ORN101

体内（In vivo）CAR-T细胞治疗是一种创新策略，直接将编码CAR的转基因递送至内源性T细胞，在体内对其进行重编程，具有生产流程简化和成本降低的优势。已发表的临床试验显示，体内CAR-T取得了令人鼓舞的治疗效果，但仍有多个关键障碍有待解决，包括递送载体的靶向特异性不足、载体介导的免疫清除、生产瓶颈和安全性问题。递送系统是体内CAR-T治疗的关键组成部分，可分为病毒载体和非病毒载体。目前，优化递送系统以支持其在体内CAR-T制备中的稳健应用，已成为推进体内CAR-T治疗的关键因素。 《Biochemical Pharmacology》近日一篇综述中，作者首先总结了体内CAR-T细胞治疗的机制、当前临床格局和主要挑战。随后，针对这些挑战，系统梳理了适用于该疗法的现有优化策略。此外，该综述还为研究人员提供了关于体内CAR-T细胞治疗优化的展望。 引言 嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞治疗涉及工程化T细胞以表达识别细胞表面特定抗原的受体，使其能够杀死肿瘤细胞或其他靶细胞以治疗疾病。已有多款体外CAR-T产品上市，在血液恶性肿瘤治疗中发挥关键作用，包括多发性骨髓瘤、大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病；此外胃癌也有CAR-T上市。然而，体外CAR-T治疗仍面临制造工艺复杂、成本高昂以及需要为每位患者制造个性化产品等挑战。为解决这些问题，已提出众多策略。例如，从健康供者分离T细胞以生产“现货型”异基因CAR-T细胞，具有生产成本更低、可预先制造和产品储存等优势。与体外CAR-T和自体CAR-T相比，体内CAR-T治疗具有独特优势，近年来为解决CAR-T技术的实际瓶颈而得到越来越多的发展。体内CAR-T治疗具有显著优势，包括成本降低和制造程序更简化。 当前临床试验数据已证实体内CAR-T治疗在多发性骨髓瘤和难治性系统性红斑狼疮（SLE）中具有良好的治疗疗效。 然而，体内CAR-T治疗比传统体外CAR-T治疗表现出更突出的安全风险，从而阻碍了其广泛临床应用。缺陷性递送策略是限制体内CAR-T治疗临床转化的核心障碍。首先，这些载体的全身给药可触发内源性宿主免疫应答，导致载体清除，因此提高载体的免疫逃逸能力对于确保其在体内的功能效力至关重要。此外，载体对T细胞亚群的靶向精度仍不理想，为实现高效且特异的T细胞工程化，需开发能够选择性识别和稳健激活功能性CAR-T细胞以实现有效抗肿瘤免疫的靶向分子。对于慢病毒载体（LVs），必须优化包膜蛋白和靶向配体，并提高病毒滴度以降低制造成本。对于脂质纳米颗粒（LNPs），优化脂质组成和组分比例以使CAR分子在T细胞中持续表达仍是一项挑战。最后，慢病毒载体的随机基因组整合和载体免疫原性等安全性问题仍有待解决。此外，补体激活相关假性过敏（CARPA）、固有输注反应以及由于肝脏趋向性导致的潜在脱靶毒性是脂质基纳米载体的主要挑战。幸运的是，近年来已建立多种递送系统优化策略，为开发高效安全的体内CAR-T治疗奠定了坚实基础。 在本综述中，作者首先总结了体内CAR-T细胞治疗的机制、当前临床格局和主要挑战。随后，针对这些挑战，作者系统梳理适用于该疗法的递送系统现有优化策略。此外，作者还为研究人员提供关于体内CAR-T细胞治疗优化的新见解。 体内CAR-T治疗的特征与机制 CAR-T细胞治疗涉及工程化T细胞以表达识别细胞表面特定抗原的受体，使这些细胞能够消除肿瘤细胞或其他靶细胞以治疗疾病。与传统体外CAR-T治疗不同，体内CAR-T治疗直接在患者体内生成功能性CAR-T细胞。这避免了体外细胞操作和复杂的操作程序，有效克服了传统CAR-T产品的关键限制。虽然这两种治疗模式的细胞制备机制不同，但其核心治疗功能保持一致。该疗法依赖以慢病毒载体和LNPs为代表的递送系统，将编码CAR的遗传物质精确递送至患者的内源性T细胞。因此，递送载体的优化已成为体内CAR-T治疗进一步发展的关键驱动力。 目前，LNPs和慢病毒载体是体内CAR-T治疗最常用的两种递送载体。LNPs利用表面偶联的靶向分子识别靶细胞并诱导瞬时CAR表达，由于其内在设计导致治疗活性短暂。对于临床应用，通常采用制剂优化或重复给药以提高整体治疗疗效。相比之下，慢病毒载体介导CAR基因稳定整合至T细胞基因组。由此产生的工程化T细胞可以以抗原依赖的方式在体内持续增殖和长期存续。然而，慢病毒载体携带脱靶基因组整合和插入诱变的潜在风险。此类安全性问题需要在临床应用前进行持续严格的评估（图1）。 图1.体内 CAR-T治疗的输送策略存在多个挑战 体内CAR-T细胞治疗的当前临床进展 体内CAR-T治疗在血液恶性肿瘤和自身免疫性疾病中均取得了令人鼓舞的临床结果。四种基于慢病毒载体的候选产品ESO-T01、JY231、KLN-1010和LB2501已被开发用于复发/难治性多发性骨髓瘤，并通过单次静脉输注给药。在2×10⁸ TU剂量下，ESO-T01的总体缓解率为80–100%，大多数患者达到严格完全缓解（sCR）、完全缓解（CR）或非常好的部分缓解（VGPR）（NCT06691685，NCT06791681）。CAR-T细胞的峰值扩增发生在第10至17天之间，治疗相关毒性包括1–3级CRS和轻度ICANS]；一名患者死于髓外疾病相关并发症。JY231（NCT06797024）是一种基于慢病毒的体内CAR-T候选产品，用于难治性神经系统自身免疫性疾病，通过单次静脉输注2.0×10⁹转导单位给药，导致有效的全身性B细胞清除。患者在中位随访6个月时显示出可测量的临床和生物学改善。 根据2026年美国临床肿瘤学会（ASCO）年会报告和2026年欧洲血液学协会（EHA）大会，KLN-1010（NCT07075185）以2×10⁷ TU/kg和6×10⁶ TU/kg的剂量静脉给药，所有六例可评估患者均根据国际骨髓瘤工作组（IMWG）统一缓解标准达到临床缓解。一名患者在6个月时维持严格完全缓解（sCR）并持续MRD阴性。3例患者发生输注相关反应，4例患者发生2级CRS。此外，2026年EHA大会数据显示，LB2501（NCT07002112）——一种用于复发或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤的新药——在高剂量组中达到83.3%的CR率，安全性良好。然而这些相关临床试验的随访时间仍然有限，未来研究需要长期监测（表1）。尽管完整的正式临床试验报告仍待发布，但迄今为止报告的令人鼓舞的初步疗效数据仍证实了体内CAR-T模式的转化潜力。 迄今为止，病毒载体介导的体内CAR-T治疗的临床开发主要集中在复发或难治性血液恶性肿瘤和自身免疫性疾病，代表性候选产品包括靶向CD20的INT2104（NCT06539338）和靶向CD19的UB-VV111（NCT06528301）。所有这些产品均通过包膜修饰消除天然趋向性，并通过整合T细胞靶向修饰（如CD3、CD7和CD8靶向）增强转导特异性。 同时，基于LNP的HN2301靶向难治性系统性红斑狼疮，需要多次静脉输注（NCT06801119）。所有接受治疗的患者均获得明显的临床改善。LNPs驱动的CAR表达在输注后6小时达到峰值，仅伴随短暂的CRP和IL-6轻度升高。少数患者接受了托珠单抗治疗，反映出良好的安全性特征（表1）。 非病毒载体介导的体内CAR-T治疗的临床研究涵盖三大领域，包括实体瘤、自身免疫性疾病和纤维化疾病，代表性产品包括靶向TROP2的MT-302（NCT05969041）、靶向GPC3的MT-303（NCT06478693）和靶向CD19的CPTX2309（NCT06917742）。该类载体的重复给药可行性已得到验证，部分产品进一步探索环状RNA作为有效载荷以延长CAR分子的体内表达持续时间。 尽管体内CAR-T已取得令人鼓舞的临床结果，但其两大递送系统均具有固有局限性。总之，体内CAR-T细胞治疗在治疗肿瘤和自身免疫性疾病方面展现出光明前景。慢病毒载体确保持久CAR表达，但携带整合相关安全隐患；而LNPs具有良好安全性，但受限于治疗效力短暂。 体内CAR-T细胞治疗的当前递送系统与优化策略 优化递送系统以使其在体内CAR-T细胞制备中稳健应用，已成为推进体内CAR-T细胞治疗的关键因素。众多优化策略已成功增强体内CAR-T治疗的疗效，这些方法为进一步开发提供了新见解。本文对现有体内CAR-T生成策略进行了比较总结，为优化方法的设计提供了框架（参见原文表2）。 慢病毒载体 LVs属于逆转录病毒的一个亚类，其特征在于球形、有包膜结构和两条单链RNA基因组。慢病毒的生命周期涉及多个复杂步骤，其中逆转录和核输入是实现非分裂细胞转导的关键（图2）。 图2.慢病毒载体和脂质纳米颗粒递送 CAR基因生成体内 CAR-T细胞的机制图 目前有多种优化慢病毒载体递送的策略不断涌现，有利于体内CAR-T治疗的发展。因此，本文对此类优化策略进行了总结。从野生型病毒到高效多功能递送载体，科学家们通过包膜假型化和靶向分子优化等策略，使慢病毒载体在基因治疗中的应用成为可能。 包膜假型化和靶向分子优化 例如，使用辛德毕斯病毒（SINV）作为载体骨架，对其包膜蛋白（E1/E2）进行假型化。为实现“脱靶阻断”，在E2蛋白中引入定点突变。然后将工程化的SINV载体与缺乏Fc区的双特异性Fab片段偶联。该靶向分子由两个功能部分组成：抗辛德毕斯E2 Fab和抗人CD3ε Fab，表现出优异的亲和力和特异性。在动物实验中，CD8+ CAR-T细胞约占CAR-T细胞总数的40%。同时，观察到脾脏肿瘤显著消退，肿瘤组织中CAR-T细胞比例达到0.6%，荷瘤小鼠的生存时间显著延长。 一项研究描述了第四代慢病毒载体，能够在体内高效生成CAR-T细胞。他们使用尼帕病毒（NiV，一种副粘病毒）的G和F蛋白作为工程基础修饰慢病毒载体的包膜，其中NiV-G蛋白作为受体结合蛋白，F蛋白负责与细胞膜融合。其次，在决定病毒载体对T细胞亚群识别精度的靶向分子优化方面。小鼠实验结果显示，在CD3-设计锚蛋白重复蛋白（DARPin）-LV组的骨髓中，CAR-T细胞比例可达60%，而靶向相同抗原的单链可变片段（scFv）-LVs组中，B细胞比例可降至1–2%。 研究人员开发了一种用犬瘟热病毒（CDV）的H/F包膜蛋白假型化的慢病毒载体，命名为CDV-Ad-LV。该载体对两种包膜蛋白均进行了靶向结构修饰：对于H蛋白，其胞质尾端截短30个氨基酸，并敲除介导与CD150受体结合的氨基酸残基以防止脱靶细胞结合。同时，将抗连接标签表位（LLE）scFv融合至H蛋白以连接靶向分子。在使用NSG小鼠的实验评估中，观察到显著的治疗效果和安全性：载体给药后15天内，小鼠血液、骨髓和脾脏中的B细胞被消除；相关组织和器官中CAR+ T细胞比例为15%至20%。 作为慢病毒载体的主力假型，水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）可通过低密度脂蛋白受体（LDL-R）家族受体实现高滴度载体生产和广泛细胞进入，但其非选择性趋向性阻碍了体内CAR-T应用中精确的T细胞特异性基因递送。为优化传统慢病毒VSV-G包膜蛋白载体，对VSV-G与LDL-R结合关键的残基I182E进行定点突变。食蟹猴大型动物实验结果显示，给药后四天，外周血中CD20+ B细胞数量减少53%–84%。此外，研究人员采用了广泛的突变策略，均旨在消除VSV-G的天然趋向性。研究人员还使用cocal包膜蛋白替代VSV-G。这种修饰大大增强了对血清介导清除的抵抗力，并允许靶向分子展示在病毒表面。 如上所述，包膜假型化与靶向分子工程相结合的整合优化策略已广泛应用于各种慢病毒载体，这构成了体内CAR-T治疗临床转化和实际部署的基本前提（图3）。 图3.体内 CAR-T细胞治疗中慢病毒载体包膜蛋白和靶向分子的假分型策略 为应对慢病毒载体的现有挑战，学者进一步开发并实施了一系列优化策略，致力于增强载体的关键特性，包括靶向特异性、持久性、转导效率和载体制备（图4）。 图4.目前增强体内 CAR-T细胞治疗疗效的慢病毒优化策略  靶向与T细胞激活增强策略 为优化靶向特异性，靶向分子的工程化是慢病毒载体升级的核心焦点。为确定体内CAR基因递送最有效的靶向分子，研究人员对三种常用候选物的靶向效力进行了比较分析。其中，将重链仅抗体可变重链域（VHH）或设计锚蛋白重复蛋白（DARPin）整合到慢病毒载体中，可显著增强转导效率，同时显著提高T细胞靶向特异性（图4）。 从增强T细胞激活的角度，研究人员将CD80、CD58和抗CD3 scFv融合形成多域融合蛋白（MDF），导致T细胞上CD25高表达、细胞因子分泌增加和增殖能力增强。与对照组相比，对NALM6肿瘤表现出显著的细胞毒性效应。 此外，从表达平台的角度，也有旨在增强T细胞激活效力的策略。使用骨髓增生性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失、d1587rev引物结合位点替换（MND）启动子驱动基因表达，载体携带的核心基因组通过多顺反子序列实现CAR和RACR（雷帕霉素激活的细胞因子受体）系统的共表达。雷帕霉素触发FKBP12-雷帕霉素结合域（FRB）和RACR亚基之间的异二聚化，组装完整的细胞内信号复合物，实现可调控的T细胞激活，避免组成性刺激导致的持续性T细胞耗竭。在NSG小鼠中，第18天在外周血中可检测到CAR-T细胞；外周血CD19+ B细胞在第11天降至检测下限（<1%），并连续25天保持不可检测且无恢复。 免疫逃逸增强策略 此外，已开发多种专门优化策略以增强慢病毒载体的免疫逃逸能力，鉴于递送载体在体内给药后容易被宿主免疫系统清除，这是一个关键问题。为减轻这种免疫清除，将CD47蛋白工程化表达于病毒包膜表面；使其能够与巨噬细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）受体结合，从而抑制病毒颗粒的吞噬作用，有效延长载体的体内半衰期。SIRPα胞质域的细胞内磷酸化传递强效的“别吃我”抑制信号，阻断载体的吞噬降解。同时，敲除病毒包装细胞中的MHC I类分子可减少抗载体适应性免疫应答的诱导。在涉及四名患者的临床试验中，两名达到严格完全缓解（sCR）。 载体制备增强策略 慢病毒载体携带两条正义RNA链，许多优化策略聚焦于其基因组序列。进一步优化慢病毒载体基因组是克服现有挑战的另一关键方法。一种修饰涉及将色氨酸RNA结合衰减蛋白（TRAP）结合序列（tbs）插入CAR基因的5‘UTR区域，同时在载体制备细胞中表达TRAP。TRAP与tbs的结合抑制CAR蛋白翻译，减少其意外整合到载体颗粒中。类似地，采用T细胞特异性启动子驱动CAR基因表达。这两种策略均有效防止CAR基因在病毒包装细胞中的过早表达，避免CAR分子包装到载体表面，从而增强慢病毒载体在体内CAR-T应用中的安全性。 其他优化方法还包括消除病毒包装信号中的“主要剪接供体（MSD）”以防止异常剪接病毒RNA的产生并提高病毒滴度。此外，工程化长末端重复序列（LTRs）以增强转录绝缘，减弱载体基因组整合对宿主基因表达的影响，从而减轻插入诱变的潜在风险。值得注意的是，许多慢病毒载体依赖强启动子驱动CAR表达；然而，这种高转录活性常导致过早的T细胞耗竭和相关安全问题。此外，慢病毒的制备和纯化对体内CAR-T治疗尤为关键。高纯度病毒制剂不太可能触发过度免疫应答，而高滴度制造有助于控制总体成本。这既是体内CAR-T治疗的固有优势，也是决定其进一步发展的关键因素。 总体而言，基于慢病毒载体的体内CAR-T产品的临床进展具有“血液恶性肿瘤优先，逐步扩展至自身免疫性疾病”的轨迹。在安全性方面，它们均表现出优于体外CAR-T治疗的特征，同时在疗效方面达到客观缓解。基于上述优化策略总结，也为慢病毒在体内CAR-T治疗领域的后续优化提供了见解（图3）。 腺相关病毒 腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA细小病毒，其基因组包含rep基因、cap基因和两端的反向末端重复序列（ITRs）。作为基因治疗中的关键递送载体，它具有众多核心优势，如致病性弱、免疫原性低和广泛趋向性。超过100种AAV变体已应用于基因递送；这些不同的AAV血清型通过结合不同受体靶向不同分子，从而治疗多种疾病。AAV作为体内CAR-T生产的另一种流行病毒载体，具有众多优势。研究人员对AAV的持续优化不断增强其将CAR基因递送至体内T细胞的能力。 AAV-CD4CAR通过将AAV-DJ血清型与抗CD4 scFv结合构建。当AAV-CD4CAR注射到携带人T细胞白血病模型的小鼠体内时，第10天开始观察到肿瘤缩小，第17至25天出现显著治疗效果。在6只接受治疗的小鼠中，4只达到完全缓解（CR）。 DARPin具有高稳定性、低免疫原性和无需翻译后修饰等优势，使其非常适合用作载体表面的靶向配体。通过核糖体展示技术生成高亲和力CD8靶向DARPin并展示在AAV表面。体外特异性实验结果显示，在总脾细胞（含有大量脱靶细胞如B细胞）中，mCD8-AAV转导的GFP+细胞中CD8+细胞比例超过99%。此外，mCD8-LV-CAR将CD19+ B细胞数量降至对照组的不到20%，并将细胞活力降至60%，表明具有显著的细胞毒性效应]。目前，尽管AAV在基因治疗领域已被广泛研究，但AAV在体内CAR-T治疗领域应用的成功案例仍相对较少。这归因于AAV载体的固有局限性，包括货物容量受限、无法将转基因整合到T细胞基因组以及靶向能力相对较弱。然而由于AAV载体的独特优势，研究人员继续探索解决体内CAR-T细胞治疗所面临挑战的方案。 许多有效的AAV优化策略可为其在体内CAR-T中的应用奠定基础。众多科学家致力于通过修饰AAV的反向末端重复序列（ITRs）来提高转导效率和包装容量。这种修饰消除了宿主酶合成互补链的需要，从而节省时间并提高转导效率。同时，利用启动子的双重RNA聚合酶II/聚合酶III（pol II/pol III）活性，该设计能够通过单一载体递送所有治疗组分，解决AAV的包装容量限制。 脂质纳米颗粒 LNPs是一类非病毒递送载体，由水相中的mRNA和有机相中的脂质自组装而成。其脂质组成在结构上模拟细胞膜，能够与靶细胞高效相互作用、内化，随后将遗传货物释放到细胞质中（图2）。此外，LNPs在疫苗开发、传染病防控、组织修复、肿瘤治疗等领域至关重要。近年来，它们也成为体内CAR-T治疗领域的焦点。 最初，研究人员开发了靶向CD4的mRNA-脂质纳米颗粒平台，实现对CD4+ T细胞的特异性靶向。该平台使脾脏和淋巴结中CD4+ T细胞的Cre/loxP介导的基因重组效率分别达到约60%和40%。此外，已建立包封mCherry或Fluc报告mRNA的抗CD3偶联LNP平台。具体而言，他们构建了以CD5为标志物的靶向LNPs，包封编码成纤维细胞激活蛋白（FAP）导向CAR的核苷修饰mRNA。在血管紧张素II/去氧肾上腺素诱导的心力衰竭小鼠模型中，48小时内脾脏T细胞中CAR-T细胞比例达到17.5%–24.7%。 脂质组成和靶向分子优化 含可生物降解酯基的可电离脂质（如MC3、SM-102、ALC-0315）优先用于避免不可降解脂质（如C12-200）相关的高毒性。同时，应用微流控混合降低LNPs的多分散性。为满足体内CAR-T治疗的靶向需求，进一步实施多项优化：用靶向配体进行表面修饰增强T细胞特异性转导；调整LNP形态和表面电荷减少肝脏脱靶积累；控制mRNA纯度（通过减少dsRNA污染物）并结合PEG-脂质锚长度优化延长全身循环（图5）。 图5.目前用于增强体内 CAR-T细胞治疗疗效的 LNPs优化策略 当LNPs用作递送载体时，其脂质组成和比例并非固定。研究人员根据具体需求选择满足转染效率和安全性等要求的最佳脂质组分组合。在体内CAR-T治疗领域，已确定众多合适的脂质组分比例（图5）。这构成了优化递送策略的重要步骤，也是更好应用于体内CAR-T细胞治疗领域的初步探索。 研究人员设计了心磷脂模拟磷酸酰胺（CAMP）脂质以构建CAMP-LNP系统，以PL40为核心组分，该系统通过调节脂质的形态积累和刚性实现T细胞特异性递送，无需抗体修饰。在转染细胞中，脾脏中80%为T细胞。与CD3-Fab修饰的靶向LNPs相比，该LNP在脾脏和血液中达到相当的T细胞转导效率（20%–30%）。一般而言，静脉输注是LNPs临床试验中的主要给药途径。根据靶向策略的差异，这些试验可分为两种主要类型：一种利用髓系细胞趋向性LNPs，另一种采用抗体修饰的tLNPs。 对于LNPs上靶向分子的优化，研究人员尝试使用双靶向分子以实现增强的靶标特异性和改善的转染效率。新型T细胞特异性tLNP载体NCtx实现了双靶向，功能化有抗CD7纳米抗体和抗CD3 scFv。CD19 CAR-T细胞的转染效率超过41%。此外，DNA锚定技术能够将抗体修饰到以Dlin-MC3-DMA为可电离脂质的LNPs表面，构建双特异性LNPs。与传统方法（酰胺键形成、马来酰亚胺化学）相比，该锚定技术提供更高的精度和更短的反应时间（1小时内完成）。同时，此类LNPs可有效减少肝脏积累，与未修饰LNPs相比，脾脏转染效率提高5倍以上。 安全性增强策略 对于LNPs的安全性优化，研究人员构建了CD3抗体修饰的脂质纳米颗粒（AntiCD3-LNP/CAR19+ shIL6）。这些纳米颗粒负载含有IL-6 shRNA和CD19-CAR的融合质粒，从而在体内生成IL-6敲低的CAR-T细胞。在NSG小鼠中，肿瘤负荷在第12天开始减少，到第41天几乎所有肿瘤被消除，CAR-T细胞的峰值产生在第14至21天之间达到。在这些CAR-T细胞中，CD8+ CAR-T细胞占75%，CD4+ CAR-T细胞占25%。该平台表现出良好的安全性，无明显毒性。 此外，采用CD3靶向抗体修饰结合共递送FAP-CAR和人表皮生长因子受体截短（HuEGFRt）分子开关融合mRNA，不仅实现泛T细胞特异性转导，还能通过西妥昔单抗控制性消除CAR-T细胞。在心肌纤维化小鼠模型中，该策略显著减轻纤维化，改善心脏功能，且无脱靶组织损伤。 与慢病毒载体相比，LNPs通常被认为更安全，但其固有的肝脏趋向性和脱靶转导仍是进一步临床转化的主要挑战。随着体内CAR-T治疗的发展，需要更多研究来开发适应此类治疗方案的LNP系统。 持续表达和载体感染效力增强策略 T细胞在体内激活不足，损害治疗疗效。研究人员通过将CD3和CD28抗体片段偶联到以C14-4为可电离脂质的LNPs表面，开发了激活型脂质纳米颗粒（aLNPs），模拟抗原呈递细胞（APCs）的“主要激活信号+共刺激信号”功能。与前述慢病毒载体上的MDF类似，该方法产生具有增强细胞毒性和改善持久性的CAR-T细胞。 在这些努力中，ORN-101利用上述环状RNA（circRNA）与LNPs结合。circRNA的闭合结构将其血清半衰期延长至48小时以上，是线性mRNA的3倍。在非人灵长类动物模型中，ORN-101实现了超过50%的T细胞转导效率，无明显脱靶毒性。在肿瘤模型中，给药后3天内CAR-T细胞浸润肿瘤组织，7天内肿瘤体积减少60%以上。同时，在人原代T细胞中，环状荧光素酶RNA与线性对应物相比将蛋白表达延长至5天，突出了circRNA在蛋白表达方面的优势。 NCtx能够共负载编码CAR的小型环状DNA（mcDNA）和介导基因整合的SB100x转座酶mRNA。这种优化允许在体内稳定生成CAR-T细胞。在B细胞白血病小鼠模型中，20天后诱导出强效的CAR-T细胞生成，实现完全肿瘤清除或显著控制，并延长了小鼠的生存时间。 LNPs具有优异的安全性，但仅维持瞬时CAR表达；而慢病毒载体支持长期稳定的CAR表达，但安全性相对较差。当前研究努力持续解决这些递送载体的固有缺陷，以在安全性和持久CAR表达之间取得平衡。 值得注意的是，已建立合适的tLNP制造工艺，具有与多种制剂和配体的模块化兼容性、受体介导的递送增强靶向特异性同时减少剂量和脱靶毒性、依赖常规实验室设备、高重现性和良好的临床转化性。聚焦多样化优化需求，这些可简要概括为多维修饰，包括脂质组分的组成和比例、靶向选择、安全性和效力（图5）。 聚合物纳米颗粒 纳米颗粒（NPs）由纳米球和纳米胶囊两种组分构成。由于其可控释放能力和保护包封分子免受外部损伤等优势，已被设计并应用于多种疾病的治疗。在体内CAR-T治疗的生成中，纳米球包封CAR mRNA并将其递送到T细胞中。以下总结了纳米颗粒在体内CAR-T细胞治疗中应用的研究进展。 研究人员证明，与抗CD3ε（Fab）2靶向配体偶联并负载编码白血病特异性194-1BBz CAR和iPBT转座酶的质粒DNA的合成聚合物纳米载体，可在体内编程循环T细胞。在免疫活性B细胞急性淋巴细胞白血病小鼠模型中，纳米载体诱导生成足够数量的CAR-T细胞（第6天，CD3+细胞中CAR细胞比例达到5.8%±0.9%）。纳米载体为癌症免疫治疗提供了一种新型、低成本且广泛适用的策略。 其他推进体内CAR-T细胞治疗的递送策略 已开发了双载体系统，它包含用于CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）递送的CD3靶向包膜递送载体（EDVs）和用于递送同源修复模板的T细胞趋向性AAV-hT7，该系统支持在体内原代人T细胞的T细胞受体α恒定链（TRAC）位点进行大DNA货物的位点特异性整合。它将CAR转基因精确插入T细胞特异性位点，驱动均匀稳定的CAR表达。单次静脉注射到人源化小鼠中产生治疗功能性TRAC CAR-T细胞。该治疗对B细胞急性淋巴细胞白血病达到90%以上的完全缓解，在多发性骨髓瘤模型中达到100%完全缓解。 除上述递送策略外，其他几种方法在体内CAR-T治疗中也取得了进展，如生物指导性可植入支架、Cas9包装包膜递送载体和病毒模拟融合纳米囊泡。生物指导性可植入支架代表一种应用于体内CAR-T治疗的创新方法，因为它们为CAR-T细胞的激活、增殖和释放创造局部支持性微环境。例如，基于藻酸盐的支架含有靶向人CD3和CD28的抗体以及促进T细胞增殖的人IL-2。该支架接种自体外周血单核细胞（PBMCs）和逆转录病毒，然后植入人体。令人惊讶的是，这种基于支架的方法在CAR-T细胞扩增和持久性方面表现出优越性能。 Cas9包装包膜递送载体（Cas9-EDVs）是用于基因编辑工具的膜衍生颗粒递送系统。通过在其表面展示scFvs和突变VSVG，它们实现对特定细胞类型的精确靶向。该系统可包封Cas9蛋白单引导RNA（sgRNA）复合物（核糖核蛋白，RNPs），并优先在混合细胞群中介导靶细胞的基因组编辑，最大编辑效率为80%。此外，用于体内CAR-T细胞生产的病毒模拟融合纳米囊泡（FuNVs）。通过将麻疹病毒或呼肠孤病毒的融合蛋白工程化为T细胞靶向融合原（p14TF和MVTF，均用抗CD3 scFv修饰），构建了共表达这些融合原和抗CD19 CAR蛋白的RAW264.7生产细胞，并进一步从这些细胞制备FuNVs。此外，这些抗CD19 CAR-T细胞，单独或与抗OX40抗体联合，可有效治疗B细胞淋巴瘤而无细胞因子释放综合征（CRS）风险。该方法解决了传统CAR-T细胞治疗复杂的体外制造、高成本和易诱导CRS的问题。 展望 基于当前体内CAR-T优化策略的发展趋势，递送载体是体内CAR-T治疗的关键组成部分。未来的递送载体将围绕四个核心维度进行优化：递送载体在靶向性、安全性、T细胞激活水平和功能持续性方面的增强。 优化策略的展望 如上所述，对于慢病毒载体，采用了“包膜假型化和靶向分子筛选”等策略；而对于LNPs，“脂质组分比例优化和靶向分子筛选”则常被应用。研究人员应选择具有低毒性、高递送效率和稳定生产特征的载体。例如一些研究表明，在LNPs的脂质制剂中补充甲硫氨酸、精氨酸和丝氨酸可显著增强递送效率。 载体安全性是推进体内CAR-T治疗临床转化的首要考虑因素。对于LNPs，编码甲病毒复制酶机制的自扩增RNA（saRNA）在细胞内复制以实现持久表达]。同时，尿苷-假尿苷修饰的端粒酶mRNA可通过改善细胞存活显著增强递送系统的功能持久性。 此外，其他技术（如CRISPR）可被整合以敲除与CAR-T细胞功能持久性相关的基因，其中十一位易位2（TET2）、DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）和碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子（BATF）作为潜在靶点。特定基因过表达，如上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α），也可改善CAR-T细胞效力。总之，优化体内CAR-T的治疗效果不仅限于递送载体修饰，还包括与其他治疗模式的联合或使用促进体内CAR-T细胞生成的共培养剂。 LNPs在包括体内CAR-T细胞治疗在内的多种治疗领域取得了实质性进展。鉴于LNPs在众多治疗领域的广泛适用性，已建立的LNPs优化策略可应用于解决体内CAR-T细胞治疗的关键挑战。为提高转染效率，除脂质组分比例优化外，有效方法还包括加入单宁酸以增强内体逃逸。 潜在递送系统的展望 多种潜在递送系统也在体内CAR-T治疗中逐步探索。研究人员发现了一种逆转录病毒样蛋白PEG10，它可以结合自身mRNA并在其周围形成球形保护胶囊。经过工程化修饰后，它可作为mRNA递送的载体。基于该技术，Aera Therapeutics推出了名为蛋白纳米颗粒（PNP）的新型递送平台，这是对LNPs的进一步改进，有望未来应用于体内CAR-T细胞治疗领域。此外，抗体-寡核苷酸偶联物（AOCs）由用于靶向特定细胞的抗体片段、携带基因药物的寡核苷酸和维持抗体功能及寡核苷酸活性的活性连接子组成。 体内CAR-T治疗研究的展望 未来体内CAR-T治疗的研究需要在临床前和转化开发过程中进行系统、多维的表征，以全面评估安全性、功能稳定性和治疗效力。给药后，基于qPCR的外周血和组织中CAR转基因拷贝数的动力学定量能够追踪CAR-T扩增峰值和长期持久性。对于治疗后安全性评估，效应细胞因子（包括IFN-γ和IL-2）的定量，结合组织病理学和免疫组织化学，建立瘤内CAR-T定位、杀肿瘤活性与脱靶浸润风险之间的相关性。由于当前临床试验缺乏足够的长期随访来验证持久安全性特征，需要高灵敏度测序来表征载体整合模式并评估插入诱变相关危害。总之，这一系列现代表征方法有助于合理优化体内CAR-T平台，并加速安全有效的下一代细胞治疗的临床转化。 结论 体内CAR-T治疗是过继性免疫治疗的关键突破。当前的临床前和临床数据表明，其在治疗血液癌症和自身免疫性疾病方面具有可接受的安全性和令人鼓舞的疗效。然而短期随访限制了对长期安全性和缓解持久性的结论性判断，需要更大规模和更长持续时间的临床验证。尽管如此，初步结果为体内CAR-T平台的治疗潜力提供了令人鼓舞的证据。 本综述总结了体内CAR-T治疗的治疗机制、临床进展和已报道的优化策略，并强调了进一步改进的其他有前景的方向。例如，增强T细胞激活的策略——包括慢病毒载体的MDF修饰和LNPs的双靶向分子——可适用于其他递送平台。研究人员可根据具体实验或临床需求选择合适的优化方法，而不限于已部署用于体内CAR-T的技术。在其他研究领域验证的方法也可作为推进体内CAR-T治疗的可行替代方案。然而，与CRISPR等其他技术结合仍存在多个未解决的障碍。未来研究应优先考虑这些潜在方法，以完善载体效力、克服当前挑战，并促进递送系统在体内CAR-T治疗中的更好应用。