Zelatriazin

一、论文介绍题目： Ultra-large virtual screening unveils potent agonists of the neuromodulatory orphan receptor GPR139 研究导语 孤儿GPCR的一大现实难题，并不是缺少潜在药理价值，而是缺少足够可靠的化学工具去验证它究竟“能不能成药”。这项研究把GPR139作为测试对象：研究者以已有的GPR139冷冻电镜结构为起点，用DOCK3.7对2.35亿个类先导化合物进行分子对接，从68个实际合成并测试的候选物中获得5个较强的完全激动剂，再围绕最佳命中物进行结构指导优化。最终，团队获得纳摩尔级GPR139激动剂，并用细胞药理、冷冻电镜和小鼠实验逐级验证。值得注意的是，作者还专门测试了AlphaFold3能否替代实验结构支持这类虚拟筛选，结果反而揭示了AI面对缺少近邻训练样本的孤儿GPCR时仍然存在明显边界 二、 研究背景与核心问题 GPCR是药物研发中最成熟的靶点家族之一，但成熟并不意味着所有成员都已经得到充分开发。仍有超过100个非嗅觉GPCR被归入孤儿受体，即其内源性激活配体尚未得到确定。对于这些受体，真正限制后续研究的往往是缺少可靠的药理学工具。没有高质量激动剂或拮抗剂，就很难进一步拆解信号通路，更难通过体内实验判断受体是否具有治疗价值。传统高通量筛选在这一类靶点上并不总能获得好的起始骨架，一些既往报道的孤儿受体配体还存在难以重复的问题。 GPR139正处在这样的尴尬位置。它主要表达于中枢神经系统，在与运动、认知、情绪、行为和奖赏有关的脑区中出现，尤其在缰核中具有较高表达。已有遗传学、动物研究和药理学证据使它受到神经精神疾病研究者关注，但其生理功能仍没有完全厘清。此前开发的GPR139激动剂TAK-041甚至已经进入临床研究，但针对精神分裂症和重度抑郁障碍快感缺失的Ⅱ期研究没有达到主要疗效终点。这意味着GPR139并非一个已经完成临床验证的成熟靶点，而是一个仍需要更好化学探针重新审视其生物学与治疗潜力的靶点。 转折来自结构生物学。GPR139与合成激动剂JNJ-63533054结合的冷冻电镜结构已经获得，使研究者第一次能够比较清楚地看到正构结合口袋的位置、形状和关键相互作用。作者因此提出一个很实际的问题：与其继续依赖传统实验筛选，能否直接利用受体的高分辨率结构，在数亿级可合成化学空间中寻找新的GPR139激动剂，再通过实验逐步把计算命中推进成真正可用的药理工具？ 这个问题背后还有另一层意义。AlphaFold3已经能够预测蛋白质与小分子复合物，如果它给出的孤儿GPCR结合模式足够可靠，未来甚至可能绕过昂贵的冷冻电镜或晶体结构解析。因此，这篇论文实际上同时比较了两条路线：一条是“实验结构加超大规模分子对接”，另一条是直接依赖深度学习预测受体—配体复合物三、 研究数据与核心方法 这项研究没有传统机器学习任务中的训练集、验证集和测试集划分。筛选空间来自ZINC15数据库的lead-like子集，限定分子量不超过350 Da、cLogP不超过3.5。整个库超过2.35亿个商业可获得化合物，其中约2.28亿个成功完成对接。研究者使用GPR139与JNJ-63533054复合物的冷冻电镜结构作为筛选模板，以DOCK3.7搜索正构结合位点。平均每个分子评估3933种取向，每种取向又评分约178种构象，整个筛选累计评分超过200万亿个复合物。 筛选并没有简单地把对接分数最高的分子送进实验。作者先提取排名前30万个分子，再排除PAINS结构以及与ChEMBL已知GPR139配体高度相似的化合物，随后按照拓扑结构聚类。在形成的13106个簇中选取代表分子，再人工检查排名靠前的1500个簇中心，最终只留下68个候选物进行合成和体外药理测试。也就是说，从2.35亿规模的初始空间到68个真实实验对象，计算筛选将实验范围压缩了约六个数量级。 68个候选物首先进入稳定表达人GPR139的CHO-K1细胞体系，通过钙动员实验检测Gq/11通路激活，并使用M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体进行反筛以排除非特异性作用。命中物进一步接受IP1累积实验验证。随后，研究者选择最有潜力的compound 1继续优化，从Enamine REAL约340亿分子的化学空间中搜索其类似物，得到7574个候选类似物，其中44个被实际合成和测试。 整个流程并没有停在虚拟筛选。优化得到的compound 1.1进一步接受多种G蛋白、钙动员和arrestin-3募集实验，并通过冷冻电镜直接观察其与GPR139的结合模式。考虑到1.1(S)代谢稳定性较差，动物实验又选择同系列中药代性质更合适的1.5(S)，通过小鼠开放场实验和脑/血浆暴露测定评价体内作用。与此同时，作者使用AlphaFold3预测GPR139以及另外5个未进入其训练集的孤儿GPCR小分子复合物，以实验结构作为参照检验AI模型能否真正承担结构筛选的起点四、 主要发现1. 2.35亿规模虚拟筛选最终获得5个具有明确剂量反应的GPR139激动剂 68个计算优选化合物在10 μM浓度下接受初筛，其中14个产生超过参考化合物25%的钙动员响应，并且在M1受体反筛中没有表现出相同激活作用。继续进行浓度梯度测试后，compound 1—5成为最有活性的5个候选物，其钙动员实验EC50分布在160 nM至3.6 μM之间，Emax达到参考化合物Lundbeck Cmp 1a的70%—100%。 其中compound 1和2的EC50分别达到160 nM和320 nM，前者已经与Lundbeck Cmp 1a的200 nM处于同一量级。正交IP1累积实验虽然整体给出了较低的效力，但5个化合物的活性排序基本保持一致。更重要的是，compound 1—4与ChEMBL中已有GPR139配体的结构相似性较低，compound 2—4的最大Tanimoto相似系数低于0.30，说明超大规模筛选并不只是重新找到已有化学系列，而是拓展了GPR139可利用的化学空间。 2. 从初始160 nM命中物继续优化，得到50 nM级compound 1.1 作者没有把虚拟筛选命中作为终点，而是围绕EC50为160 nM的compound 1继续开展两轮结构指导优化。从数十亿级make-on-demand化学空间中找到7574个类似物，最终选择44个进行合成和实验评价。除compound 1.36外，其余类似物均能够激活GPR139，41个产生较强响应的类似物进一步完成浓度—反应曲线测定，EC50覆盖50 nM至5 μM。 构效关系逐渐明确：compound 1核心中的1,2,4-噁二唑环对活性尤其重要，而末端芳香环的取代位置能够明显改变效力。其中compound 1.1的EC50达到50 nM，相比初始compound 1提高约3倍；compound 1.2同样达到50 nM。进一步与Lundbeck Cmp 1a、JNJ-63533054和TAK-041比较后，compound 1.1在钙动员和IP1实验中表现出很强的激动活性，尤其值得注意的是，它在两种实验中的效力均达到50 nM。 3. 冷冻电镜直接验证了计算预测的结合模式，而不是让对接结果停留在假设层面 这是这项工作中非常关键的一层验证。研究者解析了GPR139—compound 1.1—mini-Gs/q—Nb35复合物的冷冻电镜结构，整体分辨率达到3.2 Å。配体密度更支持S构型，即1.1(S)。实验结构与此前分子对接给出的结合模式具有较好一致性，配体RMSD为2.9 Å，预测正确捕捉到了phenethylamide和1,2,4-oxadiazole基团所占据的区域。 实验结构同时补充了对接难以完全描述的细节。1.1(S)与JNJ-63533054虽然结合在同一总体口袋中，但具体极性作用网络并不完全相同；1.1(S)的噻吩基还进入了由TM6和TM7构成、JNJ-63533054没有占据的空间。这些结构信息不仅证明计算筛选确实抓住了合理结合模式，也为后续围绕该骨架继续优化药代性质和选择性留下了明确的结构依据。 4. 拆分对映体后，1.1(S)达到个位数至百纳摩尔活性，并揭示此前未报道的G12偶联 由于前期类似物筛选主要使用外消旋混合物，作者随后分别合成compound 1.1的S、R对映体，并与JNJ-63533054的两个对映体进行系统比较。检测范围不再局限于单一Gq通路，而是覆盖Gi2、Gi3、GoA、Gq、G12、细胞内钙动员以及arrestin-3募集。 1.1(S)在所有这些信号检测中均表现出明显活性，其刺激不同GPR139信号通路的EC50为13—200 nM，相比1.1(R)强13—63倍。在稳定表达GPR139的CHO-K1细胞钙动员实验中，1.1(S)的EC50进一步达到8 nM。作者据此将其视为目前已报道最强效的GPR139激动剂之一。 这组实验还有一个额外发现：GPR139能够产生明显的G12蛋白偶联，此前这一信号联系尚未被报道。因而1.1(S)不仅是一个优化后的候选化学骨架，也成为研究GPR139多通路信号行为的新药理工具。不过这些结果主要来自工程化细胞体系，G12偶联在原生细胞和真实神经系统中的生理意义仍需进一步验证。 5. 动物验证没有直接使用最强的1.1(S)，而是换成药代性质更合适的1.5(S) 这一步很好地体现了“体外效力最高”与“适合进入体内验证”并不是一回事。1.1(S)虽然活性很强，但在小鼠肝微粒体中的代谢稳定性很差，内在清除率达到1369 μL/min/mg，动力学溶解度为13 μM。因此研究者转而选择同系列的1.5(S)，其外消旋体代谢稳定性和溶解度更适合动物实验。 小鼠以30 mg/kg腹腔注射1.5(S)后，在开放场实验中的总移动距离显著下降，与参考激动剂JNJ-63533054产生相似趋势；同时，小鼠在场地外围停留的比例增加，作者将其解释为焦虑样行为增加。两种行为变化在给药后10—20分钟较明显。每组包含8只小鼠。 给药1小时后，1.5(S)在血浆中的总浓度为8.0 ± 2.2 μM，在脑组织中达到4.8 ± 1.0 μM，单时间点脑/血浆总浓度比为0.67 ± 0.15，说明该分子能够进入脑组织。这里需要保持边界：研究证明的是1.5(S)具有脑暴露并伴随行为学变化，并不能据此认定它已经具有治疗神经精神疾病的疗效，更不能把开放场结果等同于疾病模型中的药效验证。 五、 研究价值、局限与总结 这项工作的价值不只是“筛出了一个活性更强的分子”，而是把结构导向虚拟筛选真正走完了从超大化学空间到实验验证的多个关键环节。2.35亿个初始候选经过计算压缩至68个实际合成化合物，再从命中物进入类似物搜索、构效关系优化、细胞功能验证、冷冻电镜结构验证和小鼠体内研究。对于实验筛选困难、已知配体有限的孤儿GPCR，这种路线展示了实验结构如何直接转化为化学起点。 同时，这篇论文对“AI能否替代实验结构”给出了一个相当克制的答案。AlphaFold3预测1.1(S)—GPR139复合物时表现不错，配体RMSD为2.7 Å，但GPR139相关结构已经进入AF3训练数据。作者因此又测试了5个训练集中没有相应结构的孤儿GPCR复合物，AF3只有1例达到相对合理的预测水平，配体RMSD为3.4 Å；另外4例中，有1例虽然找到正确口袋但配体RMSD达到5.7 Å，其余3例甚至把配体放到了正构口袋之外，RMSD达到6.3—20.3 Å。这意味着对于真正缺乏结构先验的孤儿受体，目前还不能默认深度学习预测结构足以替代高质量实验复合物结构。 从候选药物研发的尺度看，这项研究距离真正的候选药物仍有明显距离。首先，最强的1.1(S)具有较差的小鼠肝微粒体稳定性，作者不得不使用1.5(S)完成体内研究，这本身说明高受体活性尚未转化为理想的综合成药属性。其次，动物实验只进行了30 mg/kg单剂量开放场行为测试，每组8只动物，并非精神分裂症、抑郁症或其他疾病模型中的治疗效果评价，也没有建立完整的剂量—暴露—效应关系。 选择性方面同样需要继续推进。研究使用M1受体反筛支持命中物并非简单造成非特异性钙信号，但这远不能等同于完成系统性的GPCR谱或全靶点选择性评价。对于中枢神经系统候选物，后续还需要更全面的脱靶筛查、安全药理、ADME和PK研究。作者也明确指出，进一步优化compound 1.1骨架时需要同时考虑药代动力学性质和靶点选择性。 此外，GPR139本身仍然属于生理功能尚未完全明确的孤儿受体。TAK-041此前的Ⅱ期临床研究未达到主要疗效终点，因此发现更强的GPR139激动剂并不意味着靶点的临床有效性已经得到重新证明。本文更准确的贡献，是提供了一组更有力的化学探针和结构依据，让研究者能够继续回答“GPR139究竟参与哪些生理过程，以及怎样调控它才可能产生治疗价值”