LS-106

点击蓝字 ↑ 关注药研视角 PharmaView JMC速览 2025.12.22 近日，四川大学何杨/李为民团队在药物化学权威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为《一种二氯丙酰胺取代的二氨基嘧啶类EGFR-TKI通过Ser797与Met793双位点锚定克服非小细胞肺癌对奥希替尼的耐药性》的研究论文，报道了一种新型第四代EGFR酪氨酸激酶抑制剂H8b，通过双重锚定机制有效克服奥希替尼耐药问题，为EGFR突变型非小细胞肺癌患者提供了新的治疗希望。 1 min速览 研究背景 奥希替尼（osimertinib）是第三代 EGFR-TKI，已成为 EGFR 敏感突变（19del/L858R）合并 T790M 阳性 NSCLC 的一线标准治疗。 临床长期使用后，约 10–25% 患者会出现“on-target”获得性耐药——ATP 结合区 C797S 突变，使奥希替尼失去共价结合位点，导致药物失效。 目前全球尚无获批针对 EGFR L858R/T790M/C797S 三重突变的第四代抑制剂，存在巨大未满足需求。 重点内容 结构设计与优化： 以 brigatinib 为母体，保留 2,4-二氨基嘧啶骨架； 在苯环对位引入吸电子基团（–NO₂），并在溶剂暴露区安装二氯丙酰胺“弹头”，形成 49 个衍生物库； 通过酶活、细胞、构效关系（SAR）三轮迭代，锁定候选化合物 H8b。 体外活性： 酶学水平：H8b 对 EGFR L858R/T790M/C797S 突变激酶 IC₅₀ = 3.86 nM，比奥希替尼（>120 nM）提升 30 倍，与 brigatinib（2.38 nM）相当。 细胞水平：– 双重突变 NCI-H1975 细胞 IC₅₀ = 0.03 μM（brigatinib 0.83 μM；奥希替尼 0.41 μM）；– 三重突变 H1975-M3 细胞 IC₅₀ = 0.57 μM（brigatinib 2.37 μM；奥希替尼 6.48 μM）。 选择性与安全性：对野生型 EGFR 窗口 > 20 倍；对 BEAS-2B 正常肺上皮 IC₅₀ = 1.42 μM，提示治疗窗充足。 作用机制： 共晶结构（PDB 9JQ1）显示“双点锚定”新模式：–  hinge 区 Met793 氢键（与 brigatinib 相同）；–  二氯丙酰胺羰基与突变后的 Ser797 形成额外氢键；–  末端哌嗪氮与 Phe795 形成溶剂区氢键，增强口袋占有率。 100 ns 分子动力学：H8b-EGFR 复合物 RMSD 更低、氢键数更多，结合自由能 −76.0 kcal/mol（brigatinib −58.1 kcal/mol）。 ATP 竞争实验：高 ATP 浓度下 H8b 的 IC₅₀ 增幅小于 brigatinib，提示更优的 ATP 竞争能力。 质谱证实：H8b 可与含 Cys797 的 EGFR 发生共价加成（+708 Da），但对 C797S 突变体仅非共价结合，仍能凭借多重氢键维持高亲和力。 细胞功能： G0/G1 期阻滞：0.25 μM H8b 使 NCI-H1975 细胞 G1 比例升至 73.7%，优于 1 μM 奥希替尼。 诱导凋亡：1 μM H8b 在 H1975-M3 细胞中凋亡率 30.4%，高于 5 μM 奥希替尼（18.8%）。 抑制迁移/侵袭：0.25 μM H8b 使划痕愈合率降至 2.25%，Transwell 迁移抑制率 85%，均显著优于对照药。 下调 p-EGFR/p-AKT/p-ERK/p-STAT3 信号轴。 体内药效与毒理： 药代：小鼠腹腔注射 30 mg/kg，T₁/₂ = 6.26 h，AUC = 43 762 μg·h/L，口服生物利用度 49.99%。 抑瘤实验：– NCI-H1975 模型：30 mg/kg H8b 抑瘤率 72.3%；– H1975-M3 模型：30 mg/kg H8b 抑瘤率 71.2%，显著优于同剂量 brigatinib（52.9%）。 急性毒性：单次 300 mg/kg 腹腔给药，14 天内小鼠无死亡、无体重异常，主要器官 H&E 染色未见毒性。 研究总结 该研究基于理性药物设计，成功开发了一种新型第四代 EGFR-TKI——H8b。其通过“双点锚定”策略，既能在 C797S 突变位点形成关键氢键，又保留对 Cys797 的共价加成能力，从而同时高效抑制 EGFR 双重与三重突变体。体外、体内实验均证实 H8b 在疗效上显著优于奥希替尼与 brigatinib，且安全性良好。 图片来源：ACS 详细阅读 01 INTRODUCTION 研究背景 第一代可逆性抑制剂（吉非替尼、厄洛替尼）对敏感突变有效，但 9–14 个月内几乎均因 T790M 门控突变而耐药；第二代共价泛 ErbB 抑制剂（阿法替尼等）虽能覆盖 T790M，却因野生型 EGFR 抑制带来剂量限制性毒性；第三代选择性靶向 T790M 的奥希替尼则成为一线及脑转移标准治疗，然而其长期应用后又出现以 C797S 突变为主的获得性耐药，该突变用丝氨酸取代半胱氨酸，阻断了奥希替尼的共价结合，导致目前尚无获批药物可治的“三重突变（L858R/T790M/C797S）”困境。作者指出，尽管已有 brigatinib、TQB3804、BBT-176、LS-106 等临床前候选，但其体内疗效或毒性仍未满足需求，因此亟需基于结构优化开发能同时锚定突变位点且保持选择性的新一代抑制剂。 02 Drug Design ①药物设计与合成 brigatinib 虽对 EGFR T790M/C797S 有抑制活性，但效力与选择性仍不足；作者遂以其共晶结构为模板，保留 2,4-二氨基嘧啶核心，在苯环对位甲氧基旁引入硝基或氨基等氢键受体/供体，并在溶剂暴露区用 1-甲基-4-(哌啶-4-基)哌嗪片段进行空间填充，以提升与突变口袋的契合度。首轮筛选显示硝基优于氨基，于是固定该基团，系统替换尾链胺部分，发现六、七元环叔胺活性最佳；进一步在苯环间位引入酰胺连接臂，将脂肪胺、芳香胺、杂环胺及丙烯酰胺、磺酰胺等“共价弹头”逐步接入，最终获得 49 个衍生物，并从中锁定带有二氯丙酰胺的 H8b 为候选——其既可通过酰胺羰基与 Ser797 形成氢键，又能保持对 Cys797 的潜在共价反应性，从而兼顾三重与双重突变体的抑制需求。 ②体外 EGFR 激酶抑制活性与构效关系 报告了 49 个新化合物在 100 nM 与 30 nM 两浓度下对 EGFR L858R/T790M/C797S 激酶的抑制率，并测定代表性分子的 IC₅₀。结果显示，所有目标物在 30 nM 时抑制率均 >50%，远优于奥希替尼（15.8%）。固定苯环对位硝基后，作者首先变换尾链胺片段：六元或七元环叔胺活性最佳，芳香杂环因平面刚性导致活性下降；在哌啶环对位引入羰基可再提升结合力。随后保持硝基不变，将氨基转化为酰胺，考察不同 R 基对活性的影响：乙酰胺系列活性平平；苯甲酰胺中，间位氯代物 H4g 活性最优（IC₅₀ 5.55 nM），电子效应与空间位姿同时决定效能；氮杂芳酰胺亦优于脂肪酰胺。最后引入“共价弹头”策略，三氯或二氯丙酰胺衍生物 H8a/H8b 在 30 nM 抑制率均 >80%，其中 H8b 的 IC₅₀ 为 3.86 nM，与 brigatinib 相当，但对野生型 EGFR 选择性指数仍保持 49 倍，证实二氯丙酰胺基团在维持高酶活的同时未牺牲选择性。 图片来源：ACS 03 RESULTS ①体外抗增殖活性 首先构建稳定表达 EGFR L858R/T790M/C797S 的 H1975-M3 细胞株，并用 MTT 法同步检测 49 个化合物对 H1975（双突变）、H1975-M3（三突变）、HCC827（19del）、A549（野生型）及 BEAS-2B 正常支气管上皮细胞的抗增殖活性。结果显示，细胞水平 IC₅₀ 与酶活数据总体一致：H1 在双突变株中 IC₅₀ 为 0.19 μM，在三突变株中为 0.66 μM，均优于奥希替尼（0.41/6.48 μM）与 brigatinib（0.83/2.37 μM）；H8b 活性更为突出，对 NCI-H1975 的 IC₅₀ 仅 0.03 μM（比 brigatinib 强 27.7 倍，比奥希替尼强 13.3 倍），对 H1975-M3 仍维持 0.57 μM（比奥希替尼强 11.4 倍，比 brigatinib 强 4.2 倍）。作者指出，H8b 的二氯丙酰胺基团增强膜通透（log P 1.906 vs H1 的 0.709），从而弥补酶活略低于 H1 的劣势；相反，H1 因强吸电子硝基导致极性表面积增大，细胞摄取受限，且对 BEAS-2B 毒性高（IC₅₀ 0.38 μM），故未进入后续机制研究。综合酶抑制、细胞活性与选择性，H8b 被选为体内外进一步验证的候选化合物。 ②化合物 H8b 与 EGFRL858R/T790M/C797S 的相互作用 通过解析 H8b 与三重突变 EGFR 的共晶结构（PDB 9JQ1）发现，H8b 保持 brigatinib 的“U 型”构象，在铰链区与 Met793 形成两条保守氢键；其特有的二氯丙酰胺羰基额外伸向突变后的 Ser797，形成新的氢键，同时哌嗪末端氮与溶剂区的 Phe795 建立氢键，实现“双点锚定”。与 brigatinib 仅依赖铰链区单点作用相比，该模式补偿了 C797S 突变失去的范德华接触，使 H8b 在 ATP 口袋两端均被固定，降低对耐药突变的敏感性。分子对接进一步显示，H8b 的 2-氨基嘧啶骨架在 ALK、ROS 和 IGF1R 等旁路激酶中也通过氢键占据铰链，为其多靶点抑制提供结构基础。 ③H8b 的 ATP 竞争抑制活性显著强于 brigatinib 通过 LanthaScreen TR-FRET 法在 2.4–234 μM ATP 梯度下测定 H8b 与 brigatinib 对 EGFRL858R/T790M/C797S 的抑制曲线。结果显示，随 ATP 浓度升高，两药的 IC₅₀ 均右移，但 H8b 的增幅更小：在生理相关的高 ATP（93.75 μM）条件下，H8b IC₅₀ 为 7.23 nM，显著低于 brigatinib 的 14.53 nM；全局拟合 α 值均 ≫1，证实二者均为 ATP 竞争性抑制剂。作者据此指出，H8b 在胞内高 ATP 环境中能更稳定地占据 ATP 口袋，是其细胞水平活性优于 brigatinib 的关键动力学基础。 图片来源：ACS ④完整蛋白质谱分析 H8b 与 EGFR 的结合模式 通过完整蛋白 LC-MS 检测发现，当 H8b 与 EGFRL858R/T790M/C797S 孵育后，蛋白分子量保持 37 487 Da 不变，说明二氯丙酰胺弹头未能与 Ser797 形成共价加合物；而与 EGFRL858R/T790M（含 Cys797）孵育后，出现质量增加 673 Da 的主峰（实测 38 176 Da），对应蛋白与 H8b 1:1 共价结合并脱去一分子 HCl 的产物。该结果证实 H8b 对双重突变体可额外形成共价键，对三重突变体则依赖氢键等非共价作用维持高亲和，为其在两种耐药背景下的强效抑制提供了互补的分子机制。 图片来源：ACS ⑤H8b 抑制肿瘤细胞集落形成 通过 14 天克隆形成实验显示，H8b 对 NCI-H1975（双突变）和 H1975-M3（三突变）细胞均呈浓度依赖性地抑制集落生成：在 NCI-H1975 中，0.25 μM H8b 几乎完全阻止集落形成，抑制效果优于同浓度奥希替尼与 brigatinib；在 H1975-M3 中，1 μM H8b 的抑制率也明显高于 2 μM 奥希替尼和 1 μM brigatinib。作者指出，这种高效抑制反映了 H8b 在高 ATP 环境下仍保持强效 ATP 竞争抑制，同时对 Cys797 可形成共价加成、对 Ser797 则通过氢键稳固结合，从而阻断 EGFR 驱动的克隆源性存活，提示其具备防止肿瘤复发与转移的潜力。 ⑥H8b 将细胞周期阻滞于 G0/G1 期 采用 PI 染色流式细胞术检测发现，经 24 小时处理，0.25 μM H8b 即可使 NCI-H1975 细胞的 G0/G1 比例从 41.9% 升至 73.7%，显著高于 1 μM 奥希替尼（70.3%）和 1 μM brigatinib（65.2%）；在 H1975-M3 细胞中，1 μM H8b 将 G0/G1 比例提高到 67.5%，优于 5 μM 奥希替尼（60.5%）并与 2 μM brigatinib（64.5%）相当，同时伴随 S 和 G2/M 期细胞相应减少。作者据此指出，H8b 通过阻断 EGFR 下游增殖信号，有效诱导双重与三重突变 NSCLC 细胞发生 G0/G1 期阻滞，是其抑制肿瘤生长的关键细胞学机制之一。 ⑦H8b 抑制 NCI-H1975 与 H1975-M3 细胞的迁移和侵袭 通过划痕愈合和 Transwell 实验评估显示，H8b 在 0.25 μM 即可将 NCI-H1975 细胞的 24 h 迁移率降至 2.25%，显著低于 1 μM 奥希替尼（8.52%）和 brigatinib（10.24%），并使穿膜细胞数减少 85.4%；对 H1975-M3 细胞，1 μM H8b 迁移率仅 25.17%、侵袭抑制率达 89.4%，均优于 5 μM 奥希替尼和 2 μM brigatinib。作者指出，H8b 通过阻断 EGFR 及其下游 AKT/ERK/STAT3 信号，有效削弱双重和三重突变 NSCLC 细胞的迁移与侵袭能力，提示其具备抑制转移的潜在临床价值。 图片来源：ACS ⑧H8b 诱导 NCI-H1975 与 H1975-M3 细胞凋亡 采用 Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测发现，经 48 小时处理，0.25 μM H8b 即可使 NCI-H1975 细胞的早期+晚期凋亡比例从 6.6% 升至 30.4%，显著高于 1 μM 奥希替尼和 brigatinib；对 H1975-M3 细胞，1 μM H8b 诱导凋亡率达 30.4%，优于 5 μM 奥希替尼（18.8%）并与 2 μM brigatinib（29.3%）相当。作者指出，H8b 通过抑制 EGFR 及其下游存活信号，有效克服 C797S 介导的耐药，促进双重与三重突变 NSCLC 细胞发生显著凋亡，是其克服奥希替尼耐药的重要机制之一。 图片来源：ACS ⑨EGFR 相关信号通路的免疫印迹分析 用 24 小时药物处理的细胞裂解液进行 Western blot 检测，结果显示在 NCI-H1975 细胞中，0.25 μM H8b 即可几乎完全抑制 EGFR Tyr992 位点磷酸化，并同步下调 p-AKT(Ser473)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204) 与 p-STAT3(Ser727) 水平，强度优于同浓度奥希替尼和 brigatinib；在 H1975-M3 细胞中，5 μM 奥希替尼无法抑制 p-EGFR，而 1 μM H8b 仍显著降低 p-EGFR、p-AKT 和 p-ERK，尽管 p-STAT3 下降有限，但整体存活信号被大幅削弱。作者据此确认，H8b 通过持续阻断突变 EGFR 及其下游关键通路，实现对奥希替尼耐药细胞的有效杀伤。 图片来源：ACS ⑩H8b 的急性毒性研究 将 300 mg/kg 剂量单次腹腔注射于雄性昆明小鼠，连续 14 天观察未见死亡、体重增长与对照组无异，主要脏器 H&E 染色未见病理改变，提示 H8b 的腹腔 LD₅₀ > 300 mg/kg，急性毒性低且耐受性良好。 图片来源：ACS H8b 的药代动力学特征 对雄性 Balb/c 小鼠分别给予 3 mg/kg 静脉和 30 mg/kg 腹腔注射，采血至 24 h 后 LC-MS/MS 测定血浆浓度。静注组 T₁/₂ 1.70 h、AUC₀₋∞ 7 824 μg·h/L；腹腔组 Cₘₐₓ 3 815 μg/L，T₁/₂ 延长至 6.26 h，AUC 达 43 762 μg·h/L，绝对生物利用度 49.99%，显示 H8b 腹腔吸收迅速、暴露量高且消除适中，为后续体内药效实验提供了可行的给药方案。 H8b在体内抑制NCI-H1975与H1975-M3移植瘤生长 在NCI-H1975与H1975-M3裸鼠皮下移植瘤模型中，每日腹腔给予H8b（10或30 mg/kg）连续14–16天，30 mg/kg组对NCI-H1975肿瘤的生长抑制率达72.3%，对H1975-M3达71.2%，显著优于同剂量brigatinib（52.9%）并优于奥希替尼对照；10 mg/kg剂量亦分别实现55.5%和42.2%的抑瘤效果，且各组小鼠体重无异常，主要器官H&E染色未见毒性改变，表明H8b在体内兼具强效抗肿瘤活性和良好耐受性。 CONCLUSIONS C797S 突变通过取代半胱氨酸阻断奥希替尼共价结合，是三代 EGFR-TKI 获得性耐药的主要机制；本研究以 brigatinib 为起点，经多轮结构优化得到 49 种新型二氨基嘧啶衍生物，其中 H8b 对 EGFRL858R/T790M/C797S 激酶 IC₅₀ 达 3.86 nM，细胞抗增殖活性优于奥希替尼与 brigatinib，且可诱导 G0/G1 阻滞、凋亡并抑制迁移侵袭。共晶结构揭示其通过 hinge 区 Met793 和突变位点 Ser797 的“双点锚定”增强结合稳定性；体内抑瘤率超过 70%，急性毒性试验 300 mg/kg 未见明显毒副反应。作者因此认为 H8b 是一种有潜力的第四代 EGFR-TKI，为克服 C797S 介导的奥希替尼耐药提供了新的候选分子。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c02807 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓