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靶向蛋白降解（TPD）是利用细胞蛋白酶体与溶酶体途径诱导人类疾病靶点蛋白降解的技术，其主要应用场景之一在于开发靶向先前认为不可成药的靶点的药物。目前TPD技术的进展主要集中于肿瘤靶点上，研究人员正试图把这项技术拓展到其他治疗领域。由于β淀粉样蛋白、Tau、α-连核素等错误折叠的蛋白聚合体被认为是导致神经退行性疾病（NDD）的主要原因之一，目前NDD领域的研究策略之一是利用TPD技术开发有效的疾病修饰疗法（有效减少复发、减轻疾病负担的治疗方式）。包括蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）、点击化学形成的蛋白水解靶向嵌合体（CLIPTAC）、特异性非基因的基于IAP的蛋白清除剂（SNIPER）、疏水标签、分子胶在内的TPD技术都具有降解NDD病理学标志的潜力。各类TPD技术（来源：Ageing Research Reviews）靶向NDD的TPD技术研发进展过去20年间，TPD技术的进展加速了对各种NDD的研究。进入临床试验的TPD药物革新了NDD药物开发思路。通过促进神经毒性蛋白质降解，TPD可作为神经保护剂，防止疾病模型中蛋白聚合物的形成。这些技术在NDD领域初步显示了治疗潜力，下面将对各种TPD技术在NDD领域的进展进行介绍。部分靶向NDD的TPD药物（来源：Ageing Research Reviews）1.蛋白水解靶向嵌合体PROTAC穿过血脑屏障（BBB）、方便给药（口服、静脉注射、皮下注射和鞘内注射）的潜力吸引了很多制药企业的关注。行业先驱Arvinas已经开始探索利用PROTAC技术降解AD和帕金森病（PD）中的病理蛋白（Tau蛋白和α-同核蛋白）。制药巨头辉瑞（Pfizer）、基因泰克（Genentech）正与Arvinas展开合作，研究PROTAC在NDD领域的应用。Arvinas在神经疾病领域布局的产品管线（来源：Arvinas官网）2016年，首个研究证明可以通过PROTAC技术招募VHL E3连接酶消除Tau蛋白活性。随后又开发了E3连接酶分别为Keap1、CRBN、VHL的Tau-Keap1-CPP、QC-01–175和C004019，都可以在AD模型动物中靶向降解Tau蛋白。TH006通过增加Tau蛋白多聚泛素化来诱导细胞内Tau降解。TH006可诱导Tau水平降解，可防止Aβ引起的细胞毒性（来源：Cell Chemical Biology）部分可降解Tau蛋白的PROTAC结构（来源：Ageing Research Reviews）小分子PROTAC还可介导神经保护蛋白与毒性蛋白（如转甲状腺素可抑制β-淀粉样蛋白形成）之间的正性交互作用，组织其寡聚化及随后的聚集。R．B．Kargbo等开发了靶向Tau蛋白和α-同核蛋白的小分子PROTAC。基于CRBN和VHL E3连接酶，配以不同长度的连接基团开发的PROTAC化合物2、3、4、5、9和11可用于降解Tau蛋白。随后，R．B．Kargbo又开发了6款PROTAC分子，包括1、4、5、7、30和34，用于降解帕金森病中的α-同核蛋白。因此，这项技术可以有效的降解此前认为“不可成药”的靶点。部分可降解α-同核蛋白的PROTAC结构（来源：Ageing Research Reviews）2.点击化学形成的蛋白水解靶向嵌合体药物的极性表面积（PSA）与细胞通透性有关。PROTAC分子PSA范围在194–211 Å2，不利于药物进入细胞。CLIPTAC是指利用两个PSA较小的细胞通透性的配体，经历环化加成反应在细胞内形成完整的PROTAC结构。需要注意的是，两个配体片段必须间隔给药，防止在细胞外过早形成PROTAC。2002年，Sharpless首次报道了点击化学生物学，目前已应用于包括Astex pharmaceuticals公司在内的产品开发。这项技术解决了PROTAC分子量太大，细胞膜通透性差的问题，两个相对分子量较低的前体药物可以顺利的通过细胞膜。目前，包括化合物91、化合物92在内的CLIPTAC已经可以降解诸如BRD4、ERK1/2的肿瘤靶点，而这项技术在NDD领域的应用仍需继续探索。PROTAC分子量太大，影响其细胞通透性、溶解度和其他药物特性；利用CLIPTAC前体在细胞内的生物正交点击化学形成完整的CLIPTAC分子（来源：ACS Central Science）3.特异性非基因的基于 IAP的蛋白清除剂SNIPER是一类由凋亡抑制蛋白（IAPs）的配体与靶蛋白的配体嵌合而成的小分子蛋白降解剂。与PROTAC不同，这类分子可以利用IAPs的E3连接酶的性质促使靶蛋白泛素化，从而使靶蛋白被蛋白酶体降解。例如，化合物1和化合物2可以降解亨廷顿病（HD）患者成纤维细胞中的mHTT。这两种化合物分别使用了2种噻唑衍生物作为靶蛋白配体，以乌苯美司类似物为细胞凋亡抑制蛋白（cIAP1，IAPs的一个类别）配体。随后，他们通过引入E3连接酶配体MV1提高了对cIAP1的亲和力，开发出活性更高的SNIPER化合物7，可以以时间和剂量依赖的方式降低HD患者成纤维细胞中的mHTT水平。目前，正在提高上述SNIPER的生物利用度，加快候选化合物进入临床的速度。而SNIPER在HD患者中体现的潜力促使研究人员进一步研究这种技术在其他由异常蛋白聚集引起的疾病[如AD、PD和肌萎缩侧索硬化症（ALS）]中的应用潜力。部分作用于NDD的SNIPER结构（来源：Ageing Research Reviews）4.疏水标签疏水标签技术（HyT）是将疏水标签 [如金刚烷或Boc3Arg（一种氨基甲酸叔丁酯保护的精氨酸）] 结合到配体上，随后诱导靶蛋白结构变化，暴露内部输水基团。卤代烷烃脱卤酶（Halo-Tag）融合蛋白技术在2008年首次被报道（推荐阅读：新型蛋白降解技术NanoTAC 来了！与PROTAC相比，有何不同？）。这种技术可以开发一端带有氯烷基，另一端带有低分子量疏水基团的HyT蛋白降解剂。这种双功能HyT可以协助Hsp70和Hsp90等分子伴侣识别靶蛋白，与Hsc70羧基末端反应蛋白（CHIP，一种新发现的具有泛素化连接酶活性的协同分子伴侣C端有U-box结构,具有E3连接酶功能）结合后，对靶蛋白泛素化后降解目标蛋白。疏水多肽的脂肪侧链一般埋在球状蛋白的内部，而亲水性氨基酸残基位于表面。即使是少量增加表面疏水性，可以使蛋白质不稳定。因此，利用疏水标签模仿蛋白错误折叠状态是降解这些蛋白的第一步。然而，这种技术具体的作用机理仍不清楚。例如，Boc3Arg不会破坏蛋白的稳定结构或诱导蛋白泛素化，而是直接通过20S蛋白酶体降解靶蛋白；而金刚烷标记的蛋白经泛素化后被26S蛋白酶体降解。HyT已经在降解某些NDD病理靶标上取得成果。Gao等分别在2017年和2019年公开了用于治疗AD和ALS的HyT，靶蛋白配体分别为靶向Tau蛋白和TAR DNA 结合蛋白43的肽段。其中，靶向Tau蛋白的HyT结构中，靶蛋白配体为YQQYQDATADEQG序列，N端与金刚烷标签相连，而另一端为序列是聚D-精氨酸的细胞穿透肽。结果表明，HyT-Tau-CPP嵌合体可以通过时间与剂量依赖的方式降低neuro2a 细胞中Tau蛋白水平。体内实验中，静脉注射这种嵌合体有效降解了AD模型小鼠内部Tau蛋白，表明这种HyT具有血脑屏障通透性。这些临床前数据表明，HyT是一种很有潜力的NDD治疗方式。部分靶向NDD的疏水标签结构（来源：Ageing Research Reviews）5. 分子胶分子胶可促进靶蛋白与E3连接酶结合，并诱导蛋白酶体水解。来那度胺（一种治疗骨髓瘤的药物）和其他免疫调节酰亚胺药物（ImiD）可与Cereblon结合，招募Cullin 4 E3 连接酶诱导底物降解，具有很高的选择性。由于这类药物无需靶蛋白上存在结合口袋，因此可靶向“难以成药”的靶点。此外，这种药物非化学计量学作用机理与降解非酶蛋白的性能使这种药物具有光明的发展前景，尤其是在抗肿瘤领域。这种药物在退行性疾病和一些严重疾病（囊性纤维化、糖尿病、炎症和各种神经疾病）也有广泛的应用前景。大脑中天然的分子胶（VAPB和PTPPIP51）被破坏，阻碍了线粒体和内质网之间的通信，诱发AD疾病。因此，合成分子胶药物可能是治疗这类疾病理想的形式。此外，此前TPD中分子胶依赖E3连接酶受体，而最近的研究表明诱导聚合（类似于蛋白分级途径异常导致的蛋白异常沉积，如淀粉样变性）可能是另一种结合E3连接酶并触发降解的方式。分子胶的另一实例是人参皂苷Rg3。TRKA是神经生长因子的细胞膜受体，二者结合后TRKA活化，可进一步与生长因子受体结合蛋白2（GRB2）结合。也就是说，人参皂苷Rg3可以协助酪氨酸激酶受体与GRB2间形成复合物TRKA-GRB2，PD模型中无需神经生长因子即可转导激活信号通路。这一现象再次证明，分子胶的神经保护作用有望作为治疗NDD的前景。神经生长因子（NGF）与TRKA配体结合域的结合导致TRKA自身磷酸化和各种信号级联的激活（来源：Nature Reviews Cancer）小结NDD药物开发的主要挑战包括聚集蛋白的致病性与药物的血脑屏障通透性。实践证明，利用激动剂或抑制剂改变蛋白功能对NDD疗效并不显著；而通过基因编辑技术沉默致病蛋白表达具有挑战性，包括递送难度、安全性与伦理挑战。通过识别错误折叠蛋白的共同特征，即富含β-折叠，TPD技术不依赖致病蛋白的固有结构或功能，可降解整个蛋白，发挥治疗疾病的功能。但是，这类药物的弊病在于违背类药五规则的较大的分子量，这可能会降低其生物利用度。尽管目前临床试验进度最快的两款PROTAC，ARV-110和ARV-471都是口服药物，更多的PROTAC分子都不符合类药五规则的要求。CLIPTAC可能是解决这一问题的一种手段，这种药物具有较低的分子量，可在脑部组装后形成完整的PROTAC分子。SNIPER可在DC50为nM数量级的水平下降解很多肿瘤和神经退行性疾病的相关蛋白，目前的研究方向是开发出具有可接受生物利用度的SNIPER分子，促进这类药物在NDD领域的临床转化。HyT模式可以实现更好的生物利用度，其分子结构中氢键供体和受体较少，分子量更低。因此，这是一种对中枢神经系统疾病极佳的药物形式。然而，在开发这类药物时，必须仔细研究其特异性。尽管分子胶的设计和鉴定非常困难，但从类药五规则的角度而言，这种技术非常适合开发成中枢神经药物。有报道指出，NDD状态下蛋白降解功能受损，这可能不利于TPD发挥治疗作用，但这一点仍存在争议。例如，有报道指出错误折叠的蛋白聚体阻碍泛素-蛋白酶体信号通路和自噬体发挥作用，而其他报道的结论与此正好相反。因此，必须仔细研究TPD在NDD疾病中的应用，针对特定的疾病情况仔细分析每种TPD技术的可能利弊。总结来说，分子胶和小分子PROTAC等TPD技术仍需进一步发展，以提高各类技术的疗效、类药性等问题。这类技术目前还有一些明显的问题需要解决，例如1）由于UPS蛋白表达的特异性及相关配体的研发情况，目前TPD适用的靶标和细胞类型有限；2）相对较大的分子量和结构复杂性导致的不良类药性特征；3）在肿瘤TPD过程中发现的，由于发挥作用需要针对几种特定的蛋白而导致的耐药性是否同样会在NDD中出现等等。参考资料：[1] Dhiraj Kumar et al. Targeted protein degraders march towards the clinic for neurodegenerative diseases. Ageing Research Reviews. 2022.[2] 常艳宇 et al. 重视中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病的神经保护治疗. 中国神经免疫学和神经病学杂志. 2017.[3] 吉钰 et al. 小分子蛋白降解剂SNIPERs的研究进展. 广东化工. 2020.[4] 张志清 et al. 协同伴侣分子CHIP的E3连接酶活性及其生物学意义. 细胞生物学杂志. 2008.