Apolipoprotein E(Centre Hospitalier Universitaire de Nimes)

*仅供医学专业人士阅读参考只要提起阿尔茨海默病的发病机制，大家的脑子里肯定会浮现“Aβ级联”假说，毕竟它是阿尔茨海默病发病机制的主流学说。然而，这一假说背后一直存在一个问题：这一病理级联究竟是如何启动？或者换句话说，究竟是什么启动了Aβ斑块的形成？我们都知道，无论是雨滴还是雪花，启动形成的必要条件中都有凝结核（尘埃或盐粒等）。那么Aβ毒蛋白形成Aβ斑块需要“凝结核”吗？如果需要的话，又会是谁呢？今天，由德国慕尼黑工业大学Mikael Simons和Stefan A. Berghoff领衔的研究团队，在著名期刊Immunity上发表一篇重磅研究论文[1]，初步解开了上述谜题。他们基于小鼠模型和人脑组织样本，发现原来小胶质细胞中聚集的APOE蛋白就是驱动Aβ斑块形成的内核，是“Aβ级联”和阿尔茨海默病病理的肇始者，它在小胶质细胞溶酶体内促进Aβ斑块的形成。▲ 论文首页截图那么Simons团队是如何抓住APOE聚集体的呢？他们的出发点其实很简单。他们注意到，包括阿尔茨海默病在内的多种中枢神经系统疾病，都存在APOE上调这一现象；还有很多研究发现，如果敲除小鼠的APOE编码基因，就会导致纤维状淀粉样斑块沉积减少。以上的种种说明，APOE在Aβ纤维化/稳定和/或压实中发挥重要作用。那干脆就从APOE入手。为了能在小鼠体内看到APOE的一举一动，Simons团队先构建了一个很特殊的模式小鼠（ApoE-Halo）。他们先把小鼠的原装APOE编码基因去掉，然后插入融合了HaloTag标签的新APOE基因。一番比较之后，他们发现给APOE加个小标签，不影响APOE蛋白的功能。随后，他们又让ApoE-Halo小鼠与阿尔茨海默病小鼠模型5xFAD小鼠杂交，如此一来就得到了5xFAD ApoE-Halo小鼠，与5xFAD小鼠相比，5xFAD ApoE-Halo小鼠在Aβ代谢方面、APOE和小胶质细胞标志物基因的表达等方面，也没有差异。接下来就可以仔细看看APOE与“Aβ级联”之间的关系了。他们首先看了看APOE的定位。荧光标记结果显示，在5xFAD ApoE-Halo小鼠的大脑中，APOE标记阳性的小胶质细胞（IBA1阳性）增多，而且APOE-Halo的定位与纤维状β折叠斑块重叠（MX04阳性）。▲ 染色结果以上结果说明，Simons团队开发的5xFAD ApoE-Halo小鼠模型，可以用于观察APOE与“Aβ级联”之间的关系。接下来，他们就开始研究5xFAD ApoE-Halo小鼠模型，他们发现这个小鼠模型大脑中的MX04阳性斑块大体可以分成三类：第一类最多，是Aβ标记和APOE标记均强阳性，在小鼠3.5个月和6个月时分别占比82.1%和62.6%；第二类随着疾病进展逐渐增加，是Aβ标记强阳/APOE标记弱阳，从小鼠3.5个月时的4.1%增加到6个月时的19.7%；第三类含量稳定，属于Aβ标记弱阳/APOE标记强阳，小鼠3个月时比例为14%，6个月大时比例为11%。重要的是，阿尔茨海默病患者脑组织样本也表现出类似的特征。▲ 斑块特征Simons团队还通过一些生化方法从斑块中提纯了APOE-Halo蛋白，发现它们形成了多聚体，呈现出一种蛇形纤维形态。如果将纯化的APOE-Halo蛋白加到小胶质细胞的培养液中，就可以检测到斑块的形成。随后，他们还在阿尔茨海默病患者的脑组织样本中证实了APOE聚集体的存在。以上结果说明，APOE确实会在5xFAD小鼠和阿尔茨海默病患者大脑中形成聚集体。▲ 5xFAD小鼠和阿尔茨海默病患者大脑中均存APOE聚集体那APOE聚集体究竟是不是Aβ斑块形成的关键因素呢？Simons团队通过成熟的注射实验，发现纯化的APOE聚集物注射到APOE编码基因被敲除的5xFAD小鼠体内，可以检测到MX04阳性的APOE聚集物，而且它们与Aβ共定位。基于以上研究结果，Simons团队认为APOE聚集物是Aβ斑块形成的辅助因子。▲ APOE聚集物是Aβ斑块形成的辅助因子接下来的问题是：人类的APOE聚集物是Aβ斑块形成的关键么？不同亚型的APOE对Aβ斑块的形成又有什么影响呢？为了回答上述问题，Simons团队又构建了两个新的小鼠模型，APOE3编码基因敲入小鼠5xFAD APOE3 KI和APOE4编码基因敲入小鼠5xFAD APOE4 KI。他们先比较了MX04阳性淀粉样斑块的数量，发现与5xFAD APOE3 KI和5xFAD小鼠相比，5xFAD APOE4 KI的MX04阳性斑块负荷更高。随后，他们又从基因型为APOE3/3和APOE4/4的阿尔茨海默病患者脑组织中，纯化了APOE3和APOE4聚集物，并分别注射到5xFAD小鼠体内，发现与对照相比，两者都能促进MX04阳性斑块的形成。这说明，APOE3和APOE4都可以在Aβ斑块形成过程中充当辅助因子。不过，后续研究表明，与APOE3相比，APOE4对Aβ斑块的影响更大。▲ APOE3和APOE4都可以在Aβ斑块形成过程中充当辅助因子在研究的最后，Simons团队探索了APOE促进Aβ斑块形成的机制。简单来说，脂质化的APOE颗粒（含胆固醇）被小胶质细胞吸收之后，会进入小胶质细胞的溶酶体内发生脱脂作用，胆固醇形成脂滴，而脱脂的APOE变得更容易聚集，形成聚集体；在小胶质细胞出现溶酶体功能障碍和促炎激活的情况下，APOE聚集体就会诱导Aβ斑块在溶酶体中形成。▲ 潜在机制示意图基于以上研究结果，Simons团队认为，在阿尔茨海默病患者体内，APOE表达的上调可能会导致小胶质细胞对脂蛋白颗粒的摄取增强，导致APOE聚集体的形成，而APOE聚集体可能为Aβ成核和/或聚集提供了一个可附着的表面，从而引发病理级联反应，最终导致Aβ斑块的形成。我们都知道，小胶质细胞其实是大脑中的免疫细胞，它在预防Aβ斑块形成和阿尔茨海默病进展的过程中发挥着重要的作用。有研究表明，小胶质细胞功能受损时，Aβ斑块的积累就会增加。不过，也有不少研究发现，清除小胶质细胞可以抑制Aβ斑块的形成。Simons和他的同事认为，这些看起来很矛盾的研究其实并不矛盾，因为它们可能研究的是不同阶段的小胶质细胞。他们认为，小胶质细胞可能同时负责Aβ斑块的生成和降解，而且这两个过程能在溶酶体内同时发生。总的来说，这一发现让我们对“Aβ级联”假说的启动有了新的认知，如果这一机制在人体内被进一步证实，将有助于阿尔茨海默病的防治。参考文献：[1].Kaji et al., Apolipoprotein E aggregation in microglia initiates Alzheimer’s disease pathology by seeding β-amyloidosis. Immunity. 2024. DOI:10.1016/j.immuni.2024.09.014本文作者丨BioTalker

导读：核苷修饰的信使 RNA（messenger RNA, mRNA）-脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNP）是两种紧急使用授权COVID-19 疫苗的基础。使用核苷修饰的 mRNA 作为药理学试剂为治疗、预防和诊断分子干预提供了巨大的机会。特别是，基于 mRNA 的药物可以特异性调节免疫细胞，例如 T 淋巴细胞，用于肿瘤、感染和其他疾病的免疫治疗。 经全身给药后，mRNA的器官和细胞特异性递送是一项重大挑战。全身递送后，mRNA-LNP主要靶向肝脏，因为它们能够结合载脂蛋白 E（Apolipoprotein E，APOE）并靶向肝细胞表面的APOE受体。将其偶联到纳米载体亲和配体表面，例如，针对特定靶分子的抗体为靶向递送提供了一种替代方法。亲和靶向可以更精确地控制RNA在器官中的分布。 近年来，Ab-LNP（抗体偶联LNP，Antibody Conjugation LNP）似乎成为mRNA治疗性药物开发的一大研究热点。宾大诺奖（Drew Weissman）得主发表多篇Ab-LNP实现mRNA靶向递送的概念性研究成果。今天，菌菌带大家一起梳理Weissman团队在该领域的研究进展。 01 作者及团队介绍 Drew Weissman，美国免疫学家、2023年诺贝尔生理学或医学奖得主，宾夕法尼亚大学RNA创新研究所所长。Drew Weissman长期专注于RNA和先天免疫系统生物学的研究，是该领域的先驱，为该领域做出了重大贡献。Weissman 博士和他的同事发现了一种新型核苷修饰的 mRNA 平台，可以绕过不良的免疫反应。该平台是数十年专注和研究的成果，现已成为针对世界上一些重大疾病靶向疗法蓬勃发展研究的基础。这一研究成果为第一批 mRNA 疫苗铺平了道路，成为 COVID-19 mRNA 疫苗的关键支柱。 图1 2023年诺贝尔生理学或医学奖得主 02 Weissman团队在Ab-LNP的研究进展2.1 抗PECAM/mRNA-LNP实现mRNA的肺部靶向2.1.1 文章信息 题目：PECAM-1 directed re-targeting of exogenous mRNA providing two orders of magnitude enhancement of vascular delivery and expression in lungs independent of apolipoprotein E-mediated uptake 期刊: Journal of Controlled Release（一区，IF=10.5） 链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30336167/2.1.2文献解读 mRNA给药后不会特异性递送至某个器官或者细胞，这是限制其在不同疾病领域发展的关键瓶颈。最近热门的抗体与mRNA-LNP偶联，似乎是一种可行的解决途径，使其递送的准确性变得可及。血管腔内的内皮细胞是许多心血管、神经和肺部疾病的药物干预目标。利用结合内皮表面决定因子CD31（又称血小板内皮细胞粘附分子-1 (Platelet-endothelial Cell Adhesion Molecule-1, PECAM-1)）等的抗体和其他亲和配体，已经实现了多种药物和载体对肺和部分血管区域的内皮靶向。 本文中作者宣布，他们将核苷修饰的mRNA-LNPs与血管细胞粘附分子PECAM-1特异性抗体结合，Ab/LNP-mRNA独立于APOE，可将mRNA靶向递送到小鼠肺部。这使得mRNA-LNP在许多心血管、神经和肺部疾病的治疗成为可能。 文中披露的LNP脂质组分摩尔比为，可电离的阳离子脂质：磷脂酰胆碱：胆固醇：聚乙二醇脂质=50:10:38.5:1.5，同时为了实现偶联，作者在脂质中加入了马来酰亚胺官能团（DSPE-PEG-mal）。其中mRNA的浓度为1μg/μL，并用N1-甲基假尿苷对其进行修饰。抗体则经由N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫乙酸酯(N-Succinimidyl-S-Acetylthioacetate, SATA)进行功能化地引入巯基从而允许与马来酰亚胺偶联，随后使用G-25 Sephadex快速旋转蛋白柱去除未反应的成分。紧接着利用硫醚偶联法将抗体上的活性巯基偶联到马来酰亚胺上，完成LNP与抗体的偶联。最后，作者利用Sepharose CL-4B凝胶过滤柱对其进行了纯化。因此，作者通过SATA-马来酰亚胺将靶向抗体或同型对照的IgG偶联到LNP颗粒上。 经过偶联后LNP粒径由82.5±1.8nm，增加至~100 nm，形态无明显差异。进一步的实验表明，抗PECAM/mRNA-LNP不依赖于APOE介导的摄取途径就可以实现体内外的内皮细胞靶向。同时，作者通过体内毒性实验发现，该Ab-LNPs对细胞并无毒性和促炎反应，表明其是安全的。 图2 图形摘要2.2 抗CD4/mRNA-LNP在体外靶向 CD4+ T 细胞2.2.1 文章信息 题目：Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs 期刊：Molecular Therapy（一区，IF=12.1） 链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34091054/2.2.2 文献解读 当今的免疫疗法在很大程度上依赖于基于生物蛋白质的药物或免疫细胞的离体修饰，这些药物成本高昂且制造具有挑战性。嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor ,CAR）T细胞疗法就是典型案例。CAR T 细胞疗法是癌症的重要免疫疗法之一。对于实体瘤、T 细胞计数非常低或需要大规模使用的患者，CAR T不是一种好的治疗选择。因此，迫切需要开发体内 T 细胞靶向mRNA的递送系统，以实现稳健和快速的 CAR T 细胞生成。而且，基于 mRNA 的 CAR T 细胞疗法还可以通过降低 CAR T 细胞诱导的毒性风险以及在需要时避免基因组整合的风险来提供更安全的平台。 文中，作者为我们展示了一种含有核苷修饰的抗CD4/mRNA-LNP，用于高效和特异性的体外和体内递送。建立了mRNA 对 T 细胞的特异性和高效靶向和转染为破坏性疾病的免疫治疗和 HIV 治愈提供了平台技术。 本文使用了mRNA m1Ψ-5′- UTP 修饰的 mRNA，poly（A）尾长101nt，用cap1 类似物进行共转录加帽制备得到mRNA，并通过纤维素完成纯化工作。LNP制备过程中，脂质摩尔比为可电离的阳离子脂质：磷脂酰胆碱：胆固醇：PEG 脂质（50：10：38.5：1.5），并以 ∼0.04（w/w）的mRNA与总脂质比进行制备，并在PEG中掺入DSPE-PEG-马来酰亚胺。抗体则经 SATA（Sigma-Aldrich）修饰，引入巯基，然后使用硫醚将抗体上的反应性巯基偶联到LNP的马来酰亚胺部分。 根据动态光散射（DLS） 进行粒度测量，mRNA-LNP 的直径∼80 nm，而Ab-LNP的流体动力学直径为 88.37 ± 4.2nm，尺寸分布窄（PDI = 0.1），每个 LNP 含有 ∼3.5 个抗体。进一步的实验结果显示，抗CD4/mRNA-LNP可以在体内/体外靶向 CD4+ T 细胞。而且小鼠全身注射后，CD4 靶向放射性标记的 mRNA-LNP 在脾脏中积累，比非靶向LNP 的mRNA信号高出 ∼ 30 倍。静脉注射载有 Cre 重组酶编码 mRNA 的 CD4 靶向 LNP 提供了特异性剂量依赖性 loxP 介导的基因重组，导致脾脏和淋巴结中约 60% 和 40% 的 CD4+ T 细胞中分别表达报告基因。此外，T 细胞表型显示 T 细胞亚群的转染均匀，在幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应细胞中，CD4 靶向 mRNA-LNP 的摄取没有变异性。 图3 图形摘要2.3 抗CD117/LNP-mRNA有效靶向BM细胞2.3.1文章信息 题目：In vivo hematopoietic stem cell modification by mRNA delivery 期刊：Science（一区，IF=44.7） 链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37499029/2.3.2 文献解读 造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSC)是人一生中所有血细胞的来源，通过造血干细胞移植(HSC Transplantation, HSCT)，可以用基因工程造血干细胞或健康造血干细胞替代患病的造血干细胞。然而，目前的方案有很大的副作用，而且使用机会有限。本文中，作者宣布他们开发了CD117/LNP-mRNA，基于此递送系统几乎纠正了造血镰状细胞。此外，体内递送促凋亡的 p53 上调凋亡调节因子，进一步影响HSC功能并允许HSCT的非遗传毒性调节，为造血干细胞移植提供了一种非遗传毒性的预处理方案。该平台可能成为体内基因组编辑治疗遗传性疾病的基础，消除对HSCT的需求。 作者采用N1-甲基假尿苷修饰的mRNA，将其包封在阳离子脂质：DSPC：胆固醇：PEG=50∶10∶38.5∶1.5（摩尔比）的LNP中，并在其中加入含有马来酰亚胺功能基团（DSPE PEG-mal）的脂质。其次，将该LNP与完成N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫乙酸酯(N-Succinimidyl-S-Acetylthioacetate, SATA)功能化含有巯基的抗体进行反应。随后用 0.5 M 羟胺去除反应中的 SATA，并通过 Zeba 离心脱盐柱去除未反应的组分。最后LNP中的马来酰亚胺与抗体的巯基在硫醚的作用下完成偶联反应，并使用Sepharose CL-4B凝胶过滤柱对产品进行进一步纯化。 通过对其表征发现，抗CD117/LNP-mRNA可以在体外实现mRNA的有效递送，并靶向骨髓细胞与造血干细胞。同时，体内实验进一步证实其可以靶向LT-HSC。 图4 代表性结果 03 总结 在本文中，菌菌横向回顾了Weissman 团队使用Ab-LNP平台用于肺、T细胞和骨髓干细胞的靶向递送进展。 Weissman 团队研究核苷修饰的 mRNA 和脂质纳米颗粒 （lipid nanoparticle, LNP）疗法，在疫苗和mRNA 蛋白疗法中都有着广泛的研究。目前，团队根据核苷修饰的 mRNA 的瞬时和可控优势，开发了多种将LNP 递送至肺、心脏、大脑、CD4+ 细胞、所有 T 细胞和骨髓干细胞的系列研究。这种靶向性允许通过简单的静脉注射靶向 mRNA-LNP 将基因编辑系统递送到需要基因操作的特定细胞和器官。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。