作者 ： Heather M. Callaway https://orcid.org/0000-0003-4003-3854 https://doi.org/10.1128/jvi.01786-25 摘要
狂犬病毒是迄今为止发现的最致命的病毒，尽管有疫苗和暴露后治疗，它仍然是全球健康威胁。除了狂犬病毒外，还有17种其他丽沙病毒，其中一些已经跨越物种屏障感染人类，并引起与狂犬病毒相同的临床疾病。虽然目前的狂犬疫苗能有效预防狂犬病感染，但它们无法提供持久的保护，也无法诱导产生对狂犬病毒及其相关丽沙病毒均具有广泛保护作用的抗体。为了改进狂犬疫苗，使其诱导产生更均匀、更持久、更广谱的中和抗体反应，结构导向设计将大有裨益。结构导向设计是指利用高分辨率蛋白质结构来设计疫苗抗原。在过去的六年里，首批丽沙病毒糖蛋白的高分辨率结构相继被解析，这为我们深入了解这些病毒如何与宿主抗体和受体相互作用提供了新的视角，也使得结构导向抗原设计成为可能。这篇综述涵盖了狂犬病毒糖蛋白结构、与中和抗体的相互作用以及与潜在细胞受体的相互作用方面的最新发现，重点关注狂犬病毒。介绍
狂犬病是迄今为止发现的最致命的病毒，致死率接近 100%。每年有超过 59,000 人死于未经治疗的狂犬病病例，其中 40%的死亡病例发生在儿童中（ 1 , 2 ）。虽然目前已有针对狂犬病毒的救命疫苗和暴露后治疗方法，但这些疫苗和暴露后治疗方法均无法提供持久保护，且对已出现感染症状的患者无效（3-5 ） 。 此外，狂犬疫苗诱导产生的多克隆抗体（也用于狂犬病暴露后治疗）不能有效中和非狂犬病丽沙病毒（ 6 ）。目前已发现 17 种非狂犬病丽沙病毒（ 7 , 8 ），其中一些已经跨越物种屏障感染人类（ 7 ），并导致与狂犬病毒相同的临床症状（ 7 , 9-12 ） 。
大多数人类狂犬病暴露和死亡病例是由犬咬伤造成的，尤其是在野狗普遍存在、动物狂犬病疫苗接种计划有限、以及人类狂犬病暴露后治疗费用昂贵或难以获得等地区（ 2 ）。在美国、欧洲和其他兽医狂犬病疫苗接种计划覆盖面广、狂犬病暴露后治疗费用低廉且易于获得的国家，野生动物传播（尤其是蝙蝠传播）才是狂犬病暴露和死亡的主要途径（ 1 ）。然而，尽管这些国家的死亡人数较少，狂犬病仍然是一个重大的公共卫生问题和经济负担。仅在美国，每年就有 140 万人因疑似狂犬病暴露而接受治疗（ 13 ），狂犬病的预防和治疗费用估计每年高达数亿美元（ 2 , 14 ）。在全球范围内，这些费用高达数十亿美元（ 2 ）。
为了预防人类狂犬病死亡，减轻狂犬病预防和治疗带来的巨大经济负担，并为未来可能发生的狂犬病相关丽沙病毒大流行做好准备，迫切需要研发更有效的狂犬病疫苗和治疗方法。理想的狂犬病疫苗应能诱导产生持久、强效且广谱的中和抗体反应，有效对抗狂犬病毒和多种其他丽沙病毒。同样，理想的狂犬病治疗方法，无论是抗体还是抗病毒药物，都应成本低廉，有效对抗狂犬病毒和相关丽沙病毒，并且对已出现感染症状的患者也有效。然而，研发这些新型疫苗和治疗方法需要更深入地了解丽沙病毒的结构及其表面糖蛋白（中和抗体反应的靶点）。本综述涵盖了狂犬病毒糖蛋白的结构和功能，包括它们在中和抗体反应和感染（结合/摄取和融合）中的作用，重点是狂犬病毒糖蛋白（RABV-G）。狂犬病病毒糖蛋白对感染和病毒中和至关重要
狂犬病毒是子弹状的包膜病毒，编码五种蛋白质：病毒糖蛋白 (G)、核衣壳蛋白 (N)、基质蛋白 (M)、磷蛋白 (P) 和 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (L)。病毒糖蛋白是狂犬病毒和其他狂犬病毒表面唯一的蛋白质，负责受体结合以及病毒膜与细胞膜的融合。该糖蛋白也是中和抗体反应的唯一靶点，而中和抗体反应是公认的狂犬病感染保护性免疫指标 ( 3 )。
狂犬病毒糖蛋白属于 I 型跨膜蛋白和 III 型病毒融合蛋白。它们由一个 19 个氨基酸的 N 端信号肽（成熟蛋白中会被切割）、一个大的 N 端胞外结构域（氨基酸残基 20-458；若排除信号肽则为 1-439）、一个跨膜结构域（氨基酸残基 459-481；若排除信号肽则为 440-462）和一个短的胞质结构域（氨基酸残基 482-524；若排除信号肽则为 463-505）组成（ 15 , 16 ）。据报道，胞质结构域与病毒基质蛋白相互作用（ 17 ），并且在不同的狂犬病毒株之间存在高度差异（例如，CVS 和 PV 狂犬病毒株的胞质结构域保守性约为 67%）。
在 2020 年之前，尚未解析出任何狂犬病毒糖蛋白的结构，无论是部分结构还是完整结构。然而，在过去的 6 年中，狂犬病毒糖蛋白（RABV-G）的晶体结构已被解析，包括融合前单体（ 18 ）和融合后单体 （ 18 ），冷冻电镜研究也解析出了融合前三聚体的结构（ 19-21 ）。除 RABV-G 外，莫科拉狂犬病毒糖蛋白（MOKV-G）的融合后单体结构（ 22 , 23 ）和伊科马狂犬病毒糖蛋白（IKOV-G） 的融合前三聚体结构（ 23 ）也已被解析。其中一些结构还解析出了与中和单克隆抗体的复合物结构（18-21 , 23-25 ） ， 具体细节将在下文详述。这些研究结合先前的生化分析和负染电子显微镜，揭示了狂犬病毒糖蛋白的整体结构，并为先前主要通过诱变和竞争鉴定的抗体和受体结合位点的研究提供了背景（6、15、26-28 ） 。
狂犬病毒糖蛋白可在融合前、融合后、单体和三聚体构象之间可逆转变（29-32 ） 。这种转变主要受 pH 值驱动，酸性 pH 值（pH 5.9 或更低，取决于毒株 ） 会使构象平衡向融合后状态移动并触发融合（ 29 ）。然而，即使在 pH 值低至 4.0 时，仍可检测到一部分狂犬病毒糖蛋白处于融合前构象（ 32 ）。类似地，在中性 pH 值下，也可在病毒表面检测到融合后糖蛋白（ 32 ）。由于这种构象异质性，狂犬病毒表面呈现出一种模糊的外层结构，其糖蛋白呈现多种不同的构象（ 30 , 33 , 34 ），而非像水疱性口炎病毒（VSV）（ 35 ）那样呈现均匀的排列。VSV 是一种子弹状弹状病毒，与狂犬病毒属于同一病毒科。这种构象异质性的一个后果是，中和抗体可以识别多种不同的糖蛋白构象，包括融合前、融合后或融合前和融合后两种构象（ 18 , 19 , 21 , 25 , 36 ）。然而，这种异质性也使疫苗设计的改进变得复杂。目前尚不清楚哪种糖蛋白构象或构象中间体能够诱导最强的中和抗体反应。 此外，狂犬病疫苗中 RABV-G 的构象异质性可能导致个体间观察到的中和抗体滴度的较大差异 ( 3 )，也可能降低免疫过程中多价重复表位增强的抗体反应的强度 ( 37 )。狂犬病病毒糖蛋白的高分辨率结构
狂犬病毒糖蛋白的高分辨率结构揭示了狂犬病毒属和弹状病毒科中保守的结构同源性 ， 尽管它们的氨基酸序列存在显著差异（ 18-20 , 22 , 23 ）。狂犬病毒糖蛋白（RABV-G）、莫卡病毒糖蛋白（MOKV-G）、伊科病毒糖蛋白（IKOV-G）以及水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV）的胞外结构域长度为 1440 个氨基酸，包含三个结构域：中心结构域、融合结构域和 Pleckstrin 同源结构域（ 图 1 ）（ 18 , 19 , 21 , 22 , 38 , 39 ）。中心结构域（CD）包含一个长的中央螺旋和糖蛋白的三聚体界面。融合结构域包含两个短的融合环，其中含有高度保守的芳香族氨基酸，这些氨基酸对于融合至关重要。最后，Pleckstrin 同源结构域连接中心结构域和融合结构域。
图 1
图 1： 狂犬病毒糖蛋白尽管序列存在差异，但结构上却具有显著的相似性。( A ) RABV-G 融合前、融合后和融合前三聚体构象的结构，结构域以不同颜色编码，融合环用箭头标示。伊科马狂犬病毒糖蛋白 ( B ，青色) 和莫科拉狂犬病毒糖蛋白 ( C ，玫瑰色) 分别与 RABV-G 融合前和融合后糖蛋白的结构比对结果也显示在图中。
位于中心结构域和 Pleckstrin 同源结构域之间的保守组氨酸残基（RABV-G 中的 H261）触发了融合前到融合后的转变（ 18 , 20 ）。具体而言，当 pH 值降低时，该组氨酸被质子化，可能破坏与相邻亚基上的天冬氨酸残基（D368）的氢键（ 19 ），进而导致融合前三聚体不稳定，并促进构象变化。在向融合后转变的过程中，中心结构域的螺旋延长并重排，显著改变了该结构域的结构（ 图 1 ）（ 18 ）。相比之下，融合结构域和 Pleckstrin 同源结构域保持其整体结构不变，但其相对于病毒膜的方向发生了改变（ 18 ）。在融合前构象中，融合域底部的融合环指向病毒膜，而在融合后构象中，它们向外旋转 180° 与细胞膜接合。糖蛋白三聚化
与融合前到融合后的转变类似，狂犬病毒糖蛋白三聚化也是可逆的。然而，由于狂犬病毒 G 蛋白三聚体不稳定，其与可溶性胞外结构域的结合亲和力约为 10⁰ M ( 19 )，因此解析其结构一直极具挑战性。目前尚未解析出任何融合后狂犬病毒糖蛋白三聚体的结构，但狂犬病毒 G 蛋白和伊科马病毒 G 蛋白的融合前三聚体的结构已于近期解析( 19 , 20 , 23 )。对于狂犬病毒 G 蛋白的融合前三聚体，需要使用能够将糖蛋白锁定在融合前构象的单克隆抗体来稳定三聚体( 19 , 21 , 25 )。值得注意的是，这些抗体并非通过跨越原聚体来稳定三聚体。相反，稳定糖蛋白的融合前构象并降低构象变异性会诱导融合前三聚体的形成。相比之下，IKOV-G 融合前三聚体的结构是在没有任何稳定抗体的情况下通过 X 射线晶体衍射解析的，这可能得益于三聚体界面处更强的结合力。
在融合前的狂犬病毒 G 蛋白三聚体中，亚基间的界面由中心结构域的三个环组成：小螺旋（残基 296-305）、支架环（残基 378-388）和螺旋环（残基 259-271）（ 19 ）。这些环之间的一系列氢键稳定了三聚体。虽然中心结构域在糖蛋白三聚体的核心也包含一个α螺旋，但这些螺旋在三聚体亚基中距离过远，无法相互作用形成三聚体界面（ 19 , 20 ）。除了中心结构域的相互作用外，融合环中保守的芳香族氨基酸也在狂犬病毒 G 蛋白融合前三聚体的形成中发挥作用（ 18 , 19 ）。这些氨基酸的替换导致 RABV-G 形成单体，即使与原本会促进三聚化的融合前稳定单克隆抗体结合使用也是如此 ( 19 )。其他狂犬病病毒糖蛋白的结构：伊科马和莫科拉糖蛋白
尽管 IKOV-G 与 RABV-G 的氨基酸序列同一性仅为 50%（ 15 ），但 IKOV-G 融合前三聚体的结构却惊人地相似。两种结构的叠加均方根偏差（RMSD）为 2–2.4 Å，IKOV-G 三聚体界面与 RABV-G 相似，但其亚基间接触更为广泛（ 图 1B ）（ 23 ）。值得注意的是，IKOV-G 无需添加稳定抗体，甚至在融合环被甘氨酸-丝氨酸连接肽取代的情况下，也能以融合前三聚体的形式结晶（ 23 ）。融合后莫科拉病毒糖蛋白（MOKV-G）单体与狂犬病毒糖蛋白（RABV-G）具有 50%的序列同一性，与伊科拉病毒糖蛋白（IKOV-G）具有 50%的序列同一性（ 15 ），已通过 X 射线晶体衍射法测定（ 22 , 23 ）。与 RABV-G 类似，融合后 MOKV-G 的中心结构域包含一个细长的α螺旋，且 RABV-G 和 MOKV-G 的叠加结构非常相似（ 图 1C ）。用于替代人狂犬病免疫球蛋白的治疗性单克隆抗体混合物
近期该领域的另一个研究重点是利用糖蛋白-抗体结构开发治疗性单克隆抗体混合物，以替代人狂犬病免疫球蛋白（HRIG）。HRIG 由接种过疫苗的人的多克隆血清组成，与狂犬病疫苗系列联合使用，是狂犬病暴露后治疗的关键组成部分。狂犬病暴露后，在伤口处注射 HRIG 以中和残留病毒，从而将治疗效果提高到接近 100%的存活率（ 40 ）。然而，尽管 HRIG 在狂犬病治疗中疗效显著，但仍有很大的改进空间。首先，由于 HRIG 直接来源于人血，因此价格非常昂贵（2004 年平均价格为 700 美元[ 14 ]），而用合成抗体替代 HRIG 可以大幅降低治疗成本。其次，多克隆血清本身就具有异质性。尽管狂犬病免疫球蛋白（HRIG）的配方中含有最低固定滴度的狂犬病中和抗体（ 41 ），但不同批次的 HRIG 抗体在结合位点、中和范围和中和机制方面可能存在差异。这种差异对于开发泛狂犬病毒疗法而言并不理想。此外，单克隆抗体疗法比人血制品更安全，大大降低了传播未被发现的血源性病原体的风险。截至本文撰写之时，HRIG 仍然是世界大部分地区的标准疗法，但几种前景广阔的治疗性抗体混合物正在研发中（ 4 , 5 , 42-44 ）。
据报道，一种特别令人振奋的候选药物有望替代狂犬病免疫球蛋白（HRIG），用于治疗小鼠的症状性狂犬病，该药物由两种单克隆抗体组成：RVC20 和 RVC58 ( 4 , 6 )。在该研究中，作者通过肌肉注射和脑室内注射两种途径给药，其中脑室内注射可将抗体输送到脑脊液中。在症状出现当天给药，该疗法可有效清除约 30% 小鼠的感染 ( 4 )。（否则，症状性感染的致死率是 100%。）这些结果表明，用于治疗症状性狂犬病的抗病毒药物需要能够穿过血脑屏障才能有效，而治疗性抗体可以作为此类疗法进行开发。高分辨率结构揭示狂犬病抗原位点
自 2020 年以来，已解析出多种狂犬病毒 G 蛋白与中和单克隆抗体复合物的结构（ 18-21 , 24 , 25 ） （ 图 2 ， 表 1 ），加深了我们对狂犬病毒构象和抗体结合的理解，并促进了开发可替代狂犬病毒免疫球蛋白（HRIG）的单克隆抗体混合物。在此之前， 人们对狂犬病毒抗体结合的理解仅限于通过竞争性实验和诱变实验获得的信息（ 15 , 26-28 ）。这些新的结构极大地加深了我们对抗体如何识别和中和狂犬病毒的理解。
图 2
图 2 狂犬病抗体结合位点覆盖糖蛋白表面。( A ) 根据基于诱变命名法定义的狂犬病抗原位点 IIa、IIb、III、IV 和“a”，以及新发现的抗原位点 V 和 VI。注意，从该视角无法看到抗原位点 I。( B ) 来自高分辨率蛋白质结构的狂犬病抗体结合足迹，按抗原位点分组。足迹图描绘了距离抗体 4 Å以内的氨基酸，这些氨基酸映射到来自 RABV-G/RVC68 共结构（具有最完整的融合域）的 RABV-G 单体上。
表 1 RABV-G 与中和单克隆抗体复合物的高分辨率结构总结
单克隆抗体
表位
构象结合
已知病毒识别 a
mAb 足迹（4 Å 以内的残基） b
已知逃逸突变 c
A2（25）
第二/四区
融合前/融合后（ 25 ）
RABV（ 25 ）
36–44、189、192、194、196、198、199、203-204、228、230-231、242–244
A11（ 25 ）
第二/四区
融合前/融合后（ 25 ）
RABV（ 25 ）
39、41-44、147、187、189、194、196、199、201、204、206、226、228-231、242-244、246、248、251
1112-1 (20)
第二/四区
融合前/融合后（ 20 ）
RABV（ 20 ）
36–42、44、189、192、194、196、198、199、202、203、228–231、242–245
8C5 (25)
第二/四区
融合前/融合后（ 25 ）
RABV、DUVV、EBLV-1(25)
42–44、47、188–190、192–196、228–231、242–245
RVC20（ 24 ）
第二/四区
仅在融合前存在；表位存在于融合后，但 mAb 与融合域发生冲突，抗体在 pH 5.6 时不结合（20, 24）
RABV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、SHIBV、IKOV、BBLV ( 6 )
42、44、47、186-192、194、226-231、251
K226E/N、G229E（ 6 ）；M44、R147、K226、G229、V230、A242（ 45 ）
4H3（25）
第二/四区
融合前/融合后（ 25 ）
RABV、DUVV、EBLV-1 (25)
44、144-147、164、187、189、190、192、194、226、228-231、251
CR57（ 46 ）
二/四号遗址
仅在融合前存在（ 46 ）；表位存在于融合后，但单克隆抗体与融合域发生冲突。
RABV、DUVV、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV ( 6 )
44, 187–189, 192、194、224、226、228-231、242、244、246、251、252、254
K1、G34、M44、R147、D190、K198、K226、G229、V230、A242、Q382（ 45 ）；K226N/E、G229E（ 47 ）
CTB012（ 21 ）
第三站
仅在融合前存在（ 21 ）；融合后构象中不存在表位
狂犬病毒（ 21 ）
1、28、29、31、33、34、267–272、275
F2、N27、L28、V29、E31、D32、E33、G34、Y50、I51、K198、A200、V210、I268、E269、H270、L271、V272、E274、E275、L276、V308、F311、D326 ( 45 )
RVA122（ 19 ）
第三站
仅在融合前存在（ 19 ）；融合后构象中不存在表位
ABV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、 KHUV，ARAV（ 6 ）
1–3、29、31、33、35、36、38、198、213–216、270、271、309、331、333、334、337
P137S/R333Q ( 19 ); K1、V29、E31、L38、K198、A200、V210、P309、S331、R333、T334、N336、E337、I338 ( 45 )
4C12（ 25 ）
第五站
仅在融合前存在（ 25 ）；融合后构象中不存在表位
RABV、DUVV、EBLV-1、IRKV ( 25 )
10、11、13-16、47、190、193、194、318、319、340-344、346、348-355
RVC68（ 25 ）
第六站
融合前/融合后（ 25 ）
RABV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、IRKV、KHUV、ARAV、LBV、MOKV、SHIBV ( 6 )
90、92、93、96、97、100、103、105-107、110、111、113-116、118、129、132
A97、W100、D105、R107、E110、L132（ 45 ）
17C7 (20)
站点“a”
融合前/融合后（ 20 ）
RABV（ 20 ）
333、334、336、337、340-342、344、346、349、350、368、370、371、376、380
R333、T334、N336、E337、I338、P340、S341、R346 ( 45 )
523-11（ 18 ）
站点“a”
融合前/融合后（ 18 ）
RABV（ 18 ）
212、333、334、336、337、340-342、344、346、348、349、351、370、380、382
CTB011（ 21 ）
站点“a”
仅在融合前（ 21 ）；表位存在于融合后构象中，但据报道 CTB011 可阻断融合后转变（ 21 ）
狂犬病毒（ 21 ）
334, 336, 337, 339, 341, 342, 349, 368, 370, 371
a
病毒识别包括抗体能够中和的病毒列表，以及据报道其糖蛋白能够与抗体结合的病毒列表。并非所有抗体都经过广泛的交叉反应性测试。RABV，狂犬病毒；DUVV，杜文哈格病毒；EBLV-1，欧洲蝙蝠狂犬病毒 1；EBLV-2，东部蝙蝠狂犬病毒 2；ABLV，澳大利亚蝙蝠狂犬病毒；IRKV，伊尔库特狂犬病毒；KHUV，胡占德病毒；ARAV，阿拉万病毒；LBV，拉各斯蝙蝠病毒；MOKV，莫科拉狂犬病毒；SHIBV，希莫尼蝙蝠病毒；BBLV，博克洛蝙蝠狂犬病毒。
b
RABV-G 的前 19 个氨基酸构成信号肽，该信号肽会被蛋白酶切割，成熟糖蛋白中不存在。抗体接触位点在成熟糖蛋白上进行编号，不包括被切割的信号肽（例如，编号为 Lys1，而不是 Lys20）。这种编号方案遵循文献中的标准惯例。
c
并非所有具有特定结构的抗体都经过了逃逸突变检测。
目前已在狂犬病毒糖蛋白（RABV-G）表面鉴定出七个抗原位点（ 图 2 ），可能还有更多尚未发现的抗原位点。这些抗原位点编号为 I-VI 和“a”，其命名方案基于糖蛋白诱变 ， 根据竞争性试验将抗体分组为表位，而点突变会破坏结合（ 26-28 ）。这些突变分别对应于残基 263-264（位点 I）、198-200 和 34-42（分别为位点 IIa 和 IIb）、330-338（位点 III）、226-231（位点 IV）和 342-343 （“a”）（ 15 ）。抗原位点 V 和 VI 是近期发现的（ 25 ），它们也基于这种诱变命名方案。
位点 I 位于中央结构域侧面，目前尚未解析出位点 I 抗体与 RABV-G 复合物的结构。抗原位点 II 和 IV 构成 Pleckstrin 同源结构域上的重叠区域（ 图 2 ）( 25 )，是 RABV-G 上的两个主要抗原位点之一 ( 6 , 27 )。Pleckstrin 同源结构域和位点 II/IV 在融合前和融合后状态下均保持几乎相同的构象 ( 18 , 19 , 24 )。识别位点 II/IV 的抗体能够结合 RABV-G 的融合前和融合后构象 ( 25 )，且不会稳定任何一种糖蛋白构象。目前已解析出八种位点 II/IV 抗体的结构，包括抗体 A2 ( 25 )、A11 ( 25 )、1112-1 ( 20 )、8C5 ( 25 , 48 )、RVC20 ( 6 , 24 )、4H3 ( 25 , 48 ) 、 7E8 ( 25 , 48 )和 CR57 ( 46 )。这些结构表明，抗原位点 II 和 IV 在 Pleckstrin 同源结构域上形成一个连续谱。虽然有些抗体结合于该连续谱的两端，可被视为严格意义上的位点 II 抗体或位点 IV 抗体，但另一些抗体则能识别这两个位点 ( 20 , 25 )，这表明抗体与 Pleckstrin 同源结构域的结合比最初基于诱变的研究中所描述的更为复杂。
与抗原位点 II/IV 不同，靶向抗原位点 III（第二个主要抗原位点）的抗体特异性识别融合前 RABV-G 蛋白。当 RABV-G 蛋白转变为融合后构象时，Pleckstrin 同源结构域位于中心结构域上方，阻断了抗原位点 III 的接近（18-20 ） （ 图 1 ） 。识别抗原位点 III 的抗体可能在结合时稳定融合前 RABV-G 蛋白，进而稳定融合前三聚体；也可能结合融合前 RABV-G 蛋白但不促进三聚化。稳定三聚体的位点 III 抗体包括 RVA122 和 CTB012（ 图 2 ）（ 6 , 19 , 21 ），它们有助于 RABV-G 融合前三聚体的结构解析；而不稳定位点 III 的抗体包括 10H5（ 25 , 48 ）和 A4（ 25 ）。
在位点“a”处已解析出三种狂犬病毒 G 蛋白（RABV-G）抗体结构：一种与融合后单体形成复合物（抗体 623-11）( 18 )，两种与融合前三聚体形成复合物（抗体 17C7 [ 20 ] 和 CTB011 [ 21 ] [ 图 2 ]）。抗原位点“a”存在于 RABV-G 的融合前和融合后构象中，并且在识别该位点的三种抗体结构中，抗体结合区域均局限于中心结构域（ 图 2 ； 18 , 20 , 21 ）。
最近，在高分辨率冷冻电镜结构中发现了两个新的抗原位点（ 25 ），沿用经典的诱变命名方案，分别命名为位点 V 和 VI。位点 V 位于中央结构域侧面，在抗原位点“a”下方（ 图 2A ）（ 25 ），而位点 VI 位于融合结构域上（ 图 2 ）（ 6 , 25 , 45 ）。位点 V 抗体 4C12 具有融合前特异性，可将融合前中央结构域与 Pleckstrin 同源结构域连接起来（ 25 ）。与抗体 4C12 不同，位点 VI 抗体 RVC68 仅与融合结构域结合，并能识别糖蛋白的全部构象（ 6 , 25 , 45 ）。与 Pleckstrin 同源结构域一样，融合结构域在融合前和融合后状态下保持相同的整体构象（ 图 1 ）（ 18 ）。
V 位点抗体 4C12，尤其是 VI 位点抗体 RVC68，因其对狂犬病毒 G 蛋白（RABV-G）和其他狂犬病毒糖蛋白（包括来自伊尔库特狂犬病毒、杜文哈格狂犬病毒、伊科马狂犬病毒、莫科拉狂犬病毒和/或东部蝙蝠狂犬病毒 1 型的糖蛋白）的广泛识别而引人注目（ 6 , 25 ）。这种广泛的糖蛋白识别源于抗原位点 V 和 VI 的高度氨基酸序列保守性，远高于糖蛋白其他部分的保守性（ 25 ）。这些新发现的抗原位点可能是治疗性抗体组合中泛狂犬病毒抗体的理想靶点，或可作为泛狂犬病毒疫苗的重点靶点。单克隆抗体的耐药性和逃逸突变
在从多克隆抗体疗法（HRIG）过渡到单克隆抗体鸡尾酒疗法的过程中，病毒逃逸突变（即对鸡尾酒疗法成分产生耐药性 ） 是一个主要问题。一些单克隆抗体的此类突变已被确定（ 6 , 28 , 36 ），而另一些则可以通过高分辨率蛋白质结构（ 18-21 , 24 , 25 ）或将抗体分组到经典的狂犬病抗原位点（由赋予抗体耐药性的突变定义）来预测（ 6 , 15 ）。然而，最近一项采用深度突变扫描的研究对治疗性抗体候选物的狂犬病抗体逃逸突变进行了更深入的探索（ 45 ）。在该研究中，作者构建了一个包含所有可能氨基酸突变的狂犬病毒 G 蛋白（RABV-G）的 DNA 文库，生成了假病毒，然后确定了哪些假病毒对抗体具有耐药性（ 45 ） 。
该研究的一个特别有趣的发现是，虽然某些抗体的逃逸突变范围很广，几乎覆盖了整个结合区域，但另一些抗体的逃逸突变则集中在 2-3 个氨基酸的较小位点上。对于这些抗体，包括 RVC20、RVA122 和 RVC68（ 45 ），或许可以利用已解析的高分辨率结构（ 19、24、25 ）来构建抗病毒逃逸突变的抗性。狂犬病多克隆抗体反应的抗体靶点和变异
在改良狂犬病疫苗的工程化过程中，三个主要研究方向是提高中和抗体反应的持续时间、效力和广度。现代人用和兽用狂犬病疫苗均由灭活狂犬病毒组成，人用疫苗不添加佐剂，兽用疫苗则添加明矾佐剂（ 49 , 50 ）。野生动物狂犬病疫苗最初通过可食用诱饵投放，采用减毒活狂犬病毒株，但由于存在病毒返祖为毒性更强狂犬病毒株的风险，目前已转向载体疫苗（ 51 ）。然而，所有这些疫苗类型都含有野生型狂犬病毒 G 蛋白（RABV-G），并且诱导的抗体反应在个体间可能存在显著差异（ 3 , 15 , 52 ）。
大多数狂犬病疫苗抗体反应持续时间短，且具有狂犬病特异性，中和范围较窄（ 3 , 6 , 53 ）。然而，也有报道称，少数个体产生持续时间更长、中和效力更强和/或中和范围更广的抗体或抗体反应。参考文献 6 中鉴定的广谱中和单克隆抗体就是一个例子。另一项关于人类狂犬病免疫的研究表明，一些个体产生的中和抗体滴度比平均值高 2 至 3 倍（比最低滴度高 10 倍以上），还有一些个体在 5 年后仍保持较高的中和抗体滴度，而不是降至无法检测的水平（ 3 ）。
一种可能性是，这些抗体靶向狂犬病毒 G 蛋白（RABV-G）的罕见表位或构象。此类表位的例子包括抗原位点 V 和 VI（ 25 ），这些位点的残基比糖蛋白的其他部分更为保守。此外，更持久的抗体反应也可能与 RABV-G 上的表位有关，因为在基因相同的动物中也观察到了中和抗体反应持续时间的显著差异（ 54 ）。识别、稳定和强化能够诱导广谱中和、强效中和和持久抗体反应的表位，对于开发改良的泛狂犬病毒疫苗可能至关重要。狂犬病受体
与了解狂犬病毒及相关丽沙病毒的抗体结合机制同等重要的是，确定这些病毒利用哪些受体来驱动感染。病毒受体能够提供关于病毒宿主范围和传播的关键信息，从而预测可能易感的新宿主物种。病毒受体结合位点也是抗病毒药物研发和疫苗设计的潜在靶点。目前，仅鉴定出狂犬病毒的潜在受体，而对于非狂犬丽沙病毒如何进入细胞以及它们是否使用与狂犬病毒不同的受体，我们知之甚少。此外，狂犬病毒用作受体和/或附着因子的蛋白质或其他分子仍然是一个活跃的研究领域。
迄今为止，已有报道称五种蛋白质和两种非蛋白质配体能够促进狂犬病毒的细胞黏附和感染，但证据级别各不相同。这些潜在的受体和黏附因子包括尼古丁乙酰胆碱受体 (nAChR)、p75 神经营养因子受体 (p75NTR)、神经元细胞黏附分子 1 (NCAM1)、代谢型谷氨酸受体 2 (mGluR2)、整合素 β1、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG) 和磷脂酰丝氨酸 (55-60 ) 。作为病毒表面唯一的蛋白质，狂犬病毒糖蛋白 (RABV-G) 也负责介导病毒与细胞的黏附。然而，鉴于 RABV-G 可用于受体结合的表面积相对较小，且缺乏其他表面糖蛋白来介导与受体的接触，RABV-G 似乎不太可能与每种已提出的配体形成特异性相互作用。研究狂犬病受体结合的另一个复杂之处在于，目前尚未找到狂犬病的非容许性哺乳动物细胞系，这使得开展经典的实验——即在非容许性细胞系上表达潜在受体并确定该受体是否能促进感染——变得困难甚至不可能。然而，尽管存在这些困难，仍有令人信服的证据表明，这些蛋白质确实会影响狂犬病的感染。尼古丁乙酰胆碱受体（nAChR）
尼古丁乙酰胆碱受体 (nAChR) 是一种五聚体配体门控膜转运蛋白，控制钙离子进入神经元 ( 61 )，目前有最强有力的证据表明其参与狂犬病感染和疾病的发生发展。首先，nAChR 以不同的亚型存在于神经肌肉接头和突触中 ( 62 , 63 )，这意味着狂犬病病毒可感染宿主的两种神经元类型：运动神经元和中枢神经系统神经元。其次，狂犬病毒 G 蛋白 (RABV-G) 与 nAChR 配体 α-银环蛇毒素具有氨基酸序列同源性 ( 64 )，并且对应于 nAChR 174-203 位氨基酸残基的肽段均能与狂犬病毒结合并抑制病毒感染 ( 65 )。此外，追踪狂犬病毒适应新宿主物种进化过程的研究发现，狂犬病毒 G 蛋白 183 位残基（ 66 ）存在正向选择的证据，该残基位于预测与 nAChR 相互作用的环状结构（狂犬病毒 G 蛋白 190-203 位残基， 图 3A ）附近（ 64 , 67 ）。最后，向表达 nAChR 的细胞中添加狂犬病毒 G 蛋白会导致神经元信号传导发生改变。当在蛙卵母细胞上表达人源 nAChR 时，添加狂犬病毒 G 蛋白肽会降低跨细胞膜的信号传导（ 68 ）。类似地，当将狂犬病毒 G 蛋白肽注射到小鼠脑内时，小鼠会出现行为改变，包括活动量增加，这些改变与狂犬病的症状一致（ 69 ）。
图 3
图 3 狂犬病毒受体的潜在结合位点位于 RABV-G 的 Pleckstrin 同源结构域和中心结构域。( A ) nAChR 和 p75NTR 的潜在结合位点映射到 RABV-G 融合前三聚体上。残基 P183 已突出显示。( B ) α7 nAChR 与α-银环蛇毒素结合，详细展示了 RABV-G 和α-银环蛇毒素之间的序列同源区域。( C ) p75NTR，其中预测的 RABV-G 结合残基 Q33 已突出显示。
nAChR 以多种亚型存在，可以是相同亚基组成的同源五聚体，也可以是多种不同的异源五聚体（ 62 ）。对于狂犬病感染而言，最相关的 nAChR 亚型可能是存在于中枢神经系统神经元上的α7 同源五聚体，以及存在于运动神经元上的含α1 亚基的异源五聚体（ 63 , 68 ）。2021 年，通过冷冻电镜技术解析了人α7 nAChR 同源五聚体的首个结构，包括其单独存在以及与α-银环蛇毒素复合物的结构（ 61 ），这进一步揭示了狂犬病毒 G 蛋白与 nAChR 之间潜在的相互作用以及 nAChR 信号传导的变化。在这些结构中，与狂犬病毒结合相关的 nAChR 区域是胞外结构域上的一个外向环状结构（ 图 3B ； 61 ）。根据结合配体的不同，nAChR 中心的离子通道可能处于开放（激活）、关闭（静息）或脱敏构象（ 61 ）。当α-银环蛇毒素与 nAChR 结合时，离子通道进入静息状态，此时通道变窄以阻止钙离子流动（ 61 ）。如果狂犬病毒 G 与 nAChR 的结合也引起构象变化并导致离子通道关闭，则预计会影响神经元信号传导。
虽然有强有力的实验证据表明 nAChR 与狂犬病有关，但它究竟是作为受体、黏附因子，还是在感染过程中发挥其他作用，仍有待确定。有证据表明 nAChR 会发生内吞作用 ( 70 )，这使得 nAChR 有可能成为狂犬病毒的真正受体，既能结合病毒颗粒，又能促进病毒被细胞摄取。然而，对上述实验证据的另一种解释是，狂犬病毒与 nAChR 的相互作用并非对细胞摄取至关重要，而是对诱导宿主行为改变至关重要。这些改变，包括攻击性和运动能力的增强（这些改变会促进感染），对于病毒在宿主间的传播至关重要 ( 69 , 71 )。另一个重要的注意事项是，RABV-G 的 190-203 位残基的构象与 α-银环蛇毒素的相应残基不同（ 图 3 ），这引发了人们对该糖蛋白部分是否与 nAChR 相互作用的疑问。要确定 nAChR 是否作为狂犬病受体发挥作用，需要在真正抗狂犬病的哺乳动物细胞系上表达 nAChR（目前尚未建立此类细胞系），并观察添加 nAChR 是否允许感染发生。p75 神经营养因子受体（p75NTR）
除了 nAChR 之外，最有证据表明其功能可作为狂犬病受体或附着因子的是 p75 神经营养因子受体 (p75NTR)。p75NTR 是一种单次跨膜单体蛋白，含有多个离散的富含半胱氨酸的结构域 (CRD)，存在于中枢神经系统的神经元上，但不存在于运动神经元上 ( 55 )。p75NTR 的已知配体包括神经生长因子等神经营养因子，以及糖鞘脂神经节苷脂 GT1b 和与阿尔茨海默病相关的 β-淀粉样蛋白 ( 55 )。
支持 p75NTR 作为狂犬病毒受体的最有力证据是一系列利用全长和可溶性 p75NTR 进行的结合和感染抑制研究（72-74 ） 。尽管缺乏对狂犬病毒感染不敏感的细胞系使得这些研究具有挑战性， 但过表达 p75NTR 的转染细胞系与 RABV-G 的结合显著增强（ 72 , 73 ）。此外，当 p75NTR 通过与抗体 Fc 结构域融合以可溶性二聚体的形式表达时，它能以剂量依赖的方式抑制狂犬病毒感染（ 74 ）。RABV-G 在 318 和 352 位氨基酸残基上的特定点突变抑制了 p75NTR-Fc 介导的病毒中和作用以及与 p75NTR 的结合（ 74 ）。然而，含有这些突变的病毒仍然能够在 BSR 细胞上生长，尽管滴度降低（ 74 ），这表明虽然 p75NTR 可能有助于狂犬病感染，但它可能并非必需。
在 p75NTR 上，单个 CRD 缺失的构建体表明，最 N 端的 CRD（CRD1）负责与 RABV-G 结合（ 图 3C ； 73 ）。CRD1 的点突变进一步将 RABV-G 结合位点缩小到 p75NTR 残基 Q33 周围的区域（ 73 ）。人源 p75NTR 蛋白前两个 CRD 的晶体结构（ 75 ）显示，Q33 位于蛋白的 N 端附近，并且位于 CRD1 的最外侧边缘（ 图 3C ）。总的来说，现有证据最有力地支持 p75NTR 作为一种狂犬病毒附着因子，能够增强狂犬病毒感染，但最终并非其必需。神经元细胞粘附分子（NCAM1）
最后一种经典提出的狂犬病受体是神经元细胞黏附分子（NCAM1）。与 p75NTR 类似，NCAM1 是一种表达于神经元细胞表面的单次跨膜蛋白（ 76 ），并且与 nAChR 类似，它以多种不同的亚型存在。每种 NCAM1 亚型都具有长度不同的胞内结构域（NCAM120、140 和 180，按长度由短到长排列），但胞外结构域相同（ 55 , 76 ）。NCAM1 胞外结构域由五个免疫球蛋白（Ig）样结构域和两个纤连蛋白样结构域组成（ 76 ）。前三个 Ig 样结构域和两个纤连蛋白样结构域的结构已通过 X 射线晶体衍射解析，从而揭示了该蛋白的整体形状（ 77 , 78 ）。
目前支持 NCAM1 作为狂犬病毒受体或黏附因子的证据包括：NCAM1 定位于神经元突触（ 76 , 79 , 80 ），以及细胞表面缺乏 NCAM1 对狂犬病毒感染的易感性较低（ 55 ）。此外，NCAM1 敲除可延长狂犬病毒感染小鼠的存活时间，并减少其脑内感染细胞的数量（ 79 ）。然而，或许最有趣的是，添加 NCAM1 的配体硫酸乙酰肝素（ 76 ）可显著降低细胞内的狂犬病毒感染，而结构相似的多糖硫酸软骨素则无此作用（ 79 ）。这一发现提示，狂犬病毒 G 蛋白可能通过肝素-糖结合（如下所述）与 NCAM1 相互作用，而非直接与 NCAM1 形成蛋白质-蛋白质相互作用。总的来说，这些证据支持 NCAM1 作为狂犬病毒的附着因子，但不一定是受体，因为 NCAM1 似乎对感染并非必需。狂犬病受体新报告：mGluR2 和整合素β1
近年来，随着 siRNA 基因敲低筛选技术的发展，一些研究报道了狂犬病毒的其他潜在受体，包括代谢型谷氨酸受体 2（ 56 ）和整合素β1（ 57 ）。然而，作为较新的发现，目前关于这些蛋白如何参与狂犬病毒感染的具体信息相对较少。
代谢型谷氨酸受体 2 (mGluR2) 是在 siRNA 敲低筛选中发现的，据报道，当其以可溶性胞外结构域形式表达时，能够抑制组织培养中的狂犬病毒感染并提高狂犬病毒感染小鼠的存活率 ( 56 )。虽然作者也通过共沉淀实验报道了 mGluR2 与狂犬病毒 G 蛋白胞外结构域之间的蛋白质-蛋白质相互作用，但该发现的一个重要局限性在于，这种结合是在两种蛋白均在大肠杆菌中表达且缺乏糖基化修饰的情况下观察到的。由于糖基化对于狂犬病毒 G 蛋白的正确折叠和分泌至关重要 ( 81 )，因此狂犬病毒 G 蛋白和 mGluR2 如何相互作用仍不清楚。
采用类似的实验方法，同一研究小组鉴定出整合素β1 是狂犬病毒的入侵因子和另一个潜在受体（ 57 ）。与他们对 mGluR2 的研究类似，作者报道可溶性整合素β1 胞外结构域能够抑制组织培养中的狂犬病毒感染，提高狂犬病毒感染小鼠的存活率，并能直接下拉 RABV-G 胞外结构域（ 57 ）。然而，关于大肠杆菌表达的 RABV-G 的局限性同样适用于下拉实验，而且 RABV-G 和整合素β1 的相互作用机制仍不清楚。不过，该研究的另一个有趣发现是整合素β1 和 nAChR 存在相互作用（ 57 ），这或许可以解释为什么可溶性整合素β1 和抗整合素β1 抗体均能降低小鼠狂犬病死亡率。另一种解释是，已有报道称整合素β1 可与纤连蛋白结合（ 82 ），而纤连蛋白又可与肝素结合（ 83 ）。与上文所述的 NCAM1 类似，如果 RABV-G 通过肝素间接与整合素β1 相互作用，则可能解释这些结果。RABV-G 的非蛋白配体（糖类和脂质）
除了蛋白质受体/附着因子外，据报道狂犬病毒 G 蛋白 （RABV-G）还能与糖类和脂质结合（19, 55, 58–60 , 84–86 ） ， 这或许可以解释狂犬病毒为何能感染如此广泛的物种和细胞。然而，值得注意的是，弹状病毒水疱性口炎病毒（VSV）也曾报道过类似的脂质结合现象（ 87 ），但随后的研究表明，该脂质并不作为病毒受体发挥作用（ 88 ）。狂犬病毒感染是否也存在类似情况，尚待进一步研究。
据报道，能与狂犬病毒结合的特定分子包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇（ 58 , 59 ），以及唾液酸、半乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖和肝素（ 60 , 84 , 85 ）。狂犬病毒 G 蛋白（RABV-G）的脂质结合相互作用受病毒融合环的调控，其中 W121 残基对结合最为重要（ 19 ）。值得注意的是，具有未修饰融合环的可溶性 RABV-G 胞外结构域能与细胞脂质膜共纯化（ 19 ），而融合环被甘氨酸-丝氨酸连接肽取代或发生 W121A 点突变的 RABV-G 胞外结构域则不能（ 18 , 19 ）。
糖蛋白与非蛋白配体结合在狂犬病感染中的确切作用尚需进一步研究，但可能与病毒糖蛋白的细胞黏附或稳定有关。在狂犬病毒颗粒上，即使在中性 pH 条件下，部分糖蛋白仍保持融合后构象（ 32 ），其融合环指向远离病毒膜的方向。通过亲和力结合相互作用，多个融合后糖蛋白同时与细胞脂质或聚糖结合，可能有助于病毒黏附于细胞表面。虽然病毒仍需经历内吞作用，并可能与特定受体结合以促进内吞，但初始的细胞黏附可能使狂犬病毒能够利用其结合亲和力相对较低的细胞受体。脂质结合还能稳定狂犬病毒糖蛋白（RABV-G）的融合前构象，芳香族融合环残基（尤其是 W121）的突变会降低处于融合前构象的糖蛋白比例（ 19 ）。当其融合环与脂质膜结合时，融合前的狂犬病毒 G 蛋白三聚体必须从膜和三聚体的其他亚基上解离，才能转变为融合后构象（ 19 ）。稳定融合前构象反过来可能有助于确保一部分糖蛋白上的受体结合位点保持可及性，或防止过多的糖蛋白转变为融合后构象。狂犬病毒 G 蛋白受体与配体结合相互作用的三种假设
RABV-G 不太可能与如此多的不同受体形成独特的直接蛋白质-蛋白质相互作用。这些潜在受体之间没有显著的序列同源性，而且 RABV-G 的表面积不足以容纳五个或更多不同的受体结合位点。相反，以下三种可能性更为合理。第一种可能性是，狂犬病毒存在一个主要的蛋白质受体，该受体在感染过程中促进病毒附着并被神经元细胞摄取。这种受体需要同时存在于运动神经元和中枢神经系统神经元上，高度保守，并且能够进行内吞作用。在目前已鉴定的潜在受体中，nAChR 最符合这些要求。其余的 RABV-G 配体可能作为附着因子或调节 nAChR 的表达/定位，从而影响病毒感染。
第二种可能性是，狂犬病毒首先通过与细胞膜上存在的或与其他蛋白质结合的糖类或脂质的非蛋白质相互作用附着于细胞。附着于细胞后，病毒需要与正在进行内吞作用的蛋白质结合才能被细胞摄取。促进内吞作用的蛋白质可以直接与狂犬病毒 G 蛋白（RABV-G）相互作用，也可以通过结合的糖类或脂质间接相互作用。
第三种可能性是，RABV-G 可以识别保守的蛋白质折叠结构，例如 CRD、纤连蛋白样结构域或免疫球蛋白样 (Ig) 结构域。狂犬病毒颗粒可以通过与该折叠结构发生多次低亲和力结合而附着于细胞。如果含有该保守折叠结构的蛋白质发生内吞作用，则也可能促进病毒进入细胞。此外，RABV-G 附着于细胞后，还可以与另一种蛋白质结合以促进内吞作用。
检验这些假设并精确确定狂犬病毒如何结合并进入细胞将极具挑战性。首先，需要一种完全不具有感染性的哺乳动物细胞系来测试潜在的受体。其次，需要消除狂犬病毒糖蛋白（RABV-G）与糖和脂质的结合，这很可能会破坏病毒的融合环，使病毒失去感染性。最后，第三点最好能得到狂犬病毒糖蛋白与保守折叠结构复合物的高分辨率结构支持。未来方向
新近解析的狂犬病毒糖蛋白结构以及狂犬病毒 G 蛋白与中和抗体复合物的结构，标志着在结构导向设计改良狂犬病疫苗和治疗药物方面取得了重大进展。然而，我们对狂犬病毒糖蛋白的结构和功能的理解仍然不完整。在已知的 18 种狂犬病毒中，仅有 3 种（狂犬病毒、伊科马病毒和莫科拉病毒）的糖蛋白结构被解析，且尚未有任何狂犬病毒的融合后三聚体结构被解析。虽然狂犬病毒糖蛋白的整体形状预计相似，但不同狂犬病毒的糖蛋白在构象稳定性或疫苗接种过程中强调的表位方面可能存在差异。此外，持久性狂犬病免疫反应中的抗体与狂犬病毒 G 蛋白的结合位点以及导致这些持久性免疫反应的因素仍不清楚。最后，尚未确定 RABV-G 与受体或附着因子的复合物结构，狂犬病用作细胞受体的蛋白质或分子仍然不确定。
https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.01786-25
疫苗网2026年6月8号访问人数3849人，访问量15279.
