Ocaratuzumab

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注单克隆抗体药物风险因素分析及非临床研究与评价的一般考虑戴学栋，王 寅，周 恒，尹华静，付淑军，尹茂山，吴 爽，于 冰，孙 涛，王庆利国家药品监督管理局药品审评中心中国新药杂志 2022 年第 31 卷第 18 期 物药CMC简介1975 年，Köhler G 和 Milstein C 建立的杂交瘤 技术使规模化制备高特异性、均一性的单克隆抗体 ( 以下简称单抗) 成为可能，由此获得的单抗在疾病 诊断和各种检测中发挥了巨大的作用。基于该项技 术，1979 年，Schlossman 和其同事发现了靶向 T 细胞 表面抗原并具有清除 T 细胞单抗 OKT3( muromonab- CD3) 。经过临床试验验证，1986 年，美国 FDA 批准 OKT3 用于器官移植后的急性排斥，这也是 FDA 批 准的第一个单抗药物。但由于鼠源性抗体在人体反 复使用后出现的人抗鼠抗体反应，很大程度上限制 了其在临床治疗中的应用，这也导致 2006 年以前仅 有寥寥几个抗体产品批准上市。随着分子生物学的 发展，人们已可通过抗体工程技术制备基因工程抗 体，如人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体等， 治疗用抗体药物已逐渐成为生物技术药物开发的热点。随着对抗体的结构和功能的深入了解，新一代 更符合临床治疗需求的新型抗体药物( 如糖工程抗 体、Fc 融合蛋白、抗体偶联药物、双特异抗体、抗体 片段等) 不断出现，抗体治疗的疾病种类也在不断 扩大。截至 2015 年，FDA 仅批准了第 50 种抗体药 物，然而仅仅 6 年多时间，2021 年 4 月 FDA 便批准 了第 100 个抗体 dostarlimab，抗体类药物正式进入 了“百”抗时代［1］。这些抗体类药物主要批准用于 肿瘤、炎症性疾病、器官移植排斥、偏头痛和感染性 疾病。据统计，治疗用抗体类药物 2018 年全球销售 总额约为 1 152 亿美元，预计到 2025 年将会达到 3 000 亿美元［2］。相比发达国家，我国抗体类药物 的研发起步较晚，但随着抗体类药物研发的工程技 术开发、人才队伍建设以及投资规模等方面的不断 发展，我国抗体类药物开发正处于快速发展的阶段， 大量从事抗体类药物创新研发的公司不断涌现，抗 体类药物的申报数量也在逐年增长，虽然仍存在热 门靶点大量集中的现象，但差异化现象已逐渐显现。为更好地促进我国抗体类药物产业科学健康的发 展，本文参考相关技术指南和专业文献，初步探讨了 单抗药物风险因素，阐述了对单抗药物设计、早期筛 选及非临床研究计划的一般考虑，以期为申办方、研 究者以及审评人员提供参考。1.影响抗体药物有效性和安全性的因素1.1 抗体类别、亚型、结构以及功能 1.1.1 抗体的类别和结构抗体的基本结构是由 2 个完全相同的重链( heavy chain，H) 和 2 条完全 相同的轻链( light chain，L) 通过二硫键连接的呈 Y 形的单体。根据 H 链恒定区抗原性的差异又可将 其分为 5 类: α 链、δ 链、ε 链、γ 链和 μ 链，抗体也对 应被认为 5 类: IgA，IgD，IgE，IgG 和 IgM。按照 L 链 的不同，抗体又可分为 κ 型和 λ 型。抗体的 H 链和 L 链靠近 N 端的氨基酸序列变化较大，形成的结构 域称为可变区( variable region，V 区) ，靠近 C 端的氨 基酸序列相对恒定的区域称为恒定区( constant re- gion，C 区) 。V 区的 H 链和 L 链分别称为 VH 和 VL，VH 和 VL 各有 3 个互补决定区( complementarity determining region，CDＲ) ，可与抗原表位形成互补的 空间构象。C 区的 H 链和 L 链分别称为 CH 和 CL。截至目前所有批准的治疗用抗体都是 IgG，标准的 IgG 抗体 结 构 由 2 个完全相同的抗原结合片段 ( Fab) 和 1 个可结晶片段( Fc) 组成。其中 Fab 段由 L 链( 包括 VL 和 CL 结构域) 和 H 链的 VH 和 CH1 结 构域组成，可特异性地与单个抗原表位结合; Fc 段 是由 1 对 H 链的 CH2，CH3 结构域组成，无抗原结合 活性，但可与 Fc 受体( FcＲ) 或补体成分 C1q 相互作 用而发挥重要的功能效应。2 个 Fab 段通过柔性铰 链区与 Fc 段相连，这种结构可将结合的抗原与免疫 系统的体液成分和细胞成分“桥联”，在识别抗原的 同时，发挥 Fc 段介导的功能效应［3］。 1.1.2 人 FcＲs 及表达特征 在人体中，与 IgG 的 Fc 段结合的 FcＲs 共有 10 种［4 － 5］，包括 6 种经典的 IgG FcＲs( 即 FcγＲI/CD64，FcγＲIIA/CD32A，FcγＲIIB/ CD32B，FcγＲIIC/CD32C，FcγＲIIIA/CD16A，FcγＲIIIB/ CD16B) 、2 种非经典的 FcＲs( 即 FcＲn 和 TＲIM21) 和 2 种 FcＲ 样受体( 即 FcＲL4 /CD307d 和 FcＲL5 / CD307e) 。这些 FcＲs 主要表达于免疫细胞( 包括血 小板) 及一些非免疫细胞( 如内皮细胞) 表面，并且 不同细胞表达的 FcＲs 组合和表达水平各自不同。在血管内皮细胞和肠上皮细胞表面表达的 FcＲn，参 与 IgG 的循环和间接转运( 从循环系统进入组织，反 之亦然) ，而在胎盘母体一侧滋养层细胞表达的 FcＲn，可将母体 IgG 主动转运到胎儿血液中。除了 运输和循环 IgG 的作用外，FcＲn 还被报道运输 IgG 结合的抗原，促进树突状细胞、单核/巨噬细胞和中 性粒细胞对抗原的递呈及随后的免疫应答。FcＲL4 和 FcＲL5 仅在 B 细胞表达，其中 FcＲL5 在多种 B 细 胞亚群中表达，而 FcＲL4 仅在组织记忆型 B 细胞中 表达。TＲIM21 是一种广泛表达的细胞内受体，但 在自身免疫性疾病患者的上皮细胞和胶质细胞表 面也有表达。经典的 FcγＲs 又可分为激活性 FcＲs ( 包括高亲和力的 FcγＲI 和低亲和力的 FcγＲIIA， FcγＲIIC，FcγＲIIIA) 和抑制性 FcＲs( FcγＲIIB) 。激 活性 FcＲs 可通过胞质内的免疫受体酪氨酸激活基 序 ( immunoreceptor tyrosine-based activation motif， ITAMs) 的磷酸化招募蛋白酪氨酸激酶( protein tyro- sine kinase，PTK) 来传导激活信号，最终会导致效 应细胞的激活、细胞因子/趋化因子的释放以及细胞 的迁移。而抑制性 FcγＲIIB 通过胞内的受体酪氨酸 抑制 基 序 ( immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIMs) 的磷酸化并招募蛋白酪氨酸磷酸酶 ( protein tyrosine phosphatase，PTP) 从而达到抑制和 平衡 PTK 参与的激活信号通路。FcγＲI 在单核/巨 噬细胞以及一些树突状细胞中组成性地表达，在炎 症状态下在中性粒细胞和肥大细胞表面也可诱导表 达。FcγＲIIA 在所有的髓样细胞以及血小板表面表达，在淋巴细胞表面无表达。FcγＲIIB 在 B 细胞和 嗜碱性粒细胞表面高表达，在单核细胞、组织巨噬细 胞和树突状细胞表面也有表达。FcγＲIIC 仅在携带 FCGＲ2C-OＲF 等位基因的个体( 约占人群的 20% ～ 25% ) NK 细 胞、单核细胞和中性粒细胞表达。FcγＲIIIA 仅在 NK 细胞和单核/巨噬细胞表面表达。FcγＲIIIB 仅在中性粒细胞有较高表达，在碱性粒细 胞也有少量表达。FcＲs 所触发的细胞反应不仅取 决于其细胞表面的表达水平和传递信号的能力，还 取决于其结合的配体。研究显示，免疫球蛋白( im- munoglobulin，Ig) 与 FcＲs 相互作用的亲和常数( KA ) 范围为 2 × 104 M － 1 ～ 1 × 1010 M － 1，可区分为高亲和 力 FcＲs 和低亲和力的 FcＲs，高亲和力的 FcＲs 可与 游离/单价 Ig 结合，而低亲和力的 FcＲs 只能与免疫 复合物、聚合体或调理形式的 Ig 结合［3 － 7］。1.1.3 抗体 Fc 段介导的功能效应Fc 段介导的 功能效应包括［4 － 5］: ① Fc 介导的细胞激活，Fc 可与 激活性 FcγＲs 结合，直接激活表达 FcγＲs 的免疫细 胞( 如 NK 细胞、血小板、巨噬细胞等) ，进而导致细 胞因子释放、激活相关的凋亡，以及主要由 NK 细胞 介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用( antibod- y-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC) 和由巨 噬细胞和粒细胞介导的抗体依赖性细胞介导的吞噬 作用( antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP) ; 对于某些共刺激分子( 如 4-1BB，CD40 等) 激动型单 抗，Fc 与 FcγIIB 结合后可诱导靶细胞表面的靶抗原 聚集，进而导致靶细胞激活和细胞因子释放［8］。Fc 介导的补体激活和补体依赖性细胞毒作用( comple- ment dependent cytotoxicity，CDC) ，2 个以上的抗体 Fc 段与 C1q 结合后，可导致 C1q 发生构型改变，通 过经典途径激活补体系统，最终在靶细胞表面形成 攻膜复合物( membrane attack complex，MAC) ，MAC 插入靶细胞细胞膜，形成渗漏斑或亲水性孔道，进而 导致靶 细 胞 裂 解。② Fc 介 导 的 细 胞 因 子 释 放， ADCC 和 CDC 介导的靶细胞( 如肿瘤细胞) 杀伤作 用可导致细胞因子释放( 包括肿瘤裂解综合征) ; 而 补体激活过程中形成的过敏毒素 C3a 和 C5a 又可 与免疫细胞( 如粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和嗜碱 性粒细胞) 表面的 C3aＲ 和 C5aＲ 结合，进而导致这 些免疫细胞的激活、驱化、ADCP 和细胞因子释放。1.1.4 人IgG 亚型与FcＲs 亲和力和Fc 功能活性 人 IgGs 又可分为 IgG1 ～ IgG4 这 4 种亚型，由于 Fc 段 的不同，不同的 IgG 亚型与不同的 FcＲs 或 C1q 有不 同的亲和活性，这导致不同亚型的 IgGs 体外和体内 功能活性有明显不同。IgG1 可与除 FcＲL4 之外的 所有的 IgG FcＲs 结合; IgG2 可与 FcγＲI，FcγＲIIB 和 FcＲL4 以外 的 IgG FcＲs 结 合; IgG3 可 与 所 有 IgG FcＲs 结 合; IgG4 可 与 FcγＲIIIB 以 外 的 所 有 IgG FcＲs 结合。IgG1 是治疗性单抗最常采用的亚型，可 与激活性和抑制性的 FcγＲs 结合，能够诱导 ADCC， ADCP 和 CDC; IgG2 的铰链区相对较短，上铰链区含 有额外的半胱氨酸残基形成的二硫键可影响 IgG2 的空间构象和功能，IgG2 与 FcγＲs( 尤其与 FcγＲI) 的相互作用比 IgG1 弱，但 IgG2 仍可通过 FcγＲIIA 引发单核细胞介导的 ADCC 以及巨噬细胞介导的 ADCP 作用。IgG3 与 FcγＲs 的相互作用较强，可引 发 ADCC，ADCP 作用，并且引发 CDC 的作用优于 IgG1，但 IgG3 的铰链区较长( 难以制备和生产) ，其 核心铰链区有 11 对二硫键，因此对蛋白酶切割不稳 定，半衰期也较其他亚型相对较短( 可能与 FcＲn 的 亲和力有关) ，目前尚没有批准的 IgG3 亚型的单抗。IgG4 的上铰链区较短，除与高亲和力的 FcγＲI 有相 互作用外，与其余 FcγＲs 的相互作用较弱，不会引发 CDC 和 NK 细胞介导的 ADCC 作用，但可引发 AD- CP 作用。在体内，IgG4 分子会经历 Fab-arm 交换， 从而形成半分子以及双特异功能单价抗体［3，5，9］。1.1.5 候选抗体的设计及工程化改造 由于不同 的 IgG 亚型的铰链区及 Fc 功能效应各有不同，在设 计和筛选候选单抗时，研究者可结合靶点表达分布 情况和拟定作用机制，平衡获益和风险，选择合适的 IgG 亚型或 Fc 结构。如果 Fc 介导的功能效应对有 效性并无任何贡献( 如靶向可溶性靶点或阻断细胞 表面受体信号传导的单抗) ，反而出现不期望的风 险时，研究者可能会选择 Fc 功能效应较低的 IgG4 或采用工程改造使 Fc 功能效应沉默。例如: 已批准 上市的 PD-1 单抗药物( nivolumab 和 pembrolizumab) 就采用了功能活性较弱的 IgG4［10］，以降低对 T 细胞 清除作用。相反，如果 Fc 介导的功能效应对有效性 至关 重 要 ( 如 利 用 ADCC，CDC 作用以清除靶细 胞) ，这时就需要保留 Fc 功能效应。但这有可能会 带来安全性风险，例如: 在非靶细胞表面也有较高水 平的靶抗原表达时，可能会导致这些细胞/组织的损 伤。靶向 CD40L 的单抗与血小板表面的 FcγＲIIA 结合，可能导致血小板激活和血小板减少症［11］。在 考虑是否保留 Fc 功能效应或是否进行工程化改造 以增加或降低 Fc 功能效应时，应平衡风险和获益，考虑的因素包括: ① 靶抗原在靶细胞和其他正常/ 效应细胞中的表达水平是否存在明显差异。② 是 否可以对 Fc 段进行改造，使其保留与有效性相关的 FcγＲ 相互作用位点，从而使与风险相关的 FcγＲ 相 互作用位点突变沉默。例如: 靶向免疫激活受体 ( 如 CD40，4-1BB) 的激动型抗体，就需要消除 IgG1 与激活型 FcＲs( 包括 FcγＲI，FcγＲIIA，FcγＲIIIA) 的 结合活性，保留甚至增强 IgG1 或 IgG4 与抑制性受 体 FcγIIB 的亲和力［10］。随着结构生物学研究的不断进展，研究者对影 响抗体功能的关键结构( 相互作用界面和糖基化位 点及糖型) 的认识越来越充分，例如: 添加岩藻糖可 降低单抗与自然杀伤细胞和巨噬细胞上表达的 FcγＲIIIa 的亲和力，降低 ADCC 作用; 添加半乳糖可 增强 CDC 作用; 唾液酸化在增加肝细胞对单抗摄取 的同时还可降低 ADCC 作用［12］。为满足不同的临 床需求或竞争差异化的需求，基于结构生物学和拟 定作用机制的工程改造抗体也越来越多［8］，例如: 用于湿性年龄相关性黄斑变性的玻璃体注射药物雷 珠单抗( ranibizumab，Fab 片段) 和 brolucizumab( 单 链抗体片段) ，通过改变抗体的分子大小，提高了组 织渗透力; 抗 CD20 抗体 obinutuzumab 和抗 CCＲ4 单 抗 mogamulizumab，通过去除 Fc 段盐藻糖修饰增强 了 ADCC 活性; 第 2 代 抗 CD20 抗 体 ocaratuzumab 通过 Fc 段氨基酸替换增强了 Fc 与 FcγＲIIIA( 包 括 158V 和 158F) 的亲和力及 ADCC 活性; 抗 C5 抗体 eculizumab 通过跨亚型 Fc 段整合( 具有 IgG2 的 118 ～ 260 氨基酸和 IgG4 的 261 ～ 447 氨基酸) 降低了 Fc 功能效应，PD-L1 单抗 atezolizuamb 通过 突变糖基化位点( N298A) 去除糖基化消除了 Fc 功 能效应。这些药物的成功上市，均说明了单抗药物 结构设计的重要性。1. 2 药理作用机制及靶点特性抗体一般通过 3 种机制发挥作用，即作为拮抗 剂、激动剂、通过动员具有细胞杀伤功能的先天免疫 成分的细胞毒性反应发挥调理作用或促进细胞表面 受体内化和降解。作为阻断剂可阻断配/受体的相 互作用; 而激动型单抗则是模仿配/受体的相互作用 从而启动有助于清除病原体细胞的信号级联反应。具有调理作用的单抗，可通过其抗原结合部位与靶 点结合，通过其 Fc 段激活补体或与先天免疫细胞表 面的 FcγＲs 结合，通过 CDC，ADCC 或 ADCP 发挥细 胞毒性杀伤/吞噬作用。一般抗体会通过以上多种 机制组合发挥作用。 选择合适的靶点是开发抗体药物时需要慎重考 虑的重要一环，除拟用药理作用机制外，还应充分考 虑靶蛋白的生物学功能和表达特征，包括: ① 靶蛋 白属于分泌性介质还是细胞表面受体; 对于细胞表 面受体，还需考虑其在哪些类型的细胞或在何种细 胞状态( 免疫激活/免疫耗竭) 下表达，表达丰度如 何，是否可以脱落或内化［13］。② 靶蛋白是否存在 基因多态性或剪接变体，是否与其他蛋白或自身形 成二聚体或多聚体。③ 靶蛋白的生物学功能，基于 文献或数据库对靶点的生物学功能/作用( 包括非 期望的药理学作用) 以及下游的信号通路( 包括与 其结合的配体和受体) 进行全面的分析。这些信息 可能来自基因敲除/转基因小鼠模型或其他动物模 型的相关研究信息，也可能来自同靶点药物的已有 临床/非临床研究信息，或者存在靶点自发突变的相 关人群的研究信息。若靶点涉及多条信号通路、生 物级联效应或细胞因子释放，当可能导致某一无法 被生理反馈机制完全控制的生物放大效应时，应引 起高度关注。④ 靶蛋白在患者和正常人、疾病组 织/微环境和正常组织/微环境中的表达差异，例如: 对于拟通过细胞毒性杀伤作用治疗肿瘤的单抗，理 想的靶点应该是仅在肿瘤细胞表面表达而在正常细 胞中无明显表达的肿瘤特异性抗原。1.3 质量控制水平 相比小分子药物，单抗的药学质量控制水平对 其安全性和/或有效性的影响更大。高分子聚合物、 宿主细胞残留成分、内毒素等均可能给临床带来安 全性风险［14］。产品中来自生产细胞的杂质( 尤其是 先天免疫应答调节杂质，如脂多糖、β 葡聚糖、鞭毛 蛋白、高迁移率族蛋白和核酸) 以及高水平的单抗 聚合物( 多个 IgG 分子相互靠近) 可作为危险信号 促进 DC 细胞的成熟、激活、蛋白胞吞和递呈，直接 诱导机体产生抗宿主细胞蛋白抗体和/或抗药抗体 ( anti-drug antibodies，ADA) 。抗宿主细胞蛋白抗体 如果能够和人体细胞产生交叉反应，则可能导致自 身免疫性疾病产生。有些聚合物( 含有重复结构， 能够直接与 BCＲ 结合) 在没有 T 细胞的帮助下也可 直接激活 B 细胞产生 ADA( 主要为 IgM) 。此外，单 抗聚合物还可通过促进靶受体或 FcγＲ 聚集和激活 导致放大的或非期望的 Fab 和/或 Fc 段介导的药理 学效应。单抗产品的来源也是影响免疫原性的重要 因素，虽然与嵌合型、人源化或全人源的单克隆抗体相比，鼠源抗体可引发人体强烈的免疫应答，但值得 注意的是，嵌合型、人源化和全人源单克隆抗体也可 引发较高发生率的免疫原性。单抗中新型序列( 如 CDＲs 和其他新型序列) 、突变( 如为增加 Fc 功能效 应、稳定性而进行的基因突变，亲和力成熟所导致的 新独特型) 、修饰( 如氧化、脱酰胺、醛基化、外源性 糖型) 、新型结构( 如融合蛋白、双特异性或多特异 性抗体、单链片段、单域抗体) 、连接子或连接区形 成的新表位，理论上都可能被抗原递呈细胞处理和 递呈给 Th 细胞，帮助 B 细胞形成 ADA。此外，制剂 中所采用的辅料( 如人血清蛋白和聚山梨醇酯) 以 及容器密闭系统的材料( 包括萃取物和浸出物) 也 有可能会与单抗发生相互作用进而影响产品的质量 ( 导致蛋白聚集、变性或形成加合物) 和免疫原性， 进而导致临床风险［15］。1.4 拟用患者人群 虽然单抗具有较高的选择性和特异性，但不同 适应证或者同一适应证的不同患者对同一药物的反 应往往有很大差异，这提示患者个体间的差异对有 效性和安全性有很大的影响。可能影响有效性和安 全性的患者个体差异因素包括: 疾病特征( 疾病类 型、严重程度、靶蛋白表达水平) 、年龄( 如儿童与成 人) 、遗传学( 如基因多态性、基因突变等) 、免疫学 ( 如免疫状态、免疫能力、预存抗体水平) 、伴随治疗 ( 药物相互作用) 等。2.抗体药物非临床研究策略的一般考虑2.1 预期目标在制定单抗的非临床研究计划时，应根据对上 述可能影响产品有效性和安全性的风险因素的科学 理解以及临床拟用情况( 如适应证、患者人群、拟定 给药方案等) 合理设计支持性的非临床试验。这些 试验获得的数据应能够满足以下评估目的: ① 阐明 毒性靶器官、毒性反应的剂量/暴露量关系以及潜在 可逆性。② 确定临床试验中需要监测的与安全性 和有效性相关的指标/生物标志物。③ 可估算人体 临床试验的起始剂量、递增剂量以及临床预期治疗 剂量范围。④ 能够初步提示在拟用患者人群中预 期获益大于风险。2.2 试验项目及时间安排 与小分子药物不同，单抗由天然氨基酸组成，分 子量较高，仅在细胞外液中分布，不会进入细胞质或 细胞核中，不与 DNA 直接发生相互作用，一般无遗 传毒性风险，通常无需开展遗传毒性试验。单抗在 体内可被代谢成为小肽和氨基酸，一般不会产生活 性代谢产物，因此也无需开展代谢研究。单抗的靶 点一般为细胞外可溶性介质或细胞表面受体，并具 有较高的特异性和亲和力，因此发生脱靶毒性的可 能性较小，单抗药物的毒性反应主要是放大的药理 学作用。单抗与 hEＲG 通道或其他离子通道的细胞 外/细胞内结构域发生相互作用的可能性较低，因此 一般不会对心脏的收缩功能产生明显影响，一般情 况下不需要进行心血管系统体外安全药理学研 究［16 － 18］。单抗所需要开展的非临床安全性试验项 目可参考 ICH S6 ( Ｒ1) 推荐的基本框架，非临床试 验的实施时间可参考 ICH M3 ( Ｒ2) 的指导意见。2.3 临床转化思维 单抗的非临床试验一般包括采用人体/动物细 胞和组织进行的体外试验以及采用相关动物种属/ 模型进行的体内试验，这些体外和体内试验都有助 于确定单抗的药理毒理学特征。由于体外和体内、 动物和人体、健康人与患者以及患者人群之间存在 各种差异，如体外静态和体内动态的差异，靶点的结 构、分布、表达调控和生物学功能的差异，免疫成分 的结构、功能和状态的差异等，任何一项体外和体内 试验都不能完全解决这种差异对临床转化的影响， 各有其优缺点，在设计非临床试验时应尽可能根据 试验的目的和试验影响因素对试验进行优化，以提 高预测的准确性。在对这些非临床试验数据进行解 释和评估时，应考虑与人体的相关性和局限性，尤其 要关注向人体转化的不确定性。3 有助于风险获益评价的体外试验由于抗体具有种属特异性，关键的体外药理活性 试验( 如与靶抗原的结合活性和功能活性试验等) 应 同时采用不同种属( 包括人) 的靶蛋白、细胞/组织进 行评估，定量评价单抗在不同种属中的相对生物活性 和敏感度，以帮助选择合适的动物种属用于进一步的 体内药理学和毒理学试验，同时也有助于将动物体内 试验结果外推至人体。这些体外试验可能会发现动 物体内试验所不能预测的免疫毒性或可阻止临床试 验开展的非预期免疫反应。在缺乏相关动物种属的 情况下，这些在人体细胞/组织中进行的体外试验对 预测人体有效性和安全性具有重要的价值，也是推算 人体首次临床试验起始剂量的重要依据［19］。3.1 评估 Fab 功能效应的体外试验 与 Fab 相关的效应包括期望的药理学作用和非 期望的脱靶作用。评估 Fab 功能效应的体外试验包括但不限于: 与靶抗原的亲和力试验、抗原表位表征 试验( 如采用晶体衍射技术表征抗体互补位-抗原表 位的空间构象) 、与天然配体的竞争结合试验( 拮抗 剂应与天然配体竞争结合，而激动剂应尽可能避免与 天然配体竞争结合) 、靶点占有率、细胞水平的功能活 性试验( 如检测对下游信号的阻断/激动作用) 等。3.1. 1 on-target 效应应评估候选单抗与人和不 同动物种属的靶抗原/靶细胞的特异性结合作用。若可获得靶抗原的重组蛋白，可 采 用 BIAcore， ELISA，KinExA 等方法测定体外结合力，包括解离常 数( Kd ) 以及结合动力学参数( Kon /Koff ) 等。基于细 胞结合的亲和力试验可采用流式细胞术测定 EC50 值。在理想情况下，如果靶点在血液细胞或其他容 易采集的细胞表面表达，最好能够采用流式细胞术 评估人和毒理学试验动物细胞表面天然蛋白与抗体 的亲和力。此外，也可采用免疫组化( immunohisto- chemistry，IHC) 技术评估与人和动物组织的结 合［19］。需要强调的是，抗体-抗原结合力高并不意 味着更强的功能活性，靶向同一抗原的不同抗体由 于结合的抗原表位不同，可能导致其功能活性有明 显不同。例如: 靶向 CD28 的抗体如果结合部位在 天然 CD86 结合部位附近，则传导共刺激信号; 但与 CD28 远端位点结合的超级激动抗体即使没有组织 交叉反应( tissue cross-reactivity，TCＲ) 识别的第一 信号也可直接激活 T 细胞［20］。因此，除评估与靶抗 原的结合活性外，还应采用临床相关的体外/离体试 验系统评估单抗在人和毒理学试验动物中的相对药 理学活性，如对细胞的清除、抑制、激活和细胞因子 生成的影响等。在进行这些试验时，应采用梯度稀 释的抗体，以获得完整的剂量-反应曲线，评价指标 除 EC50或 IC50外，还应关注 Emax，尤其在与同靶点其 他药物进行比较时。试验中所采用靶抗原表达水 平/浓度应能反映拟用患者人群中实际生理情况。由于体外刺激试验中所采用的基质( 如采用全血或 PBS) 对有效浓度范围的影响较大，在试验中应进行 谨慎的对比和分析［19］。除了期望的药理学作用外， 还应采用这些体外试验测定候选单抗是否有非期望 的免疫学作用，如阐明拮抗剂有无激动作用，受体阻 断剂有无细胞清除作用等。3.1. 2 脱靶毒性 采用计算机对靶抗原和其他蛋 白的序列同源性进行分析，可以初步了解候选单抗 的潜在脱靶风险。对于同源性较高的蛋白或同一蛋 白家族的其他成员，应测定候选抗体的脱靶结合风险。 采用 IHC 技术进行的组织交叉反应 TCＲ 试验 除可用于表征单抗与人体组织/细胞的交叉反应性、 为靶点的分布提供有用信息外，也可用于脱靶风险 的筛选和评估，发现非预期的结合表位。对于单抗 药物，一般采用一系列人体组织进行 TCＲ 试验，这 也是首次人体临床试验之前所推荐的一系列安全性 评估 试 验 之 一。不推荐采用全套动物组织进行 TCＲ 试验，一般仅在人体组织中发现存在交叉反应 的情况下，才会采用毒理学试验所选的相关动物组 织进行 TCＲ 试验，这主要是为了确证毒理学试验所 采用的动物组织中是否存在人体组织中类似的交叉 反应性特征，评估动物试验结果与人体的相关性，解 释动物试验中发现的毒性结果。需要注意的是，在 抗体无法到达的区域( 如细胞质、细胞核等) 发现的 阳性结合通常无临床意义。应在药理学和安全性评 估的全部数据背景下对 TCＲ 试验结果评价和解读。 根据目前的经验，TCＲ 试验很少能够发现非预期结 合反应( 脱靶风险) ，这主要是因为 TCＲ 试验敏感性 较差，并不能代表生理条件。在进行 TCＲ 试验时， 需要对多种条件进行优化，包括阳性对照组织、阴性 对照组织、合适的标记物或二抗、合适的固定剂和染 色程序、受试单抗的浓度范围等，此外还需要关注组 织样本的质量，通常需要采用 HE染色评估组织形 态，采用 IHC 标志物( 如抗平滑肌肌动蛋白抗体) 评 估组织样本的完好性。 由于 TCＲ 试验的预测脱靶毒性的价值较低，因 此业界开发了很多评估脱靶毒性的替代方法，包括 人蛋白微阵列技术［21］，如 Protoarry，HuProt，这种技 术是采用高通量自动化的蛋白表达系统表达和纯化 带有标记的人蛋白，然后将这些蛋白固定在经微细 加工的微阵列表面上( 约包含 10 000 ～ 15 000 多种 人蛋白) ，以实现高通量地结合筛选。但这些微阵 列技术的蛋白均不是采用哺乳动物细胞表达，有一 定的缺点: ① 这些蛋白缺少完整的哺乳动物细胞的 糖基化模式。② 不确定这些蛋白是否以天然构象 的形式存在。③ 当蛋白点样到玻璃载玻片上时也 可能发生变性。最近，越来越多采用人细胞阵列技 术，例如: Ｒetrogenix 公司采用专有的表达载体阵列， 能够在载玻片的人类细胞中分别单独过表达约 5 500 多个全长人质膜蛋白和分泌蛋白，这些膜蛋白 更接近天然构象，并且具有哺乳动物细胞的糖基化 模式，与人体生理条件更相关，假阳性率更低。Inte-gral Molecular 公司的人质膜蛋白阵列技术( Mem- brane Proteome Array) 也是采用的基于细胞的结合 筛选平台，建立了可表达 5 300 多个全长人质膜蛋 白的 HEK-293T 细胞库，采用高通量的流式细胞术 检测抗体与非固定细胞表达的膜蛋白的结合活性， 对于筛选试验检测到的结合靶点，还可以通过梯度 稀释后分析稀释结合曲线进一步确证是否属于特异 性结合。由于采用流式细胞检测技术，因此该技术 平台的效率和敏感性更高。不足的是这一平台技术 不能检测抗体与分泌蛋白的脱靶结合作用。3.2 评估 Fc 段功能效应的体外试验一系列的体外试验可用于评估 Fc 段的功能效应， 如与人 FcγＲs 亲和力研究以及细胞水平的 ADCC，CDC 和 ADCP 试验等。对 Fc 功能试验的要求很大程度 上取决于所选择的 IgG 亚型、工程化改造目的以及 拟定的作用机制。对于 ADCC 和 ADCP 试验，靶细胞的选择主要 取决于单抗的靶点表达情况，可采用人原代细胞，也 可以采用表达靶蛋白的细胞系。对于 ADCC 试验， 免疫效应细胞一般为人原代 NK 细胞或采用 IL-2 激 活、并表达高水平的 FcγＲIII A 的 NK 细胞系( 如 NK-92 细胞) 。靶细胞诱导的 NK 细胞激活可通过 流式细胞术检测( 细胞激活标志物 CD69 和 CD107a 增加) 。此外，也可以采用转染表达人 FcγＲIII A 和 报告基因［携带荧光素酶( luciferase) 的 NFAT 启动 子结构］的 Jurkat 细胞来评估效应细胞的激活程 度［19，22 － 23］。除了采用报告基因法评估效应细胞的 激活外，还可以采用 LDH 释放法、荧光素钙染色法、 CFSE 染色法或者 51Cr 释放法评估对靶细胞的杀伤 活性。ADCP 试验的效应细胞一般采用原代细胞 ( 全血或 PBMC) ，也可采用表达高亲和力的 FcγＲIII A 并转染报告基因的 Jurkat 细胞或体外传代的巨噬 细胞，通过荧光标记的靶细胞数量下降或采用流式 细胞术评估细胞绝对数量的下降来评估吞噬作用。由于在体内发挥 ADCP 作用的主要是网状内皮系 统，体外 ADCP 试验并不能反映体内的复杂情况，因 此这些体外试验只能用于定性 ADCP 作用，而不能 定量转化到人体。对于 CDC 作用的评估，可直接评估 C1q 与 Fc 的亲和力。但更常用的做法是采用表达目标靶抗原 的细胞系或原代细胞与人补体及不同浓度的单抗共 孵育，采用 ADCC 试验中类似的方法检测靶细胞的 毒性。 可基于这些 Fc 功能效应体外试验( ADCP 除 外) ，采用最低预期生物效应剂量水平( minimum an- ticipated biological effect level，MABEL) 法计算人体 起始剂量，但前提是所采用的靶细胞的靶抗原的密 度/表达水平要与拟用患者人群中体内靶细胞的抗 原表达水平一致/相当，这样才可以基于体外试验中 EC50值计算 MABEL。此外，如果在同一试验条件 下，发现受试抗体引发的细胞和补体激活效应远远 高于阳性对照［如阿仑单抗( alemtuzumab) 、利妥昔 单抗( rituximab) ］，应需谨慎考虑，即使这些增强的 反应是所期望的或者可能增加有效性。 3.3 体外细胞因子释放试验( cytokine release as- say，CＲA) 首先需要明确 CＲA 主要是用来发现风险/危 害，而不是对人体风险进行定量评估。对于作用机 制涉及细胞因子释放的单抗，CＲA 可用于作用机制 研究，也可用于候选抗体的筛选［19，24 － 25］。治疗性单抗可能通过 Fab 介导的免疫细胞表面 靶受体聚集/激活和/或 Fc 介导的与 NK 细胞、中性 粒细胞 FcγＲs 相互作用诱导细胞因子释放，在人体 中导致形成细胞因子释放综合征( cytokine release syndrome，CＲS) 。这些细胞因子可能来自靶细胞， 也可能来自效应细胞。在开发候选抗体药物时，应 对靶点的生物学作用及作用机制的已有信息进行综 合分析，设计并筛选合适的候选抗体结构，并考虑是 否需要进行 CＲA。由于 CＲS 有可能给人体带来严 重的危害甚至导致死亡，因此即使作用机制不涉及 细胞因子释放，在以下情况下都应进行体外 CＲA， 以识别临床可能出现的 CＲS 风险［19］: ① 单抗可与 免疫细胞或其他能够产生细胞因子/趋化因子的细 胞( 如 内 皮 细 胞、成 纤 维 细 胞 等) 表 面 的 靶 点 或 FcγＲs 结合。② 抗体与 FcγＲs 有很强的交联能力， 即使靶细胞不表达细胞因子。③ 对于靶向可溶性 靶点的单抗，通常不要进行 CＲA。但也有例外的情 况，例如: 有比较强的证据提示有免疫复合物的形成 ( 如靶点为多聚体蛋白) ，或靶抗原在免疫细胞表面 存在膜蛋白形式的剪接体( 如 IL-6) ，这时就需要进 行 CＲA。④ 2 个临床经验有限的单抗联合使用，即 使单个抗体已阐明无诱导细胞因子释放的潜力。值 得注意的是，体外 CＲA 并不能预测大量细胞凋亡/ 坏死导致的细胞因子释放( 如肿瘤裂解综合征) 。 目前业界已开发了多种 CＲA 检测平台，不同的 研究者采用的方法也多种多样，所选择的受试抗体呈现形式、细胞类型、阳性对照抗体、细胞因子检测 方法和检测时间点等均各有不同。受试抗体的呈现 形式主要包括可溶性形式( 液相) 、湿法或干法直接 包被( 固相) 、抗 Fc 抗体捕获固定或与免疫细胞和 靶细胞共培养，其中可溶性形式和干法直接包被占 大多数。受试细胞包括全血细胞、外周血单个核细 胞( peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 、PBMC 与内皮细胞共培养等［25 － 26］。目前，国内外尚无专门 针对 CＲA 的技术指导原则，也无标准的试验方法， 应基于受试抗体的靶点、涉及的细胞群和可能的作 用机制选择并优化 CＲA 方法。在选定 CＲA 方法 后，需了解这种方法出现假阳性和假阴性概率，而这 很大程度上取决于所选择的阳性对照和阴性对照。为降低因细胞因子分析检测时间点错误所导致的假 阴性风险，应首先采用不同的供者细胞评估细胞因 子释放的动力学特征，研究中应伴随阳性对照，阳性 对照最好能够反映可能的/所期望的细胞因子释放 机制。如果作用机制涉及 FcγＲs 参与，应采用包含 所有表达 FcγＲs 的细胞( 包括中性粒细胞和血小 板) 和补体的全血细胞，并以阿伦单抗( Campath) 作为阳性对照［27］。而对于直接靶向 T 细胞和作用 机制可能涉及靶点聚集的抗体，基于 PBMC 的 CＲA 可能 更 加 敏 感，muromonab ( 靶 向 CD3 的 单 抗) / TGN1412 更适合作为阳性对照［28］。如果靶点仅在 组织中或疾病状态下表达( 如肿瘤细胞、激活的效 应细胞或自身致病性细胞) ，或者所涉及的细胞在 全血/PBMC 中并不存在，在 CＲA 试验中可能采用 细胞系或原代细胞( 如肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮 细胞或过表达激活所需靶点的细胞) 以模拟体内的 疾病状态。如果同时存在细胞因子释放和血小板激 活/聚集的风险( 如单抗可与血细胞板细胞表面受 体结合，或 ADA 形成的免疫复合物可与血小板表面 的 FcγＲ IIA 结合) ，这时就需要考虑 FcγＲ IIA 基因 多态性( 包括 FcγＲ IIA 131 H/H，FcγＲ IIA 131 H/Ｒ 和 FcγＲ IIA 131 Ｒ /Ｒ 这 3 种剪接变体) 对反应的影 响，因此应采用包含不同 FcγＲ IIA 变体的供者细胞 进行试验［19］。所选择检测细胞因子应与特定的作 用机制和所担忧的安全性高度相关，由于 IL-6，IL- 8，IFN-γ 和 TNF-α 常与临床细胞因子释放有关，因 此建议常规检测。其他可检测的细胞因子还包括 IL-1β，IL-2，IL-5，IL-10，IL-12 和 IL-17［29］。目前，有 多种方法可用于细胞因子定量检测，其中最常用的 是多重细胞因子检测，这种方法可以从少量的血清 或血浆样品中检测评估大量的细胞因子。若有可 能，药物浓度应在预测的人体有效药物浓度范围内， 但由于体外静态系统难以反映药物在体内的动态特 征，如组织分布、代谢和长期暴露等。为研究给药后 所导致的急性反应，可基于人体拟用剂量下的 Cmax 选择体外 CＲA 中的受试物浓度［19］。 对体外 CＲA 的结果解释需要考虑多方面的内 容包括: 拟用的患者人群、靶点的生物学特性、作用 机制及新颖程度( 对于没有临床经验的 first in class 产品需特别谨慎) ，细胞因子释放属于预期药理学 作用还是非期望的不良反应，细胞因子的来源，例 如: 来自 T 细胞的 IL-2 可导致效应记忆 T 细胞快速 扩增，需要引起高度注意。这与从 NK 细胞、巨噬细 胞和中性粒细胞中来源的细胞因子是不同的; 不同 供体间的反应频率与基因多态性的关系。结合体外 CＲA 的结果以及已有的药理毒理学数据，基于证据 权重 分 析 方 法，项目团队可能做出的决策包括: ① 在确定给药途径、给药剂量、给药速率、给药频率 给予相应的考虑。② 对药物进行改造，改变药物的 结构。例如: 采用单价抗体结构以避免靶点的交联 和聚集，采用工程方法使 Fc 功能沉默等。③ 排除 风险增加的人群。④ 制定风险控制计划，加强给药 后监测，制定明确的紧急干预措施，如给予类固醇皮 质激素、细胞因子/受体阻断剂等。⑤ 结合拟用患 者疾病的严重程度，预期的风险获益比，风险的可监 测、可控制和可接受程度，已有的替代治疗方法及可 及性等，综合考虑是否继续开发。4.小结与小分子药物不同，单抗的毒性反应主要是放 大的药理学作用，其有效性、安全性和药代特征与其 类别、结构、靶点特性、作用机制密切相关。在早期 筛选设计候选抗体时，应综合考虑当前对疾病病理 学机制、靶点表达分布和功能特性的认识以及预期 的作用机制，选择合适的 IgG 亚型或 Fc 结构，甚至 可能需要进行工程改造以去除对有效性无任何贡献 的功能或者增强拟用的功能活性。在制定非临床计 划时，应基于对风险因素的理解及临床拟用情况合 理设计非临床试验。在对非临床研究结果进行评价 时需关注人体转化的相关性和局限性，尤其要关注 因体外/体内、动物/人体、健康人/患者之间靶点表 达及功能活性差异所导致的非临床研究结果外推至 人体的不确定性。在推算首次人体临床试验起始剂 量时，应综合考虑所有的体外体内的药理学、药动学及毒理学试验数据，尽可能建立完整的剂量/暴露 量/靶点占有率-反应曲线关系，以确保所选择的起 始剂量能够出现预期的药理学作用，且在安全剂量 范围内，随后剂量递增时应基于新获得的人体数据 对建立的药动学/药效学模型不断修正［30］。文章信息源于中国新药杂志，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读