Recombinant human albumin(Shanghai Anruite)

已经披露的 2022 年财报中，FDA 批准的 6 款 CAR-T 细胞治疗产品销售额达到 25.66 亿美金，使用慢病毒载体（Lentiviral Vectors, LVs）的四款产品（包括 Kymriah，Breyanzi，Abecma，CARVYKTI 等），获得 11.07 亿美金销售，较 2021 年增长 32%。国内药明巨诺瑞基奥仑赛注射液（relma-cel，商品名：倍诺达）使用慢病毒载体，其技术来源于美国 Juno therapeutics 产品 Breyanzi，2022 年获得 1.46 亿人民币（约 2200 万美元）销售。随着国内外越来越多的免疫细胞治疗产品进入临床研究和上市销售，慢病毒载体的市场也将持续快速增长。慢病毒载体市场浅析美国第三方市场调查公司 PMR（Persistence Market Research）公布的数据显示，2021 年全球慢病毒载体市场达到 1.276 亿美元，未来十年将保持 11.4% 年复合增长率，至 2032 年预估可以到 4.112 亿美元[1,2]。根据慢病毒载体应用领域，市场可分为 CGT（细胞和基因疗法）、疫苗等，其中 CGT 占主要份额。在 COVID-19 大流行期间，随着疫苗开发的需求和投资不断增加，也带动了慢病毒载体在疫苗领域的快速增长，但随着流行趋于结束，这部分市场也在快速回落。全球而言，北美地区是慢病毒的主要市场。因为该地区获批了最多的细胞疗法和基因疗法，同时，CGT 在研的临床试验阶段的疗法也最多。而亚太地区将成为预测期内增长最快的市场，主要是因为包括中国、印度在内的亚洲国家，将细胞治疗、基因治疗、疫苗等新兴技术产业作为重点投资领域，获得大量资金支持。慢病毒上游工艺开发的要点环节1用于慢病毒生产的细胞系高滴度慢病毒生产需要合适的细胞系。常用的细胞系包括人胚胎肾上皮细胞 293（HEK-293），以及衍生的 293T 细胞系。HEK-293T 具有 SV40 T 抗原，该抗原与抑制 p53 和阻止细胞内先天免疫反应的激活有关。HEK-293T 与 HEK-293 相比具有多个优势，比如倍增时间更短、转染效率更高、载体滴度更高，适合悬浮培养等。2瞬时、稳定和诱导工艺模式主要的慢病毒生产模式是瞬时转染多种质粒（用于慢病毒表达和包装）至目标细胞系。该方法最初是为了最大限度地降低感受态载体的复制风险而开发的，其经历了代际发展，也帮助提高了产量和安全性。通常，每百万个细胞至少使用 1μg 质粒 DNA。质粒与化学转染试剂共转染，未纯化的滴度通常在 106-107 TU/mL 范围内。由于转染剂的细胞毒性问题，转染后培养基更换通常是强制性的，除了增加总培养基消耗外，还需要额外的泵和存储设备来混合质粒 DNA、转染试剂和培养基。共转染过程中，许多因素都会直接或间接影响转染效率，包括质粒浓度、试剂、DNA 比例、细胞密度、孵育时间、混合方案、温度和 pH 值，且其中一些因素给放大生产带来新的挑战，载体滴度的批次间差异也无法得到稳定控制。此外，临床级质粒、转染试剂和培养基的成本大大增加了生产运行的费用。除了瞬时转染，稳定细胞系生产是另外一种选择。在这些细胞中，病毒组成性表达，不需要额外的质粒和转染试剂，只需要转移质粒的包装。这简化了上游培养，避免了去除残留质粒的成本和污染物。此外，稳定的生产细胞系产生更高质量的慢病毒颗粒，批次间一致性更佳。表：稳定和诱导生产细胞系生产细胞或包装细胞面临的最大挑战是在保持高滴度的同时控制细胞毒性或细胞抑制效应。原理上，这可以通过诱导系统缓解，但 Tet-on 诱导将需要添加四环素，必须在后续环节进行去四环素操作，而 Tet-off 诱导可能需要延长培养时间才能使表达达到峰值，并且需要完全更换培养基，这会增加很多生产成本。所以行业仍旧面临诸多挑战，我们仍需寻找更合适的生物工艺解决方案。3慢病毒载体的上游培养方法贴壁培养贴壁细胞通常在细胞培养皿或培养瓶表面培养，气体和营养物质交换需要通过培养基进行。在早期开发阶段，为了生产灵活性，目前行业多数平台在用的还是传统的贴壁，实现小规模生产。这种方法操作简易，但贴壁细胞培养存在贴壁不佳、产量或活性下降以及生成不均匀的细胞单层等问题，在细胞扩增过程中，这些影响会更加明显。因此必须全面优化培养条件，以便支持细胞生长。悬浮培养为了避开贴壁的问题，并实现放大生产，人们会将贴壁细胞驯化为可悬浮培养，如 HEK-293T。悬浮培养通常用于生产各种重组蛋白，它具有易于缩放、方便控制培养参数、取样更方便等优势。对工业化生产来说，在悬浮培养模式下，通过大体积生物反应器中培养细胞通常是最便捷的方式，可用常规搅拌式生物反应器或一次性反应袋。生物反应器中进行悬浮培养，更大限度地减少了人工操作，除了简化转染试剂，还允许灌注培养、在线监测和控制、补料自动化，现在的报道滴度可以达到 108 TU/mL。通常，细胞密度远低于贴壁，因此载体在这种方法中会自然稀释。此外，需要额外考虑初步澄清以去除悬浮细胞。HEK-293T 培养案例SciVario® twin 是 Eppendorf 针对工艺开发阶段推出的一款双联生物反应器，能够同时独立控制两个反应器系统，是一款灵活且易操作的生物过程控制器。我们用它在悬浮细胞培养中生产腺相关病毒。SciVario® twin 的设置高效而简易，与摇瓶中的细胞转染相比，可实现对细胞培养环境的精准控制，来自细胞团的 AAV2 衣壳滴度可达到约 1012 个衣壳/mL，而在相同摇瓶转染条件下只能获得约 1011 个衣壳/mL。此外，从两种分批培养工艺中获得的数据证明，使用 SciVario® twin作为控制器时，这些实验可获得良好的可重现性。❖手机扫码，免费下载《应用文献-使用SciVario® 双联生物反应器控制系统在悬浮细胞培养中生产腺相关病毒》，了解开发方法和操作细节。 猜你喜欢 ☞ AAV的自述——从发现、应用到工艺开发和生产☞ Scivario® Twin 生物反应器 — 满足不同培养工艺的所有要求☞ 外泌体的成功案例，一文读懂整个生产工艺灌注培养工艺模式细胞培养用于生产，往往需要不断扩大悬浮培养种子细胞的反应器体积，直到达到足够数量。常规工艺有分批、流加、灌流工艺等模式，不同工艺模式会影响营养物质的可用性和副产品浓度，从而影响细胞生长、活力和产品组成。其中灌流培养工艺，因其具有可以去除细胞废物、维持生产细胞的营养水平、生产率高、反应器设备规模小、产品质量高、生产成本低等优势，在细胞和生物制品的工业生产上有着广阔的应用前景。灌注培养案例DASbox® 生物反应器系统在小规模下平行筛选灌流工艺参数极具优势，可以大大节省时间和成本。本案例使用 DASbox® 生物反应器系统在工作体积为 230 ml 的小规模进行灌流培养的工艺开发。该系统适用于长时间灌流培养 CHO 和 HEK293 细胞等，细胞密度可达到 80 x 106 cells/mL。手机扫码，免费下载《应用文献-集成 ATF 装置与 DASbox® 迷你生物反应器系统用于小规模细胞灌流培养》，了解开发方法和操作细节。 猜你喜欢 ☞ 抗体药入门，如何进行大规模细胞培养工艺？☞ 如何在反应器中进行细胞 3D 成团培养☞ 如何提高悬浮或贴壁细胞的分泌产率？☞ 被忽视的CD4+T竟是隐藏的高手?!4细胞培养基和补充剂培养基的选择直接关系到生产细胞的扩增、活力以及下游工艺等。合适的血清可以优化细胞生长和载体本身的稳定性，这可能与白蛋白和脂质相关（补充白蛋白可增加载体在下游工艺中的稳定性）。然而，血清多为牛源性，这一定程度上增加了牛有关的疾病传播，以及受到全球短缺的威胁。重组人白蛋白可作为替代品，但这会增加生产成本，也会增加下游纯化工艺的压力。基于以上因素无血清培养基逐渐成为慢病毒生产的主流，其滴度与含血清培养基相当。质量研究与质量控制因为慢病毒最终用于人体，因而在放行前，需要有严格的质量研究和质量控制。质量研究是工艺优化与改进、制定整体控制策略及保证产品质量的基础，贯穿于产品的全生命周期，全面的质量研究有利于关键质量属性的确定，需随着对产品认识的深入和技术的发展不断补充和完善。质量研究需采用相应研究阶段（如非临床研究批次、临床试验批次、商业化生产批次）或适当步骤的代表性样品。质量标准需基于全面的风险分析、积累的生产和临床研究经验以及统计分析（如适用）、可靠的科学知识，并结合质量研究、稳定性研究等结果而制定。质量标准包括检验项目、检测方法与标准限度。可依据检测需求合理设置样品检测阶段，如中间样品、放行检测、留样样本等，以有效控制产品质量。检验项目一般包括鉴别、生物学活性、纯度、杂质、转基因拷贝数（如适用）、和一般检测（如 pH、渗透压、无菌、支原体、细菌内毒素、外观、明显可见异物等）、稳定性等。对于慢病毒载体来说，多采用三质粒或四质粒瞬时转染包装细胞（如 293T/17 或 293T 细胞）的方法。该系统中，含有 CAR 基因的穿梭载体、慢病毒包装辅助元件的二个或三个辅助质粒载体以及包装细胞均是制备慢病毒载体的起始原材料。但同时，对于这些含有不同目的基因的质粒来说，菌种又是质粒生产的起始原材料。如果研究者可以开发出生产慢病毒的稳转细胞株，就可以将慢病毒的起始原材料仅定义为细胞。对于使用质粒转染系统（如 Piggybac）的非病毒载体，则其起始原材料是指生产含 CAR 基因质粒的菌种。1病毒载体滴度检定γ- 逆转录病毒载体和慢病毒载体均不具有/失去了自我复制能力，因此，不能通过常规的细胞病变法（如 PFU 或 CCID50 法）进行病毒滴度的测定，而是将细胞转导的能力做为病毒载体的滴度的评定，即将病毒载体转导敏感细胞系（如 293T 细胞、HT-1080 细胞等）或原代细胞（如 PBMC）后，检测细胞 CAR 表达阳性率或 CAR 基因拷贝数，从而计算其转导滴度（TU/ml）。但由于不同的细胞对病毒载体的敏感性不同，不同的检测参数对病毒载体转导滴度结果也不同，因此，选择何种细胞、检测何种指标进行病毒载体的转导滴度的测定需要进行充分的验证，同时，鼓励研究者在临床试验过程，探索病毒载体转导滴度测定结果与转导 T 细胞所用的病毒量、CAR-T 细胞阳性率以及临床有效性之间的关系，以建立最适病毒滴度测定方法及病毒载体转导剂量。除病毒转导滴度外，还可通过检测病毒载体特定抗原或病毒基因拷贝数来检测病毒载体的物理滴度，如慢病毒载体 p24 抗原含量的检测。但由于病毒载体包装过程中可能会形成无转导效力的病毒，而这些无效力的病毒载体不能将 CAR 基因整合到 T 细胞基因组中，因而也不能产生 CAR-T 细胞，因此，为限制无转导效力的病毒载体的水平以监测病毒载体工艺的一致性，建议限定转导滴度与物理滴度的比例，即比活性。2工艺相关杂质病毒载体工艺杂质残留量的限定标准可以参考 in-vivo 方式的病毒基因治疗制剂的要求。如残余 DNA 通常使用定量聚合酶链式反应（qPCR）进行测定，而宿主细胞蛋白残留、核酸酶等可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行分析。表：慢病毒载体生物工艺中的常见杂质3病毒载体稳定性病毒载体的稳定性研究数据是制定病毒载体保存条件及有效期的重要依据，因病毒载体的生产成本较高，在研究早期，可重点开展保存温度及转导条件的病毒载体稳定性研究。保存温度可开展实时稳定性研究，而转导条件的稳定性可根据转导 T 细胞的最长时间设置稳定性研究的时间点，稳定性研究主要考查病毒载体对保存条件敏感的质量参数，如可见异物、转导滴度、无菌及细菌内毒素等，如是冻干保存的病毒载体，还需进行水分的检测等。小结在可预见的未来，随着细胞和基因治疗的临床获益凸显，临床需求增多，对慢病毒的需求被预估将会保持超过 10% 的年度复合增长潜力。对于慢病毒的生物工艺研究也日趋完善，研发初期多使用贴壁培养，临床大规模生产使用悬浮培养，便于进行工艺优化，国内外也出台了相关药学研究和质量控制的法规，以规范行业发展。生物工艺优化，需要考量培养基、添加物、细胞密度、细胞代谢等众多因素，控制更加灵活的生物反应器，选 Eppendorf。只有全产业链的密切配合，将更能推动行业的健康快速发展。参考资料:[1] Southey, F. Oxford BioMedica to capture 25–30% of lentiviral vector market by 2026. Predicts CTO, 10 December 2018.[2] lentiviral-vectors-market：https://www.persistencemarketresearch.com/market-research/lentiviral-vectors-market.asp[3] Bauler, M.; Roberts, J.K.; Wu, C.C.; Fan, B.; Ferrara, F.; Yip, B.H.; Diao, S.; Kim, Y.I.; Moore, J.; Zhou, S.; et al. Production of Lentiviral Vectors Using Suspension Cells Grown in Serum-free Media. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2020, 17, 58–68.[4] 《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》，国家药监局药审中心 2022年5月[5] 《CAR-T 细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》中国食品药品检定研究院 2018 年 6 月 5 日[6] Perry, C.; Rayat, A.C.M.E. Lentiviral Vector Bioprocessing. Viruses 2021, 13, 268_______________________________________________免责声明：Eppendorf Bioprocess 内容团队专注介绍公司产品、应用案例、全球生物药进展和活动公告等。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表 Eppendorf 立场，亦不代表 Eppendorf 支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。版权说明：本文来自 Eppendorf 内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「Eppendorf 生物工艺」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。点击阅读原文，查看 Eppendorf Bioprocess 产品相关信息