XH101

导读：癌症患者间新抗原差异是通用癌症疫苗/药物开发的一大难题，基于核酸的新抗原疫苗的开发是一种新的应对技术。体外转录（IVT）mRNA新抗原疫苗的代表性产品为BioNTech和罗氏子公司基因泰克合作开发的autogene cevumeran（BNT122），其他相似管线包括XH101、ABOR2014和LK101等。 2024年7月29日，福建医科大学刘小龙等人在MedComm（影响因子10.7）发表文章：Circular RNA-based neoantigen vaccine for hepatocellular carcinoma immunotherapy，他们开发了一种基于circRNA的肿瘤新抗原疫苗，通过表达肝癌新抗原Ptpn2_I383T，促进树突状细胞（DC）活化并增强DC诱导的T细胞活化，从而增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤。这种基于circRNA技术的肿瘤新抗原疫苗在小鼠肿瘤模型表现出卓越的肿瘤治疗和预防，为实体瘤新抗原免疫疗法提供了新的选择和应用前景。 01 研究背景 肿瘤新抗原(Neoantigens)是指只在肿瘤细胞表达，而在正常组织细胞中不表达的抗原分子。它们是由肿瘤细胞基因组突变、RNA剪接失调、翻译后修饰紊乱和病毒整合等机制产生的。肿瘤中的新抗原数量可高达成百上千甚至上万个，而每个患者的新抗原各不相同，呈现高度的个体差异性。 最近，BioNTech开发了一款表达胰腺癌患者20种新抗原的个性化mRNA新抗原疫苗—BNT122，在手术切除后的胰腺患者中，与化疗和免疫检查点疗法联用时，有潜力地延缓了PDAC患者的复发。同时，国内多家mRNA公司在肿瘤新抗原mRNA疫苗研发方面也取得显著进展： ·XH101: 新合生物开发的靶向胃癌公共新抗原的治疗性肿瘤mRNA疫苗。从大量胃癌患者中筛选、预测、验证出的一段免疫原性强、覆盖度广的肿瘤公共新抗原序列。 ·ABOR2014：艾博生物与臻知医学合作开发的编码近20种肝癌抗原的治疗性肿瘤mRNA疫苗，该疫苗经肌肉注射后可诱导患者自身免疫系统恢复抗肿瘤能力，联合PD-1抑制剂进一步激活T细胞。 ·LK101：北京立康开发的一款基于新生抗原的个性化治疗性肿瘤mRNA疫苗，覆盖了数十个新生抗原靶点。利用编码肿瘤新生抗原的mRNA体外转染DC细胞，兼具了mRNA疫苗和DC疫苗的优势。 02 肿瘤新抗原circRNA疫苗的设计 早在2022年，刘小龙团队在小鼠肝癌细胞系Hepa1-6中筛选并鉴定出七种可触发强烈免疫反应的突变编码肽，并且设计了一款由高免疫原性新抗原肽和临床级Poly（I：C）组成的肝癌肿瘤新抗原疫苗NeoVAC，可在HCC小鼠模型中产生强烈的抗肿瘤免疫反应。正是基于上述研究结果，刘小龙团队从七种筛选到的新抗原中选择免疫原性更显著的Ptpn2_I383T作为circRNA编码的肝癌新抗原（Neoantigen）。 本研究采用2018年Daniel Anderson开发的具有自我剪接功能的I型内含子环化策略构建circRNA骨架序列，并将其克隆至PET-28a质粒载体上。按照体外转录（IVT）→DNase I酶切→试剂盒纯化→重新环化（GTP+55℃，15min）→RNase R富集circRNA→纯化circRNA工序，制备得到高纯度的circRNA，并且通过琼脂糖凝胶电泳、PCR及Sanger测序确认环化反应成功制备circRNA。 在细胞水平，与LinRNA（线性mRNA）相比，circRNA表达荧光蛋白或者PTPN2新抗原的水平更高。 03 circRNA疫苗稳定性研究3.1 存储稳定性 相比LinRNA，circRNA无游离末端，拥有更高的稳定性。线性mRNA（LinRNA）对RNase R极其敏感，而circRNA耐受RNase R的降解。在室温条件下放置，随着时间的推移，LinRNA表达活性会出现极其显著的下降，相比之下，circRNA表达活性下降更加缓慢。这些数据表明，circRNA比线性RNA更稳定、蛋白表达更持久。 3.2 表达稳定性 小鼠尾静脉注射10ug circLuc LNP，活体成像系统显示circRNA主要靶向肝脏。共聚焦激光扫描显微镜显示Cy5 标记的 circRNA主要位于溶酶体。尾静脉注射LinGluc LNP或者CircGLuc LNP，LinGluc在注射第3天后表达出现显著下降，表达持续至第9天，相比之下，CircGLuc在注射第5天后表达出现显著下降，表达持续至第11天。 04 circRNA体外免疫原性评估 为增强多肽片段表达，研究人员采用三个多肽片段 3×PTPN2 的重复序列作为新抗原。CD80和CD86是两种重要的共刺激分子，主要由抗原呈递细胞（APCs）表达，对T细胞的激活和免疫反应起着关键作用。相比PBS或者CircGLuc对照组，转染circRNA3×PTPN2的DC细胞组，CD80、CD86及MHC 1表达明显增强，说明编码新抗原的circRNA疫苗明显促进DC细胞激活。 将转染circRNA3×PTPN2的DC细胞与未激活的T细胞共同培养会显著增加CD25+或者CD69+活化T细胞比例，而且，T细胞分泌的IFN-γ/TNF-α细胞因子水平也明显增加。 circRNA3×PTPN2免疫小鼠脾脏的离体 IFN-γ ELISPOT 测定表明免疫小鼠体内触发有效的T细胞免疫反应。此外，circRNA3×PTPN2疫苗还展现出对 Hepa1-6 肿瘤细胞显著的杀伤能力。 上述结果表明，circRNA3×PTPN2新抗原疫苗能够促进DC细胞成熟，刺激T细胞活化，从而增强T细胞介导的肿瘤细胞杀伤能力。 05 circRNA新抗原疫苗HCC治疗效果5.1 皮下HCC模型 皮下注射Hepa1-6荷瘤小鼠模型，与LinRNA LNP相比，尾静脉注射circRNA3×PTPN2 LNP会更加显著的抑制肿瘤生长。值得注意的是，60%（3/5）小鼠的肿瘤完全消失，并且，这种肿瘤抑制作用呈现剂量依赖性。在circRNA3×PTPN2 LNP免疫组小鼠的肿瘤组织中，发现更多的浸润T细胞，诱导更多的肿瘤细胞死亡。 5.2 原位HCC模型 在表达荧光素酶的Hepa1-6细胞的肝内肿瘤模型中，与PBS或者线性RNA对照组相比，注射circRNA3×PTPN2 LNP后，随着治疗时间的延长，肿瘤部位的荧光信号显著减低，最终，circRNA疫苗接种组80%的小鼠肝脏肿瘤完全消失，并且存活时间得到延伸。表征先天免疫反应的IL-6和TNF-α在circRNA疫苗接种组中也表现出更高的血清水平。在circRNA疫苗接种组，引流淋巴结中的成熟DC细胞比例更高，脾脏中的CD25 +和CD69 + T细胞比例更高，而且CD44+CD62L+ 中枢记忆 T 细胞比例也高。ELISPOT显示circRNA疫苗接种组小鼠脾脏分泌更多的IFN-γ，并且肿瘤组织中浸润T淋巴细胞更高。 总的来说，circRNA新抗原疫苗在小鼠皮下或者原位肝癌模型中均可触发有效的先天免疫反应和适应性免疫反应，抑制肿瘤生长，延长小鼠存活时间。 06 circRNA新抗原疫苗预防效果 在小鼠尾静脉间隔七天注射两次circRNA3×PTPN2 LNP，随后皮下注射Hepa1-6肝癌细胞，评估circRNA新抗原疫苗的免疫保护效果。与线性RNA或者PBS组相比，circRNA免疫小鼠体内的肿瘤受到更加显著的抑制，分泌IFN-γ的特异性浸润CD8+ T细胞比例更高。这些数据表明circRNA新抗原疫苗可触发有效的免疫反应预防肿瘤生长。 07 总结 采用PIE策略（permuted intron‒exon）体外构建circRNA，可在circRNA骨架中插入较长的靶标蛋白编码序列。相比依赖帽结构翻译的线性mRNA来说，IRES介导的circRNA更加稳定，蛋白翻译持续时间更久。而且，circRNA本身携带的I型催化活性的内含子序列具有免疫原性，从而起到佐剂的作用。 体细胞突变可以产生癌细胞特有的新抗原，而这些新抗原不存在于健康组织中。这一特性使它们成为开发免疫治疗策略的理想靶点。与多肽疫苗相比，circRNA具有更高的免疫原性，可以诱导更强大的先天免疫，使其成为一种有效的自我佐剂。与线性mRNA相比，circRNA在存储和蛋白表达稳定性方面更加卓越。这项工作开发的基于circRNA平台的肝癌新抗原疫苗在肿瘤小鼠模型中表现出非常有效的抗肿瘤效果，触发显著的先天免疫和细胞免疫反应。总之，这项工作充分证实基于circRNA的肿瘤疫苗拥有的巨大的临床转化潜力和独特的优势。在未来，随着circRNA制备工艺的成熟，circRNA肿瘤疫苗的开发会迎来新浪潮。 参考文献  [1] Wang F, Cai G, Wang Y, Zhuang Q, Cai Z, Li Y, Gao S, Li F, Zhang C, Zhao B, Liu X. Circular RNA-based neoantigen vaccine for hepatocellular carcinoma immunotherapy. MedComm (2020). 2024 Jul 29;5(8):e667. doi: 10.1002/mco2.667. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所转载文章系出于天坛生物，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。