ML-171

侃言单价分子胶降解剂靶向降解蛋白是消除致病蛋白一种强大的治疗方式。然而，合理设计分子胶降解剂非常具有挑战性。上周聊了聊通过DNA编码化合物库筛选技术合理设计、筛选分子胶降解剂的实例，详见👉 🔗本月中旬美国加州大学伯克利分校Danniel教授课题组在ACS Cent. Sci.（IF ~18.2/Q1)上报道了其关于分子胶靶向降解剂的最新研究。这是一篇非常有意思的研究，Danniel教授发现了一种可以移植安装在不同靶点配体上的共价弹头手柄——乙烯基磺酰基哌嗪，能够将非降解剂配体转化为有效降解其对应靶蛋白的共价降解剂。省流，请看下图，研究人员首先发现了有效、选择性降解BRD4的共价分子胶降解剂；并发现其共价弹头手柄可以移植安装到多种蛋白质靶向配体上，能够有效降解其靶蛋白，包括CDK4、AR、BTK、SMARCA2 /4、BCR-ABL/c-ABL等。1、确定促使降解BRD4的共价手柄2、定位BRD4降解的E3连接酶3、探索共价手柄对其它靶标的适用性接下来展开聊聊研究过程。01确定促使BRD4降解的共价手柄共价分子胶降解剂：近期有多项研究表明，可以通过细微的化学修饰，给非降解剂配体安装上共价手柄，可以将其转变成共价分子胶降解剂：配体靶向POI，共价手柄“连锁”E3连接酶残基形成共价键，进而使POI降解，如下图。这些研究中，已经确定了各种共价手柄靶向E3连接酶底物受体DCAF16、或DCAF11的半胱氨酸残基（Cys）。因此，可以基于POI已知的配体、和E3连接酶受体（如DCAF16）共价靶向手柄，合理设计共价单价分子胶降解剂。而且，共价分子胶降解剂还可以加强POI与E3连接酶受体之间的存在的微弱的相互作用，进而降解POI。如上图，研究人员首先使用BET家族抑制剂JQ1作为测试模板，合成了一系列具有各种亲的弹头手柄的共价JQ1类似物。这些共价弹头手柄可以与E3连接酶受体上的半胱氨酸、赖氨酸、或其它亲核氨基酸残基反应，以降解BRD4。研究人共合成、测试了18个JQ1共价衍生物，最终，只有化合物ML1-50会同时导致HEK293 T细胞中BRD4的长型和短型消失。其共价弹头手柄为乙烯基磺酰基哌嗪。ML1-50以剂量依赖的方式降低BRD4水平，在HEK293T细胞中优先降解短型BRD4亚型，并具有nM级别效力。研究人员还研究了ML1-50在不同细胞类型、不同靶标（包括BRD4的同亚族）的POI降解效力，证明其针对BRD4的特异性。接下来，研究人员设计方案，确定化合物ML1-50降解BRD4的E3连接酶的受体。02定位BRD4降解的E3连接酶为了确定化合物ML1-50降解BRD4的E3连接酶受体，首先合成了一个包含炔烃功能基团、和乙烯基磺酰基哌嗪手柄的探针——化合物ML2-33，如下图。这个探针比化合物ML1-50更加简单，没有潜在的配体连接，理论上它比化合物ML1-50更加混杂，因此，研究人员针对化合物ML2-33处理的细胞，设计了竞争性下拉蛋白质组学实验，寻找被化合物ML1-50预处理后，明显消失的蛋白。化合物ML2-33下拉蛋白质组学实验得到6259个蛋白，其中有133钟蛋白分布在不同的蛋白类别中，被过量的ML1-50预处理显著胜过。在这些ML1-50预处理显著胜过的靶标中，只有一种E3连接酶是Cullin E3连接酶家族中的一部分，可以被NEDD8-DCAF16调控。利用基于竞争活性的蛋白质谱分析（ABPP），通过半胱氨酸反应性探针，在原位ML1-50靶标结合与非原位全蛋白质组半胱氨酸标记的竞争，显示对照DCAF16细胞的C119与ML1-50处理的探针修饰的胰蛋白酶肽的比率为1.4，表明该半胱氨酸的衔接率为28%。为了进一步证实ML1-50与DCAF16的直接相互作用，研究人员用ML1-50取代了半胱氨酸活性探针，用基于凝胶的ABPP方法标记了纯化的DCAF16蛋白，而不会引起蛋白的任何沉淀。ML1-50介导的BRD4降解可以被过量JQ1预处理的细胞所取代，并且用共价烷基功能化手柄ML2-33单独处理的细胞不会改变BRD4水平，这表明BRD4的损失可能是通过与BRD4的特异性相互作用，而不是通过共价手柄的非特异性作用。同时，研究人员还证明了，可以通过不同的E3连接酶，针对同一靶标的不同亲电降解物。接下来，探索乙烯基磺酰基哌嗪共价手柄对其它靶标的普适性。03探索共价手柄对其它靶标的普适性很多的关于降解剂的研究都是基于BRD4进行研究，这是因为BRD4是一个非常典型的靶向蛋白降解的模型，它对靶向蛋白降解非常的敏感，因此，常被用来作为POC验证的模型。但是，BRD4共价降解剂的成功，并不能说明这个共价弹头手柄就具有其它靶标的更广泛的普适性了。需要进一步的验证，这种在非降解剂配体上安装共价弹头手柄，进而将其转化为特异性靶向的分子胶共价降解剂的靶点普适性。此外，先前的研究已经表明共价和非共价BRD4分子降解剂通过DCAF16起作用，通过加强DCAF16和BRD4之间存在的弱相互作用。亦可以通过共价招募DCAF16，生成针对BRD4以外的其它靶标的异源双功能的PROTACs降解剂。然而，ADCF16靶向共价手柄是否可以广泛移植到其它POI配体上，以产生BRD4以外的新底物蛋白的无连接、单价降解物尚不清楚。因此，本项研究首先将乙烯基磺酰基哌嗪手柄抑制到临床批准的CDK4/6抑制剂Ribociclib上，生成化合物ML1-71，如下图。尽管与ML1-50降解BRD4相比不太明显，但ML1-71能够在细胞依赖剂量显著地降解CDK4，如上图。尽管这种降解剂只有中等效力，但是可以观察到CDK4降解在DCAF16敲除细胞显著衰减。没有发现ML2-33处理对CDK4的降解，也没有观察到ML1-77处理对CDK4的细胞毒性。基于同样的考虑，研究人员也生成了针对SMARCA2/4的安装有乙烯基磺酰基哌嗪共价手柄的单价降解剂ML1-96。ML1-96能够显著降解MV-4-11白血病癌细胞中的SMARCA2、SMARCA4，并且这种降解作用在DCAF16敲除的细胞中显著减弱。同样，ML2-33不影响SMARCA2/4的水平，以及ML1-96对细胞没有毒性。将这种策略应用于雄激素受体（AR）单价降解剂，得到化合物ML2-9，同样降解效果显著，对细胞没有毒性。应用于BCR-ABL/c-ABL、以及BTK生成ML2-5、TH1-9，也证明了这种策略的可行性。总结与展望：总的来说，Daniel教授这种策略对于合理设计分子胶靶向降解剂非常具有参考意义。方法中涉及到共价手柄的探索、E3连接酶受体的探索，以及共价手柄在不同POI中的适用性等。证实了通过共价化学处理E3连接酶受体设计POI降解物的可行性。同时，也可以发现，每个降解物仍然还是表现出了不同程度的脱靶降解现象，可能表明蛋白质靶向配体在使用的浓度下脱靶或由共价降解处理引起的脱靶效应。因此，在后续的进一步药化的研究工作中，需要注意，进一步提高共价降解剂的手柄的选择性。更多详细的实验方案，请阅读原文（开源）。参考文献DCAF16-Based Covalent Handle for the Rational Design of Monovalent Degraders. ACS Central Science，2024, in printDOI: 10.1021/acscentsci.4c00286声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓