瘤免疫反应，而且还通过表观遗传调控和IFN-g诱导其靶向抗原PD-L1的上调，从而使PD-1/PD-L1阻断更具敏感性。Michael N. Alonso的团队将TLR7/8激动剂与HER2抗体偶联，形成了一种通过肿瘤抗原识别Fcg受体依赖性吞噬作用和TLR介导的激活的ADC药物，驱动髓样细胞肿瘤杀伤和随后的T细胞介导的抗肿瘤免疫，适用于系统给药，安全有效。此外，越来越多的公司开始使用TLR激动剂进行抗体药物偶联：Bolt的BCC-1001（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04278144），用于治疗HER2阳性实体瘤，源自HER2的TLR7/8激动剂偶联已进入临床研究。Sutro的IADC技术可用于将TLR激动剂与抗体偶联。Tallac的TRAAC技术用于TLR9激动剂的位点特异性抗体偶联。与Tallac合作开发的ALX Oncology的SIRPa抗体可以与TLR9激动剂偶联。恒瑞药业使用TLR7激动剂，百济神州使用TLR7/8激动剂，信达生物引入Bolt技术并使用TLR7/8激动剂进行偶联。Silverback的ImmunoTAC技术选择TLR8激动剂作为有效载荷。这些研究提供了一种新的ADC策略，增强了免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤免疫反应。同时，这种策略还为解决直接使用免疫激动剂时药物质量差的问题提供了思路。 3.4.2. STING激动剂 干扰素基因刺激因子(STING)是天然免疫信号通路中的关键调节因子，具有启动机体天然免疫防御反应和促进T细胞形成适应性免疫的功能。STING介导的I型干扰素信号通路是天然免疫领域的重大发现，为肿瘤免疫疗法提供了新靶点。激活STING通路可以诱导I型干扰素和其他多种细胞因子的表达和分泌，激活天然免疫反应，促进抗肿瘤免疫反应，实现治疗肿瘤的目的。STING激动剂在多个研究领域得到广泛应用。除了诱导天然免疫反应外，它们在其他DNA或RNA传感器信号通路、自噬、内质网应激和凋亡中也发挥作用。凭借其抗肿瘤和免疫原性特征，STING激动剂也已成为新的免疫疗法试验药物和疫苗佐剂。现有的临床研究数据初步证明了STING激动剂与免疫检查点抑制剂的组合可以显著提高免疫疗法的疗效，并有望成为创新疗法。非核苷类小分子STING激动剂具有良好的稳定性，可以在动物模型中通过口服或注射给药，并显示出有希望的抗癌活性。然而，由于STING蛋白也存在于健康细胞中，系统性STING激动剂需要解决的问题之一是如何在不引起健康细胞过度炎症反应的情况下刺激抗肿瘤免疫反应。如果这些激动剂可以进一步优化，它们有潜力革新免疫疗法领域。 鉴于游离STING激动剂的系统给药可能受到毒性限制，广泛生物分布可能不理想，可以考虑通过ADC实现STING激动剂的肿瘤靶向递送以减少毒性。环二核苷酸(CDNs)(93)作为STING蛋白的天然配体已得到广泛研究（图16A）。栗川谷团队确定了猪STING复合物的CBD（CDN结合位点）与四种CDN：2,3 cGAMP；3,3 cGAMP；c-di-GMP和c-di-AMP的结合。其中，不对称配体2,3 cGAMP与STING的结合亲和力最高（图16B）。对猪STING CBD 20,30-cGAMP复合物的结构分析发现，非对称单元包含两个STING CBD分子（原型A和B），它们形成二聚体。各个原型通过a1、a2、a3和中心β-折叠区广泛相互作用，形成一个深U形裂口。20,30-cGAMP配体位于裂口中，其嘌呤指向上方，核糖环位于下方（与膜相关）。碱基、磷酸和核糖基团都有助于与STING结合。20,30-cGAMP的嘌呤环与两个原型中的Tyr167和Arg238堆叠。20,30-cGAMP的磷酸基团通过静电相互作用和氢键被Arg238识别。Arg238还在核苷部分的Hoogsteen边缘形成氢键。除了堆叠相互作用外，腺苷和鸟苷部分与STING的相互作用模式不同。对于两者，相互作用涉及它们的Watson-Crick、Hoogsteen和糖边缘。所有氮原子（除位置9氨基外）和嘌呤中的氧原子直接或间接（通过水介导）与STING蛋白相互作用。这些广泛的相互作用与配体和猪STING CBD之间的高结合亲和力一致。猪STING CBD-20,30-cGAMP复合物的一个显著特点是，两个原型采用不同的构象，导致非对称的配体结合口袋。因此，非对称的20,30-cGAMP在配体结合口袋中以一种明确定义的构象被固定。这种独特的结合模式与之前涉及其他物种STING蛋白的结构形成鲜明对比，其中20,30-cGAMP以两种替代模式结合对称的STING二聚体，腺苷和鸟苷部分交换位置。总之，研究发现猪STING采用非对称构象结合CDN。对这种非对称构象的分析揭示了配体识别的机制，并鉴定了STING。 以CDN作为ADC有效载荷，CDN和抗体可以通过磷酸酯、糖环和碱基进行偶联。SPEROVIE（WO2021046426A1, 2021.03.11）通过将CDN中的硫代磷酸酯或甲酸盐酯与PD-1或CTLA-4抗体偶联，形成ADC药物；Immunesensor（WO2021016204A1, 2021.01.28）从CDN在30位的核糖处引出氨基或巯基，然后通过与抗体形成碳酸酯或二硫键，形成ADC药物；MIT和Millennium（WO2021216572A1, 2021.10.28）创新地将磷脂分子与CDN的磷酸酯偶联。所得的偶联物也可以进一步形成脂质体结构，以提高它们与细胞膜融合的能力。北京轩逸制药（WO2021178818A2, 2021.09.10）将TLR9激动剂CpG-DNA与CDN连接，形成融合分子，可激活TLR和STING免疫信号通路，增强免疫活性。然而，CDN结构中的二磷酸酯会导致药物的生物利用度低。因此，随着苯并咪唑化合物的发现，非核酸结构的STING激动剂研究已经开始。基于二聚苯并咪唑的ADC药物也已设计和合成。Mersana使用STING激动剂94作为有效载荷获得的ADC候选药物XMT-2056已经在临床前研究中（图16A）。它旨在通过刺激肿瘤组织免疫细胞和肿瘤细胞中的STING信号，激活先天免疫系统。与STING激动剂有效载荷相比，XMT-2056的效力提高了100多倍。在临床前模型中，XMT-2056在高和低HER2表达模型中均显示出强大的单药抗肿瘤活性，并且当与多种获批药物联合使用时，其疗效得到增强，包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、抗PD-1 mAb或DS-8201。临床前数据表明，XMT-2056具有实现免疫记忆以延长抗肿瘤活性的潜力。5月，FDA授予该药物治疗胃癌的孤儿药认定。Mersana计划在今年晚些时候启动XMT-2056的I期临床试验，以研究其在一系列HER2阳性肿瘤中的治疗潜力，如乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌；日本Ono Pharmaceutical开发了一种非核酸STING激动剂95作为有效载荷，该激动剂通过药物结构中的吡唑环与连接子偶联。RYVU基于该公司开发的一类含硝杂环胺STING激动剂96，与抗体形成ADC药物。 图 16 STING激动剂的设计和SAR分析。(A) STING激动剂93e96的化学结构；(B) CDN(93)与STING复合物的结合模式（PDB代码6A05）。 3.4.3. 糖皮质激素受体调节剂 糖皮质激素受体调节剂（GRMs）通常用于治疗与各种疾病相关的炎症。在保持GR反向转录效应（被认为是预期抗炎效应的原因）的同时，可以最小化GR的反向转录效应（被认为是不良副作用的原因）。然而，GRM也可能引起肌肉骨骼、内分泌和胃肠道的副作用和其他毒性，限制了它们的治疗效果（特别是在长期使用中）。将GRM作为免疫型ADCs的有效载荷可能是一个理想的选择，因为靶向给药将最小化GRM载荷的系统暴露，可以在不引起有害副作用的剂量下提供显著的疗效，并实现慢性给药。这样的ADC将结合单克隆抗体的疗效（靶向炎症靶标）和选择性糖皮质激素受体调节剂。糖皮质激素载荷包含可以用于与溶酶体可切割抗体连接子结合的胺基功能团。首次将GRMs作为ADC载荷的报告使用了已知的地塞米松（97）（图17A），GRM ADC抗体组分选择了α-TNF，连接子与地塞米松的C21羟基相连。AbbVie正在开发的ABBV-3373也是由α-TNF和GRM组成的ADC药物，可以精确靶向激活的免疫细胞的调节，调节TNF介导的炎症信号通路，显著减少与糖皮质激素相关的系统性副作用，并有可能治疗风湿性关节炎（RA）。最近，Adrian D. Hobson启动了α-TNF-GRM ADC项目，并获得了一个DAR为4的α-TNF-GRM ADC，使用男巯基-甘-丙-ALA作为连接子。对P1NP和皮质醇生物标志物的分析表明，ADC在疗效和副作用之间有足够的治疗窗口。在慢性小鼠关节炎模型中，α-TNF-GRM ADC比具有相同GRM载荷的α-TNF单克隆抗体和同型对照更有效。 Victor Gualla团队确定了GR与地塞米松（97）和98（前药ciclesonide的活性代谢物）的晶体结构。GR和地塞米松（97）的结构使用了开放构象，GR在H6eH7区域表现出更高的突变频率。对PDB共晶结构的评估，其中配体与GR的配体结合域（残基500e777）复合，揭示了与GR复合的desisobutyrylciclesonide的结构（PDB代码4UDC, 4UDD）（图17B和C）。Peter S. Dragovich合成测试了多种含有不同胺基取代乙酸酯基团的类似物。其中，哌嗪化合物99显示出与地塞米松（97）和化合物98（GRE细胞，+ mTNF，IC50 Z 33纳摩尔/升）相似的细胞活性。然而，化合物99的渗透性差，这可能是由于化学结构中存在碱性胺基，从而减弱了其细胞效力。化合物99使用基于二肽的蛋白酶（Ala-Ala）可切割连接子与抗TNF mAb偶联，得到的偶联物在基于细胞的评估中活性较弱（IC50 Z 8.1毫摩尔/升）。进一步探索发现了含有苯胺基的化合物100，其效力比化合物99强，并且与地塞米松（97）和化合物98具有相似或更好的GR结合和细胞活性（GRE细胞，+ mTNF，IC50 Z 4.0纳摩尔/升）。随后，通过使用含有蛋白酶可切割二肽基团但缺乏氨基苄氧羰基间隔基团的连接子将化合物100与抗TNF单克隆抗体偶联，得到的偶联物在含有膜结合TNF的细胞中显示出强大的GR活性，而在外部缺乏这种蛋白的细胞中活性最小（GRE细胞，+ mTNF，IC50 Z 0.44毫摩尔/升；GRE细胞，mTNF，IC50 >50毫摩尔/升）。在胶原诱导的关节炎（CIA）模型中，以1, 3和10毫克/千克的剂量对小鼠进行腹腔注射，21天内爪子肿胀程度呈剂量依赖性降低。重要的是，这种偶联物具有较低的毒性副作用。因此，通过抗体偶联靶向递送糖皮质激素可以最小化不希望的副作用，同时提高未结合化合物的抗炎活性。 图 17 糖皮质激素受体调节剂(GRMs)的设计和SAR分析。(A) GRMs 97e102的化学结构；(B) 化合物97与GR复合物的结合模式（PDB代码4UDC）；(C) 化合物98与GR复合物的结合模式（PDB代码4UDD）。 William Olson的团队描述了新的糖皮质激素类药物。他们开发GC偶联物（GC‒ADCs）的策略是确定可以修改的布地奈德区域，以提高新游离载荷的偶联物稳定性和滴度。然后评估了布地奈德的两种修改方法：第一，用胺基或苯胺基团替代C21羟基；第二，用氟替代C9和C6的氢。含有胺基和苯胺基的有效载荷可以通过碳酸酯键与抗体偶联，这种键比羟基提供的碳酸酯或磷酸酯键更稳定。该团队通过对布地奈德分子的SAR分析和分子模拟，获得了两个领先化合物101和102。对化合物101、102的效力测试发现，这两种化合物比其他核激素受体更选择性地结合糖皮质激素受体（GR），在基于细胞的测定中具有与布地奈德相同或更好的效力，没有hERG的心脏毒性，没有Ames的基因毒性，并在体内促炎小鼠模型中显示出效力。在脂多糖（LPS）刺激的小鼠中，肿瘤坏死因子-a（TNF-a）的释放显著减少。随后通过组织蛋白酶可切割的连接子获得的GCeADC在血浆中非常稳定，并在抗原阳性细胞中特异性释放GCs，表明这些新型GC可以作为ADC有效载荷治疗自身免疫和炎症性疾病。 免疫激动剂在系统给药时激活非特异性免疫反应，严重时可能触发致命的细胞因子风暴。将免疫激动剂与肿瘤靶向抗体偶联可以将免疫激动剂递送到肿瘤微环境并在局部释放，减轻全身给药的严重毒性，并帮助避免抗肿瘤治疗中的系统性副作用。然而，尽管通过诱导免疫机制实现抗肿瘤效果的免疫刺激ADC药物的想法非常明确，并且临床前数据相对良好，但在临床试验中解决剂量依赖性毒性问题很困难。随着激动剂效力的增加，毒性也会增加，这使得很难确保可以安全可靠地提高疗效。例如，在小鼠肿瘤模型中显示出良好抗肿瘤效果的SBT6050，由于毒性问题目前在临床研究中表现不佳。因此，后续研究中最重要的考虑因素是毒性和效力之间的平衡。重新设计以减弱毒性并提高递送窗口也非常有利。 3.5. 新型潜在ADC有效载荷 3.5.1. Bcl-xL抑制剂 Bcl-xL是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤形成、转移和药物抗性中发挥重要作用。理论上，通过药物阻断Bcl-xL上的BH3结合域可以触发癌细胞的凋亡。然而，Bcl-xL对血小板存活至关重要，Bcl-xL的泛抑制剂可能产生血小板毒性。将Bcl-xL作为ADC药物有效载荷的目标可能在减少对血小板的毒性的同时保持Bcl-xL抑制剂的活性。Tomoyasu Ishikawa对Bcl-xL抑制剂ABT-737（103）与Bcl-xL共晶的晶体结构分析，结果显示，该化合物的联苯基团（单元W）在由Phe146、Leu130、Leu108和Phe105（西部区域；h1 H2）组成的口袋中形成疏水相互作用，而化合物的烷基磺胺基团（单元E）在由Phe97、Tyr195和Tyr101（东部区域；h4）组成的另一个口袋中形成疏水相互作用（图18）。在单元E中，三个芳香环形成分子内π-π相互作用，形成独特的刚性U形构象。这种构象可能增强ABT-737（103）与Bcl-xL的分子间结合。此外，研究了一系列小分子抑制剂的结构-活性关系，发现单元E对Bcl-xL的抑制作用比单元W更重要，尤其是B环。晶体结构分析和结构-活性关系分析将为设计更有效的ADC有效载荷识别抑制剂提供基础。2017年，AbbVie首次将Bcl-xL抑制剂104作为有效载荷与抗B7H3抗体以ADC的形式共轭，获得针对EGFR的ABBV-155（ClinicalTrials.gov标识符：NCT03595059），仍在临床试验中（WO2017214301A1，WO2017214282Al）。 图 18 Bcl-xL抑制剂的设计和SAR分析。(A) Bcl-xL抑制剂103, 104的化学结构；(B) ABT-737 (103)与Bcl-xL复合物的结合模式（PDB代码2YXJ）。 3.5.2. NAMPT抑制剂 烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸的限速酶，控制细胞内NAD+的浓度。当NAMPT被抑制时，NAD+水平下降至低于代谢所需的水平，导致能量危机，最终导致细胞死亡。尽管NAMPT抑制剂是强大的细胞毒素分子，但由于其毒性，它们作为癌症治疗中的化疗药物受到限制。几种NAMPT抑制剂如FK-866（105）（图19A）因剂量依赖性毒性而中止了临床试验。然而，NAMPT抑制剂具有简单的结构和高效力，它们的激活机制与当前ADC有效载荷不同，因此NAMPT抑制剂可以作为具有良好活性和耐受性的ADC有效载荷，有望改善NAMPT抑制剂的治疗窗口，然后应用于临床环境。Chris Tse及其团队鉴定了具有强大临床前疗效和药代动力学特性的新型非底物NAMPT抑制剂，使其能够口服给药。这一系列中的领先分子A-1293201（106），包含一个异吲哚啉“头基团”，可以有效地抑制重组人NAMPT。通过X射线晶体学检查A-1293201与NAMPT之间的相互作用，揭示了几个协同相互作用的不同位点（图19B）。位点包括PRPP结合亚位点A，其本质上是亲水性的，未被烟酰胺占据，烟酰胺结合亚位点B，与烟酰胺进行重要的π堆叠和氢键相互作用，连接亚位点C，其狭窄、疏水，未被结合的烟酰胺占据，以及远端开口亚位点D，其扩大并提供几个结合水分子和疏水表面。与FK866以及最近的第二代NAMPT抑制剂类似，A-1293201的异吲哚啉脲部分在亚位点B中参与重要的π堆叠相互作用以及亚位点C中的氢键和疏水相互作用。与FK866以及最近的第二代NAMPT抑制剂不同，异吲哚啉脲化合物是已知的第一种有效的非磷酸核糖化的NAMPT抑制剂。Carl Uli Bialucha设计的新型NAMPT抑制剂107在NCI-H526、MDA-MB453和NCI-N87等多个细胞系中均有效，范围在nmol/L级别。结构-活性关系表明，吡啶氮可以被NAMPT酶磷酸化，是药效团的重要组成部分。此外，整个3-吡啶（S,S）环丙基羧酰胺基团对高水平的细胞活性至关重要。R3区域可以容忍各种取代基，通过用更硬的未取代苯环替换得到的乙基取代化合物108，对A2780和CORL23细胞系与化合物107具有相似的效果。苯环可以进一步衍生以提供最佳的载体用于连接，对苯环的对位添加哌嗪取代基是可容忍的化合物109。哌嗪基团上的游离次级胺可以作为连接子的偶联点与抗体结合。R3位置上的苯基哌嗪取代和R1和R2分别替换为F和H，得到的类似物110在nmol/L浓度下对C-Kit和HER2表达的细胞系有效。使用载荷110通过不可裂解连接子获得的抗C-Kit偶联物不仅具有低聚集性，而且具有最佳的抗CKIT活性（IC50分别为9和40 pmol/L），并且在c-Kit阳性胃肠道间质肿瘤的GIST-T1异种移植模型中显示出靶向性。ADC的有效载荷需要包含活性杂原子以结合可裂解连接子，而FK-866缺乏氨基、羟基或巯基功能团。为了获得一个容易整合并保持效力的有效载荷，Peter D. Senter准备了一系列的FK-866类似物，在芳香尾部的不同位置具有苯胺取代。这些化合物进一步评估了对L540cy、A549和HepG2细胞系的细胞毒性。化合物111在两种测定中显示出与FK-866相似的效力。NAMPT和化合物111的晶体表明，新引入的苯胺基团通过氢键与Glu376的主链酰胺相互作用，可能抵消了添加极性功能团的任何去溶剂化惩罚。用含有强效抑制剂chs-828的吡啶基腈胍基团制备的化合物112和用吡啶基方形酰胺基团制备的化合物113保持了与NAMPT的强结合并具有强细胞毒性。这些化合物已进入评估作为ADC药物有效载荷。在可耐受的剂量下，在几个肿瘤模型中显示出显著的活性水平。 图 19 NAMPT抑制剂的设计和SAR分析。(A) NAMPT抑制剂105e113的化学结构；(B) A-1293201 (106)与NAMPT复合物的结合模式（PDB代码5U2M）。 3.5.3. 卡玛霉素 蛋白酶体活性抑制剂是一类新兴的抗癌药物，对某些癌细胞具有极强的细胞毒性，环氧化物蛋白酶体抑制剂卡玛霉素是这一类别的代表。从海洋蓝藻Symploca sp.分离并鉴定出的卡玛霉素A（114）和B（115），它们的a,b-环氧酮直接连接到甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸磺酮，以低纳摩尔浓度抑制蛋白酶体的b5亚基，有效对抗多种癌细胞系（图20）。然而，由于它们的选择性差，它们通常表现出毒性副作用。使用高毒性的卡玛霉素衍生物作为ADC有效载荷保持了所需的效力，并实现了更好的耐受性。卡玛霉素可以分为四个不同的部分（P1-P4）。William H. Gerwick合成了第一代衍生物116，在P4的远端引入了氨基，通过替代6-氨基己酸链，显著降低了对NCI-H460细胞的杀伤效果（IC50 Z 860纳摩尔/升）。第二代卡玛霉素衍生物在P2含有2-氨基乙基同型半胱氨酸残基。直链烷基链被芳香性的苯基或吡啶环替代，得到衍生物117，其对HCT116和NCI-H460的细胞杀伤效果低于卡玛霉素B（115），因为P2的脂肪胺在生理pH值下是碱性并带正电荷，降低了其细胞穿透性。为了减少P2的碱性，团队将卡玛霉素B（115）的P2甲硫氨酸亚磺酰基团替换为4-硫代苯胺或4-磺胺苯胺，得到化合物118或119。化合物119比118更有效，这意味着更少的碱性胺基团效力更好。之后，合成了含有两个亮氨酸-环氧酮药物簇的衍生物120，其在HCT116和NCI-H460细胞系中的IC50分别为0.2和5.4纳摩尔/升。P1的环氧酮对化合物120的强细胞毒性活性至关重要。衍生物121含有P3的含苯胺侧链，对SKBR3细胞的IC50为21纳摩尔/升。将苯胺功能团置于衍生物122的P4位置比化合物121更有效地抑制细胞生长。在衍生物系列中，化合物119保持了高细胞效力，但其目前偶联的ADC与游离抗体相比，并未显示出对测试的癌细胞系具有优越的细胞杀伤能力。 图 20 卡马霉素类似物114e122的设计。 3.6. 新策略指导的ADC载荷 3.6.1. 以PROTAC分子为载荷的ADC ADC开发的主要挑战与剂量限制毒性（DLT）有关，这表明在药物疗效与非靶标毒性之间平衡的困难。ADC实际输送到肿瘤的药物剂量非常小，这意味着药物分子必须极其细胞毒性，尽管这可能导致有毒的副作用。PROTAC是一类双功能化合物，由针对感兴趣蛋白（POI）的配体、E3泛素连接酶的配体和连接链组成。PROTAC将POI和E3泛素连接酶拉近，用泛素化标记POI，然后由蛋白酶体降解。PROTAC是催化性的，因此能够在较低剂量下有效降解感兴趣的蛋白。PROTAC可能是ADC的理想载荷。通过将抗体和PROTAC分子结合形成的抗体-PROTAC结合物可以在特定细胞中特异性降解靶蛋白，实现PROTAC技术在细胞或组织水平上的选择性。抗体-PROTAC结合物将PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性相结合，从而克服了传统靶向降解剂和ADC的限制，具有靶向新靶标的极大潜力。将针对BRD4蛋白的PROTAC分子123连接到HER2抗体上，可以形成分子量约为150 kD的抗体-PROTAC结合物，每个抗体分子平均有4个PROTAC分子（图21）。抗体-PROTAC结合物可以在HER2高表达细胞SK-BR-3中有效降解BRD4蛋白，并且对HER2低表达细胞MCF-7中BRD4蛋白没有降解作用。将BRD4抑制剂124连接到针对HER2的mAb的链间Cys残基上，使用马来酰亚胺基团结合，得到的ADC结合物可以降低BT-474（HER2阳性）细胞系中的BRD4水平。最近在专利文献中也描述了两种降解ERa的ADC。第一种是通过碳酸盐部分将基于VHL的PROTAC分子125连接到针对HER2的mAb上；第二种ADC使用含有酶的可裂解焦磷酸盐连接链连接到同一PROTAC的VHL结合区域。在MCF7-neo/HER2细胞中，两种结合物都表现出有效的抗原依赖性ERa降解，并且在小鼠稳定性和药代动力学测试中都显示出可接受的结果。具有CRBN作为E3泛素连接酶并针对TGFbR2蛋白的PROTAC分子126，可以通过不可裂解的连接链连接到抗HER2抗体上。在转染HER2受体的HEK293细胞中，0.5和1.0 mmol/L的ADC在24和48小时后降解了TGFbR2蛋白。此外，使用以VHL基降解BRM蛋白的PROTAC分子127作为载荷的ADC，通过单次静脉注射1 mg/kg，在已知表达高CD22表面受体的BJAB淋巴瘤异种移植肿瘤中实现了BRM蛋白的强烈抗原依赖性降低。这种结合物在体内表现出所需的生物活性，并进一步扩展了可以通过ADC模式成功调节的目标蛋白的范围，扩大了将PROTAC靶向到表达这种表面蛋白的细胞的可能性。 图 21 PROTAC分子123e127的化学结构。 尽管抗体-PROTAC结合物领域仍处于起步阶段，但已经创建了这样一群多样化的实体，其成员随后已经显示出在体外和/或体内具有有意义的生物活性。这些新实体中的许多使用了较高的载荷载荷（DAR值为六），相对于已知的大多数细胞毒性ADC（DAR为二到四），但是否通常需要这种增加还有待确定。使用描述的结合物在体内和体外都实现了抗原依赖性活性的多个例子，这些结果证明了抗体-PROTAC结合物模态将各自的PROTAC载荷传递到特定的肿瘤和/或感兴趣的细胞的能力。鉴于这些有希望的初步结果，抗体-PROTAC结合物似乎为未来的增长和应用做好了准备。预计未来，抗体-PROTAC结合物将应用于组织或生物体，为药物治疗或生物研究提供新的思路。 3.6.2. 以NIR-PIT药物为载荷的ADC 近红外光免疫疗法（NIR-PIT）药物通常由针对肿瘤的肿瘤特异性单克隆抗体和通过连接链连接的光激活化学物质组成，本质上是ADC药物。NIR-PIT药物可以与照射肿瘤部位的红外光设备形成新的靶向抗癌平台。该平台实现了抗体介导的靶向输送，实现了高度的肿瘤特异性，同时使用红外光激活药物的生物物理机制，准确诱导癌细胞的快速死亡，而不损害周围正常组织。NIR-PIT药物诱导的多克隆免疫反应可以消除NIR-PIT药物第一步后存活的肿瘤细胞，即使NIR-PIT药物不足、输送不均匀或剂量不足，由于目标抗原的不均匀表达，作为随后的第二步多克隆免疫反应也会杀死残留的肿瘤细胞。此外，NIR-PIT药物也可以作为现有的PD-1单克隆抗体、PD-L1单克隆抗体或CTLA-4单克隆抗体的有用补充，增强它们的肿瘤免疫反应。NIR-PIT药物中的载荷不是细胞毒性物质，而是水溶性的酞菁衍生物（例如，硅酞菁衍生物IR700（IRDye700DX）(128))（图22A）。IR700是一个小的、可被近红外光激发的光激活分子，没有光毒性或生物毒性。当抗体结合到肿瘤表面抗原时，在近红外光的刺激下，IR700经历光诱导的配体释放反应，释放亲水侧链，导致剩余部分的疏水性显著增加。这反过来破坏细胞膜，触发针对癌细胞的快速和高度选择性的免疫原性细胞死亡（ICD）（图22B）。在直接杀死癌细胞的同时，NIR-PIT诱导的ICD可以导致接近死亡的未成熟树突状细胞的快速成熟，启动宿主的抗癌免疫反应，促进对死亡癌细胞释放的抗原的CD8阳性T细胞的重新形成，并进一步放大NIR-PIT的治疗效果。 图 22 IRDye700DX (128)的设计和分析。(A) IRDye700DX (128)的化学结构；(B) NIR-PIT ADC的作用机制。 2020年，以商品名Akalux获得PMDA加速批准的Rakuten Medical的Cetuximab Sarotalocan是一种由西妥昔单抗和水溶性硅酞菁衍生物IRDye700DX组成的抗体-结合药物，针对表皮生长因子受体，用于治疗不可切除的局部晚期或局部复发性头颈部癌症，使其成为世界上第一个批准的光免疫疗法药物。给药后24小时，药物可以特异性地聚集在EGFR阳性肿瘤细胞表面。使用690纳米波长的近红外光照射肿瘤部位，诱导Cetuximab sarotalocan杀死癌细胞并激活免疫反应。在NIR-PIT药物研究中进展最快的是Rakuten Medical的ASP-1929（也称为RM-1929）。ASP-1929是一种西妥昔单抗和IR700的结合药物，针对表皮生长因子受体EGFR，可用于治疗不可切除的局部晚期或复发性头颈部癌症。除了ASP-1929，Rakuten Medical还有几种NIR-PIT药物在与PD-1单克隆抗体联合应用的晚期肿瘤动物模型的临床前研究中表现出了出色的抗肿瘤活性。其他一些NIR-PIT药物研究，包括131I（PcMAb）（CD38单克隆结合的NIR-PIT药物）、TROP-2-IR700、ramucirumab-IR700、结合物AvIR介导的PIT、抗TF抗体1849-ICG结合物、MN-14-700DX、Avelumab-IR700等都是以IR700作为载荷。作为ADC领域中的“非主流轨道”，光免疫ADC的临床和市场前景仍需经受时间的考验。然而，基于相关原理开发新靶标和新的光激活效应分子可能成为ADC轨道上的新突破点。 3.6.3. 双载荷ADC 随着ADC治疗耐药性的出现，将一种抗体与两种甚至更多不同的细胞毒性载荷结合提供了开发下一代ADC的有吸引力的选择。为了展示双载荷药物ADC可能的好处，Levengood等人在2017年制备了一类含有两种不同微管聚合抑制剂的ADC。该团队将具有不同物理和化学性质的MMAE和MMAF连接到同一抗CD30抗体上，以执行互补的抗癌活动。这项工作清楚地展示了构建有效的双药ADC的潜在有效方法，以及输送多种细胞毒性载荷如何提高ADC活性。后来，Kumar等人开发了一种异质三功能连接链，将MMAE和PBD二聚体载荷结合到产生双载荷药物ADC。Nilchan等人使用双抗体结合方法生成了一种含有目标微管载荷MMAF和DNA拓扑异构酶II抑制剂PNU-159682的双载荷ADC，通过在工程硒代半胱氨酸和半胱氨酸残基位点特异性结合HER2抗体。PNU-159682由于其DNA损伤活性导致S期细胞周期停滞，而MMAF同时抑制微管聚合并导致G2/M期细胞周期停滞。双药ADC对表达HER2的细胞系显示出选择性和强大的细胞毒性，并表现出与所附药物一致的双重作用机制。ADC药物经常遇到与肿瘤异质性相关的问题。例如，乳腺癌通常由具有不同基因表达谱的多种细胞组成，其异质性是化疗后药物抗性、复发和转移的主要因素。为了解决这个问题，Kyoji Tsuchikama通过化学酶连接方法有效地构建了一系列具有明确药物-抗体比率（DAR）的双载荷ADC（分别为2+2、4+2和2+4的DAR组合），DAR调整的灵活性有利于根据疾病目标和载荷组合对ADC的物理化学性质、效力和毒性进行微调（图23）。其中，DAR为(4+2)的MMAE/MMAF双载荷ADC比DAR为4或6的MMAE单药ADC更有效，具有特异性的HER2细胞杀伤能力，理想的药代动力学特性，最小的炎症反应，以及治疗剂量下的边缘毒性。此外，在具有HER2异质性和对TDM1增加抗性的JIMT-1/MDA-MB-231混合异种移植小鼠模型中，双载荷ADC比两种单一药物组合具有更大的治疗效果和生存益处。 图 23 双载荷药物ADC的模式图（红色和绿色形状代表不同的载荷）。 原因可能是更强的MMAF分子杀死了JIMT-1细胞，帮助结合的MMAE分子对邻近的MDA-MB-231细胞有效地发挥旁观者效应。重要的是，这种显著的疗效不能通过单独的1:1组合的MMAF ADC和MMAE ADC实现。双载荷ADC的增强疗效也在另一种具有低HER2、肿瘤内异质性和T-DM1抗性的乳腺癌hCC1954-TDR异种移植小鼠模型中得到证明。结果突出了双载荷ADC克服乳腺癌异质性和药物抗性的潜力，表明同时输送具有不同药物特性的两种载荷是ADC基于治疗其他具有异质性和药物抗性的难治性癌症的有前途的方法。使用他们的Synthemer平台，剑桥研究人员设计了一种结合了auristatin F羟丙酰胺（AF-HPA）和DNA单烷基化剂（I-BiP）的双载荷ADC，表现出强大的细胞毒性，并且可以发挥两种作用机制。然而，虽然多载荷ADC药物可以提高疗效并降低药物抗性的可能性，但它们治疗引起的副作用也值得考虑。例如，Mersana开发的针对NaPi2b的新型ADC药物Upifitamab Rilsodotin（UpRi，XMT-1536）通过抗HER2单克隆抗体HT-19的可裂解连接链与auristatin F羟丙酰胺细胞毒性药物结合，DAR为12。XMT-1536具有极强的抗肿瘤活性，特别是对HER2表达低的癌症。然而，卵巢癌的中期1期临床数据显示，XMT-1536可能导致严重的与治疗相关的副作用，发生率高达48%（47/97）。最常见的副作用是胃肠道梗阻（7%），发热、肺炎和腹痛的发生率是5%。尽管Mersana试图降低剂量，但治疗窗口选项的范围狭窄，前景不容乐观。因此，对于多载荷ADC，安全性控制在进行多类载荷组装时是一个需要关注的重要问题。关键是找到并处理治疗窗口狭窄的原因。未来的研究也应该继续朝着在疗效和毒副作用之间取得平衡的方向努力。 3.6.4. PDC的载荷 肽药物偶联物（PDCs）是一种新型靶向疗法，由连接链、定位肽和细胞毒性载荷组成。与ADC药物相比，PDC药物具有分子量小、肿瘤穿透力强、免疫原性低、可通过固相合成大规模合成、生产成本低、药代动力学相对良好以及批间产品相对一致等优点。它们是在小分子靶向药物、单克隆抗体和ADC之后的下一代靶向抗肿瘤药物。然而，PDC作为治疗药物的应用也存在一定的局限性，例如口服生物利用度低、半衰期短、一些载荷的不完全裂解导致与原型药物相比生物活性显著降低，以及可能比ADCs的靶向性差。PDC的作用机制取决于连接链和定位肽。一种是PDC被内化并在细胞内释放载荷。另一种是PDC在肿瘤微环境中裂解，载荷被内化以发挥其作用（图24A）。大多数载荷不仅可以杀死高表达目标的肿瘤细胞，还可以通过肿瘤微环境中的旁观者效应杀死周围表达低或不表达目标的肿瘤细胞。肽可以影响PDC内化的效率。理想的PDC肽应具有强大的目标结合亲和力、高稳定性、低免疫原性、高内化率和相对长的血浆半衰期。连接链的选择是PDC设计的关键因素之一。连接链需要平衡稳定性和释放效率。可裂解连接链具有更高的释放效率，而不可裂解连接链更稳定。载荷的毒性和物理化学性质可以直接影响药物杀死肿瘤的能力，从而影响其疗效。理想的载荷应具有高细胞毒性（通常IC50低）、低免疫原性、高稳定性、适当的疏水性和良好的溶解性。PDC载荷可分为化学药物（图24B）、蛋白质药物和肽药物。其中，以DM1(2)、MMAE(8)、KSP抑制剂(45)、喜树碱(54)、多柔比星(129)、紫杉醇(130)、甲氨蝶呤(131)、柔红霉素(132)和吉西他滨(133)为代表的化学药物较为常见。蛋白质药物主要包括干扰素和肿瘤坏死因子。放射性同位素也常作为PDCs的载荷。当PDCs用于癌症诊断时，它们可以被标记为正电子发射放射性同位素（氟-18(18F)、铜-64(64Cu)和镓-68(68Ga)）以产生PET成像。通过结合肿瘤细胞上的靶向受体，可以准确定位恶性组织。放射性同位素标记的PDCs也可以用于治疗。肽受体放射性核素治疗(PRTT)基于其过度表达的受体对肿瘤细胞进行靶向和组织特异性辐射。最常用的放射性同位素是铟-111(111In)、钇-90(90Y)和镥-177(177Lu)。 图 24 PDCs的关键结构和作用机制。(A) PDCs的一般作用机制；(B) 常见的PDC载荷的化学结构。 截至2023年4月，全球只有两种PDC药物获批上市，分别是Lutathera和Pepaxto 。Lutathera是由诺华子公司Advanced Accelerator Applications S.A.开发的靶向生长抑素受体的PDC。进入细胞后，它释放放射性同位素177Lu，通过辐射损伤肿瘤细胞。它于2017年9月首次获得欧洲药品管理局(EMA)批准。在晚期神经内分泌肿瘤患者中，Lutathera与高剂量长效奥曲肽相比，具有更长的无进展生存期和更高的反应率。它于2018年1月26日获得FDA批准。Pepaxto是由Oncopeptides开发的靶向氨肽酶的PDC，由DNA烷基化剂Melflufen(134)与靶向氨肽酶的肽共价连接而成。Melflufen具有高脂溶性，可以被骨髓瘤细胞迅速吸收。一旦进入细胞，Melflufen的偶联肽立即被氨肽酶裂解，释放出亲水性烷基化剂美法仑(135)，对肿瘤细胞的DNA造成损伤，导致肿瘤细胞死亡。Pepaxto于2021年2月首次获得FDA批准，与地塞米松联合用于治疗成人复发或难治性多发性骨髓瘤。然而，在同年10月，Oncopeptides宣布主要由于确证性OCEAN研究中死亡率增加，将Pepaxto从美国市场撤回。2022年8月，Pepaxto获得EMA批准。目前，全球共有17种PDC药物处于临床开发阶段，其中3种处于III期，9种处于II期，5种处于I期。主要靶标是微管和CA9，MMAE(8)是主要载荷。PDC是一种克服了ADC一些限制的等效抗体-药物偶联物，具有许多独特优势。尽管目前市场上PDC药物较少，也有因严重安全问题而撤回的案例。然而，随着相关技术问题的解决和支持技术的突破，相信PDC药物也将在未来十年拥挤的赛道上成为研究和投资的热点。 4.结论 ADC药物开发前景广阔，因为它们整合了针对选择性肿瘤细胞靶向的特异性抗体、结合了广泛的强效细胞毒性载荷，并运用了多样化的连接链技术，以产生有效的癌症治疗药物。从技术角度来看，ADC药物迄今为止已经经历了三代的变化，在抗体、药物载体、连接链等方面取得了突破，尤其是在载荷的使用上。尽管新一代ADC载荷的特异性和细胞毒性与早期阶段相比表现出显著改善的特性，但目前的载荷仍有一些限制。首先，它们通常对实体瘤的渗透性和毒性有限，这限制了它们在实体瘤中的应用。其次，一些肿瘤对当前ADC药物不敏感。第三，载荷药代动力学的复杂性、肿瘤靶向和释放不足都可能影响ADC药物的疗效。第四，与其他抗肿瘤药物一样，ADC药物也可能产生耐药性。最后，早期的载荷选择倾向于毒性大但有效的药物，但其较高的毒性限制了载荷的系统应用。尽管抗体-药物偶联物在治疗中显示出有效性，但与高毒性载荷的结合并不一定是出色的。因此，正在开发其他类型的载荷，如RNA抑制剂、免疫激动剂和促进凋亡的Bcl-xL抑制剂。特别是随着FDA批准免疫检查点阻断疗法，肿瘤免疫疗法时代开始了。免疫激动剂ADC也已经开发出来，它们可以使用抗体将免疫激动剂输送到肿瘤微环境并在局部释放，缓解了免疫激动剂系统给药的严重毒性问题。免疫激动剂（如Toll样受体、STING激动剂等）也越来越多地作为新载荷在ADCs中流行，免疫调节ADCs有望进一步提高免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤免疫反应。尽管免疫ADC仍处于开发初期，尚未取得令人满意的临床结果，但免疫调节ADC有潜力大大拓宽ADC的治疗窗口，提高其抗肿瘤活性，并具有理想的安全性和有效性。相信通过免疫调节载荷修改针对肿瘤微环境的ADC设计仍然是未来研究领域的热点，特别是使用不直接对细胞有毒的载荷（例如可以引导免疫系统攻击癌细胞的载荷）。此外，使用PROTAC分子作为ADC载荷可以充分发挥PROTAC的催化特性和ADC的组织特异性优势，并克服靶向降解剂和ADC的传统限制（如药物抗性、毒性副作用等）。鉴于有希望的结果，PROTAC-ADC是未来ADC药物开发的重要方向。抗体结合载荷还包括来自植物（例如皂苷、蓖麻毒素A链）或细菌毒素（PE、假单胞菌外毒素、DT、白喉毒素）的蛋白质衍生酶，这些酶通过催化不可逆地抑制蛋白质合成诱导细胞死亡。新型载荷类别还包括寡核苷酸、siRNA、蛋白质等。为了解决传统ADC载荷的缺点，除了开发和修改传统和新型潜在载荷外，还出现了许多新的ADC设计策略。例如，通过将具有不相关机制的不同载荷与同一抗体结合的ADC药物设计，可以通过最小化耐药性的可能性来实现协同效应，并同时靶向不同的靶标，为其他具有异质性和药物抗性的难治性癌症的治疗开辟了新的途径，这对于实体瘤尤为重要。同时，在设计混合载荷时，应强调疗效和毒性之间的平衡。此外，通过抗体介导的靶向输送，由光激活化学物质作为载荷和特异性单克隆抗体组成的ADC可以实现高度的肿瘤特异性，并通过使用激光激活的生物物理机制精确诱导癌细胞的快速死亡，避免伤害周围正常组织，并实现精准治疗的要求，这也是未来值得探索和期待的发展方向。尽管ADC已经发展至今，但它们可用的载荷骨架类型并未增加，大多数细胞毒性药物都是precore主干的衍生物。目前只有少数具有高度细胞毒性的天然化合物、衍生物或合成类似物具有作为ADCs载荷并进入临床的潜力。尽管新型ADC载荷和指导ADCs构建的新策略不断出现，但这些仍然处于开发初期，未来的方向需要更多实验来验证。因此，在下一代ADCs中，需要通过筛选天然产物库、化学合成和天然产物的直接衍生化，开发具有多种作用机制、更高疗效和更少副作用的结构新颖的高效载荷（例如具有简单结构、高活性和特殊作用机制的NAMPT抑制剂），以提高活性及其耐受性。然而，新骨架的发现是具有挑战性的，需要在天然产物鉴定、高通量筛选或基于结构的药物设计等领域进行大量工作。相比之下，对批准或研究充分的载荷进行结构修改可以更快地识别新型载荷。获得母核化合物后，应充分利用构效关系和晶体学技术来探索母核化合物与靶标的结合方式，以及化合物的有效作用位点和有效功能团。只有这样，才能有效地进行母核化合物的后续优化和转化。在修改载荷时，调整其物理化学性质，特别是其极性，可以克服ADCs的制备和应用中面临的一些问题。连接太多疏水性载荷可以改变抗体的构象稳定性，增加其聚集和沉淀的趋势，并最终影响其最大DAR、血浆稳定性、旁观者效应等。疏水性载荷可以轻易穿透细胞膜，并通过旁观者效应杀死周围抗原阴性的肿瘤细胞，而亲水性载荷从癌细胞中扩散出去的速度较慢。此外，大多数ADCs面临的一个主要问题是大的毒性副作用，其中由载荷引起的毒性副作用主要体现在对快速增殖的健康细胞的损害，如淋巴细胞减少和胃肠道反应。因此，可以选择具有小分子量、良好的组织穿透力和短半衰期的载荷，这些载荷可以在释放后迅速富集在目标位置并快速执行杀死癌细胞的功能。同时，血液中的药物分子可以迅速清除，有利于减少系统性毒性副作用。也可以突变靶标的重要位点，然后修改和筛选出更耐受的化合物。总之，新型ADC载荷与传统载荷之间存在一些差异：1）传统的ADC载荷大多选择药理作用强但毒性副作用也较大的小分子，如PBD，而新型载荷倾向于选择药理作用和毒性副作用适中的小分子，如Dxd。2）传统的ADC载荷主要由微管抑制剂和DNA损伤剂组成，而新型ADC载荷具有更丰富的靶标类型、更多的选择和与传统载荷不同的机制。例如，使用免疫刺激剂作为ADC载荷。3）传统ADC小分子载荷的结构通常复杂且难以合成。新型ADC载荷倾向于选择结构简单、分子量低的小分子，大大降低了合成难度并扩大了ADC载荷的应用市场。4）传统的ADC载荷通常使用通过连接链直接与抗体连接的单一类型的小分子化合物，而新型ADC可以将不同类型的载荷结合起来，实现1+1>2的效果。除了传统的小分子化合物外，新型载荷还选择如PROTAC和光激活分子等新型有效载荷。尽管ADC药物已经发展至今，其疗效已大大改善，但仍存在一些问题，如药物抗性、不良反应和血浆中稳定性不足等需要解决。载荷在ADC药物的疗效中占据重要地位，因此我们结合相关的晶体结构和构效关系研究，总结了ADC小分子载荷及其未来趋势，以期为ADC药物载荷的未来发展和随后的优化转化提供更多新的参考，以构建更多的ADC药物，提高其治疗效果，克服药物抗性，减少不良反应，并促进ADC药物研究的发展。