D-16(Nankai University)

今天为大家带来的是一项来自英矽智能（Insilico Medicine）团队的工作：作者主要隶属于英矽智能在上海、美国剑桥（Cambridge, MA）、香港及阿布扎比的研发机构，围绕细胞周期关键靶点 PKMYT1 展开研究；他们结合公司自研的生成式 AI 平台 Chemistry42 与结构生物学、药物化学和体内外药效评价体系，最终开发出一个具备口服暴露并可诱导 PKMYT1 降解的双功能 PROTAC（D16-M1P2），用于探索 PKMYT1 的肿瘤生物学与治疗潜力。  01   研究背景：为何要做“可口服、可降解”的 PKMYT1 药物 PKMYT1 是细胞周期 G2/M 转换的重要激酶，参与对 CDK1 Thr14 位点的抑制性磷酸化。对某些肿瘤背景（如 CCNE1 扩增、FBXW7/PPP2R1A 等改变）而言，PKMYT1 依赖性增强，使其成为具有合成致死潜力的治疗靶点。文章提出一个关键现实问题：传统 PKMYT1 抑制剂往往只“抑制催化活性”，且可能受药代与耐药限制；而 PROTAC 通过事件驱动的方式降低靶蛋白水平，有机会带来更持久的通路抑制，并同时覆盖潜在的非催化功能，因此值得系统开发。 先造“可挂接的强抑制剂”：AI 生成 + 结构生物学把 warhead 打磨到可开发 图1 基于Chemistry42平台的AI驱动生成与新型PKMYT1抑制剂及PROTAC的开发流程 a 通过 AI 生成与优化得到化合物 4。生化结合亲和力（HTRF 检测）以及细胞内 CDK1 Thr14 位点磷酸化水平 pCDK1（细胞内 Western 检测）均以 IC50 表示。KinomeScan 激酶谱图中最大的红点表示在 1000 nM 条件下测试的 PKMYT1。所有数据均为至少两次重复实验的平均值。CLp 表示血浆清除率。b 化合物 2 与 PKMYT1 的 X 射线共晶结构。c 化合物 3 的预测结合构象。d 化合物 4 的预测结合构象。e 构建的 PKMYT1–CRL4^CRBN 复合物模型。绿色卡通结构表示 PKMYT1；预测的可被泛素化的 Lys345 以绿色棒状结构显示。f 化合物 D1 的结构。g 在 HCC1569 细胞中比较 PROTAC D1 与其 PKMYT1 结合抑制剂组分化合物 4 的 pCDK1 抑制活性。数据以平均值表示（生物活性 n=2，药代数据 n=3）。 作者没有直接用已知抑制剂作为 PROTAC 的靶蛋白配体（POI ligand），而是先用 Chemistry42 生成新骨架。其策略是：固定 RP-6306 在后口袋的关键 2,4-二甲基-3-苯酚片段，同时把 RP-6306 的铰链区药效团与 dasatinib 的溶剂区特征“拼接”成一个新药效团模型，然后用片段替换与片段生长的生成式流程产出候选分子，经过聚类、重对接与人工检视后选出命中化合物 1 并开展 SAR。 从化合物 2 的共晶结构出发，作者识别到其在溶剂区可与 Gln196 形成关键相互作用，但缺乏与保守水分子相关的稳定网络；于是通过在核心引入氰基恢复与保守水分子的氢键联系并限制构象自由度，得到化合物 3，再继续围绕代谢软点优化，最终获得化合物 4。化合物 4 的“被选中”并非只因活性更强，更重要的是它同时具备：更好的渗透性/溶解度/代谢稳定性与口服生物利用度，以及一个“尾端伯胺”，既可能与 Gln196 额外成键，又提供了非常直接的偶联位点，天然适合作为 PROTAC 的 warhead。  02   三元复合物建模：用“可连接的构象”反推 linker 的长度与几何 图2 PROTAC 的构效关系（SAR）探索 a CRBN 结合基团（CRBN binders）的筛选。b 连接臂（linkers）的筛选。 PPB Fu：小鼠血浆蛋白结合实验中测得的游离分数（fraction unbound）。小鼠药代（Mouse PK）实验在 CD-1 进食状态雌鼠中进行（除非另有说明）；静脉注射（IV）组剂量为 1 mg/kg。波浪线表示成键/连接位点。 CLp：血浆清除率；PO：口服给药；Vdss：稳态分布容积；AUC0–24h：0–24 小时暴露量；DN fAUC：剂量归一化的游离暴露量；F：口服生物利用度。 生化结合亲和力（HTRF 检测）以及细胞内 CDK1 Thr14 位点磷酸化水平 pCDK1（细胞内 Western 检测）均以 IC50 表示。细胞内 PKMYT1 降解（Jess 检测）以 DC50 和 Dmax 表示。 图中显示的是三次重复实验的平均值，为了清晰起见省略标准差。a 为 IV 组；b 为 PO 组；c 为禁食小鼠。 所有数据均以至少两次生物学重复的平均值给出；KinomeScan（KS）与 PPB 的 n=2，药代（PK）的 n=3。 PROTAC 是否能降解，关键在于能否形成足够稳定、构象合理的三元复合物（PKMYT1–PROTAC–CRBN），并把可泛素化的赖氨酸暴露给 E2。作者用 MOE 做蛋白-蛋白对接，把“PKMYT1–化合物4（即新设计的PKMYT1 小分子抑制剂）”的二元复合体与“CRBN–lenalidomide”的二元复合体进行对接，并进一步把包含 CRBN/DDB1/CUL4/RBX1 的 cryo-EM 结构叠合上去，从而在三元构象中检查 PKMYT1 表面赖氨酸是否有利于伸向 E2。最终他们选取了 Lys345 朝向 E2 的构象作为设计依据，并测得两端配体连接点距离约 8 Å，对应大约 8–10 个原子长度的 linker 区间。 值得强调的是：作者并未按“最简单直链”去合成，而是把纯碳直链只作为虚拟种子；因为多数口服可用 PROTAC 的经验规律是 linker 往往半刚性，完全线性链会带来过高柔性与不利的理化性质。于是他们固定两端配体、以生成式 AI 去生成多样化 linker 片段，再用实验筛选把模型推断落到真实可行的化学空间。  03   三部分的选择与迭代：POI 端、CRBN 端与 linker 的“工程化筛选”路径3.1 POI 端（PKMYT1 warhead）的选择：优先“可开发性 + 可偶联性” 化合物 4 成为后续所有 PROTAC 的 POI 端核心模板：一方面它保留关键结合相互作用并具备优秀激酶选择性；另一方面其伯胺尾基提供了统一的 tethering site，使研究者能把变量集中放在 CRBN binder 与 linker 上做系统筛选，从而把 PROTAC 研发从“碰运气”拉回到“可控的参数优化”。3.2 CRBN 端的选择：从“能降解”转向“能口服、游离暴露高、复合体平衡好” 由于CRBN表达广且临床阶段 PROTAC 已验证其可用性，作者选用 CRBN 作为 E3 连接对象。在 D1–D6 的筛选中，一个重要观察是：这些化合物在 PKMYT1 亲和力、降解效力、清除等方面差异不大，但在溶解度、血浆蛋白结合游离分数与口服暴露上差别显著，而这些差别与分子量、可旋转键、TPSA 等可开发性参数高度相关。D1 虽然细胞降解很强，但溶解度极差且 PPB 游离分数很低，成为继续优化的直接动因。 在这条线上最关键的决策点是选择 D6：它是一个 aniline 类 CRBN binder 方案，分子量与 PSA 更低，FeSSIF 溶解度更高、PPB 游离分数最高、并带来最强的口服暴露（甚至出现超线性口服生物利用度）。文章还用若干反例提示 CRBN binder 的“微小变化”会导致降解完全丢失或出现明显 hook effect；更重要的是，某些替代 CRBN binder（D9–D11）会导致下游 pCDK1 效力变差，作者将其解释为可能形成“亲和力不平衡”的主导三元复合体，从而降低有效降解。最终，D6 被确定为后续 linker 优化的主平台，因为它提供了更好的“剂量归一化游离暴露”，也更利于口服药物化。3.3 linker 的选择：围绕“长度、角度、刚性、碱性”逐轮收敛到 D16 基于既定的 PKMYT1–CRL4^CRBN 模型，作者对 linker 做了工程化优化：插入环结构、改变 spirocycle 尺寸、微调长度（如增加一个亚甲基）、调整含氮环类型以提升碱性与溶解度，并特别强调用更刚性的 5,6-spirocycle 降低可旋转键数量。最终得到 D16，其细胞效力、溶解度与 PPB 游离分数明显改善，且在小鼠中口服暴露更线性、药代更可控。 进一步的关键步骤是“立体化学筛选”。作者通过手性拆分得到 D16 的四个非对映体，它们对 PKMYT1 的结合差异很小，但在细胞中降解效率与 pCDK1 抑制出现明显分化，最终锁定 D16-M1P2：其 PKMYT1 降解 DC50 达到 0.7 nM、Dmax 约 90%，并伴随更强的 pCDK1(T14) 抑制。  04   验证与机制：三元复合物逻辑如何在实验中“闭环” D16-M1P2 的降解依赖典型的 CRBN–UPS 机制：蛋白酶体抑制剂 MG132 或 neddylation 抑制剂 MLN-4924 可完全阻断降解；CRBN 配体（pomalidomide）或 PKMYT1 小分子配体（化合物 4）竞争也可阻断降解，这些结果共同支撑“必须形成三元复合体并触发泛素化”的核心设计假设。 文章还给出了对 PROTAC 研发非常实用的现象学解释：在超过最大降解浓度后出现 hook effect，降解下降但下游抑制继续增强。作者用不能结合 CRBN 的对照化合物 D16-NMe-M1P2 拆分贡献，指出 D16-M1P2 的长期效应主要来自降解，而在高浓度区间抑制作用会补强通路抑制，这解释了“降解与功能 readout 不完全一致”的剂量-效应关系。  05   体内证据与意义：口服可用 PROTAC 的现实落点 在 CCNE1 扩增的 HCC1569 异种移植模型中，D16-M1P2 口服给药（BID，21 天）表现出剂量依赖的抑瘤效果，并在肿瘤组织中观察到 PKMYT1 降解与 pCDK1(T14) 抑制的 PD 关联；同时作者也对比指出，若仅以相近 pCDK1 抑制为目标，D16-M1P2 并未必优于 RP-6306，可能与 RP-6306 脱靶贡献有关，但 RP-6306 的体重下降更明显，提示其治疗窗可能更窄。整体上，D16-M1P2 更高选择性与“降解带来的持久抑制”，使其既是研究 PKMYT1 生物学的高质量工具分子，也为后续临床候选的进一步优化提供了更干净的起点。  06   总结：这项工作给 PROTAC 设计的三点可复用方法学 第一，先用生成式 AI + 结构信息把 POI 端做到“强、干净、好接”，再进入 PROTAC 组合优化，能显著提高研发效率。第二，用三元复合体构象（尤其是可泛素化 Lys 的几何关系）反推 linker 的长度与角度，并把“直链”当作虚拟种子而非合成答案，更符合口服 PROTAC 的现实约束。第三，CRBN binder 的筛选不应只看“能不能降解”，而要把溶解度、PPB 游离分数与口服暴露纳入同一套决策体系；而 linker 的收敛往往需要“刚性化 + 立体化学筛选”才能把三元复合体的微小差异放大成可观的细胞效应差异。 参考文献：Wang Y, Wang X, Liu T, et al. Discovery of a bifunctional PKMYT1-targeting PROTAC empowered by AI-generation[J]. Nature Communications, 2025, 16: 10759. DOI:10.1038/s41467-025-65796-8. 版权信息 本文系AIDD Pro接受的外部投稿，文中所述观点仅代表作者本人观点，不代表AIDD Pro平台，如您发现发布内容有任何版权侵扰或者其他信息错误解读，请及时联系AIDD Pro (请添加微信号Cynthia_qin1114)进行删改处理。 本文为原创内容，未经授权禁止转载，授权后转载亦需注明出处。有问题可发邮件至qinxin@stonewise.cn 关注我，更多资讯早知道↓↓↓