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学以致用   侃侃而言 RSC Med Chem 2024, Nov. 7th DOI: 10.1039/D4MD00769G 蛋白质水解靶向嵌合体（PRTOTACs）是一种靶向蛋白降解的新兴治疗策略，它们将靶标蛋白（POI）与E3连接酶紧密结合，并诱导参与泛素-蛋白酶体系统（UPS）以促进靶向蛋白质降解。 近日，RSC Med Chem上刊载了一篇总结性研究，通过分析处于临床中的PROTACs实体分子的物理化学性质，汇总了PROTACs各组成部分的优化，以及对于实现口服生物利用度所面临的困难和挑战，并根据作者在这一领域的经验提出了一些珍贵的指导性意见和建议。 主要内容 (1) 临床中的PROTACs (2) 口服生物利用度开发中的挑战 (3) 值得注意的陷阱提示 (4) 总结与展望，及往期相关精彩回顾 01 临床中的PROTACs PROTACs等靶向降解剂是一种“事件驱动”的治疗策略，其选择性地从细胞中去除靶标蛋白质。相比于传统的基于“占位驱动”的蛋白质功能抑制策略，PROTACs等靶向降解剂具有几个优势： (1)药理学上，PROTACs等靶向降解剂有可能提供更加完整的蛋白质功能封锁（如去除支架活性），因此，更有可能概括基因敲除实验的效果。简单地说，PROTACs等靶向降解剂不仅阻断了信号传导，而且通过分解细胞传播信号所需的机制，消除了细胞传播信号的能力； (2)细胞只能通过产生新的蛋白质来恢复功能，因此，药理学受到蛋白质的再合成率以及药物药效学的影响，从而提供了延长作用时间的可能性； (3) PROTAc机制中POI与E3组分之间必要的相互作用，为异构体之间（如，取决于三元复合物的形成和/或可用的表面赖氨酸残基）和组织内（如，取决于E3表达水平）的选择性提供了额外的机会； 因此，这种药物实体已经出现，便被证明对于患者具有良好的耐受性和有效性，并已有多个实体分子进入后期临床研究。 据统计，截至2024年7月，已有13种结构已公开的PROTACs进入临床试验阶段。这些PROTACs大多数用于肿瘤相关适应症，其中一种用于治疗炎症；两种因战略规划原因而停止（ARV-110、KT-413）。 就E3连接酶配体而言，其中有12种携带CRBN配体，口服给药。而仅有一种需要静脉注射（IV）的DT-2216，携带VHL配体。如下图。 图片源自RSC Med Chem 这些处于临床阶段的PROTACs实体的物化性质统计如下表。其中，携带CRBN配体的PROTACs分子量在711~958 Da；亲脂性（pH7.4时的LogD值）为1.4~4.8；色谱极性表面积（ePSA）为107~146 Å 2。 图片源自RSC Med Chem 而计算出的分子亲脂性LogP和极性表面积tPSA的预测结果分散更为广阔：其中LogP为-0.6~6.8；tPSA范围为96~238 Å 2。此外氢键受体HBA为9~20；氢键供体HBD均≤5。 如下图A，通过雷达图更形象地展示了临床口服PROTACs的物化性质空间（蓝色区域）在所有特性方面都超出了Lipinski五规则（Ro5）和Veber关于可旋转键（RotB）和极性表面积（PSA）（绿色区域）的经验指南，仅HBD除外。 图片源自RSC Med Chem 上图B绿色条形图显示了小分子的可接受的性质范围，同时与临床PROTACs分子做了对比。 在亲脂性方面，一些PROTACs突破了小分子LogP（≤5）和LogD（1~3）的极限。值得注意的是，ePSA的值（107~141 Å2）比tPSA （96~238 Å2）的范围窄得多，这表明这可能是口服PROTACs设计的更有价值的指南。尽管超出了先前确定的物理化学空间限制，口服给药仍然是首选的给药途径，专门为血液病癌症开发的DT2216和KT-413除外。 以上每一种PROTACs都是经历了广泛的优化后，以实现药理学和物化性质的最佳平衡的结果。而PROTACs模块化、三组件的特性（POI配体、E3配体、连接子），其设计的技巧在于平衡单个部件组分的特征，从而使最终PROTACs的整体特性处于可接受的空间内。 就POI配体而言：强效，较少的暴露HBD 许多PROTACs针对靶标POI改良的抑制剂/拮抗剂进行设计。这些抑制剂或拮抗剂通常是高效的配体片段基序，在其溶剂区安装输出载体，用以连接到E3结合基序片段。此外，这些配体大多数是中性的，而非酸性或碱性，并且氢键供体HBD≤1。以上几个PROTACs中也有几个例外，如ARV-393、NX-2127、KT-413、NX-5948，整体分子分别包含3、4、4、5个HBD，但分子内氢键可能屏蔽了其中的几个HBD。 就E3连接酶配体而言：CRBN配体最流行 在已经揭示了分子结构的临床PROTACs中，上面已提到，除了DT-2216以外，均是携带了CRBN配体。如下图，使用最广泛的CRBN配体包括来自免疫调剂亚胺类药物（IMiDs）沙利度胺、和来那度胺。这两者均具有高级性、高效、低分子量、并且在基本结合药效团中只有一个HBD。此外，它们对外排转运体缺乏敏感性，使其成为PROTACs的理想选择，特别是在实现口服生物利用度上。 图片源自RSC Med Chem 而与IMiD类配体相关的安全性问题（如致畸性、血液毒性等），也可以解释为什么PROTACs最初的治疗适应症主要是肿瘤领域。也许正是因为这一点，当前正在出现不同于IMiD类的由新型CRBN配体组成的PROTACs。 就连接体而言：胺基碱及富含环型基序片段占主导 除了极个别例外，如CFT-1946，这些临床阶段的PROTACs的连接体的共同特征是存在一个叔胺碱，以及哌啶、哌嗪、或氮杂啶都行。在一些特定的情况下，哌啶的碱度似乎随着氟取代（CFT-8634）或氧取代（ARV-393、KT-474）的加入而有所缓和，使其碱度不超过所有口服PROTACs的预测值pKa=9.1。 而静脉给药的PROTACs，如DT-2216，具有非常高的预测亲脂性（LogP=15.0）；然而，这降低到低得多的LogD=3.9，可能是由于其两性离子电荷所致；其高试验极性为193 Å2，比其他口服PROTACs的ePSA值高出52 Å2，比相关bRo5口服药物venetoclax的ePSA值高出31 Å2，似乎反映了这种两性离子。 口服PROTACs的另一个共同之处是使用环状基序作为构象约束，所有实例在连接体中至少包含两个环，有些甚至三个环。 在灵活性方面，10个实例在环之间包含亚甲基作为间隔剂，只有BMS986365具有乙氧基3-原子间隔剂。此外，CFT-1946具有最刚性的连接体，以酰胺键连接哌啶和螺环。而KT-474具有最大的非环组分，具有4-原子丙炔醚间隔，但即使这样也相对刚性，这表明构象约束是PROTACs的重要设计考虑因素。 一些研究也表明富环的、刚性连接体可以产生更高的细胞靶标降解能力和更高的代谢稳定性。也因此，可旋转键仅略高于Ro5依从性口服药物经验指导的上限。而其中一个明显的例外则是DT-2216，具有29个可旋转键，高度灵活的连接体仍然可以产生强效的降解物，并且适用于静脉给药的PROTACs。 02 口服生物利用度的挑战 PROTACs分子由三个组分构成的结构特征使其在物化特性和口服生物利用度等方面面临着诸多挑战。 EARLY R&D 2.1、最严格的HBD，口服PROTACs设计的关键 首先，构建分子量MW低于~700Da的PROTACs具有挑战性。 这种对Lipinski的MW经验规则的违反，通常也会伴随着维持其它Ro5标准（如HBA、HBD、LogP）和其它物化特性的限制（如，PSA、可旋转键等）。 尽管如此，如上一单元所示，也有不少临床中的PROTACs分子是可以生物利用的，尤其是在人类中达到有效的暴露水平。随着越来越多的试验数据的积累，以及对关键理化性质的分析总结，一些新的bRo5经验指导出现，并必将越来越成熟和精准。 例如，Arvinas和AstraZeneca都强调了限制口服吸收的或溶剂暴露的HBDs（eHBDs）数量的重要性。两个团队都得出这样的结论：虽然物化性质，如分子量、亲脂性、分子极性和HBA等可以超过口服药物的Ro5限制，但eHBD≤2这个标准是一个严格有效的设计标准。 对于bRo5化学空间里的大环类药物，相关研究发现，酰胺类HBD的上限为2个，而总体正式的HBD上限为7个，这相对宽松了许多，大概也是因为分子内氢键屏蔽约束的结果。 回到PROTACs来说，也或许也解释了为什么CRBN配体在临床PROTACs组成中更受青睐，因为这些基序片段小、有效且只有一个eHBD。 因此，尽管挑战重重，通过合理使用分子属性可支配限制，是设计PROTACs的关键，特别是最严格的方面，即HBD。 EARLY R&D 2.2、三元复合物本身的问题带来的挑战 尽管PROTACs能够有效地形成促进表面赖氨酸泛素化的三元复合物，然则其也仅能针对靶向蛋白质发挥降解功能。 这种三聚体复合物的建模是非常具有挑战性的。 这是因为，可能存在多种三元复合物构象，并且并非所有这些构象都能导致有效的靶标降解，这无疑阻碍了基于结构的PROTACs设计。 相比于传统小分子设计程序，PROTACs的设计要考虑分子大小、“POI-连接体-E3”组分之间的构象和物理化学性质相互作用，这意味着有更多的“化学等式”需要优化。 考虑到构成可及的三元配合物的不确定性，以及它位于正确的物化空间，因此，生产“活性”PROTACs的复杂性将会导致一系列设计和合成方面的挑战。 针对这么多不确定性，一种解决办法是通过生产“库”，用来探索广阔的化学空间，从而实际地解决以经验方式存在的巨大的组合优化。 EARLY R&D 2.3、变形嵌合体的挑战 PROTAC的三元组成和分子大小，使理解其构象比传统小分子更具挑战性。 一般，预先组织分子使其具有生物活性构象，以减少结合时的熵损补偿是一种行之有效的策略。然而，对于PROTACs分子，配体可以获得更大程度的构象自由度，再加上三元复合物的构象可塑性和不确定性，使得准确确定要模仿的“生物活性”构象具有挑战性。 利用核磁共振技术，结合分子动力学模拟来了解PROTACs的构象行为及其对渗透率的影响是目前的一种方法。 在极性溶剂和非极性溶剂中观察到的差异性，为构象集成、端到端反折叠和潜在的分子内氢键（IMHB）提供了证据。研究发现，与未折叠的配对对比，CRBN和VHL安装的PROTACs的溶剂依赖性（即“变色龙”效应）分子内折叠，增加了它们的被动细胞通透性。 EARLY R&D 2.4、PROTACs体外试验生产数据的分析 对于PROTACs领域的工作人员来说，另一个挑战是使用基于传统小分子优化程序配置的体外分析生成对PROTACs有意义的数据的能力。 如前面所提，PROTACs分子大，通常是亲脂性的碱，有粘附在实验仪器/蛋白质/膜上的倾向，导致渗透性和蛋白质结合试验回收率很低。传统的摇瓶法亲脂性分析通常难以达到LogD＞4，而且溶解度通常低于检测极限，这使得在缺乏数据的情况下筛选候选药物极具挑战性。 而且，作者还根据经验提到，代谢稳定性测定（肝细胞和微粒体孵育）产生可靠的值，在淘汰不稳定的PROTACs方面是没有价值的。 色谱法（ChromologD、ePSA）扩大了亲脂性和暴露极性的可测范围，并允许在一系列化合物中对化合物进行排序。此外，已有报道将色谱方法与计算机方法相结合来生成更多相关的3D描述符，以提高设计口服可用PROTACs的成功率。 03 陷阱提示 在整个PROTACs中整合CRBN结合实体，特别是IMiDs，会带来需要监测的相关安全风险。这些风险可能与以下有关： 与IMiDs非常相似，相应的PROTACs可以作为分子胶降解剂，并导致许多蛋白质降解，从而诱发毒理学效应；例如，值得注意的一个新的底物，GSPT1，一个平移终止因子。其的无意降解降低了蛋白质合成的速率，导致细胞毒性，同时伴有POI的明显和误导性降解。 总的来说，这些发现强调需要细致的对照实验来询问PROTACs的作用机制（MoA），从而促进其优化为有效和安全的药物。从发现阶段到体内PROTACs的评估，一个关键教训是了解它们的代谢命运的重要性。 即使对于代谢相对稳定的PROTACs，也可能产生极性更强、亲脂性更低和未结合清除率更低的片段。然后，它们可以竞争与POI或E3结合，并降低三元复合物形成的有效性，从而降低体内疗效。 此外，即使精心设计的利用CRBN的PROTAC的代谢物，没有分子胶降解剂（MGD）活性，理论上也可以作为MGD，从而引入MGD相关的安全责任。因此，在当前临床试验执行过程中对此类风险进行评估，无疑将使科学界了解利用CRBN的PROTACs用于非肿瘤适应症的适用性。 04 总结与展望 PROTACs目前已经从初始的肿瘤适应症领域向其它领域扩展，但主要还是在肿瘤领域，并且当前临床中的PROTACs还是以利用CRBN作为首选的E3连接酶。 初步数据也证实，人类的生物功效和口服生物利用度也是可以实现的。通过已公开的数据，得到的结论是它们在一些结构上（如碱性、富环连接体）和关键物化特性上（如eHBD≤2）等方面表现出了统一性的特征，并具有一定的指导意义。 往期相关精彩回顾 A Rebiew of the Past 站在靶向蛋白降解临床获批的风口，耶鲁大学Craig M. 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