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要说今年5月的时候，武田在其Q4财报中表示要停止开发EGFR的TCE双抗TAK-186，TAK-186本来是临床进度最快的EGFR/CD3双抗，是2021年时武田收购Maverick Therapeutics获得的管线之一，这临床都到了I/II期的关节节点，是要出数据验证结果了，怎么突然就停了…… 管线被抛弃，也意味着当时收购花的5.25亿美元基本打了水漂。 问题是，为什么？ 近期，武田开发部门的研究人员在mAbs上发表的研究揭示了其中原因，原来TAK-186是遇到了抗药抗体（Anti-Drug Antibodies, ADAs）问题。 TAK-186的设计 要说TAK-186本身，从技术路线上看起来就蛮复杂。上文提要武田是收购了Maverick Therapeutics及其COBRA技术平台，TAK-186便是基于COBRA技术平台进行的研发。 COBRA平台设计初衷让药物在到达肿瘤之前保持“关闭”状态（被遮蔽），以减少对正常组织的毒性，然后靶向肿瘤之后才会受到肿瘤微环境影响变成能同时激活T细胞和抓住肿瘤的双功能大分子。 这“一开一关”也使得TAK-186的分子结构颇为复杂，主要由两个部分串联而成：活性部分和关联部分。活性部分包含两个靶向表皮生长因子受体（EGFR）的可变重链域，以及一个靶向CD3ε的活性单链抗体片段。 关联部分则含有经过突变的无活性抗CD3域，以及一个靶向人血清白蛋白（HSA）的域，用于延长药物在体内的半衰期。 TAK-186的“条件性激活”机制依赖于肿瘤微环境中富含的基质金属蛋白酶（MMP）。 在未激活状态下，TAK-186的无活性域会与活性域相互作用，阻止T细胞的激活。一旦被肿瘤环境中的蛋白酶切割，药物就会发生结构重排，形成能够同时靶向肿瘤细胞和T细胞的功能性分子。（如下图所示） 不过又要MMP条件性切割，又要EGFR靶向，还要结构重排后形成二聚体，听起来就觉得整个过程繁琐复杂。 这不，问题来了。 在TAK-186的临床试验中，研究人员发现部分患者在多次给药后产生了针对TAK-186的ADAs。 ADAs怎么出现了 ADAs是人体免疫系统对外源性治疗蛋白质产生的免疫反应。当这些外来的蛋白质进入体内时，免疫系统会将其识别为“入侵者”，并产生特异性抗体来中和或清除它们。 按理说传统的CD3双抗通常采用与人类IgG抗体非常相似的结构，所以免疫系统不会将容易将其清除，但是这里的TAK-186偏偏还不同，这TAK-186用了好几段驼源VHH，VHH是有稳定等优点不假，但是估摸着最初就没想到ADA这事。 为了深入了解这些ADAs的特性和产生机制，研究人员采用了一系列方法，包括域特异性分析（将TAK-186分解成不同功能域片段）、线性肽扫描和生物信息学B细胞表位预测，去确定患者体内的ADA主要攻击哪些功能域。 研究人员发现，不同患者在治疗过程中ADAs的靶点偏好存在显著差异，并且这种偏好会随时间发生变化。例如，在某些患者中，ADAs最初会同时针对多个功能域，但随着治疗的进行，逐渐转变为主要针对HSA结合域。 HSA结合域的本意是用来提高半衰期的，是广泛而常见的优秀策略，虽然是VHH，但经过了人源化，但现在出了这问题，说明尽管该域已经过人源化处理，但仍然可能引发较强的免疫反应。 本意是好的，执行坏了。本来是用来延长药物寿命的硬件，现在成了免疫系统攻击的目标。 更具体的定位则表明，所有患者都表现出了，对代表CDR1-框架区域2（FR2）连接区的肽8的强烈反应。此外，肽6（FR1-CDR1连接区）也被大多数患者所识别。 这一发现对于以后的药物设计有着重要启示作用。 除了实验方法外，研究人员还利用生物信息学工具进行了B细胞表位预测。通过序列依赖和结构依赖的方法，研究人员预测了HSA结合域中可能的B细胞表位分布。 尽管不同预测方法的结果存在一定差异，但它们都指向了CDR1和CDR2区域作为高风险表位区。这与线性肽扫描的结果部分一致，进一步验证了这些区域在TAK-186免疫原性中的重要性。 总结 总的来说，TAK-186复杂的结构让其很多部位都能成为ADA的靶点，从早期开始，不同患者甚至同一患者在不同时间点的ADA反应都可能不同。 即便是HSA这种辅助性的功能域，就算是人源化了那又如何？在免疫系统眼里，就是容不了小小的沙子。需要在药物设计阶段就认真评估其免疫风险。 希望研究人员的这些发现有助于改进这类特殊抗体的设计并有助于未来相关领域的开发。 参考来源： Sun, R., Ronxhi, J., Qian, M. G., Zha, Z., Li, B., & Zhang, X. (2025). Heterogeneous and evolving epitope landscape of clinical anti-drug antibodies against multidomain biotherapeutic: a case study of TAK-186. mAbs, 17(1). https://doi.org/10.1080/19420862.2025.2587584

在生物制药领域，治疗性蛋白（Therapeutic Proteins, TPs）因其高效性和特异性而受到广泛青睐。然而，这类药物在临床开发过程中常常面临一个重要的挑战——抗药物抗体（Anti-Drug Antibodies, ADAs）的产生。ADAs可能引发一系列复杂的免疫反应，不仅降低药物的疗效，还可能改变药物的暴露量、药代动力学和药效学特性，甚至诱发免疫相关不良事件。因此，对ADAs的免疫原性风险进行深入分析，对于优化治疗性蛋白的设计和临床应用具有重要意义。在众多治疗性蛋白中，多结构域生物治疗药物（Multidomain Biotherapeutics, MDBs）因其复杂的结构和多样的功能而备受关注。MDBs通常由两个或多个功能结构域组成，能够实现更精确的靶向治疗效果。然而，这种复杂性也带来了额外的免疫原性风险，包括新增的结构域表位、抗原扩散效应以及免疫复合物的形成。由于每个结构域在药物作用机制中承担不同的功能，不同结构域特异性的ADAs可能会对药物的疗效和安全性产生不同的影响。此外，MDBs中多个靶点结合区域的存在，也增加了其与ADAs形成大分子免疫复合物的可能性，这可能导致药物暴露量的减少和毒性风险的上升。因此，为了更全面地评估MDBs的免疫原性风险，需要采用更为精细的分析方法，特别是针对ADAs表位的解析。传统的多层级ADA检测和中和抗体检测虽然能够提供关于药物免疫原性的初步信息，但它们无法揭示更深层次的表位特异性信息。在本研究中，我们采用了一种综合性的策略，通过结构域特异性分析、线性肽扫描和生物信息学B细胞表位预测，对TAK-186这一多结构域T细胞激活剂（T Cell Engager, TCE）的临床ADA表位景观进行了深入分析。TAK-186是一种95 kDa的多结构域生物治疗药物，属于条件性双特异性导向激活（Conditional Bispecific Redirected Activation, COBRA）TCE类别。它由两个主要结构域组成：活性结构域和关联结构域。活性结构域包含两个针对表皮生长因子受体（EGFR）的VHH结构域（a1和a2）以及一个针对CD3ε的活性scFv结构域（b和c）。关联结构域则包括一个失活的anti-CD3 scFv结构域（d和e）以及一个针对人血清白蛋白（HSA）的VHH结构域（f），后者用于延长药物的半衰期。TAK-186的激活依赖于肿瘤微环境中特定的蛋白酶（如MMP2/9）对分子结构的切割。在未被切割的情况下，TAK-186的结构域之间通过短的连接肽相互作用，阻止其与CD3的结合，从而避免非特异性T细胞激活。一旦被切割，结构域之间的连接被破坏，活性结构域能够形成具有CD3结合能力的二聚体，从而特异性地靶向EGFR表达的肿瘤细胞。然而，由于TAK-186的三维结构具有高度的动态性和灵活性，目前尚无法完全确定其完整的构象。因此，本研究假设其结构域之间的相互作用模式，以进一步解析其免疫原性特征。在临床研究中，TAK-186被用于一项开放标签的I/II期试验（NCT04844073），结果显示部分患者在接受多次药物治疗后出现了治疗诱导的抗TAK-186抗体。然而，这些抗体的表位特异性尚未完全阐明。因此，本研究引入了一种综合性的表位分析方法，通过结构域竞争实验和肽扫描实验，结合生物信息学的B细胞表位预测，对TAK-186的ADA表位进行了系统性解析。该方法不仅能够识别ADA对各个结构域的相对贡献，还能揭示ADA表位在药物治疗过程中的动态变化。研究结果表明，不同患者对TAK-186的ADA表位偏好存在显著差异。例如，在患者3中，早期ADA信号对所有结构域的反应较为均匀，但在治疗后期，针对αHSA VHH的ADA信号显著增强，而针对αEGFR VHH的信号则有所下降。类似的趋势也出现在患者5中，其中αHSA VHH成为ADA的主要靶点。此外，患者1和4中，针对αCD3 scFv的ADA信号呈现逐渐上升的趋势。这些结果提示，尽管TAK-186的结构域之间存在一定的功能重叠，但不同结构域对免疫系统的激活潜力存在显著差异。因此，了解这些差异对于优化药物设计和减少免疫原性风险至关重要。为了进一步揭示αHSA VHH结构域的表位分布，我们进行了线性肽扫描实验。该实验基于TAK-186的氨基酸序列，合成了一系列15-mer的肽片段，并通过免疫分析检测这些肽片段是否能够被患者样本中的ADA识别。结果显示，几乎所有患者都对某个特定的肽（编号为8）产生了显著的ADA反应，该肽对应于CDR1与框架区2（FR2）的连接区域。此外，肽6（FR1-CDR1连接区域）也被广泛识别。值得注意的是，尽管部分患者对αHSA VHH的ADA信号具有显著变化，但其表位分布的稳定性提示，某些区域可能具有更强的免疫优势性。除了实验方法，我们还采用了一系列计算工具对TAK-186的B细胞表位进行了预测。BepiPred 3.0和SEMA 1D等序列分析工具能够基于氨基酸序列预测线性表位，而DiscoTope 3.0、SEMA 3D、ElliPro和GraphBepi等结构分析工具则能够结合三维结构信息进行更精确的预测。结果显示，CDR1、CDR2、CDR3以及FR3等区域被多个预测工具识别为潜在的高风险表位。这些结果与实验数据部分吻合，但同时也揭示了不同预测方法之间的差异。因此，为了提高预测的准确性，未来可能需要结合多种方法，并利用更先进的结构预测技术，如ESMFold，以获得更精确的三维结构信息。本研究还探讨了ADA表位的进化趋势。随着治疗的进行，部分患者的ADA表位偏好从多个结构域逐渐向αHSA VHH集中，这可能反映了免疫系统对特定抗原区域的识别和记忆能力。这种现象在病毒感染中较为常见，但在治疗性蛋白中尚未得到充分研究。因此，我们需要进一步探索免疫系统如何识别和响应不同结构域，以及这些识别过程如何影响药物的疗效和安全性。此外，研究还强调了个体差异在免疫原性评估中的重要性。患者的HLA类型、免疫状态以及药物的结构和给药方式都可能影响ADA的形成和表位特异性。因此，为了更全面地理解免疫原性风险，未来的研究需要结合更多的患者样本和免疫遗传学数据，以揭示个体间和个体内的差异。总的来说，本研究通过结构域特异性分析、肽扫描实验和计算预测方法，对TAK-186的ADA表位进行了系统性解析。这些发现不仅有助于理解该药物的免疫原性风险，也为未来多结构域生物治疗药物的设计和开发提供了重要的参考。尽管目前的分析仍存在一定的局限性，例如样本数量不足和部分方法的预测准确性有待提高，但这些结果表明，采用综合性的表位分析策略对于评估和优化生物治疗药物的免疫安全性具有重要的价值。未来的研究应进一步探索更先进的技术手段，如高密度肽阵列和冷冻电镜，以提高表位分析的精度和可靠性。