CGS-21680C

开发针对G蛋白偶联受体并表现出逻辑门控信号的双位纳米抗体配体偶联 希瓦尼·萨奇德夫，斯瓦纳利·罗伊，罗斯·W·切洛哈 抽象 G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的一类嵌入质膜的信号蛋白家族。这些受体参与了多种生理过程，使其成为药物开发的理想靶点。双中心配体由靶向受体直立位点的药效团和结合到独立位点的相关部分组成，具有显著潜力处理GPCR功能。本文报告了新型双中心偶联物的合成与评估，该结合体由小分子药效团激活与抗体片段（纳米抗体，Nbs）相关联的腺苷A2A受体（A2AR）。该方法利用Nbs与工程A2AR变体非直构位点的高亲和力和特异性结合，提供双中心Nb配体偶联，激发强烈且持久的信号反应。我们进一步证明，这类双中心共轭物可以通过跨越两个不同的受体原体来诱导激活。这一特性使受体对能够选择性地定向到任一受体之上，作为一种“逻辑门控”活性的形式。我们通过展示双位共轭在靶向多对共表达受体（包括不同类别的GPCR单体）中的活性，展示了其广泛适用性。此外，我们证明了这种双重靶向策略启动的信号反应与单价配体诱导的信号反应不同。利用Nb配体偶联物靶向受体对的能力，提供了一种强大的策略，具有细胞类型选择性信号传导的潜力，并对GPCR药物发现更广泛具有启示意义。 数字 介绍 G蛋白偶联受体（GPCRs）是哺乳动物细胞表面蛋白中最大的家族，是成熟的药物靶点，约占目前上市治疗药物的35%[1]。其广泛分布和多样的功能特性使GPCR成为药物开发的理想候选产品。GPCRs由多种配体激活，配体范围从小分子到肽和蛋白质。GPCR激动剂结合到受体的正体位点。该结合事件诱导构象变化，进而激活异三聚体G蛋白及下游细胞内信号级联反应。迄今为止，大多数GPCR药物发现工作都集中在靶向正构位点。此类位点在GPCR亚型中高度保守，这对识别高度特异性配体存在挑战。受体直立囊外的结合位点，也称为变构结合位点，可能在GPCR亚型之间表现出更多差异，并为生成高度特异性的结合剂提供了更好的前景[2]。然而，变构位点的结合常常无法诱导所需的信号反应。解决这一问题的一种方法是关注双位配体——即由直构和变构药基组成的分子，通过化学连接实现两个结合位点的靶向[3]。尽管双中心化合物有潜力实现选择性，但对其合理设计具有挑战性，尤其是对于通常缺乏高度明确次级结合位点的A类GPCRs。 A类，即视紫红质家族的GPCRs，是GPCR中最大的亚组，并且已被广泛研究。大多数A类GPCRs的特征是有一小块碎片暴露在细胞外空间，尽管也有许多例外[4]。其中一个代表性成员是A2A腺苷受体（A2AR），是药物开发的重要靶点。基于结构的分子结合、理性药物设计、药物化学研究和高通量筛选等方面的努力，扩展了A2AR配体的基因库[5]。这些努力催生了具有多样药理特性的新化合物;然而，仍然迫切需要新方法为配体提供所需的特异性。 特异性挑战因单个GPCRs（如A2AR）在不同组织中的表达而加剧。在一种组织中激活GPCR可能导致与在不同组织或细胞类型中激活时不同的生理反应。A2AR广泛表达于大脑、心脏、胃、膀胱、肝脏、免疫细胞和脂肪组织等组织中[6]。GPCR功能中与疾病相关的变化可能仅发生在特定的细胞亚群中。调节这些广泛表达受体功能以用于治疗的努力，可能会因药物作用在其他组织中的作用而变得复杂，导致靶点在靶点、组织外的不良副作用。解决此类并发症的一种方法是开发具有组织特异性作用的配体[7]。仅在表达两个不同靶点时发挥作用的配体，类似于“AND”逻辑门的作用，有望仅在两个靶点均表达的细胞上引发生物反应。逻辑门控活性通过使配体活性条件条件于第二标记在目标解剖部位优先表达，从而仅针对特定组织中广泛表达的受体（如A2AR）提供了可能。尽管这种方法很有吸引力，但具有逻辑门控活性的配体设计仍然具有挑战性[8,9]。 抗体及相关生物制剂因其高亲和力及能结合受体表面的能力，为GPCR药物发现提供了独特可能性[10,11]。纳米抗体（Nbs）源自骆驼科动物中仅重链抗体，因其体积小（12–15 kDa）、模块化技术支持多聚化以及高抗原结合亲和力，具有优于其他方式的优势[11–13]。此类单域抗体片段有时能结合传统单克隆抗体难以处理的GPCR表位[11]。这些特性使Nb成为组装多特异构造的理想构件。我们团队以往的研究表明，将Nbs与生物活性GPCR配体结合，这两种配体结合同一受体，提供了具有特殊且有用特性的双位共轭[14–19]。然而，这些以往的研究仅限于由肽配体结合的GPCR靶点。这些配体以逻辑门控方式作用的能力也尚未被评估。 本文介绍了一种新的半合成化学生物学方法，提供小分子-Nb偶联物，其中Nb结合系绳连接靠近作用位点的小分子激动剂，促进靶向受体激活。这些工程化的双中心小分子-Nb偶联物表现出高度有效力的A2AR激活能力，完全依赖于Nb与其细胞表面表位靶的结合。我们进一步阐述该平台，证明Nb配体共轭物可以以逻辑门控方式作用。通过将GPCR配体与靶向不同受体的Nb连接，我们产生了仅在两个靶点在单一细胞群体中共表达时表现出活性的轭射体。当配体或Nb靶单独表达时，这些轭联物不表现出活性，明确显示逻辑门控行为。该方法为组织特异性药理学提供了一条路径，对GPCR药物发现和副作用较少的疗法具有重要意义。 结果 我们团队过去针对细胞表面受体的研究主要集中于构建由Nb和中大型肽GPCR配体组成的轭联物[14–19]。在此背景下，基于结构和结构-活性关系研究，选择连接子与肽配体连接位点。连接点安装在肽末端（N或C-），位于配体与受体直立位点最紧密结合的部分远端。大多数小分子GPCR配体不具备如此明显的连接子安装位点。为克服这一挑战，我们设计了基于A2AR结构、结合腺苷类似物和激动CGS21680剂（CGS）的结构的小分子配体-Nb共轭物[20]。CGS结合A2AR的直立位点，同时将羧酸基团投射到受体的胞外前庭（见图1）。这一特性为连接子的附着提供了良好的手柄，从而构建CGS共轭物而不破坏配体激动剂特性。以往研究表明，在该位点功能化的CGS类似物仍保持强健的激动剂活性[21,22]。我们通过短聚乙二醇（PEG）将叠氮化基团连接到CGS上3）链条（S1文本中的图1和图A）。值得注意的是，这种方法能够在不改变CGS药管核心结构的情况下制备双中心共轭。 thumbnail 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图1。 工程双中心配体和受体的组成。 A）合成由Nbs和小分子G蛋白偶联受体配体（CGS）组成的轭轭物合成方案。材料与方法以及S1正文中的图A和图B提供了小分子和共轭物的详细合成方法和表征。B）受体构造的示意图。（左）未改造A2AR与CGS复合体结构（PDB： 4UG2）。（中间）表位标记（BC2、6E、ALFA）被基因移植到A2AR的N端（细胞外部分），以实现Nb识别。（正确）ALFA表位标签和Nb6E被基因植入A2AR的N端。通过Colabfold，利用Alphafold2生成了A2AR受体变异的模型（参见材料与方法）。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003424.g001 目前尚无报告有Nbs能结合A2AR的细胞外面。为便于评估靶向A2AR的CGS-Nb偶联物，我们将标记序列植入A2AR的远端N端（细胞外部分）。这些标签序列通过受体表达质粒的工程引入，由识别14mer表位标签的Nb组成（Nb）6E见图1B，右侧）[18]或串联表位标签（BC2、6E和ALFA），被其他Nb识别（图1B，中间）。这两个构造都包含ALFA表位标签[23]，即Nb阿 尔 法.植入的标签作为高亲和力锚定位点，作用于任一表位标签结合的Nb（例如Nb）阿 尔 法与A2AR-Nb结合6E-ALFA 或 A2AR-BC2-6E-ALFA）或表位肽（例如 6E 肽与 A2AR-Nb 结合）6E-ALFA）。我们假设Nb-tag相互作用会促进高亲和力配体结合，从而提高受体直体位点配体的局部浓度。这些Nb标签对此前已被鉴定，包括GPCR工程工作的背景下[14–19]。这些Nb标签相互作用的亲和力很高，K为D数值范围从纳摩尔（6E标签，BC2标签）到皮科莫尔（ALFA标签）[18,23–25]。 我们生成了嵌合配体，既结合受体直排位点，也结合高亲和力非直立（标签）结合位点;这是我们实验室此前建立的方法[14–19]。注释（注释）6E铌阿 尔 法，以及负对照NbGFP) [26]，其C末端具备sortase A识别基序（LPETG），在大肠杆菌中重组表达（见S1文本图A）。Nb C末端通过三甘氨酸功能化二苄基环辛（DBCO）探针进行位点特异性修饰，采用分选[27]。通过压力促进的叠氮化物-烔烔环加成（“点击”）反应，通过一种叠氮化物标记的CGS-叠氮化物和DBCO标记的Nbs（见S1文本中的图1和图A）共轭。我们还基于先前发表的方法（见S1文本中的图B）合成了一组肽基共轭物，其中CGS的类似物与6E表位标签肽相连[18]。通过质谱分析确认了各双中心CGS-Nb和CGS肽偶联物的身份（见S1文本中的表A和B）。对CGS-Nb的评估6E通过酶联免疫吸附测定（ELISA）与表位（6E标签）结合，发现其具有高亲和力的靶标结合能力，亲和力与Nb非常相似6E（见S1文本中的图C）这一观察表明，本研究所采用的配体连接方式并未对Nbs对表位的亲和力产生负面影响。 我们通过测量细胞内环腺苷单磷酸（cAMP）的产生情况，评估了工程受体的功能及半合成结合物诱导其激活的能力，cAMP是GPCR介导Gα的常见读数s信号。我们的检测方法采用了基于HEK293的细胞系，稳定表达感兴趣的单个A2AR受体变异，同时结合基于荧光素酶的生物传感器，实时监测受体信号传导和cAMP生成[28,29]。这些细胞系均表现出CGS的荧光团共轭染色（CGS-AZ647），其中A2AR-BC2-6E-ALFA或A2AR-Nb6E-ALFA染成最高水平（见S1文本中的图D）。我们比较了CGS与CGS-6E、CGS-Nb的激动剂特性6E，CGS-Nb阿 尔 法，以及CGS-NbGFP在表达A2AR、A2AR-BC2-6E-ALFA或A2AR-Nb的细胞系中6E-阿 尔 法。CGS治疗显示cAMP在所有受体变体中均具有浓度依赖性诱导，验证了工程受体的功能性（见图2）。将工程化的Nb和肽CGS偶联物应用于无表位标签的野生型A2AR活性较小。这一发现与先前研究一致，即不与目标受体结合的Nbs与亲和力较低的配体的联锁会显著降低激动剂活性[14,17]。表达A2AR-BC2-6E-ALFA的细胞暴露于特定CGS-Nb结合物（CGS-Nb）6E以及CGS-Nb阿 尔 法） 导致cAMP的完全活化，其效能是CGS本身的25倍（见图2B）。CGS与阴对照Nb（CGS-Nb）的共轭GFP) [26]，该表位识别不存在的表位（绿色荧光蛋白，GFP），使该共轭物在该受体处基本失活（见图2）。 thumbnail 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图2。 工程配体信号活性评估。 Nb配体共轭激活G的活性α-介导的cAMP反应在稳定表达（A， B） A2AR， （C， D） A2AR-BC2-6E-ALFA或 （E， F） A2AR-Nb 的细胞中进行评估6E-阿 尔 法。（A，C，E）配体诱导cAMP生成的代表性浓度-反应曲线。Y轴指配体添加后约12分钟记录到的cAMP峰值响应信号。反应通过每秒发光计数（cps）来量化。（B、D、F）配体诱导cAMP反应在配体添加及配体洗刷后进行的代表性动力学测量。配体添加（12 m，“配体上”）后，多余/未结合配体被移除，向细胞添加新培养基，并测量反应30分钟（“配体脱离”）。汇总和量化描述冲刷期内浓度依赖信号（曲线下面积测量，AUC）的数据见S1正文图F。数据对应于单次实验中均值±S.D.，该实验包含两次技术重复。使用三参数逻辑S形形模型生成了浓度-响应曲线。表1展示了包含3-5个生物复制的统计数据。底层数据可在S1数据中找到。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003424.g002 thumbnail 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 表1。 配体在A2AR及变体上诱导cAMP反应的活性总结。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003424.t001 在表达A2AR-Nb的细胞上也进行了类似实验6E-ALFA [18]。这里是CGS-6E和CGS-Nb阿 尔 法与CGS相比，其效力提升了30倍。相比之下，CGS-Nb6E由于该受体变异体缺少6E标签（见图2C），该变体已不再活跃。我们还将增强型GFP变体的受体构建体插入受体外胞域（A2AR-GFP）。“负对照”CGS-NbGFP共轭配体的效果优于该受体测试的其他配体，而在所有缺乏GFP的A2AR变体上则无活性（见S1文本中的图E）。这些发现证实共轭活性依赖于Nb表位相互作用，可能通过配体系留机制起作用。 配体诱导信号反应的持续时间会影响整体生物反应的强度[30]。为了确定小分子激动剂在作用位点上的Nb介导连接是否会影响信号传递持续时间，我们测量了在广泛洗刷后较长时间内的cAMP反应。简而言之，表达感兴趣受体的细胞系被刺激一段规定时间，在此期间cAMP产生达到峰值，之后激动剂被洗净。CGS诱导的cAMP反应在冲刷后持续时间相对较短，这与之前的观察结果一致（见图2）[18]。相比之下，活性CGS-Nb偶联物诱导的cAMP反应比CGS更为持久（见图2）。我们通过测量冲洗后曲线下面积（AUC）来量化信号持续时间，结果显示共轭配体与非共轭配体在作用持续时间上存在显著差异（见S1文本中的图F）。这一趋势表明，Nb对标签的亲和力可能促进了洗刷后信号的持续传递。 引入了替代工具和检测格式，进一步探讨双中心共轭的活性。基于生物发光共振能量转移（BRET）的G蛋白激活测定平台被改编用于测量A2AR的激活[31]。该方法通过测量G蛋白生物传感器的易位（GPCR激活中的近端事件）来评估配体活性，从而最大限度地减少测量下游第二信使产生方法（如cAMP）固有的信号放大效应。该BRET检测方法也应用于同一A2AR-Nb6E-用于上述cAMP实验的ALFA细胞系。使用该BRET测定法，CGS的效力与先前报告的数值[31]及测试的两种共轭物（CGS-6E和CGS-Nb）相近阿 尔 法）的效力显著更高，与cAMP测定结果一致（见S1文本中的图G）。配体诱导的BRET信号变化在整个测定过程中持续（30米），表明G蛋白激活持续受到刺激（见S1文本中的图G）。未来研究将受益于扩展BRET生物传感器测定方法，如TRUPATH或旁观者BRET，以报告配体冲刷后G蛋白激活的动态[31,32]。 评估GPCR激动剂的另一个常见问题是使用转染外源构造体的细胞系以驱动高水平受体表达。此类细胞系能提供高信噪比分析读数，但有时无法在更生理的环境中预测配体的作用。为探究该变量，我们生成了表达较低A2AR-Nb水平的细胞系6E- ALFA采用极限稀释和克隆选择。两种A2AR-Nb的表达水平6EALFA细胞系采用流式细胞术分析（见S1文本图H）[18]。高密度A2AR-Nb6E-ALFA细胞系在示踪肽下呈现强烈染色，而受体密度较低的细胞则显著（~200倍）降低。这促使我们评估受体表达较低细胞中的激动剂活性。在所有测试的共轭粒子中，CGS-Nb阿 尔 法激活的受体具有最高的效力和效力，而天然激动剂CGS和CGS-6E仅在高浓度时表现出活性（见S1文本中的图H）。这一观察表明，Nb小分子配体偶联物是受体水平较低的应用的有前景候选物，如体内常见的观察。 我们还试图测试工程化双中心配体通过双位点（标签和直立结合）机制与受体的相互作用程度（见图3A）。为评估在受体直立位点或Nb表位结合位点持续作用的重要性，我们在冲洗阶段开始时引入了竞争者（见图3B）。我们添加了游离6E肽以竞争CGS-Nb之间的相互作用6E以及A2AR-BC2-6E-ALFA（图3C）。6E竞争肽的加入导致CGS-Nb的cAMP信号迅速减弱6E通过AUC测量量化（见S1文本中的图I）。相比之下，CGS和CGS-Nb都没有阿 尔 法在相同条件下测试时，信号传递的减少如预期。CGS-Nb 信号的极快丧失6E加入6E肽后，表明双中心配体在信号响应期间无法持续与6E标签结合。 thumbnail 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图3。 冲洗信号反应的机制性研究。 A）洗净竞赛测定的示意图。配体洗脱检测使用表达A2AR-BC2-6E-ALFA的细胞进行，如上所述，并在洗脱阶段加入6E肽或黄嘌呤同系（XAC）。B）在有无竞争6E肽的情况下，稳定表达A2AR-BC2-6E-ALFA的HEK293细胞中环状腺苷单磷酸（cAMP）产生的时间周期。请注意，左右两张图中显示相同的CGS信号数据，以便更清晰地可视化。曲线数据下的量化浓度-反应面积见S1文本中的图I。C）在拮抗剂存在或缺失的情况下，cAMP冲洗反应的类似数据，XAC。请注意，左右两张图中显示相同的CGS信号数据，以便更清晰地可视化。由三个独立实验得出的激动剂效力参数总结见S1文本中的图I。底层数据可在S1数据中找到。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003424.g003 这一观察促使我们思考，工程化双中心配体是否也容易受到针对A2AR正构位点的竞争者影响。我们评估了强效A2AR受体直立拮抗剂黄氨酸同源物（XAC）对配体洗离的影响[33]。在冲刷阶段加入XAC后，CGS-Nb均为CGS-Nb6E以及CGS-Nb阿 尔 法信号持续时间略有缩短，这一现象在基于AUC测量的剂量-响应图中也可见（见S1文本中的图3D和图I）。在CGS冲洗阶段加入XAC时，信号传递也出现了类似但较轻的下降。CGS-Nb观察到的信号丢失相对较快6E以及CGS-Nb阿 尔 法表明这些双位共轭可能不会持续作用于受体的直立位点，而是在结合Nb表位和受体正构位点之间切换。类似行为此前也在针对副甲状激素受体-1（PTHR1）的双中心Nb配体偶联物研究中观察到[17]。 成功开发出靶向单一受体的双位配体，促使我们探讨该平台是否可适应处理两种不同的细胞表面蛋白（杂源共轭蛋白）。我们设想了这样一种情景：共轭物的Nb会结合到一个靶点，而连接的配体会激活在同一细胞上共表达的GPCR。我们假设异源共轭的活性取决于被Nb结合对象和配体靶向GPCR的细胞表达。这种双重依赖性将使得能够开发出表现出“AND”逻辑门控行为的共轭基因，即仅在共表达两个靶点的细胞中诱导生物反应。 我们首先将该方法应用于从不同受体类别中选取的两种不同GPCRs。A2AR属于A类GPCR，而PTHR1属于B类，其特征是参与配体识别和受体激活的大型胞外结构域[34]。我们基于上述方法，基于先前鉴定的PTHR1结合Nb（Nb）的连接合成了一组新的轭物PTHR1) [14,17]与CGS合作。CGS-Nb的生物活性PTHR1结合物通过与表达PTHR1和/或A2AR的细胞进行检测。果然，CGS-NbPTHR1仅对表达A2AR或PTHR1的细胞则不活跃（图4A和4B）。相比之下，两种受体的共表达导致CGS-Nb的生物活性强劲PTHR1 (图4C）。我们假设PTHR1和A2AR水平的绝对值和相对值变化可能导致对异异共轭反应的差异。为应对这一可能性，我们评估了CGS-NbPTHR1在受体表达水平不同、由质粒转染诱导的细胞中（图4D—4G）。CGS-NbPTHR1当使用等量质粒进行细胞转染时，诱导了强健的cAMP反应（见图4C）。还测试了质粒比例高达10：1（按w比）的比例（见图4H和S1文本表D）。采用编码A2AR：PTHR1质粒的10：1比例，CGS-NbPTHR1尽管与CGS相比，其效力仍能有效刺激cAMP反应（见图4G）。相反，当编码PTHR1的质粒水平比A2AR质粒高出10倍时，CGS-NbPTHR1显示出超过单用CGS的cAMP诱导效力（见图4D）。这些观察表明，Nb配体共轭的活性与Nb结合靶标表达水平相关。此外，Nb靶的高表达水平使异构Nb配体偶联体在相同情境下表现出超过单一配体反应的生物学活性。这些发现说明了受体共表达的原理，作为限制异源Nb配体共轭活性的手段（见图4I）。 thumbnail 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图4。 通过利用工程化双位配体靶向G蛋白偶联受体对，进行逻辑门控激活信号传导。 A–G）在与不同数量编码甲状腺激素受体-1（PTHR1）和/或A2A腺苷受体（A2AR）的质粒共转染细胞中，诱导环腺苷单磷酸（cAMP）反应的代表性浓度-反应曲线。面板A–G中的数据对应于单一代表性实验中技术重复品的平均±标准差。H）热图，描绘配体在转染不同量A2AR和PTHR1编码质粒细胞时诱导的最大cAMP反应。对应的数值数据见S1文本中的表D。I）拟议的双位配体受体依赖性活性机制。本面板中使用的PTHR1和A2AR结构均使用Alphafold2生成（参见材料与方法）。底层数据可在S1数据中找到。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003424.g004 为评估基于异源Nb配体共轭方法的适应性，我们还测量了CGS-Nb的活性PTHR1在稳定表达PTHR1的HEK293细胞系中（HEK-PTHR1，而非上述的瞬时转染）[29]，随后短暂转染A2AR-Nb。6E- ALFA（见S1文本中的图J）。非共轭配体（PTH1–34，PTH1–11以及CGS被纳入对照组，以验证受体表达和功能。与上述结果一致，CGS-NbPTHR1诱导了共表达PTHR1和A2AR-Nb细胞中cAMP生成的浓度依赖性增加6E-阿 尔 法。该共轭在未表达A2AR变异的细胞中不活跃（见S1文本中的图J）。以往针对PTHR1的Nb配体偶联物研究显示，cAMP信号高度选择性激活，且未同时诱导β-停止素招募（偏倚激动剂）[17]。其他研究表明，与大多数GPCRs不同，A2AR的激活不会刺激心脏停止蛋白招募[31]。因此，未对针对这对受体的结合物进行β停止蛋白招募分析。 我们还测试了一种异构Nb配体共轭的配置，其中Nb结合和靶向配体基的方向性相反。这里有一个弱活性的PTHR1配体（PTH）1–11）与Nb有关联阿 尔 法.选择PTH的原因1–11基于Nb配体共轭的先前判例[14]。The PTH1–11-铌阿 尔 法共轭物的cAMP诱导效力相较PTH提高了20倍1–11在共表达PTHR1和A2AR-Nb的细胞中6E- ALFA（见S1文本中的图J）。相比之下，缺乏A2AR-Nb的细胞6E-ALFA对PTH几乎没有反应1–11-铌阿 尔 法，展示了信号传递时两个靶标共表达的需求。这些发现证实了异构CGS-Nb共轭在多种条件下的活性。 尽管以往研究表明，Nb配体和PTHR1均靶向的Nb配体偶联物无法诱导受体内化，但目前尚不清楚共靶向A2AR和PTHR1的Nb配体偶联物是否会有不同的行为。为探究这一问题，我们进行了基于细胞的ELISA检测受体在受体激动剂处理后细胞表面的消失情况（见S1文本中的图K）。只有典型的PTHR1激动剂PTH1–34刺激了细胞表面PTHR1水平的下降。相比之下，PTH都不是1–11-铌阿 尔 法也不是CGS-NbPTHR1降低了细胞表面检测到的PTHR1水平。这一观察可能与之前的结论有关，即PTH的1–11-Nb共轭未能诱导β心跳停止招募[17]。同样重要的是，A2AR的激活不会显著激活β-抑制素或受体内化[31,35]。先前研究表明，针对CXCR7的双价共轭物（GPCR）可诱导靶向内化[36]，表明进一步研究将有助于揭示双价共轭在何情况下刺激靶点下调。 还测试了异源Nb配体共轭策略的进一步变体。我们构建了一个结合体，其中CGS与一种Nb结合，该Nb结合细胞表面蛋白复合体——Class I主要组织相容性复合体（MHC-I）[37]，该复合体在大多数细胞中自然表达较高水平。CGS-Nb 的应用MHC-I与表达A2AR变体的细胞共轭，导致cAMP的产生可忽略不计（见S1文本中的L图）。我们通过流式细胞术确认了高水平的MHC-I表达和Nb与HEK细胞的结合（见S1文本中的L图）。这些发现表明，高水平表达Nb结合靶点不足以确保Nb配体偶联物的活性。 还测试了连接Nb与配体的连接子的组成和长度对生物活性的重要性。我们最初选择连接剂长度是基于我们团队之前使用CGS肽偶联物的研究，其中中长PEG连接剂有效[19]。CGS-Nb共轭结合体具有不同连接子，采用上述合成方法合成（见S1文本中的图M）。我们假设较长的联动器可能缓解距离约束，而距离约束可能对共轭活动产生负面影响。连接剂与4或24单位长的聚乙二醇（PEG）构建模块线性链一起掺入。这些偶联物在共表达PTHR1和A2AR的细胞中进行了测试。本集CGS-NbPTHR1共轭在诱导cAMP反应方面表现出类似活性（见S1文本中的图M）。包含最长连接子CGS-（PEG）的共轭24-铌PTHR1与原型CGS-Nb相比，最大响应显著减少PTHR1配体共轭（见S1文本中的图M）。这种效力下降可能与较长连接体未能保持短连接剂所带来的局部浓度增强有关。 我们还探讨了Nb配体偶联物是否可以通过连接两种在不同细胞群体中表达的受体来诱导信号传导。我们共同培养了表达PTHR1（Nb靶点）或表达A2AR（配体受体）的HEK293细胞（见S1文本中的图N）。The CGS-NbPTHR1结合物未能诱导GPCR信号的细胞间激活，表明该连接机制仅在单个细胞群体同时表达两种受体时发挥作用。 在一个独立系统中评估了依赖于两种受体共表达的受体激活的普遍性。在该新版本中，A2AR与带有N端6E标签（GLP1R-6E）的类胰高血糖素肽受体在HEK293细胞中共表达。与PTHR1类似，GLP1R是一种B类GPCR，其结合者是我们群先前表征的Nb（Nb）GLP1R) [17]。我们比较了CGS-Nb6E以及CGS-NbGLP1R与GLP1R的内源肽激动剂（GLP-pep，序列见S1文本表G）[17]。在共表达GLP1R-6E和A2AR的细胞中测试时，CGS-Nb6E以及CGS-NbGLP1R诱导的cAMP反应类似于CGS（见图5）。相比之下，这些共轭在仅表达GLP1R-6E的细胞中完全不活跃（见图5及S1文本表E），这说明了异源Nb配体共轭在逻辑门控信号传递中的适应性。 thumbnail 下载： PPT幻灯片 巴布亚新几内亚大图 多伦多国际电影节原始图片 图5。 双位Nb配体轭轭至替代的G蛋白偶联受体对和信号通路。 A）示意图，展示生物电影Nb配体偶联激活GLP1R-A2A腺苷受体（A2AR）对的过程。B）配体诱导的环腺苷单磷酸（cAMP）在表达GLP1R-6E和/或A2AR的细胞中浓度反应评估。C）示意图显示双位共轭激活MOR-6E和PTHR1信号。注意，MOR激活诱导的细胞反应（如Γi激活、β-抑制素招募），而非A2AR激活介导。D） 配体诱导的Gαi2在表达MOR-6E和/或PTHR1的细胞中，激活（TRUPATH生物传感器，BRET）和E）β-抑制素招募（BRET）。数据点对应于代表性实验中技术重复±的平均值SD。来自三个独立实验的激动剂效力参数总结于S1文本中的表E和表F中。底层数据可在S1数据中找到。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003424.g005 上述例子涉及共靶向两个主要通过G信号的受体α其中一个受体来自B类GPCRs（PTHR1，GLP1R），另一个来自A类（A2AR）。我们想知道是否可以用类似的方法处理两种A类GPCRs，即主要通过Gα以外的通路信号的受体s（见下文）为评估第一种可能性，我们制造了由Nbs组成的结合物，这些结合物靶向具有N端（细胞外）6E标签（MOR-6E）的μ-阿片受体。我们通过MOR-6E和A2AR的（共）表达评估激活。我们首先评估了当Nb组分结合MOR-6E时，CGS-Nb偶联物是否能诱导cAMP反应。CGS-Nb6E确实在共表达MOR-6E和A2AR的细胞中，该活性对诱导cAMP反应具有活性（见S1文本中的图O），而仅表达A2AR的细胞中缺乏该活性。与上述例子相比，CGS-Nb诱导的cAMP反应的疗效更为显著6E低于仅有CGS的数字（见S1文本中的图O）。 我们实验室之前的研究表明，Nb配体共轭中，两个成分都靶向PTHR1，会强烈激活Gαs信号传递且不诱导β-抑制素2的招募，这是通路选择性信号传导的戏剧性例证[17]。通路选择性信号与PTH-Nb偶联体在两个不同受体原体间作用的能力相关。我们想知道，针对两种不同类型的受体是否也会导致通路选择性信号传导。为验证这一点，我们开发了靶向MOR-6E和PTHR1的Nb配体偶联物。值得注意的是，激活MOR或PTHR1已知会刺激β-抑制素的招募，尽管这些受体通过相反的G蛋白通路（Gα）发出信号我与Gαs分别是 。 我们产生了由Nb组成的共轭PTHR1以及MOR激动剂肽Dynorphin A（DynA8-Nb）的片段PTHR1，详见S1文本中的表G，关于DynA8序列），采用类似于合成Nb-TTH激动剂的方法[17]。DynA8-NbPTHR1与典型的MOR激动剂（DAMGO）、DynA8本身以及由DynA8与阴性对照Nb结合的结合物进行了比较，Nb结合了细胞表面缺失的表位（DynA8-Nb）。阴性).我们评估了DynA8-NbPTHR1在测量Gα的检测中i2激活[32]。DAMGO和DynA8在单表达MOR-6E的细胞以及与MOR-6E和PTHR1共转染的细胞中，在刺激Γγ方面表现出相似活性（见图5和S1文本中的表F）。相比之下，DynA8-NbPTHR1在仅表达MOR-6E的细胞中，其活性明显低于同时表达MOR-6E和PTHR1的细胞，后者其活性与DAMGO和DynA8相似（见图5和S1文本表F）。 还通过测量GPCR激活后质膜招募β-抑制蛋白的检测，评估了DynA8-Nb偶联物[31]。令人惊讶的是，DynA8-NbPTHR1在MOR-6E和PTHR1共表达时，其刺激β-抑制素2的效力比DAMGO或DynA8高出>10倍（见图5）。DynA8-NbPTHR1仅表达MOR-6E的细胞中，完全无活性以刺激停止蛋白招募（见图5及S1文本表F）。这些发现与以往仅靶向PTHR1的双中心Nb配体偶联结果形成鲜明对比，后者在β-停止蛋白2招募中表现为微乎其微[17]。 以进一步了解DynA8-Nb增强的β抑制素招募机制PTHR1相较于传统MOR配体，我们进行了额外的实验。我们通过转染改变编码MOR-6E和PTHR1的质粒水平，以诱导受体表达。随后，我们测量了这些转染细胞中DynA8-Nb偶联物的活性。相比PTHR1，使用较多MOR-6E编码质粒（MOR-6E与PTHR1的比例为3：1和10：1）导致DynA8-Nb活性减弱PTHR1相对于β-阿莱斯顿招募测定中的DAMGO（S1文本中的图P）。相比之下，使用更高水平的PTHR1编码质粒（MOR-6E与PTHR1的比率分别为1：3和1：10）则产生了DynA8-NbPTHR1相对于DAMGO表现出更高的活性（见S1文本中的图P）。这些数据表明，高水平的Nb靶表达导致Nb配体结合物的活性高。这些发现出乎意料，首次证明了Nb配体共轭两个受体能够强力刺激除Gα以外的通路信号传导s（Gα我以及β-停止），其活性仅超过母配体。 讨论 本研究开发的双位共轭物带来了两项重大进展。首先，我们描述了由A2AR小分子激动剂（CGS21680）制成的Nb配体共轭物（见图1）。这代表了过去研究的重大扩展，过去用于共轭合成的配体仅限于肽激动剂[14–17,38]。许多GPCR仅被非肽小分子激活[1]，这里描述的方法应有助于开发Nb配体轭联物以靶向这些受体，如上述CGS-Nb共轭物所示。其次，我们利用双位共轭通过跨越两个受体原传体诱导激活的能力，实现对单细胞表达受体对的选择性靶向（见图4和图5）。我们表明，这类Nb配体偶联体仅在Nb和配体靶共表达时表现出活性。这种双靶点依赖信号为生成仅在特定生物生态位内活性的结合物提供了有前景的途径，同时最大限度地减少靶向、组织外的副作用[39]。A2AR在不同组织中的表达[40,41]为探讨组织限制激活广泛表达受体的后果提供了机会。例如，A2AR在大脑中激活的功能效应可能与免疫细胞激活时观察到的不同[6]。CGS-Nb偶联物表现出此类研究所需的一些特性，尽管在天然组织环境中仍需进一步探索。 这些研究的一个显著观察是，CGS-Nb偶联物在工程化A2AR中诱导的信号响应持续时间更长，相较于单独CGS（见图2和图3）。这一观察表明，双位共轭的持续激活与Nb和CGS不同结合位点有关，合作相互作用导致与受体的长期结合。目前尚不清楚单个共轭物的Nb和配体组分是否同时结合，还是一次只有一个组分能结合。对连接更长的CGS-Nb偶联结合体的研究表明同时结合是可行的，但可能不是延长信号响应的重要因素（见S1文本中的图M）。对结合受体的CGS-Nb偶联物的结构研究对于解决这些问题至关重要。长效配体对A2AR具有特别的重要性，A2AR是多种疾病的成熟治疗靶点。关于人类A2AR的研究显示，配体活性在体内与受体停留时间之间存在强烈相关性。例如，长效A2AR激动剂UK-432097在治疗肺部炎症方面的强效性表明延长驻留时间可能提升治疗效果[6,42]。本研究开发的双位靶向策略为合理设计具有良好药理特性的配体提供了一种手段。 本研究中描述的方法与以往开发能够选择性定位预先指定的GPCR组装体的分子的努力有相似之处[43]。GPCR单体如A2AR在单细胞中共表达时，常与其他GPCR在膜内二聚或寡聚化[44,45]，这为开发高度特异性调节受体功能工具提供了诱人机会[46,47]。然而，设计具有GPCR二聚体或高阶寡聚体特异性的配体仍然具有挑战性。我们推断，同时利用抗体（纳米抗体）和配体结合，可以为选择性靶向GPCR异源体提供一条路径[3]。我们已经证明，这种Nb配体共轭物仅在表达两个靶点（“AND”逻辑门）的细胞上才有活性[8]。虽然这些特性可能通过传统配体设计策略实现，但Nb配体共轭的模块化可能使得更高效的扩展到新的受体对。多价共轭的原位形成提供了另一条有吸引力的前进路径[48]。 新兴证据强调GPCR组装体在介导此前分配给单个受体的生化过程中的功能性作用[46]。研究表明，GPCR组装体可由受体组成，这些受体通过相同的G蛋白通路进行信号（例如，通过Gα的A2AR-β1/β2肾上腺素能受体对）s）或通过相反的G蛋白通路（例如A2AR-D2R对，通过Gαs以及 Gα我互动）。关于GPCR组装如何整合配体刺激和环境线索以产生独特细胞反应的全面理解仍然未知。本研究了当Nb配体偶联靶向时，表达多种GPCR对（包括不同类别及不同同源G蛋白（如A2AR-PTHR1、A2AR-GLP1R、A2AR-MOR）的信号传导（见图5）。这些实验揭示了几个有趣的趋势。Nb配体添加诱导信号反应最强烈的细胞中，Nb靶向受体表达高于配体结合受体。我们还首次证明，除了Gα外，双位共轭还可以通过信号伴侣诱导信号传导s（Gα我， β-arrestin）。一个令人惊讶的观察是，一种靶向表达PTHR1和MOR的双位共軛物（DynA8-Nb）比单独的配体（DynA8）更能强健地诱导停止蛋白招募（见图5）。这些结果与以往仅针对PTHR1的双位配体偶联表现出强烈G蛋白激活且抑制素招募极少的例子形成对比[17]。这些发现提出了关于共表达GPCR对产生专门信号反应的能力的有趣问题，相较于受体单独表达的情况。这些趋势在生理学环境中尤为重要，单细胞共表达多种膜蛋白，可能扩展受体在原生细胞环境中的复杂性。 使用Nb配体偶联物进行逻辑门控受体激活，为未来研究提供了若干有吸引力的机会。例如，活化胰高血糖素家族受体（GLP1R、GIPR、GCGR）在治疗2型糖尿病和肥胖方面具有治疗效果[49];然而，这些受体在多个组织中表达[50]。组织特异性药理学对整体治疗疗效和副作用特征的贡献尚不明确。逻辑门控双位共轭物可促进基于次级细胞标记共表达的细胞类型特异性受体激活，从而实现机制性研究。我们策略的模块化和可编程特性，可能使得在体内作用部位为多种生理相关GPCRs设计配体成为可能。向生理学新领域的扩展将受益于识别与GPCR结合的Nbs的新方法[11,51–55]。还需要进一步研究设计能够跨越两个细胞（细胞间功能）来作用于异质组织中跨细胞类型的Nb配体共轭。 材料与方法 材料 指定的试剂采购自商业供应商：PTH1−34（Genscript，RP01001）、DAMGO（开门化工，编号#21553）、D-荧光素（GoldBio，LUCNA-1G）、辅腔肠素prolume purple（纳米光技术，#369-1）、CGS21680（SelleckChem，#S2153）、XAC（开曼化工，编号#23077）和THPTA（载体实验室，#CCT-1010-100）。溶剂（二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙腈、二乙醚和二甲基硫氧化物）及其他化学试剂（二异丙基甲基亚胺、二异丙基碳二亚胺、奥西玛、三氟乙酸、三异丙基硅烷）均从Sigma Aldrich采购。其他试剂则如相关图文和方法所述，在内部合成（或购买）。 细胞培养与分析 细胞培养、细胞转染及配体结合分析方法，均见S1文本。使用商业基因合成与克隆服务（Genscript）制备的质粒被用于转染细胞以表达感兴趣的GPCRs。 cAMP反应的测量（包括冲洗和竞争测定） 通过cAMP荧光素酶报告测定，通过Gs信号通路对受体激活进行了定量[28,29]。表达cAMP报告器和目标受体的HEK293细胞被蛋白酶化并植入白壁96孔平透明底板（Corning #3610）。在生物测定中使用前，细胞已培养至完全融合。在生物测定之前，已移除培养基，并去除无血清的一氧化碳2加入了含有0.5 mM D-荧光素的独立培养基。使用多孔板读器（Biotek Neo2板读器）监测10分钟，以建立稳定基线。CO中稀释的配体2-在井中加入独立介质，最终井容积为100微升。发光响应每2分钟测量一次，共计12分钟。峰值发光响应（通常测量于12米处）用于生成浓度-响应曲线。利用GraphPad Prism的三参数S形剂量-响应模型（对数对应反应）拟合浓度-反应曲线，生成EC50以及E麦克斯值。 为了测量cAMP冲洗反应，细胞被激动剂刺激，持续一段指定时间（通常为12米），如上所述（配体加持期）。此时，含有配体的培养基被丢弃。新指挥官2在所有孔中加入含有新鲜荧光素的独立培养基，并每2分钟测量一次发光反应，持续30分钟（配体脱离阶段）。对于竞争冲刷检测，实验方案如上所述，但竞争者是在配体脱离阶段加入的。冲刷测定的浓度-响应曲线通过量化冲刷阶段的发光动力学测量AUC生成。在冲刷阶段的每个时间点的不确定性测量数据被传播，以提供AUC测量的标准误差值，AUC在相关图表中以误差条表示。 生物发光共振能量转移（BRET）检测β-阻滞素易位和G蛋白运输（G）我特鲁帕斯和Gs解离） 表达目标受体的HEK293细胞被植入一个10厘米的培养皿中，使用约2,250,000个细胞，并在37°C下粘附并生长12小时。 随后，依附细胞被转染编码膜系结BRET受体质粒（rGFP-CAAX或rGFP-FYVE，1,008 ng）和RlucII结合的β-arrestin 2 BRET供体质粒（β-arrestin 2-RlucII，72 ng），如前所述，如前所述[17,31]。对于Gαs解离BRET测定，1008 ng rGFP-CAAX质粒和144 ng Gαs-RlucII质粒被转染[17,31]。 对于TRUPATH G我- 活化测定，1微克G。我TRUPATH质粒编码Gαi2，Gβ3，以及Gγ9用于转染[32]。转染细胞再培养20–24小时。转染后，细胞被重新悬浮在标准培养基中，并以密度为每孔70,000个的白色透明底96孔板中播种。生长24小时后，板化细胞在由Hanks缓冲盐水溶液组成的分析缓冲液中孵育5米，补充5 mM HEPES和1.3 μM Prolume Purple，随后加入连续稀释配体或纳米体-配体偶联物。BRET 信号通过 Biotek Neo2 板读器测量，并使用适当滤波器测量 400 和 510 nm 的发射。板式读数约需150秒，重复总计30–40分钟。每个时间点计算了每口井的BRET比值（515/410纳米）。通过使用GraphPad Prism量化BRET比率动力学测量的AUC生成了浓度-响应曲线。标准误数是通过传播每个时间点测量的标准差来计算的。 Alphafold赋能受体结构建模 在线工具ColabFold[56]实现了Alphafold2，用于预测带标记的受体和Nb受体复合物[57]。应用了默认的AlphaFold2设置，导致每个输入序列生成五个模型。所有图形均采用PyMOL生成顶级模型。在某些情况下，模型通过PyMOL中的“align”命令与相关的实验确定结构进行比对。 化学合成 关于肽和小分子的合成、纯化和分析的描述见S1文本的合成方法部分及S1文本中的图A和B。这些化合物的表征见S1正文中的表A和表B。 蛋白质表达与通过分选标记 关于使用Sortase A表达和纯化Nbs及其标记的详细内容见S1文本。Nb和Nb共轭物的质谱表征见S1正文表B。 统计分析 数据归一化仅在图例中明确提及时执行。重复数据以平均±标准差或平均±标准误表示，样本量为n。统计检验采用单向方差分析（ANOVA）评估统计显著性，并进行Dunnett事后更正。统计比较使用GraphPad Prism进行。 支持信息 补充数据、表格和方法。 显示1/3：pbio.3003424.s001.pdf 跳转到图分享导航 抱歉我们无法加载您的数据。 1 / 3 下载 图格分享 第一季文本。 补充数据、表格和方法。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003424.s001 （PDF） S1数据。 用于生成主文中显示的图形的原始数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003424.s002 （XLSX） S2数据。 用于生成图形的原始数据，显示在S1文本中。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003424.s003 （XLSX） 确认 我们感谢蒙特利尔大学的M. Bouvier和犹他大学的J. English提供用于基于RET的质粒，用于β-阿雷斯汀和G蛋白信号传导的基于BRT的检测。我们认可NIDDK（J. Lloyd）内部质谱核心设施，用于肽和轭物的表征。感谢S. Ferre（NIH）、K. Jacobson（NIH）和F. Ciruela（巴塞罗那大学）带来的有益讨论。 引用 1.张M、陈T、陆X、兰X、陈Z、Lu S. G蛋白偶联受体（GPCRs）：结构、机制和药物发现的进展。信号转导目标。2024;9(1):88.PMID：38594257 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 2.斯洛斯基轻型机枪，卡隆机枪，巴拉克长枪。偏置变构调制剂：GPCR药物发现的新前沿。《趋势药学》2021年;42(4):283–99.PMID：33581873 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 3.萨奇德夫·S，卡巴尔特贾·CC，切洛哈右翼。利用多价偶联物靶向细胞表面蛋白的策略与化学生物学。《细胞生物学方法》2021年;166:205–22.PMID：34752333 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 4.周Q、杨D、吴M、郭毅、郭W、钟L等。A类GPCRs的常见激活机制。Elife。2019;8：e50279。PMID：31855179 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 5.Jacobson KA，Gao Z-G，Matricon P，Eddy MT，Carlsson J. 腺苷A2A受体拮抗剂：从咖啡因到选择性非黄嘌呤。《布里达尔·法拉科尔杂志》。2022;179(14):3496–511.PMID：32424811 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 6.雅各布森·KA，托什·DK，贾因·S，高Z-G。临床前和临床开发中的历史及当前腺苷受体激动剂。前细胞神经科学。2019;13:124.PMID：30983976 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 7.赵Z、Ukidve A、Kim J、Mitragotri S。组织特异性药物递送的靶向策略。细胞。2020;181(1):151–67.PMID：32243788 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 8.陈Z、基布勒RD、亨特A、布什F、珀尔J、贾M等。蛋白质逻辑门的新设计。科学。2020;368(6486):78–84.PMID：32241946 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 9.奥斯廷迪SC、里纳尔迪DA、佐姆GG、韦斯特MJ、波莱特D、阿尔-塔米米K等。逻辑门控抗体对选择性作用于共表达两种抗原的细胞。纳特生物技术。2022;40(10):1509–19.PMID：35879362 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 10.彼得森·SM，哈钦斯首席大法官，胡中锋，马图尔·M，萨拉梅·JW，阿克斯罗德·F等。发现并设计了G蛋白偶联受体靶向抗体。专家观点药物分析。2023;18(4):417–28.PMID：36992620 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 11.萨洛姆·D、吴A、刘CC、帕尔切夫斯基·K。纳米抗体对G蛋白偶联受体结构生物学的影响及其作为治疗剂的潜力。Mol Pharmacol。2024;106(4):155–63.PMID：39107078 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 12.切洛哈右翼，哈曼德·TJ，维涅·C，施瓦茨·图，普洛伊赫·HL。探索纳米抗体的细胞生物化学。《生物化学杂志》2020年;295(45):15307–27.PMID：32868455 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 13.哈默斯，SMWR，博伊尔，夏普，TH。工程激动性双特异性以研究距离对表面介导补体激活的影响。《免疫学杂志》。2024;213(2):235–43. 查看文章谷歌学术 14.切洛哈右翼、费舍尔足球协会、伍德汉姆AW、戴利E、苏明斯基N、加德拉TJ等。通过纳米体系留改进的GPCR配体。国家公社。2020;11(1):2087.PMID：32350260 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 15.布拉加·埃米迪奥·N，切洛哈右翼。半合成纳米抗体-配体偶联物表现出可调信号特性，并在神经激肽受体-1处增强转录输出。《蛋白质科学》2024年;33（2）：e4866。PMID：38088474 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 16.布拉加·埃米迪奥·N，斯莫尔·BM，凯勒·阿肯色，切洛哈·右翼，温格勒·LM。纳米抗体介导的血管紧张素受体双重结合拓宽了偏置配体药理学。Mol Pharmacol。2024;105(3):260–71.PMID：38164609 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 17.萨奇德夫·S，克里默，文学学士，加德拉·TJ，切洛哈右翼。通过纳米抗体连接GPCR配体高度偏向的激动剂。国家公社。2024;15(1):4687.PMID：38824166 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 18.卡巴尔特贾·CC，萨奇德夫·S，切洛哈·右翼。纳米体-表位标签相互作用的表征及其在受体工程中的应用。ACS化学生物学，2022年;17(8):2296–303.PMID：35930411 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 19.卡巴尔特贾·CC，萨奇德夫·S，切洛哈·右翼。利用纳米抗体-表位标签对快速共价标记活细胞膜蛋白。生物结合化学 2022;33(10):1867–75.PMID：36107739 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 20.勒邦G、爱德华兹PC、莱斯利AGW、泰特CG。CGS21680与人类腺苷A2A受体结合的分子决定因素。Mol Pharmacol。2015;87(6):907–15.PMID：25762024 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 21.拉拉纳加-维拉A、托蒂KS、弗拉托JS、哈拉奇AJ、沃尼克E、拉奥H等人。新型阿仑膦酸CGS21680结合物可减少骨吸收，并在绝经后骨质疏松和炎症性骨溶解小鼠模型中诱导新骨形成。关节炎 RES THER。2022;24(1):265.PMID：36494860 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 22.雅各布森KA，潘内尔LK，吉XD，贾维斯中场，威廉姆斯中场，哈奇森AJ等。A2腺苷受体的激动剂衍生分子探针。我很懂。1989;2(4):170–8.PMID：2561548 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 23.Götzke H、Kilisch M、Martínez-Carranza M、Sograte-Idrissi S、Rajavel A、Schlichthaerle T 等。ALFA-tag 是一种高度多功能的工具，用于纳米抗体生物科学应用。国家公社。2019;10(1):4403.PMID：31562305 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 24.凌J，切洛哈右翼，麦考尔N，孙Z-YJ，瓦格纳G，普洛伊HL。一种纳米抗体能够识别E2泛素偶联酶UBC6e中14残基肽表位，从而调节其活性。Mol免疫。2019;114:513–23.PMID：31518855 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 25.布劳恩·MB，特兰克尔·B，科赫·PA，埃梅莱·F，韦斯·F，波茨·O等。头锁肽——一种新型高亲和力且多功能的肽结合纳米抗体，用于蛋白质组学和显微镜学。科学报告 2016;6：19211。PMID：26791954 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 26.基尔霍夫 A、赫尔玛 J、施密特尔斯 K、弗劳尔 C、奎 S、卡尔彻 A 等。利用纳米抗体调节活细胞中的蛋白质特性。自然分子结构生物学，2010年;17(1):133–8.PMID：20010839 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 27.布拉加·埃米迪奥·N，切洛哈右翼。分酶介导标记：在位点特异性蛋白功能化领域拓展前沿，开辟了新的研究方向。Curr Opin 化学生物学。2024;80：102443。PMID：38503199 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 28.Binkowski BF，Butler BL，Stecha PF，Eggers CT，Otto P，Zimmerman K 等。一种具有更大动态范围的发光生物传感器，用于细胞内cAMP。美国化学学会化学生物学，2011年;6(11):1193–7.PMID：21932825 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 29.切洛哈 RW、前田A、迪恩T、加德拉 TJ、盖尔曼SH。多肽药物的骨架修饰改变体内作用持续时间。纳特生物技术。 2014; 32(7):653–5. PMID：24929976 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 30.霍夫曼 C，卡斯特罗 M，林肯 A，勒尔斯 R，希尔 SJ，维舍尔 HF。配体在G蛋白偶联受体的驻留时间——为什么我们应该花时间研究它。Mol Pharmacol。 2015; 88(3):552–60. PMID：26152198 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 31.Avet C、Mancini A、Breton B、Le Gouill C、Hauser AS、Normand C 等。效应膜易位生物传感器揭示了100个治疗相关GPCRs的G蛋白和βarrestin偶联谱。Elife。 2022; 11：e74101。PMAD：35302493 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 32.Olsen RHJ、DiBerto JF、English JG、Glaudin AM、Krumm BE、Slocum ST 等。TRUPATH，一个用于探测GPCR换导体的开源生物传感器平台。自然化学生物学，2020年; 16(8):841–9. PMID：32367019 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 33.雅各布森·KA，乌克纳·D，柯克·KL，达利·JW。[3H]黄氨酸胺与1,3-二丙基-8-苯基黄黄同系：腺苷受体的受体拮抗剂放射配体。1986年美国国家科学院院刊;83(11):4089–93.PMID：3012550 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 34.切洛哈右翼，盖尔曼短腿，维拉尔达加，J-P，加德拉，TJ。PTH受体-1信号机制见解及治疗前景。内分泌自然牧师。2015;11(12):712–24.PMID：26303600 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 35.泽祖拉·J，弗赖斯穆斯·M。A（2A）腺苷受体：具有独特特征的GPCR？《布里达尔·法拉科尔杂志》。2008;153 Suppl 1（Suppl 1）：S184–90。PMID：18246094 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 36.潘斯·K、格拉梅斯帕彻·JA、伯恩斯二世、萨朗桑·F、塞拉诺·J-AC、科顿·AD等。模块化细胞因子受体靶向嵌合体，用于细胞表面和细胞外蛋白的靶向降解。纳特生物技术。2023;41(2):273–81.PMID：36138170 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 37.多曼斯卡·K、范德哈根·S、斯里尼瓦桑·V、帕登·E、杜普·F、马尔克斯·JA等。一种被纳米体捕获的结构域交换二聚体的淀粉异源β2-微球蛋白变体的原子结构。2011年美国国家科学院院刊;108(4):1314–9.PMID：21220305 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 38.切洛哈右翼，费舍尔足协，加德拉TJ，普洛伊HL。通过间接抗体介导的配体连接激活G蛋白偶联受体。RSC化学生物学，2021年;2(6):1692–700.PMID：34977584 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 39.Simic MS、Watchmaker PB、Gupta S、Wang Y、Sagan SA、Duecker J 等。编程组织感应T细胞，将治疗药物传递到大脑。科学。2024;386（6726）：eadl4237。PMID：39636984 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 40.彼得弗伦德 RA，麦考林 M，古塞拉 J，芬克 JS。人类A2a腺苷受体基因的表征与表达。《神经化学杂志》。1996;66(1):362–8.PMID：8522976 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 41.王M、李Z、宋毅、孙Q、邓L、林Z等。腺苷A2A受体的遗传标记揭示了其在脑区的异质表达。前神经神经分析。2022;16:978641.PMID：36059431 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 42.霍瑟尔 JD、郭 D、萨尔达 S、谢泼德 RJ、陈 H、Keur W 等。由缓慢解离动力学驱动的腺苷A2A受体激动剂持续效应的结构-活性关系。Mol Pharmacol。2017;91(1):25–38.PMID：27803241 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 43.Newman AH， Battiti FO， Bonifazi A. 2016 Philip S. Portoghese 药物化学讲座：设计用于G蛋白偶联受体的双价或双位分子。整体大于部分之和。医学化学杂志 2020年;63(5):1779–97.PMID：31499001 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 44.阮KDQ、维格斯M、塞法E、塞帕拉S、胡佛JP、肖嫩巴赫NS等。人类腺苷A2A受体的同源寡聚是由内在无序的C端驱动的。Elife。2021;10：e66662。PMID：34269678 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 45.Ferré S， Ciruela F， Casadó V， Pardo L. G蛋白偶联受体的寡聚化：仍然存疑吗？2020年《分子生物学研究进展》;169:297–321.PMID：31952690 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 46.戴尔 NC，约翰斯通 EKM，普弗莱格 KDG。GPCR异源体：其分类、功能及生理相关性的概述。前叶内分泌醇（洛桑）。2022;13:931573.PMID：36111299 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 47.刘武、王D、王L、胡S、江毅、王毅等。受体二聚体与偏置配体：靶向G蛋白偶联受体的新策略。药物。2025;269:108829.PMID：40023322 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 48.萨哈耶稣会士，切洛哈右翼。通过纳米抗体结合的化学诱导二聚化促进原位配体组装和按需激活GPCR。JACS Au。2024;4(12):4780–9.PMID：39735930 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 49.雅斯特雷博夫·AM，卡普兰·LM，弗里亚斯·JP，吴Q，杜Y，古尔布兹·S等。三激素受体激动剂逆肽治疗肥胖——一项二期临床试验。2023年《N Engl J Med.》;389(6):514–26.PMID：37366315 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 50.德鲁克DJ。胰高血糖素样肽1的作用机制及治疗应用。细胞甲基。2018;27(4):740–56.PMID：29617641 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 51.麦克马洪C、拜尔AS、帕斯科卢蒂R、韦格雷基M、郑S、翁JX等。酵母表面显示平台，用于快速发现构象选择性纳米体。自然结构分子生物学，2018年;25(3):289–96.PMID：29434346 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 52.克罗尔 PJ、范 J、杨 H、范戴克 D、安 Z、金 KB 等。利用悬浮细胞进化方法发现靶向多通跨膜蛋白的抗体。细胞代表法。2023;3(3):100429.PMID：37056366 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 53.施利姆根RR、彼得森FC、赫克斯R、斯米特MJ、麦考维JD、沃尔克曼BF。细胞外GPCR纳米抗体选择性和拮抗性的结构基础。国家公社。2024;15(1):4611.PMID：38816420 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 54.余志、库马尔·A、张X、马丁·C、范·霍尔斯贝克·K、赖亚·P等。纳米抗体拮抗剂靶向μ阿片受体的结构基础。国家公社。2024;15(1):8687.PMID：39384768 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 55.丰丹·T、布施·A、拉埃尔曼斯·T、德·塞斯科·S、梁永荣、雅科拉·V-P等。人类黑色素皮质素-4受体特异性直立纳米抗体激动剂的结构阐明。国家公社。2024;15(1):7029.PMID：39353917 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 56.Mirdita M、Schütze K、Moriwaki Y、Heo L、Ovchinnikov S、Steinegger M. ColabFold：让蛋白质折叠普及。自然方法。2022;19(6):679–82.PMID：35637307 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 57.萨奇德夫·S、罗伊·S、萨哈·SJ、赵G、库马里亚·R、克里默·BA等。AlphaFold建模用于阐明纳米抗体-肽表位相互作用的评估。《生物化学杂志》2025年;301(7):110268.PMID：40409557 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术