FMP-013

摘要：在当前形势下，免疫接种至关重要，因为它使我们免受传染病原的侵害，保护我们的安全。尽管疫苗学领域取得了巨大成功，但我们仍需开发安全、理想的疫苗来对抗致命感染，同时提高现有疫苗的质量，解决部分或不一致的保护问题。一般来说，亚单位疫苗在本质上是安全的，但大多数情况下它们未能产生最佳的免疫反应。因此，通过新型佐剂的配方，有很大的可能性提高疫苗的潜力，有效传递卓越的免疫力。与新型佐剂配方的疫苗也可能有助于对抗高度抗原多样性的病原体。然而，由于安全性和毒性的限制，很少有适合人类的佐剂获得批准。在这篇综述中，我们主要关注新型和改进疫苗的需求；佐剂的定义和需求；适合人类的佐剂的特征和机制；疫苗佐剂、粘膜疫苗佐剂和临床开发中的佐剂的现状；以及未来的发展方向。 引言：疫苗的发明被认为是医学研究的一项重大成就。免疫接种不仅阻止了儿童期间感染的传播，而且为某些疾病提供了一生的保护。然而，科学界在开发针对许多传染病的理想疫苗方面仍然面临挑战，例如瘟疫、结核病、疟疾、人类免疫缺陷病毒（HIV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2），这是由于免疫学障碍，如对疫苗的不充分免疫反应和较弱的免疫记忆。除了这些障碍外，疫苗安全问题，如在患有罕见遗传性疾病的人群中的不良影响、由白喉毒素和破伤风毒素以及全细胞百日咳（DTwP）引起的系统和局部反应原性，以及白喉毒素和破伤风毒素与无细胞百日咳（DTaP）一起显示出的逐渐减弱的免疫力，被认为是不可接受的，这进一步增加了解决新兴或再次出现的疾病威胁的疫苗问题的挑战。这些挑战需要新的战略，可以帮助理解免疫接种的免疫反应，并引入新的方法来在不牺牲质量和安全的情况下诱导强大的免疫力。最近，全世界科学界见证了重大的疾病爆发，即2003年的SARS、2009年的H1N1流感大流行、2014年的埃博拉病毒、2017年马达加斯加的瘟疫、2018年印度的尼帕疫情，以及迄今为止最引人注目的COVID-19大流行。2014年，埃博拉疫情在发达国家造成了巨大的恐慌，因为在西非国家的死亡率相当高。这些事件迫使科学界不仅要保持警惕，还要开辟新的途径，追求新的战略，以阐明开发针对这些新兴病原体的有效疫苗的机制方法。目前，正在进行的COVID-19大流行严重影响了全球人类的生活，破坏了全球经济；因此，广大科学界正忙于开发针对SARS-CoV-2的有效和安全的疫苗。目前，灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗是人类可获得的四种疫苗类型。减毒活疫苗包含可以复制的整个病原体，能在宿主体内诱导强烈的免疫反应。减毒活疫苗已被观察为对抗脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹（MMR）、水痘、流感、轮状病毒和黄热病最有效。灭活全病原体疫苗通过热或化学方法灭活[灭活脊髓灰质炎（Salk）和甲型肝炎]，是非传染性的，大多是安全的。灭活（杀死）疫苗已被观察为诱导弱和短期的免疫力，因此需要加强剂以达到完全保护。研究发现，来自印度的DTwP，这是一种获得许可的灭活疫苗，绕过了逐渐减弱的免疫力，显示出长期的保护效果。与灭活全病原体疫苗类似，纯化或重组亚单位疫苗不包含病原体的活体组分，但只包含病原体的抗原部分，这使它们与前者不同。亚单位疫苗抗原的免疫原性较差，因此需要添加组分以增强其保护性免疫力。亚单位疫苗有时使用表位，这些表位已被证明可以识别并与T细胞或免疫球蛋白相互作用。亚单位疫苗在毒性和反应原性方面通常被记录为安全，因为亚单位疫苗包含纯化或重组抗原，而不是整个细胞。有几个非常成功的亚单位疫苗例子，如乙型肝炎病毒（HBV）、流感病毒（注射）和百日咳疫苗。开发的亚单位疫苗被发现免疫原性较差，因此，需要多次加强剂和适当的佐剂化来增强其保护潜力。最近，在COVID-19大流行期间，mRNA疫苗（核酸疫苗）发挥了重要作用。这些基于mRNA的疫苗通过指导抗体的产生提供良好的免疫反应，从而预防严重的并发症。 对佐剂的需求 佐剂最初是在1920年由法国科学家加斯顿·拉蒙（Gaston Ramon）发现的，他在研究中观察到疫苗中加入铝盐可以增强其潜力。"佐剂"一词源自拉丁语单词adjuvare，意为“帮助”。佐剂通常不具有免疫原性，但它们与疫苗配方一起调节免疫反应，从而不仅减少了疫苗所需的剂量，还延长了免疫记忆。通常情况下，疫苗与适当的佐剂配方，以增强对接种疫苗抗原的免疫反应，评估阻止传染的潜力。佐剂另一个重要作用是指导体液和细胞介导的免疫反应，产生针对病原体的特异性免疫。目前，佐剂被利用（a）增强对给定疫苗的免疫反应，增强抗体反应以及接种疫苗的接受者数量；（b）提高因年龄、疾病或治疗干预（例如，使用佐剂MF59与流感疫苗结合，以改善/增加老年人的反应）而反应减弱的个体的血清转化率；以及（c）减少疫苗抗原的剂量和加强剂的数量，因为佐剂的能力，允许用相当低的疫苗抗原量实现相当的反应，在疫苗生产设施有限且公众普遍急需免疫的地区可能至关重要。对需要多次加强剂的疫苗的需求在全球范围内提出了值得注意的挑战。佐剂可以减少提供完全保护所需的加强剂数量（图1）。将疫苗与佐剂配方的另一个原因是实现免疫反应的质量调节。佐剂在未开发的疫苗中使用更为广泛，以调节疫苗抗原未加佐剂时不能有效刺激的免疫反应类型。佐剂用于临床前和临床研究（i）提供功能适当的免疫反应（例如，体液或细胞的，Th1、Th2和Th17）；此外，已观察到平衡的Th1/Th2/Th17反应增加了T细胞反应的持续时间并延长了小鼠的存活时间；（ii）增强长期记忆细胞（例如，T细胞记忆）；（iii）提供在大流行中可能至关重要的初始快速反应；以及（iv）修改反应的广度、特异性或亲和力（图1）。在这篇综述中，我们的主要目标是关注使用各种佐剂调节免疫反应。 图1 疫苗佐剂及其益处的示意图 铝盐（明矾）的特性和作用机制 铝盐已被临床批准，是人体疫苗中最广泛使用的佐剂。这些佐剂由磷酸铝和氢氧化铝的沉淀物组成，用于吸附疫苗抗原。Brenntag Biosector、Chemtrade和SPI Pharma™是一些准备这些配方的制造商。 铝盐（Alum） Alhydrogel®、Rehydragel™和AdjuPhos®是市场上可获得的铝盐的商品名。作为疫苗佐剂的铝盐已在疫苗研究中使用了80多年，并且通常刺激Th2型的免疫反应。铝盐已被批准作为许可的人类疫苗的成分，例如b型流感嗜血杆菌（Hib）、甲型和乙型肝炎病毒、破伤风、脑膜炎病毒、人乳头瘤病毒（HPV）、白喉，以及最近的SARS-CoV-2。铝盐作为佐剂的作用机制几乎已知，现在清楚的是，沉积物形成不是铝盐作为佐剂活性的必要步骤。作为佐剂的铝盐主要激发先天免疫。铝盐刺激B细胞分化以增加抗体产生。也有充分文件记录表明，铝盐在小鼠中刺激Th2型的免疫反应，但在人类中，几乎所有与铝盐佐剂配方的疫苗抗原都诱导混合型反应，即Th1和Th2。铝盐触发NLRP3炎症体在体外用脂多糖（LPS）对巨噬细胞和树突细胞（DCs）进行初次刺激后表达白介素（IL）1b。然而，在体内，铝盐的佐剂性并不支持数据。已观察到铝盐刺激Th2型的免疫反应，并产生IL-4、IL-5、IgG1和IgE。铝盐执行的另一种功能活动是通过使用DCs启动信号级联，以执行肌动蛋白介导的吞噬作用，导致激活两个激酶蛋白（Src和Syk），进而动员Ca2+并最终激活转录因子NFAT（钙调磷酸酶-活化T细胞核因子），从而产生IL-2。此外，铝盐通过激活补体蛋白的级联来介导其佐剂性。作为佐剂的铝盐由于其安全性、疫苗抗原稳定化以及调节高产量和持久抗体效价的高度优势。与铝盐佐剂配方的疫苗不能被过滤灭菌、冻干或冷冻。 乳液形式的佐剂（油包水） MF59和AS03佐剂 MF59是一种非常安全有效的油包水乳液，由角鲨烯油制成。与Freund佐剂不同，角鲨烯更容易代谢，并且为疫苗开发而高度纯化。最近，MF59已作为老年人流感疫苗的重要组成部分，由Fluad™（Seqirus，墨尔本，澳大利亚）授权，并且后来也在婴儿和儿童中成功使用。除此之外，它还被授权作为针对H1N1大流行疫苗在儿童、婴儿和孕妇中使用。从研究结果中可以看出，含MF59佐剂的三价灭活流感疫苗（TIV）在婴儿中引发了比不含MF59佐剂的流感疫苗更强的体液和细胞免疫反应。MF59的配方显著调节了婴儿流感疫苗的弱效。随后，与MF59佐剂配方的乙型肝炎疫苗观察到比铝盐诱导的免疫反应强100倍。与其他佐剂类似，MF59的作用机制尚未完全阐明。MF59佐剂的有效性不依赖于疫苗接种部位的沉积物形成，因为MF59的半衰期很短。然而，MF59佐剂已显示出潜力，能够引发强烈的IgG和细胞介导的免疫反应。此外，MF59可以诱导单核细胞、巨噬细胞和DCs表达和分泌趋化因子，即CCL4、CCL2、CCL5和CXCL8，这些趋化因子招募更多的白细胞重新摄取更多的疫苗抗原。最后，这种分化将免疫细胞转化为抗原呈递细胞（APCs）。此外，这些APCs迁移到淋巴结，在那里它们诱导适应性免疫反应，如图2所示。AS03也是一种油包水乳液佐剂，包括角鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80。将α-生育酚纳入AS03配方使其与其他油包水乳液佐剂不同。AS03首次用于与疟疾疫苗的配方。最近，这种佐剂已用于人类流感疫苗。最近的临床试验表明，含AS03佐剂的流感疫苗引发了强烈的免疫反应。此外，含AS03佐剂的疫苗也被发现在婴儿中诱导了强大的免疫反应。此外，AS03通过刺激核因子κB（NF-kB），一种促炎细胞因子，以及趋化因子，引发免疫反应。随后，它招募免疫细胞，如单核细胞和巨噬细胞。应用这种佐剂与大流行疫苗配方的优势在于其能够以更低剂量的疫苗抗原产生强烈的体液免疫反应，即每株3.75或7.5毫克，与常规三价灭活流感疫苗中每株15微克相比。自2009年以来，已有约470万剂AS03佐剂的A(H1N1)疫苗被用于儿童接种。 美国军方的脂质体配方 这种配方是由美国军方开发的，由含有饱和磷脂和单磷脂脂A（MPLA）的胆固醇和脂质体组成。美国军方脂质体配方（ALF）有改进版本，即吸附在氢氧化铝上的ALF（ALFA）、含有QS21皂苷的ALF（ALFQ）以及吸附在氢氧化铝上的ALFQ（ALFQA）。研究发现，用ALFA佐剂的恶性疟原虫环孢子蛋白疫苗候选物提供了足够的体液和细胞免疫反应。沃尔特·里德陆军研究所（WRAIR）疟疾疫苗部门开发并测试了FMP013（恶性疟原蛋白-013）和FMP014（一种自组装蛋白纳米颗粒）SAPN（两种新的合成疟疾抗原）与ALFQ佐剂的保护效果。用ALFA佐剂的重组gp120诱导了针对不同亚型的HIV-1的交叉反应抗体。关于ALF和ALFQ与重组HIV1包膜gp140蛋白的配方，ALF诱导了主要的Th2型免疫反应，而ALFQ诱导了更平衡的Th1和Th2型免疫。此外，ALFQ佐剂激活先天免疫反应，上调APOBEC3（载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样家族），一种抗HIV蛋白，并维持一种促炎环境，结果，允许HIV-1感染的单核细胞衍生巨噬细胞（MDMs）变得能够限制HIV-1感染。 病毒体（脂质和糖蛋白） 病毒体具有佐剂系统的特征，并且以其可生物降解和无毒的特性而闻名。通常，病毒体不产生抗病毒体抗体。病毒体是嵌入有病毒包膜蛋白（如流感病毒的神经氨酸酶和血凝素）的小型球形单层脂质膜囊泡（150纳米）。这些蛋白被整合到磷脂酰胆碱双层脂质体中。这些制备的病毒体不包含核衣壳，包括源病毒的遗传物质。这些蛋白促进病毒体膜与细胞受体结合，介导与免疫细胞的pH依赖性融合。因此，病毒体将其内容物，即疫苗抗原（s），直接运送到目标细胞，引发针对弱免疫原性抗原的抗原特异性免疫反应。病毒体是类似病毒颗粒，允许疫苗抗原的呈现对主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类，以引发B细胞和T细胞免疫反应。病毒体佐剂系统引发的免疫反应类型取决于抗原表位是位于病毒体内还是外部。有一些已建立的例子，如PeviPRO™，它诱导体液免疫反应。抗原在细胞的内体中被降解，因此主要产生MHC II抗原呈递。PeviTER™配方的抗原不仅引发CD4+和CD8+ T细胞免疫反应，还产生强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。病毒体佐剂系统通过MHC I途径封装呈现疫苗抗原，因为抗原自然地进入抗原呈递细胞（APC）的细胞质。批准的疫苗，如Epaxal®（用于甲型肝炎）和Inflexal®V（用于流感）已经成功证明了病毒体的卓越性。迄今为止，这些甲型肝炎（Epaxal®）和流感（Inflexal®V）疫苗已在45多个国家使用，至今已有超过1000万人接种。这种新一代疫苗提供了额外的好处，因为即使在免疫抑制患者和婴儿中也有效。此外，它们具有高安全性，因为嵌入的病毒不会复制。据我们所知，病毒体不再被许可用于人类。 AS04（吸附在明矾上的TLR-4激动剂） 为了开发新型佐剂系统，已经使用了铝盐，主要由吸附在明矾上的不同的Toll样受体（TLR）激动剂组成。佐剂系统04（AS04）已经被批准用于与HPV（Cervarix）和HBV（Fendrix）疫苗的配方。这种佐剂系统包括与LPS主要构成的3-O-去酰基-4'-单磷脂酰胆碱（MPLA）的明矾配方，来自萨氏菌明尼苏达菌株。有文件记录MPLA保留通过与TLR-4相互作用来刺激先天免疫的能力。它进一步导致诱导NF-kB信号并产生促炎细胞因子和趋化因子，这些因子招募免疫细胞到疫苗接种部位和引流淋巴结。在疫苗接种后的几个小时内观察到单核细胞和DCs数量的增加，它们相互作用以刺激抗原特异性T和B细胞，产生强大的细胞和体液免疫反应。明矾与MPLA没有显示出协同效应；然而，MPLA和AS04的比较研究表明，明矾延长了MPLA在疫苗接种部位引起的细胞反应。因此，研究发现AS04佐剂通过刺激TLR-4来诱导先天免疫反应。AS04佐剂的HBV疫苗在人类中引起先天免疫反应。与铝盐佐剂的HBV免疫血清相比，在AS04佐剂的HBV免疫血清中观察到IL-6和C反应蛋白的水平升高。然而，报告的HBsAg特异性T细胞和抗体比铝盐配方的HBV疫苗诱导的更高。与铝盐佐剂配方的相同疫苗相比，AS04配方的HBV和HPV疫苗引起更强的体液免疫反应，这表明TLR4激动剂MPLA佐剂对人类使用的重要性。 RC-529佐剂  LPS的顺序酸和碱水解产生MPLA，已知MPLA保留LPS的各种免疫刺激性功能。体外研究表明MPLA激活并刺激树突状细胞（DCs）成熟，并上调人类白细胞抗原-DR、CD80、CD86、CD40和CD83。MPLA也已知可诱导Th1和Th2细胞因子的表达，并增强抗原特异性Tc细胞反应。MPLA是一种获批的佐剂，并已用于乙肝疫苗配方中。此后，合成模拟物如氨基烷基葡萄糖胺4磷酸盐（AGPs）被鉴定，观察到它们激活先天细胞如巨噬细胞、DCs、B细胞和APCs。其中一种AGP化合物RC-529，观察到通过TLR-4激活信号并上调细胞表面的共刺激分子，包括细胞因子和趋化因子。RC-529在临床试验中被发现是一种有效的佐剂，其中健康志愿者接受了针对乙肝的疫苗配方，与铝盐相比，RC-529在接种疫苗配方的受试者中诱导了显著更高的抗体产生。MPLA的合成模拟物RC-529在临床试验中被观察到是安全有效的。 图2 MF59佐剂及其作用机制。在注射部位，MF59佐剂激活的巨噬细胞分泌趋化因子，刺激并招募免疫细胞。分化将免疫细胞转化为抗原呈递细胞，激活B细胞和T细胞，以传递强烈的体液和细胞免疫反应。 粘膜疫苗佐剂  这些佐剂唤起宿主的先天免疫系统，并有助于提供针对病原体的保护。使用活体减毒或灭活的全细胞疫苗通常包含内源性佐剂，如细菌细胞壁产物及其基因组DNA/RNA。这些佐剂作为病原体相关分子模式（PAMPs），足以刺激适应性免疫。然而，亚单位疫苗通常缺失或无法诱导先天免疫反应，因此，包含佐剂对于提供成功的疫苗至关重要。大多数病原体通过鼻或口途径进入宿主。因此，有效的粘膜疫苗对于预防这类粘膜传播疾病至关重要。与肌肉注射/亚单位疫苗相比，粘膜疫苗提供了显著的好处，如低成本、非侵入性和最重要的是，传播血液传播感染的风险非常低，特别是对儿童。然而，由于缺乏理想的粘膜佐剂，只有少数粘膜疫苗被批准用于人类。通常，粘膜佐剂有两个作用：首先，它们作为递送载体；其次，它们作为免疫刺激分子。然而，一些粘膜佐剂展示了免疫刺激剂和递送系统的双重特征，如壳聚糖及其衍生物。有文件记录表明，粘膜佐剂可以刺激保护性局部和系统免疫，这对于成功的粘膜免疫至关重要，以对抗各种传染病。此外，粘膜佐剂在提供针对远端和局部感染部位的保护方面发挥许多重要作用。例如，胞嘧啶磷酰硫酸鸟苷（CpG）寡脱氧核苷酸作为通过鼻途径接种疫苗的有效粘膜佐剂，针对通过输血和性活动传播的病原体。此外，粘膜佐剂是针对肿瘤的免疫的强效刺激剂。在许多粘膜佐剂中，TLR激动剂和突变型肠毒素是两种最吸引人的类型，因为它们不仅有效，而且相对安全。到目前为止，由细菌衍生的腺苷二磷酸（ADP）-核糖基化肠毒素是最典型的粘膜佐剂。这类药物包括大肠杆菌热敏肠毒素（LT）、霍乱毒素（CT）以及LT和CT的突变体/亚单位。这些毒素刺激抗原特异性的细胞和体液免疫反应，包括CTLs、Th1、Th2和Th17。最重要的是，这些佐剂在通过粘膜途径给药时，刺激针对疫苗抗原的抗原特异性IgA抗体和长期记忆细胞。 热敏毒素、双突变热敏毒素粘膜佐剂如何工作？ 粘膜佐剂LT是一种84千道尔顿的聚合物蛋白。这种佐剂以活性形式AB5存在，包含一个A亚基和一个五聚体B亚基。dmLT是其母分子LT的突变形式。佐剂dmLT在通过粘膜或全身途径接种疫苗后，对疫苗抗原的系统性和粘膜免疫反应具有免疫调节作用。它可以简单地与疫苗抗原（s）以水缓冲液的形式配方。由于佐剂的双重方法，即免疫刺激特性和普遍的细胞结合，疫苗抗原（s）的细胞摄取量成倍增加，这就是粘膜免疫被增强的方式。这是传递疫苗配方，特别是亚单位疫苗到难以到达的部位的最适宜方法，特别是用于舌下（s.l.）、口服（p.o.）和经皮（t.c.i.）递送。这些策略不仅无针头，还显示出提高管理便利性和依从性的潜力。此外，它降低了使用危险注射进行疫苗接种时疾病传播的风险。dmLT佐剂引发了针对疫苗抗原的强烈Th17反应，并诱导IL-17的产生，它主要在粘膜部位提供保护。IL-17的表达有助于通过诱导B细胞分化为IgA分泌细胞，增加分泌型sIgA抗体进入粘膜组织腔。dmLT佐剂还在全身接种后刺激粘膜免疫反应。然而，这些研究仅在动物模型中进行了测试，这种佐剂在人类中的使用尚未确定。LT、CT及其相关突变体在过去的最近时期得到了很好的表征。LT或CT佐剂的活性形式AB5的亚基具有独特的功能。亚基B与受体结合并导致细胞内进入。在粘膜疫苗接种期间，B亚基有助于将疫苗抗原在整个粘膜部位运输。亚基A负责与ADP-核糖化因子（ARFs）结合，并且ADP核糖化Gsa，导致环磷酸腺苷（cAMP）积累。然后，LT刺激树突状细胞（DCs）的激活、细胞因子的表达和Th17反应的刺激。也有文件记录表明，单独使用LT的亚基A会引发混合的Th1/Th2/Th17类型的免疫反应，但影响比LT的活性AB5形式要弱。使用亚基B会引发Th2/T调节细胞（Treg）偏向的反应。然而，毒性一直是这些佐剂的一个关注点。dmLT佐剂如何诱导免疫系统？ 图3描述了免疫级联反应。（I）在接种部位，疫苗抗原被摄取后，先天免疫系统被激活。上皮细胞分泌细胞因子和趋化因子，如IL-8和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）。（II）树突状细胞（DCs）被招募到接种部位并激活，用于抗原处理和呈现给主要组织相容性复合体（Ag-MHC）。CD80和CD86的上调以及极化细胞因子的分泌，例如IL-1、IL-23、IL-6和G-CSF，会发生。（III）携带疫苗抗原的活化DCs随后迁移到二级淋巴器官，并促进抗原特异性T辅助细胞和B细胞分化为分泌IgA和IgG抗体的浆细胞。最后，传递了混合的Th1/Th2/Th17类型的免疫反应，特别是强烈刺激Th17细胞和粘膜归巢标记。有文件记录表明，Th17细胞是免疫的重要组成部分，促进次级淋巴器官中的生发中心形成，并增强IgA抗体分泌。 被LT/dmLT佐剂激活的树突状细胞引起了非常高的Th17类型的免疫反应，这是由于caspase 1炎症体的激活，以及随后的趋化因子和细胞因子如IL-1和IL-23的表达。一项科学研究报告称，用LT激活的小鼠树突状细胞诱导了IL-1β的表达，这对Th17细胞的产生至关重要。用dmLT配方的疫苗抗原重新刺激免疫个体的人类外周血单核细胞（PBMC）增强了IL-17A和IL-13的表达。总之，在用dmLT配方的疫苗抗原免疫后，发生了一系列定义好的事件，这是APCs和疫苗免疫的有效刺激物。 TLR激动剂作为粘膜疫苗佐剂 与TLR配体基佐剂配方的疫苗触发并激活先天免疫反应，有助于增强疫苗候选物所赋予的保护潜力。基于TLR的佐剂需要一个额外的适配蛋白MyD88，它刺激APCs和B细胞进行抗体产生。此外，MyD88信号也诱导生发中心的形成，这对于产生抗体分泌细胞至关重要。基于TLR配体的佐剂包括依赖于TLR9的佐剂CpG DNA（CpG）和依赖于TLR2的佐剂Porin B（PorB），它们都需要MyD88来适当刺激APCs。CpG是一种未甲基化的细菌DNA基序，而PorB是脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白。已证明TLRs在APCs上表达，包括巨噬细胞、DCs和B细胞。因此，使用TLR激动剂作为疫苗制备中的佐剂的主要目的是刺激这些细胞以赋予强大的免疫反应，连接先天免疫和适应性免疫。各种TLR4配体不仅已在临床前研究中使用，而且还被食品药品监督管理局批准用于临床试验，如卡介苗（BCG）和MPLA。LPS，一个众所周知的TLR4配体，被用作体内诱导急性炎症的诱导剂，用于小鼠模型中的肿瘤回归。有报道称，TLR4激动剂，如第二代脂质佐剂SLA-SE，促进了通过肌肉内免疫接种含有肠毒性大肠杆菌（ETEC）疫苗抗原的粘膜抗体的增加。为了测试L-pampo的功效，一种结合了TLR1/2和TLR3激动剂的组合。 图3 dmLT佐剂的作用机制。（I）在接种部位，dmLT佐剂刺激先天免疫反应，激活的上皮细胞分泌IL-8和G-CSF。（II）树突状细胞（DCs）在注射部位被激活并招募，在那里它们处理并呈现抗原。它还上调共刺激分子，即CD80和CD86，并刺激IL-1、IL-6、IL-23和G-CSF的表达。（III）活化的DCs迁移到二级淋巴器官，在那里它们刺激抗体分泌浆细胞B细胞的分化和抗原特异性Th细胞的产生。总的来说，传递了强烈的Th17免疫反应。Th17细胞被识别为免疫的重要组成部分，并在二级淋巴器官中刺激生发中心的形成，以及增强IgA分泌。 用于SARS-CoV-2雪貂模型的利用，引发了强烈的体液和细胞介导的免疫反应。最近，一种口服SARS-CoV-2疫苗（VXA-CoV21），目前正在进行III期临床试验，使用了双链RNA佐剂，主要针对TLR3，并有助于通过该受体激活树突状细胞群。这项研究中使用的佐剂不仅扩大了模式识别受体（PRR）的目标范围，而且还是针对基于毒素的佐剂的有前途的替代品，用于口服疫苗。我们认为，这种在粘膜免疫方面佐剂发现的进步可以为对抗病原体菌株提供新的希望，并且可以实现成功的疫苗设计。 目前佐剂的现状和临床试验 安全性一直是开发新型疫苗佐剂过程中的重大关注点；因此，许多佐剂在临床前和临床研究中进行了全面评估。例如，非常常用的佐剂，如铝盐，已在美国获得批准。含铝盐的疫苗在70多年前就获得了批准。与乳液基疫苗佐剂MF59配方的流感疫苗于1997年获得许可，并在欧洲上市。此外，如AS03这样的乳液基疫苗佐剂与流感疫苗一起被佐剂化，并在2009年获得许可。病毒体，一种脂质体佐剂，于2000年作为甲型肝炎和流感疫苗的重要组成部分获得批准。除此之外，AS04，一种包含吸附在明矾上的MPLA的组合佐剂，已在欧洲获得批准，并在美国获得许可。已批准用于人类的佐剂列在表1中。尽管提供了许多值得注意的好处，如降低成本、高产量和更安全的高纯度疫苗抗原，但由于缺乏内在的免疫刺激性因素，如各种PAMPs，大多数提供较弱的疫苗潜力。理解免疫细胞受体（如TLRs）如何被PAMPs刺激，即革兰氏阴性细菌的LPS，以及适应性免疫反应是如何被先天免疫反应协调和调节的，是至关重要的。有报道称，颗粒物质会刺激先天免疫信号。因此，鉴定了可以刺激先天免疫细胞上特定受体的佐剂，这些细胞可以轻松感知危险信号和细胞压力。不幸的是，由于高度的反应原性和耐受性差，早期开发的佐剂未能进入临床开发。由于HIV和疟疾疫苗的特征，出现了使用不同佐剂的组合是促进广泛的免疫反应（即体液和细胞）的更好选择的合理性。这种佐剂的组合涉及递送系统，如脂质体、明矾或乳液，以及自然免疫刺激免疫增强剂，如细菌MPLA、病毒dsRNA或植物Quillaja皂苷。新一代的佐剂大多被称为免疫刺激剂或免疫增强剂，已在人类中进行了测试，并且正在进行临床试验，列在表2中。这些新一代佐剂系统的设计基于现有的药物递送模型和已建立的药物原理。因此，执行的递送系统主要在免疫信号激活上，可以局部化并集中在配方疫苗抗原上。GSK的佐剂系统（AS）是这种进展的最佳例子，以制造有效的疟疾疫苗。递送系统对疫苗开发有多重要？在GSK两种替代疫苗的人类临床试验中提到并强调了这一点。两种疫苗都包含相同的免疫增强剂，但它们的配方不同。包含AS01佐剂系统（一种脂质体配方）的疫苗比包含相同成分的AS02佐剂系统（一种乳液配方）提供了更好的保护。因此，疫苗候选物RTS,S与佐剂系统AS01配方，这个例子证明了两种免疫增强剂的组合是实现目标所必需的。佐剂系统AS01包含MPLA和皂苷QS-21。研究表明，当这两种免疫增强剂（MPLA和QS-21）在脂质体中配方时，它们协同工作并引发先天免疫反应，进一步增强适应性免疫反应。AS01佐剂系统在人类中刺激各种疫苗抗原的强大T细胞免疫反应的能力是通过这种独特的免疫增强剂组合，例如MPLA和QS-21，所赋予的协同效应来阐明的。这些发现开辟了大门，为开发潜在的佐剂系统提供了新的途径。大多数佐剂作为候选或已获得许可的疫苗的理由从临床研究收集的数据中变得清晰。通常，这些佐剂已知能够非常快速和及时地在免疫部位刺激先天免疫反应，将刺激的免疫细胞排入淋巴结，这对于增强针对病原体的适应性免疫至关重要。PAMP和危险信号通路的刺激，即TLR、caspase-1和溶酶体不稳定-Syk/Card9，不仅促进效应细胞的招募，包括T和B细胞，还促进APCs的招募和激活。通过目标耗竭激活的APCs的许多研究表明，这一步对于有效诱导疫苗抗原特异性T细胞非常重要。将产生的抗原特异性T细胞表型将取决于先天免疫信号激活的性质。被刺激的胶囊下巨噬细胞分泌的IL-18可能促进分泌IFN-g的CD4+ T细胞的发展。同样，被刺激的APCs分泌的IL-6或IL-12也可能促进滤泡辅助T细胞（TFH）的产生，这促进了B细胞分泌高亲和力IgG，例如流感免疫。包含TLR配体的佐剂系统可以通过刺激具有更好TCR亲和力的T细胞克隆的扩增来调节抗原特异性T细胞的克隆安排和质量。Novavax, Inc.开发了一种重要的佐剂，名为matrix-M。它基于从Quillaja saponaria（皂树皮树）树皮中提取的皂苷化合物。目前，这种matrix-M佐剂正在与针对SARS-CoV-2的重组刺突（S）蛋白的配方中使用。目前，这种疫苗配方（COVID-19疫苗）正在进行I期临床试验。matrix-M佐剂不仅诱导产生高中和抗体滴度，还诱导强大的T细胞免疫反应，并对各种冠状病毒株具有高保护效力（193-195）。Matrix-M也已在其他疫苗配方中使用，如目前处于IIb期的疟疾疫苗（R21/Matrix-M）和已达到I期的流感疫苗。已观察到，如Q-21等皂苷通过激活胶囊下窦巨噬细胞（SSMs）中的caspase 1，通过在内吞作用时破坏溶酶体激活酪氨酸蛋白激酶SYK，具有佐剂活性，诱导OVA特异性CTL反应和高抗体滴度。此外，如matrix-M等皂苷在激活先天免疫系统、允许疫苗剂量减少以及诱导体液和细胞介导的免疫反应中发挥关键作用。然而，这种佐剂的分子机制仍有待阐明。这种佐剂的作用机制可以通过系统疫苗学方法来定义。目前，机制方法和理由与人类中佐剂疫苗的有效性和可接受性相关。这些信息可能有助于提供一种协议，如何在非临床模型和临床中评估和表征新的佐剂系统进行逐一比较。最近的一项研究表明，五种不同的佐剂疫苗只影响了针对疫苗抗原的CD4+ T细胞的数量，但未能调节这些细胞的表型范围。因此，并非总是佐剂对所有抗原的免疫反应质量产生影响。通常，疫苗的有效性在很大程度上也依赖于疫苗抗原本身以及保护所需的免疫类型，例如HIV疫苗研究。 表1 人类使用的许可疫苗佐剂 表2 正在开发中的疫苗佐剂 动物模型的开发和推进也可以用于评估潜在的佐剂疫苗。 此外，在临床中，大多数分子分析都是基于外周血样本和非人灵长类动物模型进行的，这允许评估免疫接种的局部免疫反应，并为已有的外周血签名提供逻辑验证的机会。对于快速发展新一代佐剂，非临床研究始终在连接临床解释方面发挥着至关重要的作用。佐剂主要由天然成分组成。当前技术不断发展，用于开发新的佐剂；很快，将有重要的进步，用于含有合成成分的佐剂。尽管批准的佐剂将始终被视为未来的宝贵资产，但这些佐剂的许多关键成分已从自然资源中开发出来，并且可以被具有类似功能的合成分子所替代。目前正在鉴定具有成为更有效的激活剂和激动剂潜力的新分子。这些分子可以以低成本大量生产，因为它们可以轻松纯化和评估，并且不易受到其内在生物学变异性的影响。此外，这些合成分子的大规模生产过程可能不易受到获取和提取天然成分的许多困难和挑战的影响。然而，在用这些新佐剂候选物替代现有佐剂中的天然成分之前，应通过临床试验解决安全性和保护效力的担忧。如前所述，在过去的100年中，已经研究了几个有前景的佐剂候选物；然而，只有少数佐剂被批准用于人类。由细菌Acinetobacter calcoaceticus产生的复杂酰化多糖emulsan可能是一个好候选物，因为它易于结构定制和其乳化行为。我们发现emulsan激活巨噬细胞，并显示出显著的佐剂活性，通过特异性抗体滴度确定。这种免疫反应以高免疫球蛋白G2a滴度为特征，与Th1反应一致。这种复杂聚合物所显示的显著免疫增强作用确立了emulsan作为一个新的令人兴奋的佐剂候选物。我们建议，通过操纵emulsan的化学结构，我们可以探索PRRs和巨噬细胞激活的物理基础。在过去的几年中，我们对先天免疫信号有了深入的理解和巨大的知识，这为关注具有更高潜力的佐剂靶点，即TLR、干扰素基因刺激因子（STING）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）、C型凝集素受体（CLRs）、寡聚化结构域、富含亮氨酸的重复和含吡啶结构域（NLRP）以及干扰素诱导蛋白（AIM2）提供了新的途径。此外，还开发了一些复杂的探索性佐剂概念，包括包含许多不同组分的多聚配方。尽管在临床前研究中取得了令人鼓舞的结果，但这些佐剂在理想的预防性疫苗中几乎没有发挥作用，但随着治疗性疫苗的出现，如果有额外的途径，解决了大规模生产、稳健性、可重复性的问题，可能会有额外的机会。尽管在佐剂方面取得了巨大进展，但仍存在一些值得注意的限制，例如无法在人类中刺激强大的CTL反应。然而，为了刺激广泛和多样化的免疫反应，佐剂也可以在核酸和载体中用于初次/增强背景下。这种尝试已经尝试开发针对HIV的有效疫苗，并且正在评估一种佐剂疫苗抗原作为增强蛋白，在用载体进行初次免疫后使用。因此，临床研究对于定义异种初次/增强设置的最佳组合至关重要。通过更好地方法来表征新开发的佐剂，即阐明特定于先天免疫的信号级联，这是支持特定疫苗潜力所需的，可以解决一些基本问题。疫苗效果的快速及时刺激有何影响？先天免疫反应的信号通路中是否存在冗余？是否可能通过更特定的刺激获得更好的结果？先天免疫效应物（如细胞-细胞相互作用和细胞因子信号）与适应性免疫效应物（如B细胞和T细胞）之间的确切时间和空间关联是什么？这些反应是否是时间依赖性的，其中疫苗抗原和佐剂保留在疫苗接种部位，以及局部APCs是如何激活的？在人类群体中，佐剂的特定免疫反应如何受到生态因素和个体遗传倾向的影响？几种同时使用的药物和已经患病的个体对免疫接种有何影响？ 结论 免疫接种的最终目标是提供针对各种传染病的有效和持久的保护。这种免疫保护只能通过使用携带适当佐剂和抗原的疫苗配方来实现。佐剂是疫苗配方的重要组成部分，可以调节疫苗反应。早期的疫苗配方方法专注于单一类型的佐剂，即铝盐或乳液。然而，新的疫苗配方需要刺激明确定义的细胞和体液免疫反应。因此，为了触发强大的免疫反应，如体液和细胞免疫反应，疫苗配方中迫切需要新的免疫增强剂或免疫刺激佐剂。粘膜佐剂dmLT是25年研究的成果。通过临床前和临床研究表明，dmLT是一种安全有效的佐剂，可以在适当的配方中诱导保护性免疫。需要关注一些未解决的问题，以改进dmLT佐剂，例如抗原-佐剂组合的安全性和稳定性问题。dmLT的佐剂机制以及由dmLT赋予的保护性免疫的诱导也值得进一步研究。有建议称dmLT可以促进婴儿的先天和适应性免疫反应。含有dmLT的疫苗制备已被发现对粘膜感染有效。得出结论，dmLT将有助于克服对其他全细胞或基于LPS的疫苗（如霍乱、伤寒沙门氏菌和志贺氏菌疫苗）的低反应性，特别是在经济欠发达国家的婴儿中。我们预测，将来在婴儿疫苗制备中使用dmLT将非常有效。最近，我们对佐剂研究领域有了深入的了解；现在，我们可以选择一个合适的佐剂，而不是像免疫增强剂这样的经典佐剂，或者它们的组合，以增强疫苗的功效。最近，铝盐、MF59、AS03、CpG和matrix-M已获得许可，并在全球范围内用于COVID-19疫苗的制备。已经建议使用编码穗蛋白的合成基因，无论是前融合稳定还是仅有受体结合域，来工程哺乳动物细胞、杆状病毒或植物细胞以产生重组蛋白，然后将其纯化，与佐剂结合，并用作疫苗。在COVID-19期间的疫苗制备中，我们获得了使用基于蛋白质的疫苗结合许可佐剂的工业和临床知识，我们相信，将来基于这些方法的疫苗制备将是耐受性良好、有效且大量可用的。此外，在COVID-19大流行期间使用RNA成熟和病毒载体来创建疫苗已经为未来生产更有效的疫苗开辟了新的途径，以应对新出现的感染。最近完成的临床研究对新佐剂的建议是，将来在人类使用的疫苗配方中应使用一组新的免疫增强剂或免疫刺激剂。这些新一代佐剂的不同组合的可用性将使成功的疫苗开发策略得以合理化。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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