HN-2301

【编者荐语】近日， nature reviews drug discovery杂志发表Carl H. June团队的一篇综述，从历史、技术和发展等角度全方位回顾了体内（in vivo）CAR-T。现全文翻译分享如下，原文PDF已上传文末小程序，点击免费下载。 嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已改变血液系统恶性肿瘤患者的预后，但该疗法的应用受限于劳动密集型的制造过程、有限的生产能力以及不稳定的临床疗效。体内CAR-T细胞工程技术可在患者体内直接生成CAR-T细胞，通过省去体外细胞处理和复杂物流环节，同时改善临床疗效，有望克服上述挑战。病毒学、RNA药物和纳米技术领域的最新进展，推动了该方法的重大革新——利用慢病毒载体、脂质纳米颗粒（LNPs）等靶向递送系统，将编码CAR的遗传物质导入内源性T细胞。早期临床研究已显示出高效的转导效率、持续的CAR表达以及抗肿瘤活性的初步迹象，证实了该技术的概念可行性。本综述探讨了相关基础技术（包括脂质纳米颗粒递送的RNA和工程化病毒载体），并讨论了这些技术如何被改造以开发更广泛适用、可规模化、安全且有效的CAR-T细胞疗法。通过省去体外操作和化疗预处理步骤，该策略不仅能让CAR-T细胞疗法更广泛地应用于血液系统肿瘤，还能拓展至体外CAR-T细胞疗法已显示出良好前景的自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮）。 目录 1. 引言 2. 体外工程化CAR-T细胞的经验启示 3. 体内细胞疗法：历史视角 4. 病毒载体 5. 基于RNA的平台 6. 临床开发阶段的体内CAR-T细胞 7. 体内免疫工程：关键挑战 8. 展望 1. 引言     过去三十年间，在单克隆抗体、抗体-药物偶联物、细胞因子、免疫细胞衔接器、DNA疫苗，以及近年来RNA基疫苗和工程化T细胞疗法等技术进展的推动下，免疫疗法发生了重大变革。在这些疗法中，自体嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法（采集患者自身T细胞，经基因修饰表达CAR后回输）因其强效性脱颖而出，在B细胞恶性肿瘤中展现出治愈潜力。尽管前景可期，但自体或异体CAR-T细胞疗法向更广泛适应症和患者群体的拓展速度却低于预期。目前已明确的障碍包括制造和物流的复杂性、有限的生产能力，以及对基于化疗的清淋预处理的需求——这些因素均限制了疗法的可及性和适用范围。因此，该领域正处于又一个转折点，需要在递送和工程技术方面进行创新，以克服这些局限，充分发挥CAR-T细胞疗法乃至整个免疫疗法的潜力。     本综述首先探讨从传统体外工程化CAR-T细胞产品开发中获得的关键启示——这些启示推动了体内CAR技术作为替代方案的研发进程。这种新型策略省去了细胞制造及相关限制可及性的物流环节，避免了基于化疗的清淋预处理，从而为充分释放CAR技术的潜力（包括应用于安全性要求更高的适应症）提供了可能。随后，我们将综述主流的体内CAR平台，以及支持其开发的临床前或临床概念验证数据。最后，我们将讨论该疗法潜在的局限性、推动其向临床应用转化的策略，以及这一进展如何推动免疫细胞工程向更广泛的体内应用转变（利用多样化的机制和载荷）。 2. 体外工程化CAR-T细胞的经验启示     迄今为止，已有多款通过逆转录病毒或慢病毒载体工程化改造、靶向CD19或B细胞成熟抗原（BCMA）的自体CAR-T细胞产品获批，用于治疗多种B细胞恶性肿瘤，包括B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。此外，数百项CAR-T细胞研发项目处于不同阶段，全球有超过1000项临床试验正在进行中。其中包括“现成可用”的异体CAR-T细胞（allo-CAR-T细胞）产品——这类产品在肿瘤领域的临床疗效尚未达到自体CAR-T细胞水平，但可能适用于自身免疫性疾病。对已获批CAR-T细胞的详细评估（包括通过逆向转化分析阐明毒性和治疗耐药机制）为下一代细胞疗法和体内CAR疗法的设计提供了关键经验（详见专栏1）。 专栏1：从体外病毒工程化CAR-T细胞产品开发中获得的关键经验 优势 - 嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法是具有治愈潜力的强效干预手段：自体CAR-T细胞产品在部分B细胞恶性肿瘤患者中实现了持久缓解，且可能在B细胞相关自身免疫性疾病中诱导“免疫重置”。 - 可以在没有长期靶向毒性和持久性CAR-T细胞存在的情况下即可实现持久缓解。治疗相关不良事件的分级和管理已得到充分认识和标准化。 局限性 - 由于产品T细胞适应性[fitness]不足、不利的肿瘤特征和/或肿瘤克隆逃逸，许多癌症患者无法获得持久的临床获益。 - 部分患者会出现严重毒性，可能包括免疫炎症性不良事件（细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）、免疫效应细胞相关噬血细胞综合征样综合征（IEC-HS））以及与预处理相关的骨髓毒性。 - 从可及性来看，由于细胞制造的可扩展性和物流限制，且疗法仅限在经认证中心开展，仅约20%符合条件的患者可获得商业产品。 - 整合型病毒载体的使用和对化疗预处理的依赖也可能影响其适用性。 未来机遇 - 展望未来，该领域正致力于简化制造和物流流程，以提高患者可及性，尤其关注“现成可用”的产品形式。 - 短期内，CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中的应用有望从复发难治性疾病扩展到一线治疗、新诊断的高危患者（以实现治愈目的），同时也可能应用于非B细胞血液系统癌症。 - 在实体瘤领域，研究重点是开发疗效更高、缓解更持久的产品。 - 除肿瘤领域外，将CAR技术应用于非肿瘤适应症（包括自身免疫性疾病、再生医学和感染性疾病）的兴趣日益增长。 2.1 作为变革性疗法的CAR-T细胞疗法     尽管自体CAR-T细胞最初主要针对癌症开发，但越来越多的证据表明其有望治疗更广泛的疾病，包括自身免疫性疾病。在纤维化和自身免疫性疾病领域的临床前研究，以及涵盖狼疮肾炎、肌炎、系统性硬化症等自身免疫性疾病适应症的多项临床病例研究均显示，该疗法可实现持久的无治疗缓解、清除自身反应性记忆B细胞，并降低疾病相关生物标志物水平。这种机制被称为“免疫重置”，模拟了大剂量化疗后自体干细胞移植治疗严重自身免疫性疾病的效果。本质上，这种重置通过用功能正常的免疫系统替代含有致病性自身反应性免疫细胞的免疫库，实现疾病的完全且持续缓解。     体外工程化CAR-T细胞产品已积累了大量临床数据，包括超过35000名接受商业产品治疗的癌症患者，这些数据推动了治疗相关不良事件（如细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关噬血细胞综合征样综合征（IEC-HS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）、中性粒细胞减少症，以及与低丙种球蛋白血症相关的B细胞耗竭）的分级和管理的标准化。这些知识可用于推动下一代CAR-T细胞产品的临床开发，从而大幅扩大该疗法的应用范围。 2.2 可及性与临床疗效的局限性     尽管取得了这些成功，成本、可扩展性和可行性问题仍严重限制了商业体外工程化CAR-T细胞产品的可及性，也可能阻碍其向非肿瘤适应症和癌症早期治疗的广泛应用。事实上，在美国，约五分之四符合条件的淋巴瘤患者目前无法获得商业CAR-T细胞产品。除可扩展性外，临床应用或研发中的CAR-T细胞产品还存在其他问题，包括其风险特征要求采用基于化疗的清淋预处理（在肿瘤临床实践中，通常包括环磷酰胺等DNA烷化剂和氟达拉滨等嘌呤类似物）。这些药物会带来明确的毒性，叠加CAR-T细胞过度活化引发的其他不良事件，部分患者可能需要强化的住院管理，从而将该疗法限制在经认证的治疗中心开展。这些因素共同导致了疗法可及性的挑战，并可能限制其在自身免疫性疾病、再生医学等适应症中的广泛应用。     此外，肿瘤领域的疗效局限性源于影响部分患者的复杂治疗耐药机制，包括免疫细胞活性不足、肿瘤内在因素（如免疫抑制性肿瘤微环境（TME）），以及靶抗原低表达或异质性表达驱动的免疫逃逸。要将CAR-T细胞的获益扩展到更广泛的血液系统恶性肿瘤患者群体，并在实体瘤中实现相当的疗效（这一宏伟目标可能需要新的方法，如免疫系统的多模态体内工程），就必须系统性地解决这些因素。 3. 体内细胞疗法：历史视角     体内CAR-T细胞疗法作为一种可规模化的替代方案正在兴起，它既无需体外细胞操作，也无需清淋预处理。该方法的核心机制特征是利用“现成可用”的载体或制剂，在体内对免疫细胞进行直接原位CAR工程改造（详见专栏2）。这些体内工程化的免疫细胞可以是T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和/或其他免疫细胞（已分化为效应细胞），甚至可以是具有强大分化为免疫效应细胞能力的造血干细胞（HSCs）。该方法有望将CAR分子的变革性强效与“现成可用”无细胞策略的可扩展性相结合，从而可能同时解决传统疗法在可及性乃至部分临床疗效方面的局限性。 专栏2：体外工程化CAR-T细胞产品与体内CAR疗法的机制差异 体外病毒工程化CAR-T细胞 - 需进行清淋预处理，以促进输注的嵌合抗原受体（CAR）-T细胞活化、扩增并分化为效应细胞。这一过程主要由分化程度较低的T细胞（如干细胞样记忆T细胞）驱动，这类细胞具有最强的扩增和分化能力。 - 治疗后7-14天内，分化的效应细胞通过直接作用和协同其他免疫机制，识别并清除靶细胞。 - 在部分患者中，永久工程化的CAR-T细胞可能出现过度扩增或持续存在，同时还可能激活巨噬细胞，进而引发细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）和免疫效应细胞相关噬血细胞综合征样综合征（IEC-HS）。 - 此外，部分患者可能出现长期B细胞耗竭和低丙种球蛋白血症，需静脉输注免疫球蛋白以预防感染。 - 该平台的一种改良形式以mRNA而非整合型载体作为载荷，可实现CAR的瞬时表达。 体内CAR疗法 - 输注含有表达CAR的载荷的病毒载体或脂质纳米颗粒（LNP）制剂后，包括已分化效应细胞在内的免疫细胞会被快速工程化，进而在微环境中识别并清除靶细胞。 - 该治疗方式无需清淋预处理，因为需要利用患者体内已存在的免疫细胞。 - 部分载体经过工程化改造，可实现细胞靶向摄取或调节工程化免疫细胞的活性。 - 与慢病毒载体不同，CAR mRNA形式设计为瞬时发挥作用，从而在机制上限制靶向活性的持续时间。然而，要实现足够高的药理活性，可能需要对其进行大量优化或重复给药。 - 相比之下，基于病毒的平台会使T细胞携带永久整合的CAR载荷——根据抗原情况，这些T细胞可能在体内持续扩增和/或存在。     该领域源于纳米技术、RNA药物、病毒学和CAR疗法等多个领域的交叉融合（图1），引发了生物制药行业的广泛关注，多家公司已进入临床阶段（表1和表2）。最早关于CAR-T细胞体内原位编程成功的临床前报道，来自Fred Hutchison癌症中心Matthias Stephan团队（2017年8月）和Paul-Ehrlich研究所Christian Buchholz团队（2018年9月）。Fred Hutchison 癌症中心团队开发了可生物降解的、携带DNA的聚合物纳米颗粒——该颗粒靶向小鼠T细胞表面的CD3，可递送治疗性载荷（编码CD19特异性CAR的piggyBac转座子系统）。在急性淋巴细胞白血病小鼠模型中，静脉输注的抗CD19 CAR纳米颗粒疗效与过继性T细胞疗法相当，且无需体外细胞操作。Paul-Ehrlich研究所团队早在2012年就报道了一种靶向人CD8的慢病毒载体，并指出该特征对向细胞毒性T细胞体内递送抗原受体基因至关重要。将CD19特异性CAR装入该载体后，其临床前概念验证在人源化小鼠模型（通过输注人外周血单个核细胞或造血干细胞构建）中完成，证实了T细胞的工程化改造、B细胞耗竭及细胞因子产生。 图1：体内CAR技术临床转化的重要发现与里程碑时间线 体外工程化嵌合抗原受体（CAR）-T细胞产品的开发是医学领域的重要里程碑，但也凸显了该平台在可及性和临床疗效方面的局限性（左上方）。旨在克服这些局限性的体内CAR技术的出现，得益于病毒学、RNA治疗学和纳米药物等多个领域的进展（左下方）。在这些领域的交叉融合中，两种主流的体内CAR平台应运而生，目前正处于临床转化阶段：一种是基于工程化病毒（慢病毒或γ-逆转录病毒）载体的平台，可实现载荷在基因组中的整合（右上方）；另一种是基于装载RNA的脂质纳米颗粒（LNPs）的平台，可实现载荷的瞬时表达（右下方）。注：NHP，非人灵长类动物。     然而，当时该技术的临床转化似乎还很遥远，主要原因有三：首先，这些体内编程的突破并未立即被风险投资机构和生物制药公司知晓；其次，诺华（Novartis）和Kite公司刚刚获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，推出了首款CAR-T细胞疗法（Kymriah和Yescarta），且Kite Pharma被吉利德（Gilead）以119亿美元收购——这一交易提升了投资者对体外工程化CAR-T细胞产品的信心；最后，当时人们对“现成可用”的异体细胞技术能快速转化为第二代商业产品并实现更广泛应用抱有很高期望。相比开发可注射多组分纳米药物（当时大多数生物制药公司对该领域并不熟悉），在已有临床概念验证和产品获批的背景下，体外T细胞工程技术似乎风险更低，更易推向市场并获得经济回报。此外，CAR-T细胞技术相关的知识产权法律纠纷，以及纳米颗粒药物递送系统的知识产权争议，进一步复杂化了体内CAR-T细胞技术的转化进程。尽管如此，2018年7月，首家专注于体内CAR-T细胞疗法的生物技术公司Tidal Therapeutics成立。随后，Umoja Biopharma、Orna Therapeutics和Sana Biotechnology（2019年）、Abintus Bio（2020年）以及Capstan Therapeutics（2021年）等公司相继成立，为该领域的快速发展、创新和投资奠定了基础——目前已有超过30家公司活跃于该领域。2021年，Sanofi收购了Tidal Therapeutics，目前正在开发三款针对肿瘤和炎症性疾病的体内CAR-T细胞研发项目。最近，阿斯利康（Astra Zeneca）收购了开发多发性骨髓瘤体内病毒CAR疗法的EsoBiotec，艾伯维（Abbvie）收购了开发基于RNA-脂质纳米颗粒（RNA-LNPs）的自身免疫性疾病及其他适应症体内CAR产品的Capstan。 3.1 体内免疫工程：机制背景     体内CAR工程技术可快速生成CAR修饰的免疫细胞，并使其在修饰发生的微环境中或在CAR-T细胞迁移后的远端组织中与靶细胞结合。因此，清淋预处理（对CAR-T细胞产品输注后促进其扩增至关重要）不仅不必要，还与体内CAR-T细胞治疗相冲突。相反，除了提高可及性和扩大适用范围外，避免化疗预处理还为更有效地协同利用更广泛的免疫机制（以增强临床疗效）提供了可能。然而，在肿瘤领域，清淋预处理对CAR-T细胞疗法的一些有益作用（如对肿瘤微环境（TME）或先天免疫的免疫调节作用）可能需要通过其他方式解决，例如联合递送γ链受体细胞因子等生物反应调节信号。无论如何，为了成功重编程目标免疫细胞，同时最大限度减少致病性细胞或体内其他细胞对载体的摄取，体内CAR-T细胞疗法所用的载体或制剂必须具备出色的组织和细胞选择性。     目前进入临床开发阶段的两大主流平台，其载荷和递送策略存在差异：一种是携带整合型载荷的工程化病毒载体，另一种是携带瞬时表达RNA的LNPs。携带整合型载荷的体内CAR技术可使免疫细胞群体根据抗原的存在和负荷，自行调节其扩增和持续存在——这在需要较高药效以实现临床疗效的适应症中可能具有优势。相比之下，依赖瞬时表达、非整合型载荷的技术则可通过调整给药方案，相对独立于抗原负荷来控制暴露（上调或下调CAR工程化免疫细胞的数量和持续时间）——这在安全性要求更高的适应症中可能具有优势。     下文将根据载荷是否具有整合性，分别介绍主要的体内CAR疗法平台以及进入临床阶段的领先候选产品（表1、表2及图2、图3）。此外，我们还将概述体内CAR技术从临床前向临床应用转化过程中的特定挑战，并将这些挑战与传统体外CAR-T细胞疗法面临的挑战进行比较。 图2：主流体内CAR平台（聚焦工程化载体与载荷） a、b：病毒工程化载体（慢病毒或γ-逆转录病毒）。（a）靶向策略：对病毒包膜进行改造，加入T细胞特异性结合剂（实现对T细胞的选择性摄取）和融合元件（促进载荷（表达嵌合抗原受体（CAR）的载体）向细胞质递送）；（b）病毒载荷结构：通常包含CAR表达开放阅读框（ORF），其调控元件与传统体外工程化CAR-T细胞产品类似。开发基于病毒的体内CAR-T细胞平台的公司包括Interius BioTherapeutics、Umoja Biopharma、吉诺瑞（Genocury）、EsoBiotec、Sana Biotechnology和Kelonia Therapeutics。 c、d：脂质纳米颗粒（LNP）-RNA工程化载体。LNPs由脂质组成，包括可促进RNA载荷从内体/溶酶体释放到细胞质中的可电离脂质。靶向性可通过向脂质中加入嗜性成分（Myeloid Therapeutics、Carisma Therapeutics、Orna Therapeutics）或抗体来源的结合剂（Capstan Therapeutics、Sanofi）实现。目前研究的RNA形式主要有两类：（c）线性mRNA——通过优化非翻译区（UTRs）、密码子优化及使用N₁-甲基假尿苷等修饰，实现CAR的高效表达；（d）环状RNA——通过防止早期翻译终止，实现载荷的长效表达。开发该技术的公司包括Myeloid Therapeutics、Carisma Therapeutics、Orna Therapeutics、Capstan Therapeutics、深圳MagicRNA和Sanofi。 图3：主流in vivo CAR-T平台和机制 4. 病毒载体 4.1 体内CAR-T细胞疗法病毒载体的早期开发     该平台依赖于细胞选择性载体递送，以及通过工程化慢病毒或γ-逆转录病毒载体实现CAR载荷在基因组中的整合。这类病毒载体的关键要求是实现对患者T细胞的高效选择性基因转移。载体颗粒需避免被非目标细胞摄取，以确保安全性，并通过减少“载体沉默效应[sink effect]”（即载体被非目标细胞消耗）提高效率。这一目标通过对用于慢病毒载体假型化的病毒包膜蛋白进行工程改造得以实现。其核心思路是：同时消除载体与天然细胞表面受体的相互作用，同时展示能识别T细胞特异性表面标志物的高亲和力结合剂。     慢病毒载体的概念验证采用了麻疹病毒糖蛋白——该病毒的膜融合功能和受体结合功能分别由两种蛋白介导，这一特性为工程改造提供了便利。工程化尼帕病毒（NiV）糖蛋白可增强载体颗粒的基因递送活性，而展示CD4和CD8特异性结合剂则可实现T细胞特异性转导——在靶向CD8的情况下，对CD8阳性T细胞的特异性可达99%以上。     慢病毒糖蛋白工程改造的一项重要进展是，将受体靶向递送策略应用于弹状病毒水疱性口炎病毒（VSV）的G糖蛋白。VSV慢病毒具有产量高、纯化工艺成熟且符合良好生产规范（GMP）的优势。与副黏病毒糖蛋白（可在细胞表面介导高效的pH非依赖性融合）不同，VSV-G蛋白将受体结合和膜融合功能整合在单个分子中，需要晚期内体的低pH环境才能启动融合。临床测试最终将揭示不同的进入方式是否会影响基因递送效率、脱靶递送及毒性。基于“消除天然受体利用，并将高亲和力结合剂（与VSV-G蛋白融合或作为单独的跨膜蛋白）展示在载体表面”的原理，研究人员已评估了包括T细胞标志物在内的多种靶受体。     首个用于体内生成CAR-T细胞的T细胞特异性慢病毒（CD8-慢病毒）基于尼帕病毒糖蛋白，该糖蛋白展示了一种高亲和力设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin），可特异性结合CD8α链。这种CD8-慢病毒为体内生成人CD19 CAR-T细胞提供了概念验证。在人源化小鼠模型中，单次全身给药即可将足够数量的人T细胞转导为CAR-T细胞，从而有效清除循环系统和骨髓中的原代B细胞或淋巴瘤细胞。后续研究采用类似的人源化小鼠模型，使用靶向其他T细胞标志物的慢病毒，为体内CAR疗法提供了重要发现。值得注意的是，通过抗CD4慢病毒载体将CAR仅递送至CD4阳性T细胞，在临床前模型中实现了高效的靶细胞清除，其活性与CD8慢病毒载体相当甚至更高。利用激动性单链抗体靶向CD3，可实现对T细胞的选择性结合，同时诱导其活化。由于CD3仅在T细胞表面表达，且在T细胞受体（TCR）信号传导中起核心作用，其结合通常会触发内化和受体下调（作为活化过程的一部分）。为防止CD3表面表达的丢失（这会限制载体结合和转导效率），转导过程中使用酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼（dasatinib）暂时抑制TCR信号传导，从而维持CD3表达并增强基因转移。通过靶向分化程度较低的T细胞表面标志物（如CD62L），可将CAR载荷优先递送至初始T细胞、干细胞样记忆T细胞或中枢记忆T细胞——这可能有助于增强疗效或防止T细胞过早耗竭。     该技术的一个障碍是巨噬细胞可能成为“载体 sink”（消耗载体）。通过在慢病毒包膜膜中整合“不要吃我”信号（CD47），可保护载体表面免受非特异性吞噬，从而显著降低巨噬细胞清除载体颗粒的活性。     上述所有体内CAR-T细胞工程化的临床前模型均使用靶向B细胞的CAR。然而，最近一项临床前研究表明，通过CD8靶向慢病毒在体内递送CD4 CAR-T细胞，可有效治疗由CD4阳性肿瘤细胞构成的血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。此外，将CAR载荷选择性递送至CD8+ T细胞，可避免CAR递送至恶性细胞，从而防止潜在的治疗耐药性。     尽管小鼠模型非常适合为体内CAR递送提供概念验证，但大型动物模型（如非人灵长类动物（NHPs））被证明对临床转化至关重要。非人灵长类动物模型在指导平台、产品和给药方案优化方面发挥了关键作用，为基于尼帕病毒糖蛋白或弹状病毒包膜糖蛋白的T细胞靶向慢病毒的临床测试奠定了基础——后者刚刚进入I期开发阶段（表1）。表 1：开发中的基于慢病毒的体内 CAR-T 细胞平台 公司 靶向机制 治疗载荷 主要适应症 临床前证据 开发阶段 Interius BioTherapeutics 抗 CD7 单链抗体（scFv）修饰颗粒（T 细胞和自然杀伤细胞工程化） 抗 CD20 CAR、抗 CD19   CAR B 细胞恶性肿瘤、自身免疫性疾病 小鼠和非人灵长类动物（NHP）概念验证 临床阶段（2024 年启动 I 期试验，评估抗 CD20 CAR） Umoja Biopharma / 艾伯维（Abbvie） 多结构域抗 CD3、CD80、CD58 修饰颗粒（T 细胞工程化） 抗 CD19 CAR、抗 CD22 CAR、抗 CD20 CAR B 细胞恶性肿瘤、自身免疫性疾病 小鼠和非人灵长类动物（NHP）概念验证 临床阶段（2024 年启动抗 CD19 CAR I 期试验，其他候选产品分别于 2024 年、2026 年启动） 深圳济因生物（Shenzen Genocury Ltd） 抗 CD3 修饰颗粒 抗 CD19 CAR B 细胞恶性肿瘤 未披露 研究者发起试验，首例淋巴瘤患者已给药并产生应答 EsoBiotec / 阿斯利康（Astra Zeneca） 靶向慢病毒颗粒 抗 BCMA CAR、未披露 多发性骨髓瘤、自身免疫性疾病、实体瘤 小鼠模型概念验证 计划 2025 年启动 I 期试验，首例骨髓瘤患者已产生临床应答，公司已被收购 Kelonia 抗 CD3 修饰颗粒 抗 BCMA CAR 多发性骨髓瘤 小鼠和非人灵长类动物（NHP）概念验证 计划 2025 年中期启动 I 期试验 Sana 抗 CD8 融合蛋白修饰颗粒 抗 CD19 CAR 未披露 小鼠和非人灵长类动物（NHP）概念验证 未披露 Ensoma CD46 靶向病毒样颗粒（多谱系） 抗 HER2 CAR 多种实体瘤 临床前模型概念验证 未披露 Exuma Biotec CD3 靶向慢病毒载体 抗 CD19 CAR B 细胞恶性肿瘤 小鼠模型概念验证 未披露 注：BCMA，B 细胞成熟抗原；CAR，嵌合抗原受体；NHP，非人灵长类动物。     下文将介绍Interius BioTherapeutics、Umoja Biopharma、深圳吉诺瑞（Shenzen Genocury）、EsoBiotec、Kelonia Therapeutics和Sana Biotechnology等公司开发的、已进入临床或处于后期临床前开发阶段的主流体内CAR疗法工程化病毒载体。 4.2 临床开发阶段的工程化病毒平台     Interius BioTherapeutics开发的递送平台是一种工程化自灭活、复制缺陷型慢病毒载体，单次静脉给药后可在体内靶向并转导特定细胞类型。Interius载体包含 proprietary组件，可实现精准的体内基因递送：一是高亲和力结合剂，用于载体的细胞特异性靶向；二是脱靶融合蛋白，可将整合型慢病毒基因组递送至靶细胞内。     Interius BioTherapeutics的首个临床候选产品INT2104是一种靶向CD7的慢病毒载体，旨在递送CAR20转基因（编码抗CD20 CAR构建体），用于治疗B细胞恶性肿瘤。为提高细胞靶向性和载体稳定性，INT2104采用Gen 2.1融合蛋白进行假型化——这是VSV-G蛋白的改良版本，通过氨基酸替换减少脱靶结合，增强在血液中的稳定性。单个氨基酸替换可使融合蛋白脱离其天然受体（低密度脂蛋白受体（LDL-R）），同时不破坏其融合能力。INT2104的精准体内靶向通过载体表面的高亲和力CD7特异性结合剂实现，该结合剂可使载体靶向T细胞（包括CD4+和CD8+亚群）和自然杀伤细胞，单次静脉给药后即可生成多样化的效应性抗CD20 CAR细胞群体。     研究人员在非人灵长类动物和人源化小鼠模型中开展了INT2104的体内研究，评估其安全性、靶细胞转导特异性和生物学效应，为首次人体研究做准备。这些体内研究结果证实，INT2104静脉给药后可实现对T细胞和自然杀伤细胞的特异性转导，生成具有功能的抗CD20 CAR细胞并持续存在，且能特异性清除CD20+ B细胞。在食蟹猴中开展的符合良好实验室规范（GLP）的毒理学研究表明，INT2104耐受性良好，静脉给药后未观察到毒性、CRS或神经毒性，为首次人体临床试验选定剂量范围和给药途径提供了支持。     2024年10月，INVISE试验（NCT06539338）的首例受试者完成给药——这是一项首次人体I期临床试验，评估INT2104静脉输注治疗复发/难治性B细胞恶性肿瘤成人患者的安全性。INVISE试验的数据预计将于2025年下半年公布。基于INT2104开发过程中产生的体外和体内数据，Interius预计该试验的临床数据将支持其他产品的开发，包括INT2106（一种包含抗CD19 CAR载荷的CAR19载体，用于治疗自身免疫性疾病）。最近，吉利德（Gilead）旗下公司Kite宣布计划收购Interius。     Umoja Biopharma开发的VivoVec平台是一种体内递送和CAR-T细胞生成平台，基于表面工程化的第三代自失活、复制缺陷型慢病毒载体颗粒系统——该系统可表达多结构域融合蛋白，实现遗传载荷向体内T细胞的直接递送。该平台的一个关键差异化特征是，VivoVec颗粒采用Cocal融合病毒糖蛋白进行假型化——这种糖蛋白可抵抗人血清的灭活作用，从而提高体内稳定性，允许直接输注给患者。此外，VivoVec产品将CD80和CD58 T细胞共刺激配体与抗CD3单链抗体（scFv）整合到单个多结构域融合蛋白中，不仅实现了对T细胞的高特异性靶向，还使颗粒具备了在体内结合、活化和转导T细胞的能力。实际上，VivoVec颗粒模拟了启动T细胞免疫应答的抗原呈递细胞。     Umoja的首个核心研发项目是UB-VV111——这是一种基于VivoVec的药物产品，编码靶向CD19的CAR，同时携带雷帕霉素激活的细胞因子受体（RACR）。UB-VV111可在体内直接生成共表达RACR系统的CD19 CAR-T细胞，使这些细胞具备雷帕霉素诱导的扩增能力和增强的体内存活能力。2024年7月，Umoja获得FDA的研究性新药（IND）批准，已在美国和国际上启动I期临床试验，用于治疗B细胞恶性肿瘤。2024年1月，艾伯维（Abbvie）宣布获得UB-VV111的开发和商业化选择权。     非人灵长类动物模型研究表明，单次输注VivoVec药物颗粒后，经淋巴结内或静脉给药，CAR-T细胞占循环T细胞的比例最高可达65%。研究还证实，B细胞可快速且持久地耗竭，其效果超过了体外工程化CAR-T细胞非人灵长类动物基准模型的观察结果。有趣的是，其中一只受治动物出现了继发性CAR-T细胞扩增（在治疗数月后发生），同时伴随B细胞减少——这一现象可归因于病毒转导的CAR-T细胞的持续存在。受治动物出现的炎症性不良事件通过标准免疫抑制治疗（包括抗IL-6抗体托珠单抗）得到了有效控制。     Umoja的第二个核心研发项目是UB-VV400——这是一种基于VivoVec的药物产品，编码靶向CD22的CAR，同样与RACR系统联合使用。该候选产品在人源化小鼠模型中获得了临床前概念验证。Umoja与中国合作伙伴驯鹿生物（IASO Biotherapeutics）合作开展的研究者发起试验将于2025年启动，重点关注B细胞恶性肿瘤，并进一步探索其在自身免疫性疾病中的应用。     随着这一新兴领域的发展，近期启动的试验通过病例研究提供了临床活性证据。郑州大学第一附属医院和深圳济因生物（Shenzen Genocury Ltd）报道了首例接受T细胞靶向逆转录病毒载体递送抗CD19 CAR治疗的复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤患者。该载体基于水痘-带状疱疹病毒（VZV）-G蛋白逆转录病毒，表面展示抗CD3结合剂和未披露的X激活结构域，其CAR载荷包含鼠源FMC63 CD19单链抗体（scFv）（与CD8铰链区/跨膜结构域连接），以及41BB和CD3ζ刺激结构域。值得注意的是，该治疗方案包括单采术收集T细胞、清淋预处理，以及自体T细胞与病毒载体的联合输注——这一设计可能旨在同时利用预处理的潜在益处。主要副作用为骨髓毒性和1级CRS，未观察到神经毒性或感染。治疗后3周内观察到CAR-T细胞扩增，第35天通过临床影像学证实患者达到部分缓解，恶性细胞计数也随之降低。最近的更新显示，患者在治疗3个月后达到完全缓解——但尚不清楚这是否为另一名患者。     EsoBiotec/深圳普瑞金（Shenzen Pregene）采用类似策略，开发了一种基于第三代自灭活、VSV-G蛋白靶向缺陷型慢病毒载体的抗BCMA CAR产品，该产品具有一些额外特征。其中包括工程化包膜（ENaBL-T）——通过识别TCRαβ的结合剂（源自羊驼的仅重链可变域（VHH）纳米抗体）实现T细胞靶向，同时通过主要组织相容性复合体（MHC）I类分子耗竭和CD47表达实现免疫隐身，并携带由T细胞特异性启动子驱动的载荷。     该技术可有效工程化静息态和活化态T细胞，在多发性骨髓瘤模型中获得了临床前概念验证。此外，该公司已启动临床研究，最近报道了首例接受体内抗BCMA产品治疗的多发性骨髓瘤患者——该患者实现了客观应答，骨髓中的播散性疾病被清除。值得注意的是，应答评估在治疗后28天完成，凸显了临床应答的快速性，这表明CAR疗法无需长期CAR暴露即可快速实现完全缓解。最近的更新显示，4名多发性骨髓瘤患者（包括上述首例患者）均实现了客观应答。结合其良好的不良事件谱，这一结果推动阿斯利康（Astra Zeneca）近期收购了EsoBiotec，彰显了大型生物制药公司对这一快速发展的体内CAR疗法领域的兴趣。 4.3 后期临床前研究阶段的工程化病毒载体     Kelonia Therapeutics开发的体内基因植入系统（iGPS）是一种“现成可用”的基因药物平台技术，可在体内生成CAR-T细胞。iGPS颗粒设计为单次静脉给药后，即可生成强效、持久的CAR-T细胞。该平台旨在实现对T细胞的高特异性靶向，其开发基于旨在识别抗原反应性TCR的研究。研究人员最初通过改造VSV-G包膜蛋白（使其脱离天然进入受体LDL-R），并共表达肽-MHC复合物，构建了可特异性转导抗原特异性T细胞的慢病毒载体。Kelonia将该技术改造为以CD3为病毒进入受体，从而靶向所有T细胞。研究人员将抗CD3单链抗体（scFv）与脱靶VSV-G（从众多VSV-G突变体中筛选出的、能最佳抑制LDL-R结合同时保持强效T细胞转导能力的变体）结合。     iGPS平台的潜力在一系列非人灵长类动物研究中得到了证实——这些研究使用靶向正常和恶性B细胞的抗CD20 CAR，在体内转导T细胞。即使在每公斤体重仅10⁸个病毒颗粒的低剂量下，单次静脉输注仍能生成足够数量的抗CD20 CAR-T细胞，实现持续超过2个月的完全B细胞耗竭，且无需额外治疗。值得注意的是，CAR-T细胞展现出强效活性的同时，未出现明显毒性（包括肝毒性、CRS或神经毒性）。     Kelonia的核心药物KLN-1010是一种iGPS病毒颗粒，编码专有的全人源抗BCMA CAR，用于治疗多发性骨髓瘤。在临床前研究中，接受单次静脉注射抗BCMA iGPS颗粒的多发性骨髓瘤人源化小鼠模型实现了完全肿瘤清除，其体外模型中的疗效优于商业抗BCMA体外工程化CAR-T细胞产品（idecabtagene vicleucel（ide-cel）或ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel））。可能由于CD4和CD8记忆T细胞及干细胞样记忆T细胞的比例更高，KLN-1010生成的CAR-T细胞比体外工程化T细胞的持续时间更长。大多数脱靶、非T细胞的CAR表达仅限于具有吞噬能力的细胞（如巨噬细胞）。KLN-1010计划于2025年进入多发性骨髓瘤的临床开发阶段，随后将推进肿瘤和自身免疫性疾病领域的其他内部及合作研发项目。     Sana Biotechnology开发的靶向融合蛋白（targeted fusogen）平台技术，旨在通过慢病毒载体的全身给药，实现对T细胞的强效且高特异性转导。该方法采用第三代自失活慢病毒载体，配备源自副黏病毒的可重靶向融合蛋白。该融合蛋白的天然受体结合功能被“灭活”（即“盲化”），取而代之的是可结合选定T细胞表面受体的工程化结构域。与该受体结合后，融合蛋白被激活，介导膜融合，从而实现载体进入和基因递送。这种直接的质膜进入机制不仅提高了靶向特异性，还避免了内体进入途径中观察到的非特异性摄取（这是已知的影响体内VSV-G基载体的问题）。受体偶联机制确保转导仅发生在T细胞中，最大限度减少了与其他细胞类型非预期相互作用导致的脱靶效应。这种靶向精准性尤为重要，因为在慢病毒生产过程中，CAR蛋白可能会整合到载体颗粒中——这是一种已知的人工产物，当与VSV-G融合蛋白结合时，已被证明会导致脱靶转导。     尽管该融合蛋白具有模块性，可靶向CD3和CD4等不同TCR，但目前提出的治疗方案采用靶向CD8的融合蛋白。Sana在小鼠和非人灵长类动物中开展的早期研究表明，CD8靶向慢病毒载体可在外周血、脾脏和其他淋巴器官中实现对CD8+ T细胞的特异性递送。Sana基于悬浮培养的制造工艺的改进，使CD8靶向慢病毒载体（LV）的滴度比早期工艺提高了约50倍，同时保持了融合蛋白系统的特异性。这种强效载体降低了在小鼠模型和非人灵长类动物中实现强效CAR-T细胞生成和B细胞耗竭所需的体内剂量。在使用强效载体的非人灵长类动物研究中，在 peripheral blood、脾脏和其他淋巴器官中观察到对靶CD8+ T细胞的高特异性转导，而在肝脏等关键脱靶器官中未检测到信号。     Sana已利用这种模块性可重靶向系统，实现了向不同T细胞亚群、肝细胞和造血干细胞（HSCs）的递送。在每种情况下，靶向融合体递送均被证明对体内递送具有高度特异性。还可在载体表面添加其他蛋白，以在不改变特异性的情况下实现细胞活化（例如，添加CD3配体以激活T细胞）。此外，慢病毒载体可被改造用于递送基因编辑载荷（如病毒样颗粒所示），从而提供一种具有模块性细胞特异性靶向和多样化载荷整合能力的递送载体。目前，Sana正在制定计划，将核心产品（靶向CD8+ T细胞的工程化慢病毒载体形式的体内抗CD19 CAR）推进至临床阶段。     其他机构也在开发用于CAR疗法的工程化靶向慢病毒，例如Ensoma（通过重编程造血干细胞实现多细胞谱系CAR工程化）、Vyriad（最近宣布与诺华（Novartis）达成合作协议）和Exuma Biotec（T细胞和自然杀伤细胞的联合工程化）——这些机构已公布临床前数据，但尚未披露临床计划（表1）。Alaya Bio也在探索利用pH敏感性聚合物包裹慢病毒的新型技术，用于体内CAR疗法。 5. 基于RNA的平台 5.1 体内CAR-T细胞疗法RNA递送系统的起源与发展     基于RNA工程平台采用线性mRNA或环状RNA实现免疫细胞的瞬时工程化，通过组织嗜性脂质制剂或细胞靶向抗体功能化纳米颗粒进行递送。COVID-19疫情期间，基于LNPs的mRNA疫苗的快速开发和应用，加速了该平台的兴起。尽管早期研究通过负载抗CD19 CAR mRNA的CD3和CD8功能化聚合物纳米颗粒获得了临床前概念验证，但由于大规模疫苗接种的经验以及可电离脂质的创新，LNPs已成为首选制剂。与mRNA-LNP疫苗中通常使用的可电离脂质相比，具有高生物降解性和低反应原性的可电离脂质，使理想的目标产品谱和重复给药成为可能。抗体功能化LNPs可实现有效的T细胞工程化和细胞类型选择性，而通过高通量筛选发现的免疫嗜性LNPs则支持细胞或组织特异性递送。这些技术可用于在体内有效工程化T细胞亚群或整个淋巴细胞群体，而该LNP-RNA平台的另一种形式则旨在利用颗粒对髓系细胞的嗜性，实现对巨噬细胞的工程化。这一过程通过颗粒冠中尚未明确的成分与清道夫受体（可能不同于肝细胞通过ApoE/LDL-R介导的传统摄取途径）的相互作用实现。     巨噬细胞是先天免疫系统中公认的“哨兵细胞”，具有肿瘤浸润、吞噬作用、炎性细胞因子释放、T细胞募集和抗原呈递能力。与T细胞不同，巨噬细胞缺乏内源性抗原特异性，但可有效调动多种免疫机制。表 2：开发中的基于 LNP-RNA 的体内 CAR-T 细胞平台 公司 靶向机制 治疗载荷 主要适应症 临床前证据 开发阶段 Myeloid Therapeutics 脂质纳米颗粒（LNPs）—— 巨噬细胞嗜性 抗 Trop2 CAR、抗 GPC3   CAR、抗 HER2 CAR、抗 gp75 CAR（基于 CD89 和自然杀伤细胞 p44 的 CAR 构建体） 多种实体瘤、肝细胞癌 多种临床前模型 临床阶段（2024 年启动抗 TROP2  和 GPC3 CAR I 期试验，首例患者已产生临床应答） Capstan 抗 CD8 单克隆抗体修饰 LNPs（细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）工程化） 抗 CD19 CAR、未披露 自身免疫性疾病、未披露 小鼠和非人灵长类动物（NHP）概念验证 I 期试验启动（NCT06917742） Immorna 靶向 LNPs（tLNPs）（T 细胞、髓系细胞、自然杀伤细胞） B 细胞靶向 CAR（RNA 形式） CD19+ B 细胞恶性肿瘤 未披露 I 期试验启动，首例患者已给药 深圳虹信生物 CD8 T 细胞靶向 LNPs（tLNPs） 抗 CD19 CAR（mRNA 形式） 系统性红斑狼疮 小鼠和非人灵长类动物（NHP）概念验证 I 期试验启动，已报道活性证据 Orna 含免疫嗜性脂质的 LNPs（泛 T 细胞工程化） 抗 CD19 CAR（环状 RNA 形式） B 细胞恶性肿瘤、自身免疫性疾病 小鼠和非人灵长类动物（NHP）概念验证 计划 2026 年启动 I 期试验 Sanofi 靶向 LNPs（tLNPs）（T 细胞工程化） 抗 CD22 CAR、抗 CD19 CAR（mRNA 形式） 肿瘤、自身免疫性疾病 小鼠和非人灵长类动物（NHP）概念验证 未披露 Carisma/Moderna LNPs—— 巨噬细胞嗜性 抗 GPC3 CAR、未披露 肝细胞癌 小鼠临床前模型 临床前阶段；已宣布战略调整 Tessera 靶向 LNPs（tLNPs） 抗 CD19、CD20、BCMA（采用 RNA 写入技术，整合型载荷） 肿瘤、自身免疫性疾病 临床前模型 未披露 Orbital 靶向 LNPs（tLNPs）、病毒样颗粒 CAR（环状 RNA 形式）—— 细节未披露 未披露 未披露 未披露 注：BCMA，B 细胞成熟抗原；CAR，嵌合抗原受体；CTL，细胞毒性 T 淋巴细胞；GPC3，糖蛋白 3；LNP，脂质纳米颗粒；NHP，非人灵长类动物；tLNP，靶向 LNP。     下文将详细介绍新兴的LNP-mRNA体内CAR平台和领先产品（表2及图2），并根据RNA基工程方法是否依赖脂质的组织和细胞嗜性（Myeloid Therapeutics、Carisma Therapeutics、Orna Therapeutics）或细胞选择性靶向抗体（Capstan Therapeutics、深圳MagicRNA、Sanofi、Immorna）进行分类。 5.2 临床开发阶段基于RNA的非病毒系统     Myeloid Therapeutics等公司正在探索体内髓系细胞编程技术。该体内工程化平台可特异性靶向并活化髓系细胞，使其重新定向对抗肿瘤细胞。研究团队证实，递送包裹CAR mRNA的LNPs可在体内被髓系细胞摄取并选择性表达，进而在多种肿瘤模型中实现肿瘤清除。该方法利用了LNPs对髓系细胞谱系的天然嗜性。CAR设计包含截短的FcαR（CD89）融合构建体，与内源性FcRγ链形成多链复合物——这是其在细胞表面稳定表达所必需的，从而实现谱系特异性表达和功能。研究人员还通过对mRNA编码序列和3'非翻译区（UTR）进行修饰，优化了mRNA载荷，以增强并延长CAR表达。2022年，Myeloid与LNP领域的创新企业Acuitas达成协议，共同开发用于癌症患者的新型体内CAR疗法。     在小鼠中开展的初始临床前概念验证研究采用LNP-mRNA形式，递送靶向糖蛋白3（GPC3）、肿瘤相关钙信号转导子2（TACSTD2，也称为TROP2）和糖蛋白75（GP75）的CAR。在小鼠肺异种移植模型中，静脉给药TROP2 CAR mRNA-LNP可抑制肿瘤生长。与荷瘤小鼠类似，在食蟹猴中，TROP2 CAR mRNA-LNPs主要被髓系细胞内化。     研究人员还为GPC3 CAR mRNA-LNP候选产品生成了类似的临床前数据。在体外转染人及食蟹猴全血细胞的实验中，髓系细胞可有效摄取LNP，GPC3 CAR在高达30%的单核细胞中选择性表达。此外，食蟹猴输注后观察到GPC3 CAR的剂量依赖性表达。最后，在小鼠模型中，抗肿瘤活性与细胞因子水平升高相关（这是CAR与肿瘤细胞表面GPC3结合的标志）。总体而言，这些发现表明，髓系细胞可通过体内CAR mRNA-LNPs直接工程化，以清除肿瘤细胞并协调适应性免疫应答。     已有两款候选产品进入I期试验：MT-302（靶向TROP2+上皮源性恶性肿瘤的体内CAR）正在一项试验（NCT05969041）中评估安全性和初步疗效，首名患者于2023年9月12日完成给药；MT-303（靶向过表达GPC3的原发性或转移性肝细胞癌的体内CAR）于2024年7月31日在一项I期试验（NCT06478693）中启动给药。在TROP2+癌症中，MT-302可在peripheral blood和肿瘤微环境（TME）中实现CAR表达。在GPC3+肝细胞癌中，MT-303已显示出抗肿瘤活性，包括对经过多线治疗的患者实现病灶缩小。在这两项研究中，当前剂量水平下的耐受性良好，未观察到剂量限制性毒性，且CRS可控。这些发现证实了该疗法的作用机制，并支持进一步的剂量递增和联合研究的扩展。最近，Myeloid Therapeutics将临床前概念验证扩展到了靶向HER2的CAR（也适用于实体瘤）。     为有效协同利用T细胞，Capstan Therapeutics开发了配体修饰的LNP颗粒（CellSeeker技术），以支持其体内CAR产品组合。该体内CAR平台包含以优化线性mRNA形式存在的载荷，通过靶向LNPs（tLNPs）递送，其抗体基结合剂旨在选择性工程化免疫细胞亚群。与用于mRNA疫苗的LNPs相比，这些tLNPs含有生物降解性高、反应原性低的可电离脂质，可用于重复静脉输注。该平台设计得益于mRNA药物领域的重大进展（通过使用N₁-甲基假尿苷等修饰核苷酸）、纳米药物领域的进展（通过可电离脂质的出现）以及可实现强效免疫细胞功能的CAR设计。其基础研究包括：在临床前心脏纤维化模型中，采用抗CD5抗体修饰的tLNP-mRNA形式，在体内生成抗成纤维细胞活化蛋白（FAP）CAR-T细胞，减少FAP+成纤维细胞并改善器官功能。随后，通过平台和载荷优化，获得了适合开发的制剂，以及抗CD8抗体-LNP-mRNA形式的抗CD19 CAR（最近被选定为核心临床开发候选产品）。     与其他不依赖整合型载体的体内CAR技术类似，由于该mRNA工程化方法可实现CAR的瞬时、自限性表达，可能避免过高或过长的靶向毒性、病毒成分引起的免疫原性以及遗传毒性——这些因素均可能影响患者可及性。此外，通过使用靶向抗体结合剂，该技术可优先工程化免疫细胞亚群，而不会协同利用B细胞或CAR靶细胞等可能对治疗结果产生不利影响的细胞类型。降低tLNP的免疫原性和反应原性至关重要，尤其是在疗效要求较高、需要长期重复输注的疾病适应症中。最后，mRNA序列优化是增强CAR活性的关键，这凸显了线性mRNA作为载荷类型尚未被充分挖掘的潜力。     Capstan抗CD19 CAR核心候选产品的非临床证据包括：可高效体外工程化来自健康人或患者的人T细胞。在人源化小鼠模型中的概念验证表明，可在体内快速工程化人CD8+ T细胞，并对原代或恶性B细胞产生强效活性。作为适用于非人灵长类动物的替代产品，抗CD8-LNP-mRNA形式的抗CD20 CAR可在淋巴组织和骨髓中实现深度B细胞耗竭（包括记忆B细胞的耗竭），随后主要以初始B细胞重新填充——这与传统CAR-T细胞实现的“免疫重置”类似。仅需3天间隔的两次输注这一紧凑治疗周期，即可实现淋巴器官中的B细胞耗竭。这为该核心产品在自身免疫性疾病中的临床开发，以及其他体内CAR产品和针对更广泛适应症（包括遗传性疾病）的新型治疗方案的开发提供了支持——但需在早期临床试验中证实其安全性和活性。今年已启动一项首次人体试验（NCT06917742）。Capstan计划开发更广泛的体内CAR产品组合，适用于自身免疫性疾病以及其他类别适应症（基于BCMA等靶点，用于浆细胞疾病；基于活化成纤维细胞，用于再生医学、自身免疫性疾病和肿瘤应用）。最近，艾伯维（Abbvie）宣布收购Capstan Therapeutics，凸显了大型企业对这一快速发展领域的广泛兴趣。     另有两家机构也刚刚启动了其体内CAR疗法的临床测试，同样采用tLNP-RNA形式。Immorna Biotherapeutics已启动一项I期试验，评估其负载抗CD19 CAR的tLNP制剂治疗非霍奇金淋巴瘤患者的效果。该候选产品（JCXH-213）旨在联合重编程T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞，以增强药理效应。深圳虹信生物（MagicRNA）也已将负载抗CD19 CAR的CD8-tLNP（HN2301）推进至临床阶段。其Enc-LNP平台包含专有的抗体片段和可电离脂质，可在体内选择性工程化免疫细胞。临床前证据显示，在人CD8转基因狼疮肾炎模型中，替代抗CD19 CAR具有活性；在输注抗CD20 CAR替代产品的非人灵长类动物中，观察到“免疫重置”的迹象。这项由企业参与的研究者发起试验正在评估HN2301治疗复发难治性系统性红斑狼疮患者的安全性、疗效及平台的广泛可行性。在本综述发表时，该方法已首次证实可在体内工程化抗CD19 CD8+ CAR-T细胞，同时观察到B细胞耗竭、与靶向活性相关的细胞因子产生，以及系统性红斑狼疮患者自身抗体滴度降低所体现的临床相关生物标志物活性。 5.3 后期临床前研究阶段的RNA基平台     Orna Therapeutics开发的非病毒平台具有独特性——其LNPs采用免疫嗜性脂质配制，无需肽配体或其他任何靶向部分即可优先靶向免疫细胞。从化学、制造与控制（CMC）、监管和成本角度来看，这一特性具有显著优势。在免疫细胞中，下一代环状RNA被用于瞬时表达CAR（panCAR）。通过LNP设计和环状RNA工程化，可在患者免疫细胞中实现精准、瞬时的CAR表达。Orna平台采用跨物种反应性CAR设计，可在临床前毒理学研究前，在啮齿动物和非人灵长类动物模型中验证疗效。2019年成立时，Orna基于其麻省理工学院（MIT）的基础技术，专注于利用环状RNA平台中的组织特异性内部核糖体进入位点（IRES）进行免疫细胞工程化。随后，在2024年，Orna收购了ReNAgade的领先非病毒递送平台——此前ReNAgade已证实可在非人灵长类动物中实现向免疫细胞的递送，包括对超过50%的T细胞进行工程化。     研究团队采用环状RNA形式的抗CD20和抗CD19 CAR，在体外、啮齿动物和非人灵长类动物模型中证实，单次给药即可实现强效B细胞耗竭。在人源化小鼠模型中，抗CD20 CAR制剂可显著耗竭B细胞——给药24小时后，外周血、脾脏和骨髓中的B细胞减少75%-80%；在外周血和骨髓中，这一效应可维持7天。最后，在非人灵长类动物中，单次给药后，血液中的B细胞减少95%，且持续耗竭（82%）可维持7天。首个临床项目将采用环状RNA形式的抗CD19 CAR，用于多种自身免疫性疾病。针对多发性骨髓瘤的BCMA项目将在抗CD19 CAR首名患者给药后不久启动。     其他处于临床前开发阶段的公司也在探索环状RNA概念（例如Orbital Therapeutics，最初专注于疫苗领域），计划推出针对B细胞谱系抗原的、负载CAR载荷的tLNP制剂。此外，Sail Biomedicines、Strand Therapeutics和RiboX Therapeutics在体外或小鼠模型中获得的临床前证据，凸显了人们对环状RNA平台的极大兴趣——该平台可通过增强或延长CAR载荷表达来进一步优化潜在疗效优势，而颗粒功能化则可增强该方法的选择性和性能。     Sanofi也在开发基于tLNP的平台，其概念与Capstan Therapeutics、MagicRNA和Immorna相似。与常用于疫苗的典型mRNA-LNP制剂不同，该平台旨在实现选择性T细胞工程化和CAR-T细胞暴露控制。通过将修饰mRNA包裹在LNP内部，并在表面添加抗体基结合剂以靶向CD8+细胞，可实现细胞特异性CAR表达。该制剂中使用的专有的可电离脂质是通过广泛筛选获得的，旨在提高耐受性、稳定性和在T细胞中的活性——这通过改变脂质分子的头部和尾部基团实现。LNP的性能在很大程度上取决于可电离脂质的结构，包括疏水链长度、分支度、结构异构性和饱和度。对这些特征的系统性修饰，使T细胞转染效率比使用未优化脂质的LNPs提高了3-4倍。     临床前活性研究凸显了tLNP系统的模块性和灵活性，支持其针对多种靶点和疾病的潜在应用。T细胞的转染通过LNP表面的抗体片段实现——这些片段可促进靶向纳米颗粒的相互作用和摄取。研究人员使用模型LNP制剂，筛选了多种Fab片段和纳米抗体结合剂。针对CD3的抗体片段可实现快速摄取和载荷表达，但会导致非特异性活化，从而降低耐受性。针对CD8的片段修饰LNPs可实现快速的载荷表达（CAR或荧光蛋白），且无非特异性活化和细胞因子表达。结合功能筛选脂质和T细胞结合剂的LNPs，可在人T细胞中实现强效CAR表达。CAR表达仅限于CD8+细胞（包括T细胞和自然杀伤细胞亚群），且表达CAR的细胞对靶细胞系具有活性。研究人员在体外和人源化小鼠模型中证实了细胞转染——在该模型中，该平台还显示出可在全身和脾脏中控制肿瘤细胞生长的能力。最近的研究表明，在输注单次或多次剂量含CD19 CAR mRNA的CD8-tLNPs的恒河猴中，可实现快速B细胞耗竭：血液中B细胞减少（相对于基线）>95%，骨髓中B细胞减少（相对于对照动物）90%；骨髓中的B细胞在第29天恢复至输注前水平，血液中的B细胞在第50天恢复。尚未披露启动临床开发的计划。     尽管Myeloid Therapeutics已如上述进入临床开发阶段，其他机构也在探索体外或体内重编程髓系细胞的可能性。Carisma Therapeutics开发了人CAR巨噬细胞和单核细胞（CAR-M），证实CAR可重新定向巨噬细胞的效应功能，使其对抗肿瘤相关抗原。Pierini等人证实，CAR-M可重塑实体瘤肿瘤微环境（TME）、募集T细胞、驱动表位扩散，并使实体瘤对检查点抑制治疗敏感。随后，研究人员通过将CAR直接导入CD14+经典单核细胞，扩展了CAR-M的概念——这些单核细胞可在原位分化为CAR-M，同时增强迁移和持续存在能力。首个CAR-M产品CT-0508（自体抗HER2 CAR-M）在14例晚期/转移性HER2过表达实体瘤患者中进行了评估（无需清淋化疗），证实了其可行性、安全性、肿瘤微环境重塑能力和适应性免疫诱导作用。基于循环肿瘤DNA的深度但短暂降低，证实了其在HER2+实体瘤患者中的抗肿瘤活性。体外CAR-M方法的一个关键局限性是最大潜在剂量：单核细胞和巨噬细胞为终末分化细胞，无法扩增，因此剂量直接受单采术产量限制。此外，在肿瘤领域，异体CAR-M方法的应用有限，因为MHC不匹配会限制抗原呈递。因此，与前面讨论的潜在优势一致，直接在体内向髓系细胞递送CAR是一种具有吸引力的替代方案。     2022年，Carisma Therapeutics与Moderna启动合作，利用mRNA-LNP技术开发体内CAR-M。该平台的开发采用了具有强效体内转染髓系细胞能力的LNP，以及包含优化结构域和信号结构域的新型CAR（用于髓系细胞的抗肿瘤活性）。体外数据显示，CAR的表达可持续>7天，并在抗原刺激后诱导抗原依赖性细胞死亡、细胞因子释放、连续杀伤（依次杀伤多个靶细胞的能力），以及巨噬细胞向炎性表型的极化。在体内，全身给药mRNA-LNP在HER2阳性和GPC3阳性肿瘤模型中，均能在移植了转移性实体瘤的人源化小鼠中实现强效抗肿瘤活性。静脉给药mRNA-LNP后，髓系细胞是主要表达CAR的免疫细胞。2024年，Carisma和Moderna宣布选定靶向GPC3的体内CAR-M开发候选产品，用于进一步临床开发（治疗肝细胞癌）。同时，两家公司继续开发针对其他未披露肿瘤靶点的体内CAR-M，并在2024年扩大合作，将自身免疫性疾病的两个靶点纳入其中。此后，Carisma和Moderna终止了抗HER2项目，但继续推进靶向GPC3的CAR-M开发。         其他公司也在探索适用于体内CAR产品的tLNP设计和制造工艺改进，例如Acuitas Therapeutics、Mote Therapeutics、日东电工（Nitto Denko Corporation）、Aera Therapeutics和Grit Biotechnology。非病毒全RNA载荷方法（在体内特定基因座将CAR构建体基因永久插入T细胞）是一个特别受关注的方向。Tessera Therapeutics开创的此类替代敲入技术（无需使用病毒载体），可能会因RNA写入技术的出现而得到极大推动——该技术与LNP平台高度兼容。在非人灵长类动物证据支持下的小鼠临床前模型中，利用这种CAR敲入方法，已获得针对CD19、CD20和BCMA的CAR的概念验证。Stylus Medicine和Integra Therapeutics等其他机构也在探索类似路径，作为基于慢病毒（LV）的体内CAR平台的替代方案，以实现更可控的CAR载荷永久整合和表达谱。最后，为实现这一目标，NanoCell正在开发一种混合载荷方法，包含DNA形式的CAR和以mRNA形式递送的转座酶。 6. 临床开发阶段的体内CAR-T细胞     随着该领域进入临床阶段（首先在恶性疾病中探索工程化慢病毒载体和髓系细胞嗜性LNP-mRNA制剂），临床病例研究显示出良好的安全性、耐受性以及生物学应答或临床疗效。这些首次人体试验要么是企业参与的研究者发起试验，要么是公司赞助的试验，在全球范围内开展（包括中国、美国、澳大利亚和欧盟），体现了这一新兴领域的全球性。已有研究报道，在多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤中，分别使用靶向BCMA和CD19的T细胞靶向慢病毒形式CAR，可实现客观应答。最近，有研究报道了4例接受体内慢病毒抗BCMA CAR治疗的多发性骨髓瘤患者，均获得深度客观应答。其中1例患者在第28天达到严格完全缓解（sCR），另1例患者在第28天实现骨髓微小残留病（MRD）阴性——这凸显了在CAR暴露足够高的情况下，癌症治疗中快速且深度应答的可能性。CRS谱呈现双相特征：首个峰值在给药后数小时内出现，可能由T细胞活化病毒颗粒引起的急性输注反应和CAR+效应细胞介导的活性共同导致；第二个峰值则是病毒CAR的典型特征，可能由给药后7-14天左右新分化的效应细胞介导。尽管该领域仍处于起步阶段，但CAR-T细胞扩增的幅度和速度，以及治疗后数周内即可测量到的临床应答，表明在较短的CAR暴露期间即可实现具有临床意义的疗效。这对于设计为瞬时表达的CAR产品（可通过重复输注或调整剂量来校准CAR暴露）也可能是个好消息。尽管针对实体瘤靶点（TROP2和GPC3）的髓系细胞嗜性LNP-RNA制剂的最新数据支持这一观察结果，但仍需更多证据。     尽管所有这些试验都设计为仔细监测安全性，但由于这些平台技术的新颖性，以及具有不同且潜在协同毒性的组件整合所带来的风险，迄今为止尚未报告严重不良事件或剂量限制性毒性。除了从低起始剂量开始缓慢剂量递增外，这些研究可能还包括前哨患者（sentinel patients）、住院治疗和输注后随访、延长队列间观察间隔、严格的停止规则和剂量限制性毒性定义，以及对输注反应、潜在靶向毒性和产品免疫原性的广泛安全生物标志物评估。这些努力也旨在支持后续试验的给药方案选择。基于处于临床前阶段的公司数量和该领域日益增长的兴趣，我们预计进入临床开发的公司数量将继续快速增长，超过30家——在过去两年中实现了显著的两位数增长（表1和表2）。 7. 体内免疫工程：关键挑战     随着首批体内CAR疗法进入临床评估（表1、表2及图4），仍存在若干关键风险和未解决的问题（专栏3）。为应对这些挑战，早期试验纳入了广泛的安全性和药理应答生物标志物，以指导进一步开发。最值得注意的是，在安全性方面，这种方法代表了未知领域——它结合了不同的技术，每种技术都有其自身的风险特征。 图4：in vio CAR-T开发的主要挑战的宏观视角 7.1 技术风险与当前局限性     要预测体内CAR疗法相关的风险，非人灵长类动物模型可能具有重要参考价值。此外，医生对商业CAR-T细胞产品的经验日益丰富，但关于慢病毒载体和LNP-RNA产品直接体内CAR-T细胞疗法的临床经验仍非常有限。因此，在早期临床开发中采用基于风险的监测方法至关重要，需考虑平台技术（基于病毒或LNP-RNA）的具体特征，以及迄今为止在临床中使用传统体外CAR-T细胞产品的经验。     由于载荷具有整合性，基于慢病毒的CAR产品存在固有挑战，主要源于对CAR活化、扩增和持续存在的可控性有限。CAR-T细胞可根据靶细胞负荷自行调整扩增，这有助于提高治疗疗效。然而，受易感因素放大的不受控制的药理学反应，可能引发CRS、ICANS和IEC-HS等严重炎症性不良事件——这些事件需要积极处理和住院治疗。一个关键挑战是，这类不良事件可能在治疗后延迟发生，因此难以预测，需要对患者进行长期监测。在自身免疫性疾病中使用传统体外工程化CAR-T细胞的当前研究应继续提供重要信息：尽管炎症性不良事件的发生率和严重程度似乎低于肿瘤领域（原因正在研究中），但最近有报道称，在CAR-T细胞输注数月后，仍出现CAR-T细胞的持续存在甚至再次扩增，并伴随IEC-HS等严重毒性。最近，在接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的自身免疫性疾病患者中，发现了一种新型毒性——局部免疫效应细胞相关毒性综合征（LICATS）。但这似乎是一种疾病 flare-up，或CAR介导的旁观者效应对自身免疫性疾病受累器官的短暂影响：30%的受治患者接受了低剂量皮质类固醇治疗，8%需要住院。半数受治患者在治疗后至少2周出现LICATS，这再次凸显了对接受病毒工程化CAR-T细胞治疗的自身免疫性疾病患者进行长期监测的重要性。最后，CAR-T 细胞的长期存在可能导致持续性靶向毒性，表现为 B 细胞耗竭和低丙种球蛋白血症（若靶向 B 细胞谱系，需预防感染），或帕金森症 —— 这在体外抗 BCMA CAR-T 细胞产品中已有报道。除长期监测外，为提高依赖基因组载荷整合的体内 CAR 的安全性和可控性，可能需要整合确保 CAR 表达时空控制的特征，例如细胞谱系特异性启动子和自杀开关（kill switches）。 专栏 3：体内 CAR 疗法：需关注的风险与待解答的问题 基于病毒载体的体内 CAR 疗法 1. 由于嵌合抗原受体（CAR）序列在基因组中永久整合，部分患者可能出现 CAR-T 细胞活化、扩增、再扩增和 / 或持续存在的增强，进而引发细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）、免疫效应细胞相关噬血细胞综合征样综合征（IEC-HS），且针对 B 细胞的产品可能导致持续性 B 细胞耗竭和低丙种球蛋白血症。这些情况可能需要监测或强化管理，包括使用托珠单抗（tocilizumab）、皮质类固醇、阿那白滞素（anakinra）、静脉注射免疫球蛋白及其他支持治疗。 2. 存在潜在遗传毒性和低概率克隆事件风险，需长期监测，这可能影响该技术在安全性要求高的适应症中的应用。 3. 针对某些病毒成分的免疫原性也可能影响该类产品的应用和重复给药。 4. 最后，逆转录病毒载体整合可能导致插入突变，进而引发克隆事件，因此需对接受基于逆转录病毒的体内 CAR 产品治疗的患者进行长期监测。 基于脂质纳米颗粒（LNP）-RNA 的体内 CAR 疗法 5. 由于该方法为瞬时工程化，可能需要重复给药以实现足够暴露，因此产品反应原性或免疫原性可能成为限制因素，或该方式更适合疗效要求较低的适应症。 6. 根据制剂特性及对肝脏和髓系细胞的嗜性，可能发生急性输注反应、肝脏毒性，以及产品免疫原性引发的超敏反应。 7. 若细胞选择性不佳，非靶细胞的联合工程化可能限制疗效或引发器官免疫病理损伤。 8. 尽管该技术可通过给药剂量调整实现可控性，但仍不能排除出现加重药理效应（CRS、ICANS、IEC-HS）的可能性，需进行适当管理。 9. 最后，由于这类产品结合了纳米药物、RNA 分子和 CAR 产品的安全性特征，目前缺乏临床经验，因此在早期临床开发中需进行全面的基于风险的监测。 关键问题 1. 体内 CAR 能否达到与现有体外 CAR 产品相当的治愈效果？ 2. 该概念是否具有可扩展性，能否广泛应用于肿瘤和非肿瘤适应症、门诊场景及早期治疗？ 3. 哪些新型剂量限制性毒性需要适当的预防和管理措施？ 4. 需进行哪些未来优化，以最大限度扩大体内 CAR 疗法的应用范围？     与逆转录病毒载体相关的一个特别值得注意的方面是，由于基因组整合具有相对随机性，可能引发插入致癌风险。最近有报道显示，接受传统病毒工程化 CAR-T 细胞治疗的患者出现了 CAR 阳性继发性 T 细胞恶性肿瘤。然而，由于病例数量少、患者群体本身存在癌症易感性，且分化 T 细胞转化难度大，难以确定 CAR 插入与肿瘤发生之间的直接因果关系。显然，需要进一步研究该问题 —— 具体而言，需阐明 CAR 载体插入的相对贡献，以及基因座整合、与致癌基因相互作用等协同因素的作用。目前已有针对人类基因产品给药后长期监测的行业监管指南，但其可能需要进一步调整，以支持基于逆转录病毒的体内 CAR 疗法的开发。     反过来，依赖 LNP 制剂的基于 RNA 的 CAR 可能存在安全风险，这源于该技术三大核心组件的相互作用：可能介导输注反应或急性期反应的纳米制剂；具有内源性先天免疫激活作用的 RNA 载荷；以及可能引发炎症性不良事件或失控靶向药理效应的 CAR 构建体（如前文所述）。由于 RNA 模板介导的 CAR 表达具有瞬时性（尤其在 T 细胞快速分裂的情况下），可能需要重复给药或其他优化措施，以在关键治疗窗口期内实现足够的 CAR 暴露，从而达到临床疗效。这引发了若干关键挑战：首先，需实现肝脏脱靶效应的控制，以预防由这类制剂固有的肝脏嗜性引发的器官特异性毒性；其次，抗体 - tLNPs 或非靶向 LNPs 的重复给药可能诱导针对 LNP 成分、靶向部分和 / 或表达载荷的抗体和 T 细胞应答 —— 理论上，这不仅可能限制疗法有效性，还可能引发免疫介导的不良事件，包括 I 型、III 型和 IV 型超敏反应。     综上，这些潜在局限性，加之 LNP-RNA 形式体内 CAR 缺乏临床经验，凸显了在包括非人灵长类动物在内的多种临床前模型中降低这类技术风险的重要性。此前获批的 RNA 纳米药物（如 ONPATTRO）可能为体内 LNP-RNA CAR 产品的开发路线图提供关键基础，但未来指南需整合与 CAR 治疗相关的考量因素。同时，在早期临床开发中对所有潜在毒性进行全面的基于风险的监测，仍是该治疗方式成功临床转化的关键。这需要包括产品免疫原性、急性期反应、器官（肝脏）毒性，以及靶向性炎症或其他类别不良事件的监测。目前尚不清楚，采用瞬时表达载荷的体内 CAR 技术是否能避免病毒 CAR 所观察到的相对延迟或慢性靶向 / 脱靶毒性，例如 LICATS、与 CAR-T 细胞二次扩增相关的 IEC-HS、运动障碍、延迟性血细胞减少或持续性 B 细胞耗竭。     下文将根据主要体内 CAR 疗法类别的目标产品谱，提出产品开发路线图和潜在初始应用场景（图 4 和图 5）。最后，我们将对体内免疫系统编程概念的长期前景进行展望 —— 其潜力可能超越传统治疗方式。 图 5：体内工程化平台特征对目标产品谱特性及治疗应用的影响 基于脂质纳米颗粒（LNP）-RNA 的体内嵌合抗原受体（CAR）候选产品采用非整合型载荷进行瞬时工程化，理论上可重复给药且具有可控性，因此能够根据治疗疗效和安全性要求调整 CAR 暴露。此外，由于载荷不整合到基因组，这类产品适合安全性要求高、适合 “一击即走”（hit-and-run）机制的疾病适应症（如自身免疫性疾病中的 “免疫重置” 或癌症中的残留病灶清除）。尽管如此，目前在实体瘤中测试的、递送 CAR mRNA 的巨噬细胞嗜性 LNP 制剂，能够实现重复给药并协同利用内源性免疫机制，已显示出良好前景。 采用病毒（慢病毒或 γ- 逆转录病毒）载体进行稳定 T 细胞工程化的体内 CAR 产品，其机制优势在于 CAR-T 细胞可根据靶抗原负荷实现自我校准的扩增和持续存在，适合需要高且持续 CAR 细胞活性的疾病适应症。然而，基因组整合特性可能带来特定挑战，包括 CAR 阳性细胞再扩增、靶向药理效应增强，以及需监测遗传毒性。因此，理论上这类产品更易首先转化应用于疗效要求高、安全性要求低的疾病适应症，如晚期血液系统癌症或实体瘤。注：AUC，血药浓度 - 时间曲线下面积；MRD，微小残留病。 8. 产品开发策略     大多数研发机构优先选择经过充分验证的靶点（CD19、CD20、BCMA、CD22、TROP2、GPC3），以指导其平台技术的优化，从而实现临床转化和商业产品开发。总体目标是通过替代或超越可扩展性较低的体外工程化细胞产品或疗效不佳的生物制剂，扩大 CAR 疗法的临床应用范围。首批体内 CAR 人体试验除评估安全性和临床活性证据外，还将为后续概念验证试验和注册试验的给药方案选择提供依据（图 6）。这些在 B 细胞恶性肿瘤和 B 细胞相关自身免疫性疾病中开展的初始试验，将研究包括输注反应、产品免疫原性、急性 / 亚急性 / 慢性靶向毒性及遗传毒性在内的风险。因此，全面的转化分析对于制定完善的安全监测和管理计划、为 II 期试验前的优化提供信息，以及为注册试验选择合适的给药方案至关重要。 图6：快速发展的in vivo CAR-T生态 根据载荷技术（病毒或非病毒）及嵌合抗原受体（CAR）构建体是否整合到基因组，将主要进入临床测试或临床前优化阶段的技术分类。目前具有新兴概念验证证据的主流技术，是基于整合型工程化慢病毒载体和髓系细胞嗜性 LNP-mRNA 制剂，分别在 B 细胞恶性肿瘤和实体瘤中进行评估。紧随其后的是其他进入临床阶段或晚期临床前开发的工程化慢病毒载体和靶向 LNP（tLNP）-RNA 技术（表 1）。如文中所述，包含杂交或非病毒基因编辑系统的其他技术处于早期研究或临床前开发阶段。内圈为处于临床测试阶段的公司，外圈为处于临床前阶段的公司。开发工程化慢病毒载体形式的公司显示在橙色区域，开发基于 RNA 的方法的公司显示在蓝色区域，开发基于靶向递送基因编辑系统的体内工程化技术的公司显示在红色区域。 注：* 基于已报道病例研究具有新兴概念验证证据的公司：EsoBiotec（多发性骨髓瘤）、济因生物（Genocury，非霍奇金淋巴瘤）、Myeloid Therapeutics（实体瘤）。     在血液肿瘤领域，由于将免疫疗法推向早期治疗的理论依据充分，且微小残留病（MRD）检测技术不断发展，一个重要机遇是在一线治疗中针对高危患者开展治疗，以实现治愈目的。在自身免疫性疾病领域，关键目标是开发可扩展的疗法，实现 “免疫重置”—— 即深度免疫细胞谱系耗竭后，快速重建正常免疫细胞库，最终实现持久的无治疗缓解，且无组织或基因组后遗症。在再生医学领域，针对纤维化和衰老的重要机遇是，通过体内 CAR 工程化免疫细胞清除致病性细胞，恢复正常组织功能。根据基于病毒和基于 mRNA 的体内 CAR-T 细胞治疗方式的预期目标产品谱，我们预计其商业应用切入点不同，不过利用 CAR mRNA 工程化巨噬细胞靶向实体瘤可能是个例外（图 5）。     基于深度反向转化的产品和平台迭代优化，有望改善产品性能和目标产品谱，从而扩大所有这些平台的临床应用范围。 9. 迈向体内免疫系统重编程     首批体内 CAR-T 细胞产品推动的这些治疗平台的临床验证，可能为未来重新思考免疫疗法整体格局奠定基础。与其他治疗方式相比，体内免疫工程具有诸多差异化特征，治疗潜力巨大（专栏 4）。例如，在肿瘤领域，未来可能通过体内工程化实现多受体 CAR 或多类免疫细胞的 TCR 工程化（各类细胞协同作用）、免疫微环境的直接重编程、内源性免疫的有效协同利用、免疫细胞转录组和信号通路的调控，以及免疫检查点的阻断 —— 所有这些均通过体内工程化实现，具体细节如下。     在自身免疫性疾病、移植排斥管理、过敏及其他免疫相关疾病中，体内 CAR-T 细胞产品可通过协同部署反向调节机制或诱导操作性耐受，以多种方式重置或调节免疫系统，从而实现持久的无治疗缓解。其他有前景的方向包括：扩展 CAR 载荷设计以靶向更广泛的分子；选择性将 CAR 导向抗原特异性致病性细胞；或在特定场景中使用双靶点 CAR 构建体，以扩大活性范围并提高临床安全性和疗效。在抗体介导的 LNP 体内 T 细胞工程化首次得到证实的十年后，当前研究仍在继续聚焦于通过使用高选择性抗体片段和新兴结合剂（如纳米抗体），提高向特定免疫细胞亚群的精准递送效率。     包括植入式装置在内的新型平台，可能极x大推动这种整体性免疫系统工程化方法的实现。与注射剂类似，植入式装置是有望在体内对患者 T 细胞进行基因操作的新型技术。例如，生物材料植入物可在原位募集宿主 T 细胞，为其配备肿瘤特异性受体，并快速扩增这些细胞并将其分散到肿瘤微环境中。该装置是一种功能化多孔胶原支架，含有强效 T 细胞趋化因子、编码 CAR 的慢病毒载体，以及刺激性抗 CD3/CD28 抗体。在乳腺癌小鼠模型中，植入物可快速聚集并编程癌症特异性宿主淋巴细胞，实现长期肿瘤消退。这种局部植入技术的潜在优势在于，可大幅降低所需载体剂量，从而节约成本并最大限度降低全身毒性风险。该装置可在原发肿瘤减瘤手术期间或术后放置在实体瘤附近，或战略性放置在淋巴结附近，以促进原位编程的 CAR-T 细胞在全身快速扩散。此外，这些 “现成可用” 的支架可与当前 FDA 批准的任何 CAR-T 细胞疗法所用的慢病毒载体兼容。     目前已有 6 种体内基因治疗药物上市，腺相关病毒（AAV）载体可能成为体内递送的通用载体选择。然而，由于 AAV 存在固有局限性（如免疫原性、附加体定位导致的增殖细胞中瞬时活性），迄今为止其在 CAR-T 细胞生成中的应用非常有限。但将 AAV 基 CAR 递送与核酸酶介导的基因组靶向相结合，可实现 CAR 的稳定整合。另一种潜在组合策略是，将最近报道的基于衣壳设计策略（如慢病毒包膜工程化）的 T 细胞靶向 AAV 相结合，这可能很快形成一种替代载体系统，用于体内 CAR-T 细胞的瞬时或永久精准工程化。优化方向可能包括设计识别靶受体组合的双特异性 AAV，实现 “与” 门（AND-gating）逻辑调控。除直接重编程 T 细胞外，另一种方法是通过造血干细胞（HSC）工程化生成 CAR-T 细胞、CAR 自然杀伤细胞和 CAR 巨噬细胞（CAR-M）—— 具体而言，使用基于辅助依赖型腺病毒的病毒样颗粒，携带睡美人（sleeping beauty）整合载荷和 CAR 构建体。     无需使用病毒载体的替代敲入技术，也可能推动下一代体内 CAR-T 细胞疗法的发展。RNA 基因写入技术的出现，为开发具有更高 CAR 基因插入可控性的整合型载荷技术提供了巨大机遇；来自体外和小鼠模型的最新临床前数据显示，通过 tLNPs 递送全 RNA 载荷形式的、针对 CD19、CD20 和 BCMA 的 CAR，已获得概念验证。     要推动这类体内工程化平台的临床转化（尤其是在安全性和疗效要求高的疾病适应症中），开发能进一步优化安全性和疗效谱的新型技术至关重要。学术研究持续推动该领域发展，最近报道的若干概念可能极大促进下一代产品设计。在毒性规避和靶向选择性增强方面，主要方向包括载荷表达的时空控制和组合抗原识别。其他途径包括：为基因组整合技术利用组织和细胞谱系特异性启动子；对于基于 RNA 的 CAR 和其他载荷，利用组织特异性 microRNA 结合位点限制在肝脏或其他器官中的非预期翻译。要实现更高的生物活性，需要开发性能更优、组织或细胞选择性更强的纳米药物 —— 这可通过结合条形码技术的高通量筛选，以及人工智能指导的设计来实现。另一种提高 LNP 作为体内 CAR 疗法载体安全性的方法是，共配制免疫调节因子（如用于敲低 IL-6 产生的短发夹 RNA）或其他抗炎分子。随着载荷扩展到基因编辑系统，具有高度特异性的组织和细胞递送载体变得更加关键。同时，人们持续关注探索多样化的制剂和载荷化学、功能化及制造优化。     为满足实体瘤等疾病适应症的高疗效要求，目前正在考虑多种载荷多样化策略，包括用于免疫细胞强化的生物反应调节剂、用于协同利用额外效应机制的免疫细胞衔接器，以及免疫检查点调节剂。 10. 展望     在首次以质粒 DNA 形式评估体内基因基抗原免疫接种 35 年后、首次静脉输注逆转录病毒载体用于临床治疗 25 年后、首个 CAR-T 细胞产品获批 8 年后，我们展望未来将实现对免疫系统的精准且复杂的体内编程。目前这些正进入临床阶段的技术（图 6），最终将实现载荷表达的时空控制和可控性，并容纳多种协同作用机制。因此，它们将超越现有治疗方式的能力，在更广泛的疾病中实现更优的临床疗效。更具体地说，从体外到体内 CAR-T 细胞疗法的概念转变，重新定义了免疫疗法的可扩展性和可及性 —— 通过大幅降低生产成本，产生深远的社会经济影响，推动救命疗法的普及。 专栏 4：体内免疫工程相较于传统免疫疗法的主要差异化特征及潜在优势 相较于抗体和免疫细胞衔接器 1. 活性增强：得益于免疫细胞迁移能力，以及包含多个共刺激结构域的嵌合抗原受体（CAR）设计。 2. 工程化特定免疫细胞亚群的灵活性更高。 3. 可同时协同利用多种协同作用的免疫细胞类型。 4. 细胞工程化方式更多样化，包括通过重编程基因组、转录组、细胞信号网络、受体或免疫细胞生物学其他方面，从细胞内部修饰细胞功能。 5. 载荷协同递送：通过在微环境中局部表达生物反应调节剂、检查点调节剂或其他生物分子，实现更广泛的作用机制，同时提高安全性。 相较于体外工程化细胞产品 1. 无需细胞操作，可提高可扩展性和可及性，尤其相较于自体产品。 2. 避免使用基于化疗的清淋预处理 —— 这类预处理可能限制可及性，并将应用范围局限于安全性要求低的适应症。 3. 可在体内联合工程化多种协同作用的免疫细胞类型。 4. 通过激活而非清淋预处理，利用已有的免疫状态。 5. 可根据载荷特性，通过剂量调整和重复给药实现更高的可控性 —— 这对于满足具有特定性能指标的更广泛适应症的暴露要求至关重要。 术语表 1. 环状 RNA（Circular RNA）：形成连续环的单链 RNA 分子。尽管天然环状 RNA 是存在于多种物种中的非编码 RNA，但可通过改造用于细胞工程化。 2. 设计锚蛋白重复蛋白（Designed ankyrin repeat protein, DARPin）：一种基因工程化抗体模拟蛋白，通常对靶蛋白具有高特异性和高亲和力结合能力，源于天然锚蛋白重复蛋白。 3. 融合蛋白（Fusogen）：病毒表面的一种蛋白，通过将病毒膜与宿主细胞膜融合，帮助病毒进入宿主细胞，使病毒遗传物质释放到宿主细胞胞质中。 4. 低丙种球蛋白血症（Hypogammaglobulinaemia）：一种以血液中免疫球蛋白水平异常降低为特征的疾病，患者感染风险增加。 5. 内部核糖体进入位点（Internal ribosomal entry site）：一种特定 RNA 序列，可使核糖体结合 mRNA 并从内部位置启动蛋白质合成，绕过典型的帽依赖启动过程。 6. 可电离脂质（Ionizable lipids）：电荷可随环境 pH 值变化的脂质分子，是脂质纳米颗粒（LNPs）的关键组成部分，用于 RNA 治疗药物的递送。 7. 清淋预处理（Lymphodepletion conditioning）：为嵌合抗原受体（CAR）-T 细胞疗法或一般过继性细胞移植做准备的治疗步骤，通常使用化疗药物（最常用环磷酰胺和氟达拉滨）清除内源性免疫细胞。 8. 微小残留病（Minimal residual disease）：指治疗后体内仍残留少量癌细胞的状态，可见于白血病、淋巴瘤等血液系统癌症及实体瘤。 9. N₁- 甲基假尿苷（N₁-Methylpseudouridine）：一种存在于 tRNA 和 mRNA 疫苗中的化合物，虽为古菌中的天然成分，但目前广泛应用于生物化学和分子生物学领域。 10. 尼帕病毒（NiV）糖蛋白（Nipah virus (NiV) glycoproteins）：尼帕病毒表面的两种关键糖蛋白 —— 附着糖蛋白（G）和融合糖蛋白（F），对病毒进入宿主细胞至关重要。G 蛋白介导病毒与宿主细胞的结合，F 蛋白触发膜融合，使病毒进入细胞。 11. PiggyBac 转座子系统（PiggyBac transposon system）：一种基因工程工具，用于将 DNA 序列稳定且可重复地导入基因组，通过转座酶将转座子（一段 DNA 序列）“剪切 - 粘贴” 到基因组新位置。 12. 假型（Pseudotype）：一种经工程改造的病毒颗粒，表面展示外源病毒包膜蛋白。 声明：尽管本公众号译者对本文进行了二轮审校，以尽力确保内容的准确和完整，但仍然可能存在翻译或理解的不当，请读者以原文为准。如有翻译不当处，您可在公众号对话框中发送反馈，译者会尽快校对并予以回复。尽管竭力避免，但论文翻译可能引入生成式AI的幻觉问题，指导临床实践的内容须以原文为准。 预打样（Proof）稿件内容说明：部分论文在推送发布时，期刊尚在校稿，所提供的原文为非正式版本。可能存在排版、表述等问题，需以正式版为准。如果在您阅读本文时正式版已发表（至少在本推送发布后3个月以后），您可以在评论区留言，编者将更换PDF源。 文献：Bot, A., Scharenberg, A., Friedman, K. et al. In vivo chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy. Nat Rev Drug Discov (2025). https://doi.org/10.1038/s41573-025-01291-5 文献原文（直接点击右侧下载）：In vivo chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy.pdf 识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！