Lysostaphin

Protein A蛋白简介Protein A作为抗体亲和捕获配基，得到广泛关注和竞相开发，它是金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureu) 细胞壁的组分，和胞壁的肽聚糖共价结合，简称为SpA[1, 2]。分子量42 KD，为单条多肽链分子，天然序列中不含半胱氨酸，因此人为在末端加入Cys后，可用于定向偶联[3]。SpA有5个高度同源的IgG结合结构域，从N端始记为E-D-A-B-C，分别含有51, 61, 58, 58和58个氨基酸残基[4]，每个结构域均由3个α螺旋和之间的2个loop环组成，helix II和III反向平行，helix I和前者之间存在夹角，domain B为30度，domain D和E均为15度[5]。A、B、C结构域同源性高达90%，domain D因多了三个氨基酸的插入以及其它位点突变造成同源性约80%， domain E的同源性约为70%差异更大[6]。图1：SpA的5个IgG结合结构域序列比对[7]SpA的C末端还有一个X结构域，由8个氨基酸、重复12次组成[6]，用于将SpA锚定到细胞壁上。因此，SpA完整序列为EDABCX（部分文献还会备注一个跨膜区M）。图2：A) Protein A基因组成。B) IgG的Fc区域的3个β-turn（灰色）和SpA B domain的前2个α-helix（红色）互作[8]SpA对多种类型的IgG具有高亲和力，对IgG1、IgG2、IgG4的亲和力为10^8 (M-1) [9]，但是对IgG3（约占总IgG的8%）的亲和力则非常弱。目前，大部分的抗体药物是基于IgG1或IgG4开发。表1：Protein A和Protein G与人不同类型抗体的亲和力[10]虽然Protein G也能和大部分抗体亲和（表1），但其和Fab-CH1以及Fc均有互作，结合强度高，洗脱pH低，更容易造成不稳定的抗体发生聚集，而Protein A则“主要”和Fc区域互作，洗脱pH更高，因此，大部分商业化使用的亲和层析是基于Protein A开发的[11]。SpA IgG结合结构域命名为何是EDABC而不是ABCDE？简言之，和基因的发现顺序有关，顺次命名，过程曲折励志。最初，1975年，H Hjelm和J Sjödahl等[12]，使用溶葡球菌酶 (Lysostaphin) 消化细胞壁，从S. aureus strain（菌株Cowan I）胞壁中释放Protein A，并通过IgG Sepharose 4B亲和层析柱（Cytiva，当时的GE Healthcare）分离。为了获得具有亲和力的最小片段，纯化后的蛋白继续使用胰酶进行部分消化以及IgG再次捕获，然后用离子交换 (Phosphocellulose，Whatman) 进行纯化及序列分析。获得至少3个高度同源的Fc结合区，每个大约由60个氨基酸残基组成，说明Protein A存在结合IgG的重复单元结构。一年后，1976年，前述文章的2作J Sjödahl，独立发表文章，继续求证[13]。将纯化后的Protein A蛋白，使用胰酶进行降解，根据降解片段在离子交换层析上的出峰顺序（8个组分），结合氨基酸组成序列分析和功能检测结果，将和Fc区域有亲和力的片段分为A、B和C三个区域，其各自具备抗体结合能力并高度同源 (80%) 。但是否还有活性区域被胰酶降解而丢失，或从未被分离到，以及是否有更大的片段以便对三个区域进行位置排序，仍待研究。如果使用胰酶直接降解金黄色葡萄球菌（非纯化后的Protein A蛋白），A和B区对应的片段仍在，而C区则没有被检测到，提示C区接近细胞壁，存在酶解的空间位阻[13, 14]。1977年，J Sjödahl继续独立研究并发表结果，用实验证实第4个互作区域的存在[14]，使用胰酶直接降解金黄色葡萄球菌（菌株Cowan I）： 1 通过调整酶解条件而产生更大的Protein A片段，经过前述同样的亲和及离子交换层析，分离出6个组分（数量更少、片段更长），并使用DEAE离子交换进一步分离，根据氨基酸组成以及末端序列分析，并和之前的A、B、C区域进行对照，D结构域被发现。 2 通过对比更长的片段序列（如AB和DAB）以及N端测序证明其排序为D-A-B-C，并且连续。 3 对胰酶消化后，剩余的胞壁组分继续使用溶葡球菌酶处理，经过亲和以及一步离子交换进行分离，得到的片段进行氨基酸组成以及N末端序列分析，找到了Protein A碳末端缺失的X区域（酶消化后和C区连在一起，即CX区）。注意：如果先用溶葡球菌酶处理菌体，再用胰酶消化，那么C和X之间的连接会断开，因此早期研究中丢掉了X这部分。至此，D、A、B和CX 4个IgG结合结构域被发现。但是，就像之前分离的C区还存在一个嵌入细胞壁内的X区域一样，作者也推测在D区的N端很可能也存在类似区域未被发现。图3：J Sjödahl文章（1977年）中推测的Protein A（或部分）结构图[14]Domain E的晚发现：得益于基因测序技术的进步，开始从基因角度来解析Protein A序列。1983年S Löfdahl等[2]分离金黄色葡萄球菌（菌株8325-4，遗传信息比Cowan I更清晰）的染色体DNA并进行酶切，跑胶鉴定8-10 Kb的片段并克隆到pBR322载体（宿主E.coli）上，表达后，使用ELISA筛选和抗体具有亲和作用的克隆及更小的亚克隆。使用化学测序法对启动子区以及5'末端结构基因进行测序，翻译成氨基酸序列后，和前述J Sjödahl研究[14]中的序列进行比对，在N端发现了信号肽 (S，Signal) 区域以及紧挨着的、顺次命名为E的区域，E区和之前报道的D-A-B-C高度同源，由50个氨基酸组成，其中42个和D区一致。1984年[6]，同一个团队继续通过合作对菌株8325-4 的Protein A进行全基因测序，进一步验证了E区的存在。1986年，Tomas MOKS等[15]发表文章，对E区进行克隆表达，证明domain E和抗体单价结合，从亲和力上，D、A、B、C和抗体结合的亲和力差异不大，但是domain E的亲和力弱一些。至此，SpA的E-D-A-B-CX序列结构才算完成。从进化角度，SpA的5个IgG结合结构域氨基酸序列高度同源，并且存在同源梯度 (homology gradient) ，即相邻的两个区域，同源性更高（如图1）。说明原始祖先基因，在进化过程中被复制多次，并存在点突变，体现出stepwise multiple DNA duplications特征[16]。另外，在同源区域存在大量同义突变，说明存在进化压力以维持氨基酸序列高度保守，其中B区的密码子突变最少，也被认为是最接近祖先序列的[15]。SpA其实可以和Fab和Fc区域同时互作SpA通过和IgG的两个不同的位置即Fab以及Fc区域结合，以尽可能逃避或切断宿主的免疫系统[17]。目前认为，A、B、C三个高度同源的结构域，主要通过和IgG的Fc区域进行结合；由于D和E区在helix III区域存在序列差异，二者主要通过Fab和Fc与IgG互作[18]。 Helix I&II主要负责和IgG-Fc互作图4：SpA的domain B和抗体CH2-CH3之间区域互作示意图[19]SpA和抗体Fc之间的互作主要是疏水作用驱动的，另外有部分氢键以及盐桥[20, 21, 22, 23]：互作位置：IgG的CH2-CH3连接处（elbow region，3个β折叠）和SpA domain B的前两个α螺旋helix I和II发生互作。互作位点#1：由SPA-helix I的二肽疏水核心（苯丙氨酸和酪氨酸），和IgG的CH2-CH3之间的3个β折叠区组成，并通过4个氢键进行稳定。互作位点#2：SPA的helix II和Fc的CH3区域的氨基酸残基组成。互作主要通过23个氨基酸残基进行，如下表。序号基于SpA domain B在PDB数据库的序列(https://www.rcsb.org/structure/1BDC) [8]。表2：参与Protein A和IgG-Fc之间互作的氨基酸残基[8]Helix II&III主要负责和Fab区互作天然的SpA中，每个IgG结合结构域都可以和Fab区发生互作[9]，但强弱有差异：SpA的domain D[5]和domain E[24]与Fab区互作更为明显。A、B、C domain和Fab区的互作则较弱[25]。互作结构解析，最经典当属M Graille等于2000年发表的文章[5]，IgM主要通过Fab区和Protein A互作（Fc互作则缺失）因此适合用于此类研究[26]。文章通过domain D和VH3–30y1.9III编码2A2 IgM被酶切后产生的Fab区互作，解析晶体结构，要点如下：SpA domain D通过Helix II和III，与Fab-VH3的4条β链（B、C’’、D和E）发生互作（图5）。图5：SpA domain D（红色）和人IgM- Fab 2A2互作示意图。Fab-VH3重链的框架区（青色cyan）参与互作，VL区不参与互作（深蓝色）。互作区远离和抗原互作的CDR loops区（酒红色），尤其是和最常用于抗原特异性识别的CD3较远（相距10 Å以上）[5]SpA domain D中参与互作的11个氨基酸，分布在：helix II（6个）、helix II和III之间的loop环（2个），以及helix III（3个），如图6。图6：SpA domain D（棕色）和Fab 2A2-VH3（蓝色）互作氨基酸展示图。注意G29，文献报道中domain Z为了提高耐碱性，将G29突变为丙氨酸而失去了和Fab区的结合（更利于用更高的pH洗脱）[5]Fab中参与互作的区域主要在VH3框架区(framework region, FR) ，距离IgG轻链以及重链恒定区远，并区别于和抗原互作的CDR区。主要有13个氨基酸（如图6和表3），其中6个在β strands的框架区，7个位于框架区的链间loops（和抗原结合口袋最远）。SpA不和IgG的抗原结合区竞争，被认为是SpA能够和最大的VH基因家族-VH3互作的基础之一。互作结构中，主要由极性氨基酸侧链组成，包括domain D的3个带负电的侧链残基以及IgM-Fab区2个带正电的残基，提示2个分子之间的互作主要通过静电吸附发生，且5个极性互作中，3个发生在氨基酸侧链基团。其次为氢键互作，包括Tyr-H59和Asp-37、Asn-H82a和Ser-33、Gly-H15 carbonyl 和Gln-26，以及Lys-H57和Asp-36 carbonyl之间，其中后两个发生在主链原子和侧链原子之间。另外，Arg-H19和Asp-36之间形成盐桥。综上，domain D和Fab之间的互作，是以氨基酸序列特异性为主导的。SpA和Fab以及Fc的互作是否互相干扰呢？实则不然。SpA和Fc的结合主要发生在helix I和II，其中以helix I为主，疏水互作为主导；helix II以另外一面 (opposite face) 以及helix III又和Fab区发生互作，主要为极性作用，包括静电、氢键和盐桥。两个结合结构域之间各自独立、互不影响：除了domain D的Gln-32被认为较弱的、同时参与了SpA同Fab和Fc的互作，其它氨基酸均无重叠[IgM]。SpA domain B和Fc互作面积 (1,320 Å2) ，与SpA domain D与IgM-Fab互作面积 (1,220 Å2) 相似。为了进一步了解SpA和Fab-Fc之间的空间关系，结合此文以及之前domain B和Fc互作的结构解析结果[21]，通过模型模拟，如图7，抗体的Fab和Fc区形成了一个三明治结构，各自朝向Helix II的两侧，将SpA domain D夹在其中，互不干扰。 图7：SpA domain D（红色）和VH3 Fab（青色）以及Fc区（灰色）形成复合物示意图[5]其它SpA结构域，是否也能够和Fab区发生互作？通过将domain D的结构，和已发表文献中的其它IgG结合结构域进行比对，发现domain E的相似度最高（很多文献中提到D和E主要负责和Fab区互作）。如图8所示，domain D中参与Fab区互作的氨基酸残基（青色背景），在所有的SpA IgG结合结构域中高度保守（在domain E、A和B中完全一致），说明每一个结构域都能以类似方式和Fab区互作（但强度有差异）。图8：SpA的5个抗体结合区的序列示意图。domain D中参与Fab 2A2互作的氨基酸残基用青色背景表示，参与Fc互作的氨基酸残基[22]用灰色背景表示。粉色为domain D的Gln-32，同时较弱的参与Fab和Fc互作再说VH3SpA被报道可以和B细胞表面的VH3家族抗体的Fab区结合，并介导细胞凋亡，用于逃逸免疫监视[27, 28]，大约有一半的人IgM以及32–54%的人外周血B淋巴细胞 (BCR) 能够和SpA发生结合[29]，互作被严格限定在VH3基因家族（占VH基因型的50%以上）或者其它哺乳动物中的VH3同源基因家族。为何呢？表3：VH基因家族和domain D互作的13个氨基酸序列展示[5]根据前述M Graille等[5]的研究，从序列上看，和SpA互作的13个氨基酸中（图6和表3），考虑到VH3基因的种系序列多样性，只有第57位有多个突变的可能性，而其在互作结构中并不是核心氨基酸残基。另外12个直接参与domain D互作的功能氨基酸则高度保守，其中，只有2个氨基酸存在种系可变性，即19位的Lys (K) 和82位的Gly (G) ，但是这两个突变氨基酸在成年VH3 Ig表达谱中发生的可能性只有不到2%（因此，也并不是所有的VH3基因家族都能和SpA的Fab区结合）。而其它无法结合SpA的VH家族，在13个互作氨基酸残基中，至少含有2个或更多的氨基酸残基差异。作者又从结构角度，给出了7个氨基酸组成的核心关键残基 (Arg/Lys-H19, Gly-H65, Arg-H66, Thr-H68, Ser-H70, Gln-H81, Asn-H82a) ，奠定了VH3特异性结合的基础。 关于商业化配基改造针对Protein A或其单个抗体结合结构域，主要发生的改造类型：① 高耐碱性：利于低成本、方便的进行NaOH在位清洁CIP。Cytiva的多款明星抗体亲和产品，为基于domain B开发，如MabSelect SuRe和PrismA，除了和祖先序列最为相似以外，domain B还被证明对于溶剂和温度变性更加稳定[30]，并且对不同种属抗体的结合范围最广。Domain Z最初是为提高耐碱性而生（注意Z有很多不同突变的变体），将domain B中在高pH条件下会发生降解（如脱氨化）的氨基酸残基进行突变，如天冬酰胺Asn等，并进一步优化为MabSelect SuRe以及MabSelect SuRe LX填料，耐受0.1-0.5M NaOH，Sure LX载量为60 mg 人lgG/mL填料。MabSelect PrismA则进一步优化了耐碱和载量，可以耐受1M NaOH CIP，载量提升至80 mg 人lgG/mL填料。图9：对Protein A进行定点突变，产生耐碱稳定的四聚体变体[3]② 提高洗脱的pH条件：Protein A序列中的组氨酸残基His 137，有一个在IgG-Fc中高度保守的、位于互补位置的组氨酸残基His 435，在中性pH条件下两个氨基酸不带电，Protein A和IgG的互作正常发生；在低pH条件下，两个组氨酸残基被质子化而同样带上正电荷，因此互斥造成结合减弱，促进样品洗脱[31]。如果样品不稳定，需要更高的洗脱pH，也可以通过减弱或去除Protein A和Fab之间的互作达成。例如，去掉和Fab区主要发生互作的domain D和E，转而使用单独的domain B（或Z）、domain C等进行配基开发，可以将洗脱的pH提高。报道中，domain Z的29位甘氨酸突变（如G29A），使其失去了对Fab区的亲和力，从而提高洗脱pH[7, 18, 32]。另外，并不是所有的Fab区都不能和domain Z（或MabSelect SuRe）互作，在极罕见的情况下也会发生结合，但比全长Protein A更弱[26]。图10：MabSelect SuRe对于多个人抗体和Fc融合蛋白的洗脱pH分布，相较于MabSelect填料（重组Protein A配基），MabSelect SuRe洗脱pH更高也更窄[33]③ 更高载量： 1 对改造后的单一结构域，重复多次，使用同源多聚体或异源多聚体[25]。 2 优化linker设计：避免被蛋白酶降解（减少由此造成的配基脱落），同时提高配基和IgG的结合和利用率[18]。 3 基架相关：如基架材质、配基密度、粒径大小、孔径大小、化学偶联方式等。④ 针对特定区域的结合，Cytiva专门开发了多种填料例如针对VH3基因家族，专门开发了耐碱的MabSelect VH3填料[34]，也可以测试MabSelect PrismA。针对轻链的结合，Cytiva还开发了耐碱的MabSelect VL（结合Kappa轻链可变区）[35]以及LambdaFabSelect（结合Lambda轻链恒定区）以及KappaSelect填料（结合Kappa轻链恒定区）[36]。参考文献[1] J Sjöquist, J Movitz, I B Johansson, H Hjelm. 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Data File, CY13476-30Jul20-DF.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。