GPCR antagonist (Hope Medicine)

cAMP 检测（HTRF/TR‑FRET）：检测 Gs/Gi 通路，如何达到检测 GPCR 的目的 HTRF‑cAMP 检测如何间接检测 GPCR 活性 核心逻辑：不去直接测 GPCR 蛋白本身，而是检测 GPCR 激活后产生的第二信使 cAMP 浓度变化，反推 GPCR 受体有没有被药物激活。 Gs‑GPCR 激活 → 腺苷酸环化酶 AC 激活 → 胞内 cAMP 升高 Gi‑GPCR 激活 → 抑制腺苷酸环化酶 AC → 胞内 cAMP 下降 HTRF‑cAMP 是均相竞争免疫实验（TR‑FRET 竞争法，全程免洗）。 一、试剂盒两个核心试剂 Eu（铕）标记抗 cAMP 抗体：TR‑FRET 能量供体，激发 340 nm，发射 620 nm； d2 标记 cAMP 示踪分子：TR‑FRET 能量受体，发射 665 nm。 只有抗体结合 d2‑cAMP，供体受体距离＜10 nm，才发生 FRET，产生 665 nm 信号； 如果抗体结合细胞来源天然 cAMP，则不会产生 FRET 信号。 信号规律：665/620 比值与细胞内 cAMP 浓度成反比 cAMP 越低：更多 d2‑cAMP 结合抗体 → FRET 强，比值高 cAMP 越高：天然 cAMP 抢抗体位点，d2‑cAMP 被挤掉 → FRET 弱，比值低 二、Gαs 型 GPCR 检测流程（Gs 受体，激动剂让 cAMP 上升） 384 白色微孔板铺表达 Gs‑GPCR 的细胞；刺激缓冲液加入IBMX（磷酸二酯酶抑制剂），阻止细胞把生成的 cAMP 降解掉，保证 cAMP 积累。 加入梯度浓度待测药物（激动剂 / 拮抗剂），37℃孵育，药物作用 GPCR 受体； 如果是Gs 激动剂：GPCR 激活→AC 激活→细胞合成大量 cAMP。 裂解细胞，把胞内 cAMP 全部释放到孔中； 加入 Eu‑抗体 + d2‑cAMP，室温避光孵育； EnVision 仪器 TR‑FRET 模式，同步双发射读取 620 nm、665 nm，计算比值 = 665/620； 结果解读： 加激动剂 → cAMP 升高 → HTRF 比值下降； 加拮抗剂：可以抵消激动剂效果，cAMP 回落，HTRF 比值回升； 使用 cAMP 标准曲线，把比值换算成 cAMP 绝对浓度，拟合得到EC₅₀/IC₅₀，评价药物对 GPCR 的激活 / 抑制强弱。 三、Gαi 型 GPCR 检测流程（Gi 受体，激动剂让 cAMP 下降） Gi 受体激活会降低 cAMP，但细胞本底 cAMP 很低，很难看到 “进一步下降”，因此实验需要加Forskolin（福斯高林）：直接激活腺苷酸环化酶，人为把细胞基础 cAMP 拉高，制造一个高起点，才能观察 Gi 受体带来的 cAMP 下调效应。 铺表达 Gi‑GPCR 细胞，缓冲液含 IBMX； 每孔加入 Forskolin，预先升高胞内 cAMP；再加入梯度待测药物； 如果药物是Gi 受体激动剂，激活 Gi‑GPCR，抑制 AC 酶，抵消 Forskolin 作用 → 细胞 cAMP下降； 裂解、加检测试剂，EnVision 读 TR‑FRET 比值： Gi 激动剂起效 → cAMP 下降 → HTRF 比值升高； 对照组：只加 Forskolin 不加药物（最大 cAMP，最低比值）。 简单记忆： ✅Gs 激动剂：cAMP↑，HTRF 比值↓ ✅Gi 激动剂（Forskolin 预处理）：cAMP↓，HTRF 比值↑ 四、为什么这套实验可以评价 GPCR？ cAMP 是 Gs/Gi‑GPCR 下游直接的第二信使；cAMP 变化 = GPCR 受体功能被药物调控。不是测蛋白结合，测的是受体的功能活性（功能性筛选，不是单纯分子结合），这是药物筛选最看重的。 HTRF 时间分辨特性消除细胞、小分子化合物自发荧光干扰，信噪比高；均相免洗，适合 HTS 高通量 384/1536 孔筛选。 EnVision 的同步双发射检测 SDE同时读取 620 与 665，避免先后读数带来时间漂移，保证比值精准，得到可靠 EC₅₀/IC₅₀数据。 五、板型与仪器设置 板：白色不透光 384 孔板（HTRF 专用 OptiPlate） EnVision 模式：TR‑FRET 终点读数，激发 340 nm，发射 620 nm（供体）、665 nm（受体），计算比值。 β‑arrestin 信号检测：BRET 与 PathHunter 背景知识： GPCR 被激动剂激活，被 GRK 激酶磷酸化之后，β‑arrestin 被招募到 GPCR 胞内端。 两件事： 1）让 GPCR 和 G 蛋白脱耦联（受体脱敏、受体内吞）； 2）β‑arrestin 作为支架蛋白，可以独立启动不依赖 G 蛋白的下游信号（ERK 等），这就是 β‑arrestin 通路。 cAMP‑HTRF 只测 G 蛋白通路，完全看不到 β‑arrestin 的招募与激活。要直接看「GPCR 与 β‑arrestin 发生相互结合」，用BRET（NanoBRET）、PathHunter（酶片段互补 EFC）两种细胞水平实验，EnVision 酶标仪都可以测。 一、BRET（生物发光共振能量转移，NanoBRET 主流） 原理 BRET = 生物发光共振能量转移，不需要外部激发光。 供体：GPCR 的 C 端融合 NanoLuc 荧光素酶（加底物 Furimazine 自己发光，460 nm） 受体：β‑arrestin 融合荧光蛋白（如 YFP/Venus，530 nm 接收能量） ✅ 没有药物：GPCR 游离在膜上，距离远，几乎没有能量转移；只看到供体 460nm 发光。 ✅ 加激动剂：GPCR 激活磷酸化，β‑arrestin 被招募过来，两个标签距离 < 10 nm；NanoLuc 的能量转移给荧光受体，产生 530 nm 发光。 BRET 比值 = 受体通道发光值 ÷ 供体通道发光值 ×1000（mBU） 激动剂越强 → GPCR‑β‑arrestin 结合越多 → BRET 比值越高。 完整细胞实验流程 HEK293 细胞共转染两个质粒：GPCR‑NanoLuc、β‑arrestin‑Venus，铺白色不透光微孔板。 换检测缓冲液，加入 NanoLuc 底物 Furimazine，孵育稳定信号。 加入梯度浓度待测药物（激动剂 / 拮抗剂）孵育（几分钟～几十分钟）。 EnVision 化学发光模式，同时读取供体 (460 nm)、受体 (530 nm) 双通道发光，计算 BRET 比值。 扣除溶剂本底，做剂量‑反应曲线，得到 EC₅₀、Emax，评价药物招募 β‑arrestin 的能力。 拮抗剂表现：加入激动剂的同时加拮抗剂，BRET 比值被压低。 仪器 & 板型 EnVision：Luminescence 双通道读数；优先同步双发射 SDE； 板：全白色不透光板； 优势：活细胞实时动力学，可以看 β‑arrestin 招募的时间动态；自己构建质粒，灵活。 劣势：需要细胞转染；标签融合有可能轻微改变受体构象。 二、PathHunter（EFC 酶片段互补技术，商业化细胞系） 原理（Enzyme Fragment Complementation） β‑半乳糖苷酶拆成两段无活性片段： ProLink（PK 小肽片段）：融合在 GPCR 的 C 末端； EA（酶受体大片段）：融合在 β‑arrestin 上。 游离状态：两段分开，没有完整酶活性。 药物激活 GPCR → β‑arrestin 招募到 GPCR，PK 与 EA 被拉到空间靠近，重新组装成完整有活性 β‑半乳糖苷酶。 加入化学发光底物 Galacton‑Star，被重组酶水解，产生化学发光 RLU 信号。 ✅ 激动剂越强，GPCR‑β‑arrestin 互作越多 → RLU 发光读数越高。 实验流程（商用稳定细胞系，不需要转染） 使用现成 PathHunter 稳定细胞株（GPCR‑ProLink + β‑arrestin‑EA）铺白色微孔板。 加入梯度药物，37℃孵育（通常 90min，让 β‑arrestin 充分招募）。 直接加入 PathHunter 检测试剂（底物 + 增强液），室温孵育 60min。 EnVision 化学发光模式读取 RLU。 计算激活率，拟合 EC₅₀/IC₅₀曲线，评价 β‑arrestin 招募强弱。 仪器 & 板型 EnVision：Luminescence 终点读数； 板：全白色不透光板； 优势：稳定细胞系，操作简单，适合高通量 HTS 筛选，重复性好；不用做质粒转染。 劣势：只能终点检测，很难做快速动力学；需要购买商品化细胞。 四、为什么要同时测「G 蛋白通路（cAMP‑HTRF）+ β‑arrestin 通路（BRET/PathHunter）」 为评价偏向激动剂（Biased agonism）： G 蛋白偏向激动剂：强激活 cAMP，但是几乎不招募 β‑arrestin； β‑arrestin 偏向激动剂：几乎不激活 cAMP，但很强招募 β‑arrestin； 平衡激动剂：G 蛋白通路、β‑arrestin 两条通路都激活。 只做 cAMP 检测，你完全不知道这个药物会不会启动 β‑arrestin 介导的通路，而 β‑arrestin 通路往往和药物副作用、受体脱敏、受体内吞密切相关，现代 GPCR 药物筛选，两个通路都要评估。 五、简单记忆 cAMP‑HTRF：测 G 蛋白通路的下游第二信使（间接，看 G 蛋白有没有被激活） BRET / PathHunter：直接看 GPCR 和 β‑arrestin 蛋白有没有发生物理结合（直接检测 β‑arrestin 招募） GPCR 在细胞内信号通路怎么运转； GPCR 细胞内完整信号运转过程（细胞生物学版本） GPCR 信号分为两大分支：G 蛋白依赖通路（经典通路）、β‑arrestin 通路（脱敏 + 独立信号）。 整体流程顺序：胞外配体结合→受体构象改变→激活三聚体 G 蛋白→产生第二信使，放大信号；随后受体被 GRK 激酶磷酸化，招募 β‑arrestin，完成脱敏、内吞，同时启动不依赖 G 蛋白的信号。 第一步：受体激活（细胞膜上） GPCR 是七次跨膜蛋白，N 端在胞外，C 端在胞内；静息状态，胞内结合三聚体 G 蛋白（Gα‑GDP + Gβγ 二聚体），此时 G 蛋白无活性。 激动剂（配体：激素、神经递质等）结合 GPCR 胞外结构域，受体发生构象改变。 激活后的 GPCR 充当鸟苷酸交换因子 GEF，促使 Gα 上结合的 GDP 脱落，替换成 GTP。 Gα‑GTP 与 Gβγ 二聚体互相解离；Gα‑GTP、Gβγ 二聚体两者都可以向下游传递信号。 Gα 自带 GTP 酶活性，后期会把 GTP 水解回 GDP，让 G 蛋白回到静息状态，实现信号终止。 第二步：三大经典 Gα 下游 G‑蛋白通路（第二信使系统） ① Gαs 通路（升高 cAMP） Gαs‑GTP 激活腺苷酸环化酶 AC，催化 ATP 生成cAMP（第二信使）。 cAMP 激活PKA 蛋白激酶 A； PKA 进入细胞核，磷酸化转录因子 CREB，结合 CRE 响应元件，调控基因转录； 细胞实验检测：HTRF‑cAMP 检测、CRE 荧光素酶报告基因。 ② Gαi 通路（降低 cAMP） Gαi‑GTP抑制腺苷酸环化酶 AC 活性，ATP 生成 cAMP 减少，胞内 cAMP 浓度下降。 细胞实验特点：本底 cAMP 很低，实验需要 Forskolin 人为拉高 cAMP 基线，才能观察抑制效果。 补充：Gβγ 二聚体也可独立调控离子通道、激酶，不仅仅只有 Gα 起作用。 ③ Gαq 通路（IP3‑DAG 双信使通路） Gαq‑GTP 激活磷脂酶 C‑β（PLC‑β）；PLC‑β 切割细胞膜上脂质 PIP₂，生成两个第二信使： IP₃（三磷酸肌醇）：扩散到胞质，结合内质网膜上 IP3 受体通道，内质网释放钙离子到细胞质，胞内 Ca²⁺升高； DAG（二酰甘油）：留在细胞膜上，协同钙离子激活PKC 蛋白激酶 C，磷酸化下游靶蛋白。 细胞实验检测：IP‑One (HTRF)、钙流检测（Fluo‑4 / Aequorin 发光）。 Gα12/13 通路，主要调控 Rho GTP 酶，调控细胞骨架、细胞迁移，药物筛选相对少。 第三步：受体脱敏、β‑arrestin 招募（信号关闭 + 开启第二条独立通路） G 蛋白信号启动之后，不会一直无限传递，细胞会做脱敏处理，这一步非常关键： GPCR 被激动剂持续激活后，GRK（G 蛋白偶联受体激酶）结合受体，把 GPCR 胞内 C 端多个位点磷酸化。 磷酸化的 GPCR 会招募β‑arrestin（β 抑制蛋白）结合受体胞内尾巴。 脱敏作用：β‑arrestin 空间占位，阻挡 G 蛋白再结合受体 → G 蛋白通路停止，受体脱敏，不再响应配体。 受体内吞：β‑arrestin 作为衔接蛋白，招募网格蛋白 clathrin，把 GPCR 整个打包进入胞内囊泡（内吞）。囊泡内受体可以选择：回收回到细胞膜；或者泛素化降解。 β‑arrestin 独立信号（非 G 蛋白依赖）： β‑arrestin 不只是 “关闭开关”，还作为支架蛋白，组装 ERK、JNK 等激酶复合物，启动 MAPK 信号，调控细胞增殖、迁移、基因转录。这条通路完全不依赖 G 蛋白激活。 实验检测：G 蛋白通路测不到这条信号；需要 BRET (NanoBRET)、PathHunter 酶片段互补实验，直接检测 GPCR 与 β‑arrestin 蛋白相互结合。 第四步：信号终止（整套系统回到静息） Gα 把结合的 GTP 水解成 GDP；Gα‑GDP 重新和 Gβγ 结合，恢复静息三聚体 G 蛋白； cAMP 被磷酸二酯酶 PDE 降解（实验试剂盒中 IBMX 就是抑制 PDE，防止 cAMP 被降解）； IP3 被磷酸酶降解；胞质钙离子被泵回内质网 / 胞外； β‑arrestin 与受体解离；受体回收或者降解，整套系统复位。 文字极简通路总览 胞外配体 → GPCR 构象改变 → G 蛋白 GDP‑GTP 交换，Gα/Gβγ 解离 ├─ Gαs：激活 AC → cAMP↑ → PKA → CREB 基因转录 ├─ Gαi：抑制 AC → cAMP↓ ├─ Gαq：激活 PLCβ → IP₃(钙释放)+DAG → PKC 激活 └─ GRK 磷酸化受体 → 招募 β‑arrestin ├─ 脱敏，终止 G 蛋白信号；受体内吞（回收 / 降解） └─ β‑arrestin 作为支架，启动独立 ERK/MAPK 信号通路 通路与酶标仪 Assay 对应总结 表格 通路 检测指标 EnVision 实验方法 Gαs / Gαi cAMP 浓度 HTRF‑cAMP、CRE 报告基因（化学发光） Gαq IP1、胞内钙离子 IP‑One (HTRF)、钙流（荧光 / 发光） β‑arrestin 独立通路 GPCR‑β‑arrestin 蛋白互作 BRET(NanoBRET)、PathHunter 偏向激动剂（药物筛选概念） 部分药物可以选择性激活其中一条通路： G 蛋白偏向激动剂：强激活 Gs/Gi/Gq，几乎不招募 β‑arrestin； β‑arrestin 偏向激动剂：几乎不激活 G 蛋白，但强烈招募 β‑arrestin； 平衡激动剂：两条通路同时激活。 所以现代 GPCR 药物筛选，G 蛋白通路 + β‑arrestin 通路两套 assay 都需要做，才能完整评价药物功能。 小分子筛选激活 / 抑制 GPCR 药物完整实验设计（适配 EnVision 酶标仪，药物研发漏斗思路） 核心原则：GPCR 筛选是功能筛选，不是单纯分子结合；必须同时评价 G‑蛋白通路 + β‑arrestin 通路；区分激动剂、拮抗剂、偏向配体；从方法学验证→初筛→复筛→正交验证→选择性评价。 前期准备：构建稳定表达目标 GPCR 的细胞株（HEK293/CHO）；同时准备空载体母细胞作为阴性对照；确定 GPCR 偶联类型 Gs / Gi / Gq，选择对应初级 Assay。 筛选板型：384 孔（常规）、1536 孔（超高通量 HTS），EnVision 搭配板栈器实现批量读板。 第一阶段：方法学验证（Assay 开发，正式筛选前必做）  assay 质量评价指标（HTS 合格标准） Z’因子 ≥0.5（最重要，>0.7 优秀，＜0.5 实验不能用于高通量筛选） 信号 / 背景 S/B ≥10；孔间 CV 变异系数＜15% 使用已知阳性参考药物，测定 EC₅₀/IC₅₀，和文献数值接近，证明体系可靠。 每一块筛选微孔板都要内置对照组，用于质控。 微孔板内对照布局（384 孔板） 激动剂筛选模式（找激活 GPCR 小分子） Max 最大信号孔：已知阳性激动剂，代表 100% 激活； Min 最小信号孔：仅溶剂 DMSO，代表本底； 拮抗剂筛选模式（找抑制 GPCR 小分子） Max 孔：加入固定浓度EC₈₀的激动剂（产生 80% 最大信号）； Min 孔：不加激动剂，溶剂对照； 拮抗剂实验逻辑：待测化合物先加，孵育，再加入 EC₈₀激动剂；如果化合物有效，信号被压低。 DMSO 终浓度统一控制 0.1%‑0.5%，过高会产生细胞毒性干扰信号。 第二阶段：高通量初筛 HTS（单浓度筛选） 化合物库一般单浓度筛选，常用10 μM，快速把几十万 / 几万化合物过滤，得到初筛 Hit 命中分子。 ✅模式 A：筛选 GPCR 激动剂（寻找可以直接激活受体小分子） 铺表达 GPCR 细胞于微孔板； 加入各个待测小分子（10 μM）；对照组：Max（阳性激动剂）、Min（DMSO 溶剂）； 孵育合适时间（cAMP 一般 30‑60 min）； 裂解细胞，加入 HTRF 检测试剂；EnVision 读取 TR‑FRET 比值； 计算每孔激活率 =（样品信号‑Min）/(Max‑Min) ×100%； 阈值：激活率＞30‑40% 判定为初筛阳性 Hit。 Gs 受体：cAMP 升高，HTRF 比值下降； Gq 受体：IP‑1 升高，HTRF 比值下降。 ✅模式 B：筛选 GPCR 拮抗剂（寻找抑制受体激活小分子） 铺细胞；加入待测小分子预孵育 15‑30 min； 加入EC₈₀浓度的天然激动剂，启动 GPCR 激活； 孵育；裂解，HTRF 检测； 计算抑制率 = 1‑(样品信号‑Min)/(Max‑Min) ×100%； 阈值：抑制率＞40‑50%，判定为拮抗剂初筛 Hit。 ⚠️Gi 受体拮抗剂筛选：体系预先加入 Forskolin，再加 EC₈₀ Gi 激动剂。 初筛注意 空载体细胞平行筛选：剔除非特异性假阳性化合物（化合物本身直接改变 cAMP，和 GPCR 无关）； Z’因子不达标整板作废，重新检测。 第三阶段：复筛‑剂量‑反应曲线（确认 Hit 活性，得到 EC₅₀/IC₅₀） 初筛 Hit 会存在大量假阳性，必须做多梯度浓度，做剂量‑效应曲线。 化合物做倍比梯度稀释，10 个浓度点（例如 10 μM ~ 0.1 nM）； 重复上面激动剂 / 拮抗剂实验，每个浓度做复孔； EnVision 读取信号，拟合 S 型剂量反应曲线，得到： EC₅₀：激动剂，产生 50% 最大激活的浓度；数值越小药效越强； IC₅₀：拮抗剂，抑制 50% 信号的浓度； Emax 最大效应，区分完全激动剂 / 部分激动剂（Emax＜80% 阳性药最大效应，属于部分激动剂）。 复筛淘汰：没有浓度依赖效应的化合物，直接判定假阳性。 第四阶段：正交 Assay：同时检测 β‑arrestin 招募，识别偏向配体 只测 cAMP/IP1（G 蛋白通路）只能看到 G 蛋白激活，看不到 β‑arrestin 通路；现代 GPCR 药物，必须增加正交实验，判断是否为偏向激动剂。 二选一（EnVision 化学发光模式读取）： NanoBRET 实验：GPCR‑NanoLuc + β‑arrestin‑Venus 共转细胞；测 BRET 比值；适合机制研究，可做动力学； PathHunter（EFC 酶片段互补）：商用稳定细胞株，适合高通量复筛终点检测。 结果解读三种药物表型 平衡激动剂：G‑蛋白通路有效，同时强招募 β‑arrestin； G‑蛋白偏向激动剂：G‑蛋白通路强激活，几乎不招募 β‑arrestin；（很多药物追求，降低脱敏副作用） β‑arrestin 偏向激动剂：几乎不激活 G 蛋白，但强招募 β‑arrestin。 到此可以区分化合物是普通激动剂，还是偏向型配体。 第五阶段：排除假阳性 & 选择性评价 1、排除化合物干扰假象 细胞毒性校验：CellTiter‑Glo（ATP 发光）检测 Hit 是否杀伤细胞；细胞死亡会间接改变 cAMP，造成假阳性； 空载体细胞对照：确认活性依赖目标 GPCR 的表达；母细胞没有响应，才是真阳性。 2、靶点选择性谱（Panel 筛选） 将活性 Hit，测试一组同源 GPCR 亚型，看化合物是否只作用目标受体，不作用其他同源 GPCR，筛选高选择性分子，降低脱靶毒性。 整套筛选流程极简流程图 1.Assay 开发验证（Z’因子，阳性药质控） ↓ 2.HTS 初筛：单浓度小分子库，获得初筛 Hit ↓ 3. 复筛：梯度浓度，拟合 EC₅₀/IC₅₀，剔除无剂量效应假阳性 ↓ 4. 正交实验：β‑arrestin（BRET / PathHunter），评估偏向激动 / 拮抗 ↓ 5. 脱靶、细胞毒性、选择性 panel 评价 → 得到候选先导化合物