Amino Acids

大家好，今天为大家介绍的是最近在Journal of Medicinal Chemistry上报道的一篇标题为“Distinct Amino Acid-Based PROTACs Target Oncogenic Kinases for Degradation in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC)” 的文章。该文的通讯作者是南方科技大学医学院生物化学系的Rao Hai教授和中国科学院深圳先进技术研究院的Fang Lijing研究员。本文开发了一种单个氨基酸作为E3连接酶配体的PROTAC模型，能够变换不同的配体结构来靶向NSCLC中的一些致癌激酶如EML4-ALK和各种突变形式的EGFR。 靶向蛋白质降解技术在近20年间的发展过程中已经变成了降低抑制剂类药物耐药性、提升效率的强大治疗手段。蛋白质水解靶向嵌合体（Proteolysis Targeting Chimeras, PROTAC）是其中的代表技术之一，通过招募细胞内的E3泛素连接酶来使其对靶标蛋白特异性泛素化，诱导蛋白酶体系统的降解过程。然而，细胞内有近600种E3泛素连接酶，现在被用来作为PROTAC靶标的绝大多数集中于VHL（~30 %）和CRBN（~60 %）上，绝大多数E3泛素连接酶因为其降解信号未被详细定义而无法使用。由于VHL和CRBN在组织和细胞分布层面的特异性，以及CRBN配体分子可能存在的致畸作用，都影响了基于这两个E3连接酶PROTAC的进一步应用。而且，较大的分子量也降低了绝大多数PROTAC的溶解性和生物利用度。因此，PROTAC的设计和应用范围仍然有较大的改进空间。 在细胞复杂的纠错途径中，N端规则途径是特殊的一类蛋白降解机制。它通过识别短寿命蛋白质的N端残基来发挥作用。当一些特殊的氨基酸如碱性（R、H、K）和疏水（L、I、F、W、Y）氨基酸由于蛋白质的不稳定性而被水解暴露于N端时，便能够作为E3泛素连接酶UBR家族的底物而被识别。最近的研究中还发现了其他残基作为N端残基的降解机制，如N端的G残基能够被CRL2连接酶识别，而N端的P残基能够被GID4泛素连接酶识别。此前已经有一些例子使用这种N末端残基识别机制来制造新的蛋白降解剂，是一种有前景的蛋白质降解手段。 EML4-ALK和EGFR的突变是引起NSCLC的关键致癌因素，一些酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）类药物如吉非替尼和布加替尼可以短时间内抑制其活性，但会因为需要持续结合而容易产生耐药性。在本文中，作者团队开发了基于TKIs和N末端降解机制的PROTAC，命名为AATac。将三种氨基酸（Pro、Gly和Lys）添加到布加替尼类似物（BA）的另一端，构成了可以降解EML4-ALK和EGFR突变体的降解子，能够有效抑制细胞生长，促进细胞凋亡。（图1） 图1. 本文中设计的所有AATacs的化学结构。 首先，作者测试了图1中设计出的几种AATac分子降解EML4-ALK和EGFR的活性。在H1975和H3122两种细胞系上观察到长度为3个OEG重复单元的连接子具有最好的降解效果，并将氨基酸残基从Pro替换为Gly和Lys，同样能够降解EML4-ALK和EGFR。而以Orn作为末端的AATac则无法降解。定量蛋白质组学也观察到细胞中的其他蛋白几乎不受影响，证明了AATac作用的特异性。（图2） 图2. AATacs能够诱导EML4-ALK和EGFR L858R/T790M突变体的降解。 随后，作者团队进一步研究了AATac的降解效率。他们在H1975和H3122细胞系上进行了浓度梯度和时间梯度的降解实验。能够观察到在这两个细胞系上AATac能够以浓度和时间依赖的方式降解EML4-ALK和EGFR L858R/T790M，有着较低的DC50值和较高的降解效率，其中，以Pro构成的AATac效率最佳。AATac也有显著的抑制癌细胞增殖的能力，Pro-PEG3-BA对正常细胞HEK293T的毒性较低，即使在较高浓度下也不会明显抑制细胞生长。（图3） 图3. AATacs以时间和浓度依赖性的方式降解ALK和EGFR突变体，Pro-PEG3-BA有最佳的降解效率。 接下来，作者团队研究了AATac诱导EML4-ALK或EGFR降解的机制。蛋白酶体抑制剂MG132可以很好地抑制AATac的降解活性，而溶酶体抑制剂氯喹则不能。此外，在细胞中用干扰RNA抑制CRL2和GID4蛋白的表达会限制AATac的降解效果。而且在处理一段时间后脱除药物分子，AATac相比于BA这类TKIs有着更强效持久的磷酸化抑制效果。这些结果都说明AATac通过蛋白酶体途径有效降低EML4-ALK和EGFR突变体水平，并且具有持久的抑制作用，与传统TKIs相比，展现出了在非小细胞肺癌治疗中的潜力。对这两种NSCLC细胞的细胞周期研究可以发现，AATac可以将细胞周期阻滞在G1期，大幅延缓细胞的复制和增殖。流式细胞染色结果也表明，AATac可以诱导细胞的凋亡，有着抑制肿瘤增长的潜力。（图4，图5） 图4. AATac通过蛋白酶体途径介导EML4-ALK或EGFR突变体的降解，并能够实现更长效的抑制。 图5. AATac能够诱导癌细胞凋亡并将细胞周期限制在G1期从而抑制细胞的复制和增殖。 最后，作者团队在体内研究了Pro-PEG3-BA在体内的药代动力学研究和药效学评价。在小鼠模型上通过腹腔注射和静脉注射的方式给药后，Pro-PEG3-BA显示出较好的药代动力学特性，并且能够在肿瘤组织中诱导相应靶标蛋白的降解。说明AATac有着作为潜在抗肿瘤药物在体内实现治疗效果的潜力。（图6） 图6. Pro-PEG3-BA降解剂的体内药代动力学（PK）和蛋白降解效果研究。 综上所述，本文开发了一种基于单一氨基酸残基的蛋白降解剂。能够在蛋白质降解N端规则的基础上，引入Pro、Gly和Lys残基作为E3连接酶招募残基，诱导EML4-ALK和EGFR突变体的降解。这种AATac拓展了PROTAC的降解范式，拓展了其适用范围，并且体现出了良好的体内治疗效果，有着成为新一代NSCLC治疗药物的潜力。 作者：DYH  审校：ZXY DOI: 10.1021/acs.jmedchem.4c00208 Link: https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c00208 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

蛋白水解靶向嵌合体技术（Proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）利用恰当的连接子将目标蛋白（Protein of Interest, POI）配体与E3连接酶配体相连，使POI与E3连接酶之间形成蛋白-蛋白相互作用后被进一步泛素化标记，最后通过泛素-蛋白酶体途径将POI降解1。该技术自2002年诞生以来经历了二十多年的发展，已有多个分子进入临床试验阶段，如Arvinas公司的ARV-471等2。然而，尽管目前已发现超过600种E3连接酶，仅有少数连接酶能够用于PROTACs的设计与开发，如VHL（∼30%） 与 CRBN（∼60%）3。由于CRBN 与VHL 在不同细胞或组织中的特异性表达差异，以及相应配体较大的分子量造成PROTACs分子类药性较差，PROTACs的开发受到限制。此外，度胺类配体潜在的致畸副作用也限制了它的应用4，因此目前亟需寻找新型降解信号来对PROTACs技术进行优化。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer , NSCLC）是最常见的肺癌类型之一，其分子特征复杂且容易产生耐药性，治疗过程往往面临着极大的挑战。ALK 重排和 EGFR 突变是NSCLC中两个最关键的致癌驱动因素5，尽管目前已有多种ALK和EGFR酪氨酸激酶抑制剂成功问世，通过与目标激酶的持续结合发挥作用，但这种持续性结合也容易导致细胞产生获得性耐药性，限制了疗效的长期维持。 南方科技大学的饶海教授课题组针对这一问题，基于三种能够触发N-末端降解途径的氨基酸（甘氨酸、脯氨酸与赖氨酸）为E3连接酶配体分别设计了能够降解EML4-ALK 和突变型 EGFR的全新PROTACs分子，也被称为AATacs。近日，该项研究工作发表在了美国化学会出版的药物化学核心期刊Journal of Medicinal Chemistry上（J. Med. Chem. 2024, ASAP）6。 N-末端降解技术的核心在于不稳定的蛋白N-末端残基容易被修饰或加工从而暴露出来，随后被不同的E3连接酶识别后经泛素-蛋白酶体途径降解7。研究人员首先通过聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）连接子将三种氨基酸残基（Pro、Gly 和 Lys）和ALK酪氨酸激酶与 EGFR 激酶的抑制剂Brigatinib相连设计合成了AATacs分子。他们基于ALK与Brigatinib的共晶结构（PDB: 6MX8）将配体分子位于溶剂区的甲基哌嗪-哌啶基团替换为哌嗪基，合成了Brigatinib的类似物（BA），并调整了PEG连接子的数量（1-4）以探索最佳连接子长度（图1）。 图1、AATacs的设计思路 研究人员随后在H3122（EML4-ALK）与H1975（EGFR-L858R/T790M）细胞中评估了基于 Pro 的不同连接子长度的AATacs的降解能力。尽管连接子长度不同，这些化合物均能在高于1 μM的浓度下使H3122细胞中EML4-ALK蛋白或H1975细胞中EGFRL858R/T790M蛋白含量显著下调。其中Pro-PEG3-BA活性最优，表明PEG3为最佳连接子长度。研究人员随后固定了连接子，并将Pro替换为Lys与Gly进行进一步的改造。WB结果表明在H3122与H1975细胞中Lys-PEG3-BA与Gly-PEG3-BA均保留了对POI的降解活性。此外，研究人员还通过蛋白质组学分析证明了经Pro-PEG3-BA处理的H3122细胞中ALK蛋白含量降低最为明显，进一步表明了该AATacs分子具有良好的选择性（图2）。 图2、AATacs的降解活性与蛋白质组学分析 研究人员进一步评估了这些AATacs的降解能力，结果显示Pro-PEG3-BA、Lys-PEG3-BA、Gly-PEG3-BA在H3122细胞中对EML4-ALK蛋白的DC50值分别为0.42 μM、1.32 μM、0.50 μM，且Dmax均大于90 %。而在H1975细胞中AATacs对EGFR L858R/T790M 蛋白的降解能力则显著降低，DC50值均高于10 μM（图3）。此外，CCK-8细胞毒性实验显示在H3122 细胞中Pro-PEG3-BA具有比原药BA更强的抑制细胞增殖的活性，表明PROTAC化改造能够提升化合物的抗肿瘤活性。同时，Pro-PEG3-BA在正常细胞中没有表现出毒性，表明其安全性良好。蛋白酶体抑制剂MG132的引入也证明了AATacs分子经由蛋白酶体途径进行降解。 图3、AATacs的降解能力评估 为了进一步探究AATacs的作用机制，研究人员首先对参与 AATac 介导降解的 E3 连接酶进行鉴定。通过对H3122 和 H1975 细胞中GID4、ZYG11B和ZER1蛋白分别进行敲低或沉默，研究人员证明GID4介导了Pro-AATacs的泛素化降解，ZYG11B和ZER1介导了Gly-AATacs的降解，Lys-AATacs的媒介E3连接酶则尚不明确。研究人员利用流式细胞术评估了Pro-PEG3-BA对细胞周期以及凋亡的影响，结果表明，Pro-PEG3-BA能以剂量依赖的形式使H3122和H1975细胞停滞在G1期，同时显著增加了早凋与晚凋细胞的比例（图4）。 图4、Pro-PEG3-BA对细胞周期以及凋亡的影响 最后，研究人员评估了Pro-PEG3-BA的药代动力学性质，以2 mg/kg的剂量静脉给药的半衰期（T1/2）为2.9小时，而腹腔50 mg/kg给药时的T1/2约为5.2小时，表明该分子代谢较为缓慢，能够提高患者依从性。同时该分子的生物利用度较好，约为53.2 %（图5）。进一步的H3122异种模型的PD实验中，以10 mg/kg腹腔给药能显著降低肿瘤组织中ALK的水平，体现出该分子良好的抗肿瘤活性。 图5、Pro-PEG3-BA的PK与PD研究 小结：能够用于PROTACs开发的E3连接酶数量少、潜在副作用风险大与类药性差是PROTACs设计的难点与痛点；使用激酶抑制剂治疗非小细胞肺癌NSCLC产生的获得性耐药也严重影响了药物的疗效。作者运用N-末端降解技术，以Pro、Lys、Gly这些小分子量的氨基酸为配体招募新的E3连接酶，结合ALK与 EGFR抑制剂Brigatinib开发了基于氨基酸的AATacs分子，其中Pro-PEG3-BA展现出了良好的降解活性与药动学性质。该研究不仅为NSCLC的治疗提供了全新策略，也展现了PROTACs在癌症治疗中的广阔前景。 【参考文献】： [1] Békés, M.; Langley, D. R.; Crews, C. M. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat Rev Drug Discov 2022, 21 (3), 181-200. DOI: 10.1038/s41573-021-00371-6  From NLM. [2] Gough, S. M.; Flanagan, J. J.; Teh, J.; Andreoli, M.; Rousseau, E.; Pannone, M.; Bookbinder, M.; Willard, R.; Davenport, K.; Bortolon, E.; et al. Oral estrogen receptor PROTAC® vepdegestrant (ARV-471) is highly efficacious as monotherapy and in combination with CDK4/6 or PI3K/mTOR pathway inhibitors in preclinical ER+ breast cancer models. Clin Cancer Res 2024. DOI: 10.1158/1078-0432.Ccr-23-3465  From NLM. [3] Cao, C.; He, M.; Wang, L.; He, Y.; Rao, Y. Chemistries of bifunctional PROTAC degraders. Chem Soc Rev 2022, 51 (16), 7066-7114. DOI: 10.1039/d2cs00220e  From NLM. [4] Ito, T.; Ando, H.; Suzuki, T.; Ogura, T.; Hotta, K.; Imamura, Y.; Yamaguchi, Y.; Handa, H. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science 2010, 327 (5971), 1345-1350. DOI: 10.1126/science.1177319  From NLM. [5] Cooper, A. J.; Sequist, L. V.; Lin, J. J. Third-generation EGFR and ALK inhibitors: mechanisms of resistance and management. Nat Rev Clin Oncol 2022, 19 (8), 499-514. DOI: 10.1038/s41571-022-00639-9  From NLM. [6] Zhang, J.; Chen, X.; Chen, C.; Li, F.; Song, X.; Liu, C.; Liao, K.; Su, M.-Y.; Tan, C. S. H.; Fang, L.; et al. Distinct Amino Acid-Based PROTACs Target Oncogenic Kinases for Degradation in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC). Journal of Medicinal Chemistry 2024. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.4c00208. [7] Shanmugasundaram, K.; Shao, P.; Chen, H.; Campos, B.; McHardy, S. F.; Luo, T.; Rao, H. A modular PROTAC design for target destruction using a degradation signal based on a single amino acid. J Biol Chem 2019, 294 (41), 15172-15175. DOI: 10.1074/jbc.AC119.010790  From NLM. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓