A Randomized Controlled Phase III Study to Evaluate the Combination of Disitamab Vedotin, Trastuzumab, and Tislelizumab Versus Chemotherapy (CAPOX) Combined With Trastuzumab With or Without Pembrolizumab as First-Line Treatment for Advanced Gastric/Gastroesophageal Junction Adenocarcinoma With HER2-high Expression

The purpose of this study is to evaluate the efficacy and safety of Disitamab Vedotin combined with Trastuzumab and Tislelizumab Versus Chemotherapy Combined with Trastuzumab with or without Pembrolizumab as First-Line Treatment for Advanced Gastric/Gastroesophageal Junction Adenocarcinoma with HER2-high Expression.

开始日期2026-01-01

申办/合作机构

荣昌生物制药（烟台）股份有限公司

CTRI/2014/07/004722

/ Completed临床3期

Multicenter randomized double blind phase III clinical trial comparing safety and efficacy of BCD-022 (CJSC BIOCAD, Russia) used with paclitaxel to HerceptinÂ® (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Switzerland) used with paclitaxel in the first-line treatment of HER2-positive metastatic breast cancer patients.

开始日期2014-07-02

申办/合作机构-

100 项与曲妥珠单抗生物类似药(Biocad Medical, Inc.) 相关的临床结果

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100 项与曲妥珠单抗生物类似药(Biocad Medical, Inc.) 相关的转化医学

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100 项与曲妥珠单抗生物类似药(Biocad Medical, Inc.) 相关的专利（医药）

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项与曲妥珠单抗生物类似药(Biocad Medical, Inc.) 相关的文献（医药）

2022-12-01·BMC cancer2区 · 医学

Randomized double-blind clinical trial comparing safety and efficacy of the biosimilar BCD-021 with reference bevacizumab

2区 · 医学

ArticleOA

作者: Matrosova, Marina P ; Kryukov, Fedor ; Shustova, Mariya S ; Adamchuk, Grigoriy A ; Shelepen, Konstantin G ; Kalloli, Mahesh ; Fadeeva, Natalya V ; Nagarkar, Rajnish ; Zhuravleva, Daria ; Voevodin, Georgiy D ; Roy, Bodhisatta ; Stroyakovskiy, Daniil L

Abstract:

Background:

BCD-021 is a bevacizumab biosimilar which was shown to be equivalent to reference bevacizumab in a wide panel of physicochemical studies as well as preclinical studies in vitro and in vivo. International multicenter phase III clinical trial was conducted to compare efficacy and safety of BCD-021 and reference bevacizumab in combination with paclitaxel and carboplatin in a first-line treatment of inoperable or advanced non-squamous non-small-cell lung cancer (NSCLC).

Methods:

Patients with no previous treatment for advanced non-squamous NSCLC were randomly assigned 3:2 to BCD-021 or reference bevacizumab and were treated with bevacizumab + paclitaxel + carboplatin. Therapy continued for 6 cycles (every 3 weeks), until progression of the disease or unbearable toxicity. The primary study endpoint was the overall response rate. The study goal was to prove the equivalent efficacy of BCD-021 and reference bevacizumab. Equivalence margins for 95% CI for the difference in the overall response rates were set at [-18%; 18%], for 90% CI for the ratio of overall response rate were set at [67%; 150%].

Results:

In total 357 patients were enrolled in the study, 212 in the BCD-021 group and 145 in the reference bevacizumab group. The ORR was 34.63% in the BCD-022 group and 33.82% in the reference bevacizumab group. Limits of 95% CI for the difference in overall response rates between the groups were [-9.47%; 11.09%]. Limits of 90% CI for the ratio of overall response rate between the groups were [79.6%; 131.73%]. For both approaches CI lied within predetermined equivalence margins. Profile of adverse events (AEs) was similar between the groups (any AEs were reported in 86.89% of patients in BCD-021 group and 89.05% of patients in reference group). No unexpected adverse reactions were reported throughout the study. No statistically significant differences regarding anti-drug antibody occurrence rate was found between BCD-022 (n=4; 1.96%) and comparator (n=5; 3.65%). Both drug products showed low occurrence rate and short life of anti-bevacizumab antibodies. Pharmacokinetics assessment after 1st and 6th study drug injection also demonstrated equivalent PK parameters by all outcome measures.

Conclusions:

Thus, the results of this study demonstrated therapeutic equivalence of bevacizumab biosimilar BCD-021 and referent bevacizumab drug.

Trial registration:

The trial was registered with ClinicalTrials.gov (Study Number NCT01763645, date of registration 09/01/2013).

项与曲妥珠单抗生物类似药(Biocad Medical, Inc.) 相关的新闻（医药）

2026-05-29

·解放军药学学报

重点推荐 | 毛细管电泳法分析美珀珠单抗纯度

点击蓝字，关注我们毛细管电泳法分析美珀珠单抗纯度张文华①,于蒙蒙①,杨天一②, 唐浩②,刘炬①,倪明① 作者单位： ①联勤保障部队药品仪器监督检验总站 ②江苏太平洋美诺克生物药业股份有限公司 [摘要] 目的验证 CE-SDS 毛细管电泳方法用于美珀珠单抗纯度分析。方法使用毛细管电泳仪二极管阵列检测器，在还原和非还原条件下对该方法的专属性、重复性、准确性、线性、耐用性进行考察。结果该方法主峰和面积比的重复性 RSD＜2%，准确性回收率在 90%~110%，峰面积线性回归的相关系数 r＞0.99，专属性和耐用性良好。结论该方法测量结果可靠，适用于美珀珠单抗的纯度分析；也可为单抗药纯度质控方法的建立和验证提供参考。 [关键词] 毛细管电泳；美珀珠单抗；纯度分析 [中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1008-9926(2026)1-0043-04 [DOI] 10.3969/j.issn.1008-9926.2026.01.010 单克隆抗体（以下简称单抗）药物近年来发展迅速，具有特异性高、作用机制明确、效果显著、不良反应小等优势，广泛应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病和器官移植排斥等重大疾病治疗。美珀珠单抗是抗 CD147 分子的人源化 IgG2 型单抗，可通过阻断 CD147 分子与新型冠状病毒刺突蛋白的相互作用而阻断病毒入侵宿主细胞［1］，是用于治疗重型、危重型新型冠状病毒肺炎(COVID-19)成年患者的潜在候选药物。纯度是单抗药物关键质量属性的分析重点，对确保抗体药物的安全性和有效性至关重要。十二烷基硫酸钠毛细管电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulface, CE-SDS)在还原和非还原条件下，依据分子量大小，定量测定抗体药物纯度，在抗体药物的质量控制分析中应用日趋广泛［2-4］。CE-SDS 在分辨率、定量准确性及自动化程度等方面有优势，并且可以对单抗非糖基化重链进行准确定量［5］。本研究依据《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）（2020 年版通则 9101）分析方法验证指导原则利用 CE-SDS 方法对美珀珠单抗纯度进行了方法验证［6］。 1 仪器与试药 1.1 仪器 CESI 8000 Plus 毛细管电泳仪〔二极管阵列(PDA)检测器，SCIEX 公司〕，熔融石英毛细管（338451，SCIEX 公司）；SO300D 干式恒温器（赛欧华创公司）。 1.2 试药注射用美珀珠单抗、参比品（江苏太平洋美诺克生物药业股份有限公司）；碘乙酰胺（I6125-10G，Sigma 公司），β-巯基乙醇（63689-25ML-F，Sigma 公司），SDS-MW Gel Buffer（M305683，SCIEX 公司），10 ku Standard kit（M307631，SCIEX 公司）。 2 方法与结果 2.1 测定方法 2.1.1 溶液配制 SDS-MW 样品缓冲液：称取 1.21 g 的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加水 90 ml，溶解混匀，并用盐酸调 pH 至 9.0；再称取 1.00 g 十二烷基硫酸钠(SDS)加入上述溶液中，溶解混匀，加水至 100 ml，过滤，配制成含 1% SDS 的 0.1 mol·L-1 Tris-HCl 溶液。酸性冲洗液 0.1 mol·L-1 HCl：取 0.86 ml 浓盐酸加入加有少量超纯水的 100 ml 量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀过滤。碱性冲洗液 0.1 mol·L-1 NaOH：称取 4 g 氢氧化钠，加超纯水 80 ml，溶解混匀，转移至 100 ml 量瓶，加超纯水稀释至刻度，过滤。 2.1.2 样品制备采用超纯水将 100 μg 单抗稀释到 30 μl，再加入 65 μl SDS-MW 样品缓冲液，2 μl 10 ku 内参标准品，250 mmol·L-1 碘乙酰胺（非还原条件）或 β-巯基乙醇（还原条件）5 μl，盖紧盖口，充分混匀，6 000✕g 离心 1 min；70 ℃水浴 3 min（非还原条件）或 15 min（还原条件）；取出，冷却至室温，12 000✕g 离心 2 min，取 90 μl 待检测。 2.1.3 电泳条件毛细管总长 30.2 cm，有效长度 20 cm，内径 50 μm。5 kV 进样 20 s，15 kV 分离 35 min，在波长 220 nm 下进行检测。 2.2 方法验证 2.2.1 专属性分别采用非还原条件和还原条件处理空白对照（超纯水）、供试品和参比品，并进行电泳。结果显示，空白对照在出现 10 ku Marker 峰之后无明显干扰峰，供试品电泳图谱与参比品电泳图谱一致。美珀珠单抗为 IgG2 型单抗，有 2 个主峰，两种结构均有活性。非还原条件参比品迁移时间分别为 28.083 min（主峰 1）、28.558 min（主峰 2），供试品迁移时间为 27.950 min（主峰 1）和 28.425 min（主峰 2）。还原条件参比品轻链、重链出峰时间分别为 16.417、 20.500 min，供试品轻链、重链出峰时间分别为 15.842、19.833 min。结果表明，本方法专属性良好，见图 1。 2.2.2 重复性采用 6 份 100%浓度水平的样品检测结果进行评价，考察重复性。在还原和非还原条件下，相对标准偏差均小于 2.0%，重复性良好。见表 1。 2.2.3 准确性分别制备 50%、100%和 150%水平的供试品样品，每个样品检测 3 次，分析回收率。以 100%供试品水平下的峰面积结果作为基准，则 50%和 150%水平的供试品理论峰面积应分别为 100%水平下的 50%和 150%，用检测值除以该理论峰面积即为回收率。非还原条件下回收率在 97.7%~109.2%，还原条件下回收率在 94.8%~108.5%，准确性良好。见表 2、表 3。 2.2.4 线性分别制备 50%、75%、100%、125%、150%水平的供试品样品各 2 份，以峰面积和供试品含量水平进行线性回归，采用 Graphpad 进行线性拟合，非还原条件下主峰 1、主峰 2、峰面积和线性拟合后的 R2 分别为 0.998、0.997、0.998。还原条件下轻链、重链、轻链和重链峰面积和线性拟合后的 R2 分别为 0.999、0.997、0.998。R2 均大于 0.99，说明本方法在使用范围内线性良好，见图 2。 2.2.5 耐用性为考察方法的耐用性，重点对样品处理温度微小变动的影响进行了分析。在 65、70、75 ℃ 3 种处理温度下主峰面积和相对标准偏差为 0.3%，轻重链峰面积和百分比的相对标准偏差为 0.6%，见表 4、表 5。 2.2.6 样品测定取 3 个批号的注射用美珀珠单抗供试品（批号：G202112001，G202201001，G202201002），按 2.1 项下方法进行测定，结果见表 6。 3 讨论人 IgG 抗体从结构分，主要有 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 等，人血清中含量最高的抗体是 IgG1，其次是 IgG2、IgG3 和 IgG4。对于 IgG2，由于在 Fab 和 hinge 结构域中存在不同的二硫键，因此存在两种异构体(IgG2A/B)，这决定了与抗原结合时 Fab 结构域的刚性［7］。美珀珠单抗属于 IgG2 型单抗，有 2 个主峰，纯度结果两个主峰面积百分比的和相对稳定，两个主峰各自的面积百分比随着浓度、处理温度不同，比例有所变化，可能是两种异构体有所转换。目前，单抗药纯度的测定方法主要有高效液相色谱(HPLC)法、凝胶电泳法、毛细管电泳法等。传统的凝胶电泳法准确性和自动化方面存在不足，HPLC 法技术成熟，但样品和溶剂消耗大，毛细管电泳技术以其分辨率高、模式多、低消耗、速度快等优势，该法逐渐成为单抗药物纯度分析的优选方法，被越来越多的药企采用，也被包括我国在内的多国药典认可［8］。 IgG2 型抗体因其独特的结构，在纯度分析上面临特异性挑战。监管机构（如 FDA，EMA）推荐使用正交方法进行单抗纯度鉴定，CE 与 HPLC 的分离机理不同，能够发现 HPLC 可能无法检测到的杂质，为 IgG2 型抗体质量属性提供更全面的支持。本研究对使用 CE 研究方法进行 IgG2 型抗体质量控制提供参考。毛细管电泳技术不仅应用于单抗药的纯度、等电点及电荷异质性、糖型等分析中，而且随着蛋白药物、细胞/基因治疗药物以及新型疫苗等生物制品的不断发展，将会有更大的应用空间，提高生物制品的有效性和安全性［9］。参考文献［1］尉丁, 张征, 郑朝辉, 等. 美珀珠单抗治疗新型冠状病毒感染的多中心、双盲、随机、安慰剂对照的加载Ⅱ/Ⅲ期临床试验［J］. 空军军医大学学报, 2023, 44(7): 589-601. ［2］黄碧君, 黄艳, 胡红琴, 等. 毛细管电泳法测定重组人源化 IgG2 抗体的纯度［J］. 中国生物制品学杂志, 2018, 31(3): 287-293, 298. ［3］麻旭, 屈晨, 田橙, 等. 毛细管电泳法检测含聚乙二醇的曲妥珠单抗的纯度［J］. 河南师范大学学报(自然科学版), 2021, 49(3): 72-77. ［4］段颖, 谭澄莹, 李国柱, 等. 毛细管电泳法分析 IgG4 型生物类似药纯度［J］. 工业微生物, 2023, 53(5): 122-124. ［5］LI M, YU C, WANG W, et al. Interlaboratory method validation of capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate (CE-SDS) methodology for analysis of mAbs［J］. Electrophoresis, 2021, 42(19): 1900-1913. ［6］国家药典委员会. 中华人民共和国药典（四部）［S］. 北京：中国医药科技出版社, 2020: 480-483. ［7］TAEYE S W D, RISPENS T, VIDARSSON G. The ligands for human igg and their effector functions［J］. Antibodies, 2019, 8(2): 30. ［8］陈泓序, 屈锋. 毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用［J］. 色谱, 2018, 36(3): 195-208. ［9］沈娟, 刘炬, 于蒙蒙, 等. 抗体偶联药物组成及质量控制概述［J］. 解放军药学学报, 2025, 38(2): 209-215. 欢迎点击关注解放军药学学报 END

2026-05-27

·谈医说药

2026年05月27日药品临床试验默示许可

序号受理号药品名称申请人名称适应症注册分类 1 CXHL2600487 SNH-118110软胶囊赛诺哈勃药业（成都）有限公司拟用于治疗RET异常的晚期实体瘤。 1 2 CXHL2600486 SNH-118110软胶囊赛诺哈勃药业（成都）有限公司拟用于治疗RET异常的晚期实体瘤。 1 3 CXHL2600494 S241656片施维雅（北京）医药研发有限公司;上海合全医药有限公司经证实的KRAS、BRAF和其他特定RAS/MAPK突变的恶性肿瘤 1 4 CXHL2600493 S241656片施维雅（北京）医药研发有限公司;上海合全医药有限公司经证实的KRAS、BRAF和其他特定RAS/MAPK突变的恶性肿瘤。 1 5 CXHL2600492 S241656片施维雅（北京）医药研发有限公司;上海合全医药有限公司经证实的KRAS、BRAF和其他特定RAS/MAPK突变的恶性肿瘤 1 6 CXSL2600338 注射用FG-M131 明济生物制药（北京）有限公司经治的TRBC1阳性的复发/难治外周T细胞淋巴瘤患者 1 7 CXHL2600335 HRS-4508片江苏恒瑞医药股份有限公司本品联合曲妥珠单抗±帕妥珠单抗+化疗用于实体瘤的治疗 1

2026-05-16

·槐耳颗粒北京

p-MEK的表达预测食管胃结合部腺癌（AEG）患者的预后，并在槐耳抗食管胃结合部腺癌疗效中发挥作用

p-MEK的表达预测食管胃结合部腺癌（AEG）患者的预后，并在槐耳抗食管胃结合部腺癌疗效中发挥作用袁莉1,2 莫少伟2 徐志远1 吕航3 许景理2 郭凯波2 胡灿2 王晓峰2 陈贵平3 覃江江1 程向东1 1.中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）·中国科学院基础医学与癌症研究所（中国浙江杭州） 2.浙江中医药大学第一临床医学院（中国浙江杭州） 3.浙江中医药大学附属第一医院胃肠外科（中国浙江杭州）摘要食管胃结合部腺癌（AEG）的发病率在全球范围内不断增加，预后差，发病机制不明。槐栓菌（以下称为槐耳）这种传统中药已用于临床治疗多种实体瘤，包括食管胃结合部腺癌。但其抗癌成分和分子机制尚不清楚。在我们之前的研究中，我们发现槐耳正丁醇提取物（HBE）在不同提取物中显示出最强的抗癌活性。在本研究中，我们旨在研究食管胃结合部腺癌患者p-MEK表达的临床相关性以及MEK/ERK信号通路在槐耳正丁醇提取物体外和体内抗食管胃结合部腺癌疗效中的作用。我们在此证明，食管胃结合部腺癌组织中p-MEK表达显著高于癌旁组织，并与食管胃结合部腺癌患者的不良预后相关。我们进一步发现，槐耳正丁醇提取物在体外以浓度依赖性方式抑制食管胃结合部腺癌细胞株的集落形成、迁移和侵袭。槐耳正丁醇提取物还抑制食管胃结合部腺癌异种移植瘤的生长，且不会在体内引起任何宿主毒性。从机制上讲，槐耳正丁醇提取物通过在S298处去磷酸化MEK1、在T202处的ERK1和在T185处的ERK2并调节上皮-间充质转化相关蛋白的表达，导致MEK/ERK信号通路失活。总之，我们的结果表明p-MEK的高表达可能是食管胃结合部腺癌患者预后不良的一个独立因素。临床使用的抗癌药物槐耳可能通过抑制MEK/ERK信号通路发挥其抗食管胃结合部腺癌的功效。关键词食管胃结合部腺癌；槐耳；MEK/ERK信号通路；p-MEK；侵袭和转移一、介绍食管胃结合部腺癌（AEG）通常是指发生在食管胃结合部的腺癌，在两个方向上的5厘米范围内[1]。根据Siewert等人的研究，食管胃结合部腺癌通常分为三种亚型：Ⅰ型意味着肿瘤中心位于齿状线上方1-5cm，Ⅱ型的肿瘤中心位于齿状线上方1cm至下方2cm，Ⅲ型为齿状线下方2-5cm[2]。本病涉及胸腔和腹腔两个主要解剖区域，其发病机制和生物学行为不同于食管癌和胃癌，被认为是一种独立的癌症[3,4]。近年来，全球食管胃结合部腺癌发病率呈上升趋势[5]。手术仍是食管胃结合部腺癌最重要的治疗方法，在手术路径、手术方法、淋巴结清扫范围等方面已经形成了一些指南或专家共识[6-9]。但在化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等临床试验中，食管胃结合部腺癌更常与食管癌和胃癌合并研究，单独研究食管胃结合部腺癌的临床试验很少[10,11]。因此，有必要更好了解食管胃结合部腺癌的致癌过程和分子机制，寻找食管胃结合部腺癌的治疗靶点，开发新的治疗方法。丝裂原激活的细胞外信号调节激酶（MEK）/细胞外信号调控激酶（ERK）通路是癌症中最具特征的激酶级联之一[12]。它调节多种细胞过程，包括增殖、分化、凋亡、上皮-间充质转化等。在结直肠癌中，抑制MEK/ERK信号通路可促进细胞周期阻滞和凋亡，并抑制肿瘤生长[13]。MEK/ERK信号通路的激活也可促进肺癌细胞的上皮-间充质转化并引起肺癌转移[14]。Gonzalez-Hormazabal等人已经证实MEK/ERK通路的多态性与胃癌的发生发展密切相关[15]。王晓伟等人已经在MEK1中确定了三种新的基因变体，基于全基因组关联研究，这可能导致中国汉族人群胃癌风险[16]。已经发现，MEK1的低表达与胃癌患者的低生存率显著相关[16]。最近的研究表明，NF1突变会导致曲妥珠单抗耐药性，而HER2和MEK/ERK联合阻断可克服曲妥珠单抗的耐药性[17]。因此，MEK/ERK通路可能是治疗胃癌和克服耐药性的一个有前景的靶点。然而，目前尚不清楚MEK/ERK信号通路是否在食管胃结合部腺癌的起始和发展中起作用。槐耳在中医中应用已有约1600年的历史。目前，槐耳清膏和槐耳颗粒已广泛用于包括食管胃结合部腺癌在内的各种癌症的临床治疗。陈孝平院士的团队进行了一项多中心、随机对照、Ⅳ期试验，涉及39个中心和1044名患者[18]。结果表明，槐耳颗粒作为根治性肝切除术后的辅助药物可延长无复发生存期，降低肝外复发率[18]。张燕等人已证明槐耳颗粒可以延长乳腺癌患者的无病生存期，并减少情绪症状的发生[19]。但槐耳的抗癌成分及其分子机制尚不明。在我们之前的研究中，使用不同的溶剂进行萃取，产生五个相：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水相。其中，槐耳正丁醇提取物（HBE）显示出最强的抗癌活性[20]。在本研究中，我们检测了61对人类食管胃结合部腺癌组织样本和相应的邻近组织中p-MEK的表达，并评估了p-MEK表达水平与临床病理特征之间的相关性。我们还研究了槐耳正丁醇提取物在体外和体内对人食管胃结合部腺癌细胞株的抗癌作用。最后，我们研究了槐耳正丁醇提取物是否通过MEK/ERK信号通路发挥其抗癌功效。二、材料与方法 1.组织微阵列（TMA）构建和免疫组织化学分析 2014年1月1日至2017年12月31日，我们从浙江省中医院腹部外科收集了61例福尔马林固定、石蜡包埋的食管胃结合部腺癌组织和相应的邻近非癌组织。两位病理学家独立选择最具代表性的肿瘤和配对相邻组织，如前所述制备组织微阵列[21]。如前所述，对系列组织微阵列进行免疫组化染色[21]。两位经验丰富的病理学家独立评估切片。棕色染色细胞被视为阳性。用半定量方法将p-MEK的表达强度分为四种类型：（1）0，阴性，无染色。（2）1+，1%-25%的细胞有明显的染色；（3）2+、25%-50%的细胞有明显的染色；（4）3+，50%以上的细胞有明显的染色。评分为2+或3+被认为是阳性免疫组化结果。 2.细胞株、化学品、抗体和试剂人食管胃结合部腺癌细胞株，包括来自72岁男性患者贲门腺癌OE19[22]，来自男性患者胃底腺癌原发肿瘤SK-GT-2[23]，以及来自89岁高加索人种男性远端食管腺癌原发肿瘤SK-GT-4[23]，购自从拜力生物科技有限公司（中国上海）。人胃上皮细胞株GES-1从中国科学院细胞库（中国上海）获得。在37℃，含5%CO2的细胞培养箱中，OE19、SK-GT-2、SK-GT-4和GES-1细胞在RPMI 1640培养基（吉诺生物医药技术有限公司，中国杭州）中培养，该培养基含有10%胎牛血清（FBS，Gibco，美国格兰德岛）和1%青霉素/链霉素（吉诺生物医药技术有限公司，中国杭州）。抗体包括p-MEK（货号：ab96379，批号：GR112196-15）、MEK（货号：ab178876，批号：GR232892-26）、p-ERK（货号：ab201015，批号：GR3253791-6）、ERK（货号：ab184699，批号为GR3215675-8）、E-钙黏蛋白（货号：ab76055，批号：3260950-8）、N-钙黏蛋白（货号：ab79011，批号为GR3245174-7）和波形蛋白（货号：ab92547，批号：GR3186824-24）购自Abcam（英国剑桥），GAPDH（货号：SA00001-1，批号：20000242）购自Proteintech（美国伊利诺伊州芝加哥）。MEK活化剂PAF C-16（CAS74389-68-7）购自Santa Cruz Biotechnology（美国圣克鲁兹）。MEK抑制剂U0126（abs810003）购自爱必信生物科技（中国上海）。 3.槐耳正丁醇提取物的制备槐耳正丁醇提取物的制备如前所述[20,24]。槐耳购自亳州市药材有限公司（中国安徽）。将槐耳子实体制成粉末，用加热的90%乙醇回流提取两次（每次2小时）。过滤并合并提取溶液，蒸发并浓缩成稠膏状物。真空干燥后，获得90%乙醇提取物粉末。随后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、90%乙醇和蒸馏水提取90%乙醇提取物粉末。通过在旋转蒸发器上浓缩和回收溶剂、冷冻和真空干燥，获得了五种不同的槐耳提取物粉末。将得到的正丁醇提取物粉末储存在-18℃的冰箱中。将槐耳正丁醇提取物粉末溶解在二甲基亚砜中，用0.22μm过滤器灭菌，每次实验都在培养基中制备新鲜稀释液。根据槐耳正丁醇提取物的液相色谱-质谱（LC-MS）联用分析（图S1-8，见附件）共鉴定出21种潜在化合物（表S1，见附件），并用作质量控制标准。 4.细胞活性测定如前所述进行细胞活性测定[25]。简言之，将OE19、SK-GT-2、SK-GT-4和GES-1细胞在96孔培养板（2000-3000个细胞/孔）中培养过夜，然后暴露于槐耳正丁醇提取物（20、40、60、80、100、120、140、160或180μg/mL）或二甲基亚砜中24、48和72小时。然后加入CCK-8溶液以测量吸光度，并按照之前的报告计算细胞存活率和IC50值[25]。 5.集落形成实验将OE19、SK-GT-2和SK-GT-4接种在6孔培养板（500个细胞/孔）中培养过夜，并用槐耳正丁醇提取物（20、40或80 μg/mL）或DMSO二甲基亚砜处理。暴露于槐耳正丁醇提取物 48小时后，细胞在未经处理的新鲜培养基中再培养14天。此后，对细胞进行固定和用结晶紫（索莱宝，中国）染色[26]。 6.伤口愈合实验简言之，将约5×105个OE19、SK-GT-2和SK-GT-4细胞接种在6孔培养板中形成单层。贴壁后，细胞受槐耳正丁醇提取物（20、40或80μg/mL）或二甲基亚砜干预48小时。最后在400倍放大的光学显微镜（ix71，奥林巴斯，日本）下拍摄伤后0、12、24、48小时的照片。 7.Transwell迁移和侵袭（基底胶）实验对于迁移实验，约5×104个OE19、SK-GT-2和SK-GT4细胞悬浮于200μL无血清培养基中，并在槐耳正丁醇提取物（20、40或80 μg/mL）或二甲基亚砜存在下接种于transwell小室（康宁，美国）的上部隔室中。此外，将含有20%FBS的500μL完全培养基加入下部小室。培养48小时后，用棉签去除细胞膜上表面的细胞，用PBS洗涤，结晶紫染色（索莱宝，中国），并在显微镜下分析（Axio Observator A1，蔡司，德国）。对于侵袭实验，膜的上表面被一层基底胶（BD生物科学，美国）覆盖。其他步骤类似于迁移测试[26]。 8.Westernblot分析如前所述进行westernblot分析[26]。药物干预后，提取并对总蛋白定量化，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离，并转移至聚偏氟乙烯印迹膜（Millipore，美国马萨诸塞州）。用一级和二级抗体检测靶蛋白。最后，通过增强化学发光（ECL；Thermo Pierce，美国伊利诺伊州罗克福德）显示条带。计算数据并归一化为GAPDH。 9.裸鼠移植瘤实验根据“实验动物护理原则”（美国国立卫生研究院第85-23号出版物，1996年修订），所进行的动物实验由浙江中医药大学动物护理和使用委员会批准。实验前一周在我们实验室饲养裸鼠（雄性，4周龄）。皮下注射5×106个OE19或SK-GT-4细胞以建立裸鼠皮下异种移植瘤模型。通过管饲法给予不同剂量的槐耳正丁醇提取物（20、50或100mg/kg），每天一次，持续4周。对照组给予相同体积的生理盐水。记录裸鼠的体重、生存状态和肿瘤大小。根据肿瘤体积计算肿瘤抑制率。干预后，处死裸鼠，将肿瘤冷冻至-80℃下以供使用。 10.免疫荧光（IF）和苏木精-伊红（H&E）染色在多聚甲醛灌注和梯度脱水后，在低温恒温器中将连续冷冻肿瘤组织制成8μm厚的切片，固定并封闭。加入一级抗体并在37℃下培养1小时，然后与二级抗体在37℃下培养20-30分钟。最后，用抗荧光淬灭剂（包括DAPI）密封载玻片，并在荧光显微镜下观察。对于H&E染色，冷冻的肿瘤组织在低温恒温器中切割、固定、封闭，并在Mayer苏木精中染色10分钟，然后用伊红染色不到1分钟。染色后，将载玻片脱水、装载，并使用倒置显微镜（Axio Observator A1，蔡司，德国）进行分析。 11.统计分析所有实验重复三次，所有测量值均使用SPSS 22.0（IBM，美国纽约）统计软件进行分析。根据数据是否为正态分布，采用单因素方差分析和非参数检验。使用Kaplan-Meier方法评估生存曲线，使用Cox逐步比例风险回归分析模型进行多变量和单变量分析。p＜0.05被认为概率值具有统计学意义。三、结果 1.p-MEK在肿瘤组织中高表达，与食管胃结合部腺癌患者预后不良相关为了确定p-MEK蛋白在食管胃结合部腺癌中的表达及其临床意义，通过免疫组织化学染色检查了61例食管胃结合部腺癌患者的组织微阵列（图1A）。我们发现，35例（57.4%）食管胃结合部腺癌患者在肿瘤组织中p-MEK有强强度染色，另外26例（42.6%）患者在肿瘤中p-MEK表达低。然而，22例（36.1%）食管胃结合部腺癌患者邻近正常组织中有强p-MEK强度，39例（63.9%）患者具有弱p-MEK强度。所观察到得统计学显著差异（p=0.018），表明p-MEK在肿瘤组织中高度表达（图1B和表1）。我们将食管胃结合部腺癌患者的临床病理特征与p-MEK表达水平进行了比较，发现p-MEK过度表达与肿瘤分化显著相关（表2）。我们还观察到p-MEK表达与总生存率（OS）之间的良好相关性。具有高p-MEK表达的患者的总生存率显著低于具有低p-MEK表达的患者（图1C）。低p-MEK表达的食管胃结合部腺癌患者的3年总生存率为68.8%，而高p-MEK表达的仅为40.4%。进行单变量和多变量分析，表明p-MEK状态是一个独立的预后因素（表S2，见附件）。图1 与邻近组织相比，p-MEK在食管胃结合部腺癌组织中过度表达，p-MEK的高表达水平与食管胃结合部腺癌患者的不良预后相关。（A）通过免疫组织化学分析确定的组织微阵列中p-MEK染色的代表性图像；（B）食管胃结合部腺癌和癌旁组织中p-MEK的差异表达；（C）通过Kaplan-Meier分析（对数秩检验）确定具有不同p-MEK表达水平的食管胃结合部腺癌患者的总生存率（OS）曲线。变量 N p-MEK的表达 χ2值 p值高低肿瘤组织 61 35 26 5.565 0.018* 癌旁组织 61 22 39 表1 食管胃结合部腺癌和癌旁组织中p-MEK的差异表达 *表示具有统计学差异具有显著性（p＜0.05）变量 p-MEK的表达总计 χ2值 p值高低年龄（岁） <66 17 12 29 0.035 0.852 ≥66 18 14 32 性别女 7 5 12 0.006 0.940 男 28 21 49 肿瘤大小＜5cm 15 14 29 0.722 0.395 ≥5cm 20 12 32 分化等级高/中 6 11 17 4.700 0.030* 低/未分化 29 15 44 T分期 T1/T2 3 5 8 1.488 0.223 T3/T4 32 21 53 N分期 N0/N1 12 11 23 0.409 0.523 N2/N3 23 15 38 M分期 M0 32 25 57 0.544 0.461 M1 3 1 4 TNM分期 Ⅰ/Ⅱ 9 8 17 0.190 0.663 Ⅲ/Ⅳ 26 18 44 癌胚抗原（ng/mL）＜5 25 14 39 2.000 0.157 ≥5 10 12 22 HER2 阳性 11 14 25 3.100 0.078 阴性 24 12 36 表2 食管胃结合部腺癌患者p-MEK表达水平与临床病理特征的相关性 *表示具有统计学差异具有显著性（p＜0.05） 2.槐耳正丁醇提取物体外抑制食管胃结合部腺癌细胞增殖、侵袭和转移我们检测了三种人类食管胃结合部腺癌细胞株（OE19、SK-GT-2和SK-GT-4）和一种人类胃上皮细胞株GES-1在不同浓度（0-180μg/mL）槐耳正丁醇提取物的下24、48和72小时时的细胞毒性。如图2A-D所示，槐耳正丁醇提取物显著抑制所有食管胃结合部腺癌细胞株的生长，24小时的IC50值范围为105.44-126.99μg/mL，48小时为69.61-90.07μg/mL和72小时为44.13-62.16μg/mL。然而，GES-1细胞的IC50值高于食管胃结合部腺癌细胞，尤其是在72小时时。我们进一步在OE19、SK-GT2和SK-GT-4细胞株中进行了集落形成实验，以确定槐耳正丁醇提取物对食管胃结合部腺癌细胞增殖的抑制作用。如图2E和F所示，槐耳正丁醇提取物以浓度依赖性方式抑制所有三种食管胃结合部腺癌细胞株中的集落形成。为了评估槐耳正丁醇提取物对细胞迁移和侵袭的影响，我们进行了transwell迁移和侵袭实验与伤口愈合实验。如图3A-B所示，跨膜细胞的数量随着槐耳正丁醇提取物浓度的增加而减少，表明槐耳正丁醇提取物以浓度依赖性方式抑制食管胃结合部腺癌细胞的迁移能力。类似地，槐耳正丁醇提取物也以浓度依赖性方式减弱食管胃结合部腺癌细胞的侵袭能力（图3C-D）。我们进一步确定了槐耳正丁醇提取物对细胞愈合能力（迁移速度）的影响。与对照组相比，暴露于槐耳正丁醇提取物后，OE19、SK-GT2和SK-GT-4细胞的愈合能力显著降低（图3E-J）。图2 槐耳正丁醇提取物在体外抑制食管胃结合部腺癌细胞活性和集落形成。（A-D）分别用槐耳正丁醇提取物以指示浓度处理GES1、OE19、SK-GT2和SK-GT-4细胞24、48和72小时，然后进行CCK-8检测；（E）OE19、SK-GT2和SK-GT-4细胞用指示浓度的槐耳正丁醇提取物处理48小时，然后进行14天集落形成实验；（F）集落形成的定量分析。数据代表至少三个实验。（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。图3 食管胃结合部腺癌在体外抑制食管胃结合部腺癌细胞迁移和侵袭。（A）在OE19、SK-GT2和SK-GT-4细胞中，在所示浓度的食管胃结合部腺癌处理48小时后，进行transwell迁移实验。展示了通过transwell迁移的细胞的代表性显微图像；（B）对在迁移试验中通过transwell迁移的细胞进行定量化；（C）在OE19、SK-GT2和SK-GT-4细胞中，在所示浓度的食管胃结合部腺癌处理48小时后，进行了transwell基底胶侵袭试验，展示了通过transwell侵袭细胞的代表性显微图像；（D）对在基底胶侵袭试验中通过transwell侵袭的细胞进行定量化；（E-G）在OE19、SK-GT2和SK-GT-4细胞中进行伤口愈合实验，以指示浓度的食管胃结合部腺癌处理48小时。显示了0、12、24和48小时伤口愈合的代表性显微图像；（H-J）伤口愈合实验的定量分析。数据代表至少三个实验。（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。 3.食管胃结合部腺癌抑制体内食管胃结合部腺癌肿瘤生长我们进一步评估了食管胃结合部腺癌在体内两种食管胃结合部腺癌异种移植小鼠模型中的抗癌效果。将OE19和SK-GT-4细胞株分别皮下植入裸鼠。以25、50和100mg/kg/天、7天/周的剂量，通过胃内给药，荷瘤小鼠用食管胃结合部腺癌处理4周。如图4A-C所示，剂量为100mg/kg/天的食管胃结合部腺癌的处理显著抑制了32.66%的OE19异种移植瘤的生长。然而，25和50mg/kg/天的剂量没有显著的抑制作用。类似地，剂量为100mg/kg/天的食管胃结合部腺癌引起38.83%的SK-GT-4异种移植瘤模型抑制（图4D-F）。重要的是，与安慰剂处理的小鼠相比，食管胃结合部腺癌的处理不会影响小鼠的平均体重，这表明食管胃结合部腺癌在治疗期间不会引起显著的宿主毒性（图4G-H）。在实验结束时，从所有小鼠中仔细解剖肿瘤进行H&E染色。如图4I所示，对照组中的肿瘤细胞以不规则形态、核肥大、畸形、染色深度和明显异态性为特征。食管胃结合部腺癌干预后，肿瘤特征，包括细胞密度、染色深度和异型细胞减少。图4 槐耳正丁醇提取物抑制OE19和SK-GT-4异种移植瘤的生长而不引起任何宿主毒性。将OE19和SK-GT-4细胞分别皮下植入裸鼠。以25、50或100mg/kg/天、7天/周的剂量，通过胃内给药，用槐耳正丁醇提取物处理荷瘤小鼠4周。在实验过程中测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤抑制率。同时，监测小鼠的体重变化，作为毒性的替代标记物。实验结束时处死裸鼠，仔细解剖肿瘤并称重，对这些肿瘤组织的石蜡切片进行H&E染色。（A）拍摄OE19异种移植瘤；（B）不同组中OE19异种移植肿瘤平均重量；（C）OE19异种移植瘤生长曲线；（D）拍摄SK-GT-4异种移植肿瘤；（E）不同组SK-GT-4异种移植瘤的平均重量；（F）SK-GT-4异种移植瘤生长曲线；荷（G）OE19或（H）SK-GT-4异种移植瘤小鼠的平均体重；（I）OE19和SK-GT-4肿瘤组织的H&E染色代表性图像。（*p＜0.05，**p＜0.01）。 4.槐耳正丁醇提取物在体外和体内抑制MEK/ERK信号通路并调节上皮-间充质转化相关蛋白的表达 MEK/ERK信号通路在调节细胞增殖、凋亡、侵袭和转移中发挥重要作用[28,29]。我们发现p-MEK在食管胃结合部腺癌组织中高表达，并与预后密切相关。我们进一步研究了槐耳正丁醇提取物在体外和体内对食管胃结合部腺癌细胞中MEK/ERK信号通路的影响。如图5所示，槐耳正丁醇提取物在体外以浓度依赖性方式降低了所有三种食管胃结合部腺癌细胞株中S298处的MEK1、T202处的ERK1和T185处的ERK2的磷酸化。在体内，经槐耳正丁醇提取物处理的OE19和SK-GT-4异种移植瘤中获得了类似的结果（图6A-D）。上皮-间充质转化是指上皮细胞失去极性并成为活性间充质细胞的生物学过程[30]。一些上皮-间充质转化标记物已经有表征良好；E-钙黏蛋白（E-cad）表示上皮-间充质转化的上皮表型，而N-钙黏蛋白（N-cad）和波形蛋白表示上皮-间充质转化间的充质表型。我们还研究了槐耳正丁醇提取物对上皮-间充质转化标记表达的影响。如图5、图6E-G所示，槐耳正丁醇提取物增加了E-钙黏蛋白的蛋白质水平，降低了N-钙黏蛋白和波形蛋白的蛋白水平。这意味着槐耳在体外和体内抑制了上皮-间充质转化过程。图5 槐耳正丁醇提取物在体外抑制MEK/ERK信号通路并调节上皮-间充质转化相关蛋白的表达。（A）OE19、SK-GT-2和SK-GT-4细胞用指示浓度的槐耳正丁醇提取物处理48小时，并使用特异性抗体通过westernblot法检测各种蛋白质的水平；（B-D）各种蛋白的相对条带密度。使用ImageJ软件分析蛋白条带的密度，并归一化为GAPDH。数据代表至少三个实验。（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。图6 槐耳正丁醇提取物在体内调节MEK/ERK信号通路和上皮-间充质转化相关蛋白的表达。免疫荧光检测OE19和SK-GT-4异种移植肿瘤中的MEK/ERK信号通路和上皮-间充质转化相关蛋白。（A）p-MEK的代表性图像；（B）MEK的代表性图像；（C）p-ERK的代表性图像；（D ERK的代表性图像；（E）E-钙黏蛋白的代表性图像；（F）N-钙黏蛋白的代表性图像；（G）波形蛋白的代表性图像。 5.MEK/ERK信号通路对槐耳正丁醇提取物的抗癌功效很重要为了探讨槐耳正丁醇提取物是否通过抑制MEK/ERK信号通路发挥其抗癌功效，在存在或不存在MEK激活/抑制剂的情况下用槐耳正丁醇提取物处理OE19和SK-GT-4细胞。如图7A-B所示，MEK激活剂PAF C-16显著增强了集落形成[31]，而MEK抑制剂U0126抑制了OE19和SK-GT-4细胞中的集落形成[32]。然而，槐耳正丁醇提取物处理逆转了PAF C-16对OE19和SK-GT-4细胞克隆形成的影响，但增强了U0126的抑制作用。在transwell迁移和侵袭实验以及伤口愈合实验中获得了类似的结果。MEK活化剂PAFC-16的处理增加了食管胃结合部腺癌细胞的迁移和侵袭能力，而MEK抑制剂U0126产生相反的效果（图7C-H）。槐耳正丁醇提取物的加入进一步降低了PAF C-16的作用，但增强了U0126对食管胃结合部腺癌细胞的作用。如图7I所示，MEK激活剂在S298增加了MEK1的磷酸化，在T202增加了ERK1，在T185增加了ERK2，从而激活了MEK/ERK信号通路。还观察到MEK激活剂降低E-钙黏蛋白的蛋白水平，增加N-钙黏蛋白和波形蛋白的蛋白水平。MEK抑制剂获得相反的结果。正如预期的那样，槐耳正丁醇提取物的干预逆转了MEK激活剂的作用，并增强了MEK抑制剂对MEK/ERK信号通路和上皮-间充质转化标记物的作用，这表明MEK/ERK信号通路和上皮-间充质转化标记物在槐耳正丁醇提取物的抗癌疗效中都起着重要作用。图7 MEK/ERK信号通路和EMT标记物对于槐耳正丁醇提取物的抗食管胃结合部腺癌功效是重要的。在存在或不存在MEK激活/抑制剂的情况下，用槐耳正丁醇提取物处理OE19和SK-GT-4细胞，随后进行集落形成试验、transwell迁移试验、transwell基底胶侵袭试验、伤口愈合试验和westernblot分析。在这些实验中，细胞被分为五或六组：对照组给予安慰剂；槐耳组给予40μg/mL的槐耳正丁醇提取物，MEK激活剂组给予2μmol的MEK激活物PAF C-16，激活剂联合槐耳组同时给予MEK激活剂和槐耳正丁醇提取物，MEK抑制组给予10μmol的MEK抑制剂U0126；该抑制剂与槐耳组联合使用MEK抑制剂和槐耳正丁醇提取物。（A）集落形成实验的代表性显微图像；（B）集落形成的定量分析；（C）在transwell迁移实验中通过transwell迁移的细胞的代表性显微图像；（D）在transwell迁移实验中，通过transwell定量迁移的细胞；（E）transwell基底胶侵袭试验实验中通过transwell侵袭的细胞的代表性显微图像；（F）在transwell基底胶侵入试验中，通过transwell侵袭的细胞的定量；（G）0小时和24小时伤口愈合的代表性显微图像；（H）伤口愈合实验的定量分析；（I）westernblot分析的代表性显微图像。（与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与MEK激活剂组相比，##p＜0.01，###p＜0.001；与MEK抑制剂组相比，※p＜0.05，※※p＜0.01）。四、讨论食管胃结合部腺癌的发病率在全球范围内不断增加[33]。手术仍是早期食管胃结合部腺癌患者的首选；然而，大多数食管胃结合部腺癌患者在诊断时伴有远端转移。因此，包括化疗、靶向治疗、免疫治疗和中医治疗在内的综合治疗是晚期食管胃结合部腺癌的主要选择[34]。其中，中医药在提高生活质量、预防复发转移、延长生存期方面具有独特优势，已成为抗癌治疗的重要组成部分[35]。 MEK/ERK信号通路在各种类型的癌症中过度激活，与肿瘤生长、转移、耐药性和不良预后密切相关[36,37]。林建贤等人已经表明，p-MEK表达增加预示着胃腺癌患者总生存率恶化[38]。Lahat等人报道p-MEK是未分类多形性肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤的潜在预后生物标志物[39]。此外，野井正治等人已经证明ERK在舌癌中过度表达，可能是预防舌癌的新治疗靶点[40]。在我们的研究中，我们检测了61例患者食管胃结合部腺癌肿瘤组织和配对癌旁组织中p-MEK的表达，发现p-MEK在肿瘤组织中高度表达，并与肿瘤分化程度密切相关。单因素和多因素分析均表明p-MEK的表达是食管胃结合部腺癌的独立预后因素。槐耳是一种传统中药，已用于临床治疗多种实体瘤，包括肝癌、乳腺癌、胃癌等[41-43]。例如，谢骏等人发现槐耳提取物可以通过激活NLRP3依赖性上睑下垂抑制非小细胞肺癌的进展[44]。周灿灿等人报道了槐耳提取物通过在体外和体内抑制Wnt/β-连环蛋白通路抑制胰腺癌[45]。在我们的研究中，我们发现槐耳正丁醇提取物对人食管胃结合部腺癌细胞株OE19、SK-GT-2和SK-GT4显示出显著的细胞毒性，并在体外以浓度依赖的方式抑制食管胃结合部腺癌细胞株的增殖、迁移和侵袭能力。此外，槐耳正丁醇提取物抑制OE19和SK-GT-4异种移植瘤的生长，而不会在体内引起任何宿主毒性。我们进一步发现，槐耳正丁醇提取物通过在体外和体内下调S298处的MEK1、T202处的ERK1和T185处的ERK2的磷酸化，增加E-钙黏蛋白，降低N-钙黏蛋白和波形蛋白水平，抑制MEK/ERK信号通路和EMT过程的激活。此外，槐耳正丁醇提取物的处理逆转了MEK激活剂的作用，但增强了MEK抑制剂的抑制作用，这表明MEK/ERK信号通路对槐耳正丁醇提取物的抗癌功效很重要。根据高效液相色谱和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，槐耳最有效的成分被确定为多糖蛋白，其包括41.53%的多糖、12.93%的氨基酸和8.72%的水分[46]。多糖也被确定为槐耳的关键成分[47,48]。在我们的研究中，应用液相色谱-质谱联用法分析槐耳正丁醇提取物，发现21种潜在化合物，包括二苯二硫化物、酪醇4-硫酸盐、司莫司汀、丙二酰肉碱等。在未来的研究中，我们将检验这些化合物的抗癌功效，并探索其分子靶点和作用机制。总之，本研究表明，槐耳正丁醇提取物通过抑制MEK/ERK信号通路，在体内外抑制食管胃结合部腺癌肿瘤生长和转移，且在有效剂量下不会引起显著毒性。MEK/ERK信号通路是食管胃结合部腺癌的潜在治疗靶点，槐耳正丁醇提取物可用于临床治疗食管胃结合部腺癌。作者贡献袁莉、莫少伟和徐志远设计、进行实验，并撰写文稿。吕航、许景理、郭凯波、胡灿、王晓峰和陈贵平在研究数据的设计和解释方面提供帮助。覃江江和程向东组织、构思并监督该研究。所有作者都阅读并批准文稿。资金支持本研究得到浙江省自然科学基金（批号：LY18H290006、LR21H280001）、国家自然科学基金（批号：81903842、81973634、82074245）、浙江省中医药科技计划项目（批号：2018ZY006、2020ZZ005、2019ZZ010）和浙江省博士后科研项目（批号：ZJ202028）的资助。竞争性利益声明作者声明，研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在利益冲突。致谢我们感谢浙江中医药大学中医药科学院医学科研中心公共平台在技术上的大力支持。参考文献 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Sci. 15 (7) (2019) 1358-1367, https://doi.org/10.7150/ijbs.27360. 附件一、液相色谱-质谱联用法测定槐耳的主要成分 1.方法（1）槐耳正丁醇提取物的处理将1mg槐耳正丁醇提取物加入1ml的预冷甲醇中，振动20分钟，在4℃下用10000×g离心10分钟，其中600μl冻干，然后溶解在100μl甲醇/水（4：1）中，取4μl上清液进行实验。（2）色谱条件色谱柱：Waters UPLC BEH C18（1.8um×2.1mm×50mm）。流动相：A（0.1%甲酸水溶液）和B（乙腈）。洗脱程序：2%的B保持1分钟，然后在24分钟内增加到80%，26分钟达到100%，4分钟后，柱平衡5分钟。流速为0.35 ml/min，注射体积为4ul，每次注射前平衡时间为5分钟，柱温50℃。（3）质谱鉴定采用正离子检测模式-ESI电离模式，质量扫描范围为80-1000m/Z。氮气用于各种气路。质谱参数如下表所示。离子模式和极性 ESI+ 质量 80-1000M/Z 毛细管 3000V 取样锥 35V 脱溶剂温度 300℃ 脱溶剂气流量 500L/h 锥孔气流量 50L/h 源温度 100℃ 信噪比 5 2.结果（1）基峰色谱图（图1S）（2）归一化后的质谱峰和化合物 ①质量为219.0286，质量精度为30ppm（图2S） ②质量为365.0903，质量精度为30 ppm（图3S） ③质量为381.0808，质量精度为30 ppm（图4S） ④质量为248.1147，质量精度为30 ppm（图5S） ⑤质量为241.1557，质量精度为30 ppm（图6S） ⑥质量为609.2589，质量精度为30 ppm（图7S） ⑦质量为369.3534，质量精度为30 ppm（图8S）（3）槐耳正丁醇提取物的液相色谱-质谱联用成分分析编号 Metlin数据库 ID 分子式可能物质 1 70164 C12H10S2 4,4’-联苯二硫醇 2 87947 C12H10S2 二苯二硫化物 3 96137 C8H10O5S 酪醇4-硫酸盐 4 68719 C15H16N4O5S 甲嘧磺隆 5 93287 C17H16O9 花椒毒酚葡萄糖苷 6 90180 C14H20O10S 4-甲氧基苄基O-（2-磺基葡糖苷） 7 6809 C13H21N2O7PS O-乙酰丝氨酸 8 44131 C10H18CIN3O2 司莫司汀 9 6484 C10H17NO6 丙二酰肉碱 10 73463 C10H17NO6 缬氨酸 11 63624 C10H17NO6 亚麻苷 12 73225 C16H13N3 颜料黄AB 13 66744 C12H20N2O3 吡丁醇 14 66981 C17H20O 去氢镰叶芹酮 15 93252 C36H36N2O7 醉茄碱 16 263475 C31H36N4O9 酪氨酸-酪氨酸-酪氨酸-苏氨酸 17 263418 C31H36N4O9 酪氨酸-酪氨酸-苏氨酸-酪氨酸 18 262278 C31H36N4O9 酪氨酸-苏氨酸-酪氨酸-酪氨酸 19 239478 C31H36N4O9 苏氨酸-酪氨酸-酪氨酸-酪氨酸 20 42544 C27H44 3-脱氧维生素D3 21 72700 C22H44N2O2 果绿啶表1S 槐耳正丁醇提取物的液相色谱-质谱联用法组分分析二、槐耳正丁醇提取物的液相色谱-质谱联用成分分析因子单变量分析多变量分析风险比（95% 可信区间） p值 p值性别男 vs. 女 0.344 0.182 2.004（0.722-5.565）年龄＜66 vs. ≥65 0.067 0.022* 0.371（0.159-0.864） p-MEK表达低 vs. 高 0.012* 0.020* 2.922（1.186-7.202）肿瘤大小（cm）＜5 vs. ≥5 0.769 0.987 1.007（0.426-2.382）分化等级高/中 vs. 低/未分化 0.08 0.478 0.658（0.207-2.093） T分期 T1，T2 vs. T3，T4 0.078 0.148 6.433（0.516-80.210） N分期 N0，N1 vs. N2，N3 0.01* 0.061 4.383（0.932-20.623） M分期 M0 vs. M1 0.043* 0.382 1.756（0.497-6.203） AJCC分期 Ⅰ，Ⅱ vs. Ⅲ，Ⅳ 0.076 0.512 0.552（0.930-3.270）癌胚抗原（ng/ml）＜5 vs. ≥5 0.640 0.512 0.749（0.315-1.778） HER2 阳性 vs. 阴性 0.896 0.645 0.823（0.359-1.886）表2S 槐耳正丁醇提取物的液相色谱-质谱联用成分分析三、未裁切原始图像 1.图5中的未裁切westernblot分析原始图像 2.图7中的未裁切westernblot分析原始图像

100 项与曲妥珠单抗生物类似药(Biocad Medical, Inc.) 相关的药物交易

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