Anti PD-1 antibody(Chulalongkorn University)

撰文丨王聪 编辑丨王多鱼 排版丨水成文 在营养物质匮乏的情况下，肿瘤细胞通过巨胞饮作用（Macropinocytosis）维持其生长。然而，癌症巨胞饮作用在免疫逃逸中的代谢调节及其对免疫治疗的影响仍不清楚。 2025 年 8 月 14 日，曹雪涛院士团队（王羽佳为第一作者）在 Immunity 期刊发表了题为：Inhibition of tumor cell macropinocytosis driver DHODH reverses immunosuppression and overcomes anti-PD1 resistance 的研究论文。 该研究揭示了二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）促进肿瘤细胞的巨胞饮作用（Macropinocytosis）并促进肿瘤免疫逃逸的新机制，并进一步发现，靶向抑制 DHODH 可显著提高肿瘤细胞的免疫原性以及抗 PD-1 抗体的治疗效果。 在这项最新研究中，研究团队通过代谢化合物库和全基因组 CRISPR-Cas9 筛选，发现了二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）是肿瘤细胞巨胞饮作用（Macropinocytosis）的关键驱动因子。 DHODH 通过维持巨胞饮作用的介质神经纤毛蛋白-1（NRP1）的 O-GlcNAc糖基化修饰，并维持其膜定位，从而介导肿瘤细胞的巨胞饮作用。此外，由 DHODH-NRP1 信号轴驱动的巨胞饮作用增加了细胞内赖氨酸和色氨酸的含量，这促进了转录因子 II 类转录激活因子（CIITA）的戊二酰化修饰，从而抑制了癌细胞的主要组织相容性复合体 II 类（MHC II）的表达。 通过药理学抑制或基因敲除肿瘤细胞表达的二氢乳清酸脱氢酶（DHODH），可显著促进体内免疫细胞的浸润，并激活抗肿瘤免疫反应，从而克服抗 PD-1 治疗的耐药性。 研究团队进一步发现，在人类乳腺癌和肺癌组织中，二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）和神经纤毛蛋白-1（NRP1）的高表达预示着患者的预后不良。 该研究的核心发现： 高通量筛选发现，二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）是癌症巨胞饮作用所必需的； DHODH 维持 NRP1 的 O-GlcNAc 糖基化修饰和膜定位以促进巨胞饮作用； 巨胞饮作用通过增加 CIITA 的戊二酰化修饰来抑制 MHC II 类分子的表达，从而促进免疫逃逸； 抑制癌症 DHODH 可激活免疫反应并逆转抗 PD-1 治疗的耐药性。 总的来说，这项研究表明，靶向二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）来抑制肿瘤细胞的巨胞饮作用，是逆转免疫抑制、改善癌症免疫疗法的一种潜在方法。 论文链接： https://www.cell.com/immunity/abstract/S1074-7613(25)00322-X 设置星标，不错过精彩推文 开放转载 欢迎转发到朋友圈和微信群  微信加群  为促进前沿研究的传播和交流，我们组建了多个专业交流群，长按下方二维码，即可添加小编微信进群，由于申请人数较多，添加微信时请备注：学校/专业/姓名，如果是PI/教授，还请注明。 点在看，传递你的品味

该研究明确 UL16 结合蛋白 2（ULBP2）为胃癌潜在治疗靶点，揭示其通过激活转化生长因子 -β（TGF-β）信号通路促进癌相关成纤维细胞（CAFs）活化及肿瘤进展的机制。 该研究聚焦胃癌治疗难题，针对其致密基质微环境导致的治疗 resistance 问题，发现 ULBP2 通过激活 TGF-β 信号通路促进癌相关成纤维细胞活化，加剧肿瘤进展。研究者开发的 ULBP2 CAR-T 细胞，在体外可有效清除胃癌细胞系及患者来源类器官，体内在细胞系衍生异种移植和患者来源异种移植模型中，单独或联合抗 PD-1 抗体均显著抑制肿瘤生长、延长生存期，还能减少基质沉积、促进 T 细胞浸润。这项工作为胃癌免疫治疗提供了新靶点与联合策略，对实体瘤 CAR-T 疗法发展具有重要参考价值。   技术路线图   科学背景与研究现状 胃癌（Gastric Cancer, GC）作为全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病，在肿瘤领域占据着极为重要的地位。从全球疾病负担角度来看，其发病率位居所有恶性肿瘤的第五位 ，每年新增病例超百万；而死亡率更是高居第三位，成为导致癌症相关死亡的主要原因之一 。在地域分布上，胃癌呈现出显著的不均衡性，东亚地区堪称胃癌的高发地带，以中国为例，全球近 44% 的胃癌新发病例集中于此 。如此高的发病率与死亡率，使得胃癌的防治成为医学领域亟待攻克的难题。​ 深入剖析胃癌的发病机制，是探寻有效防治策略的关键所在。已知幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）慢性感染是引发胃癌的主要危险因素，尤其是对于非贲门部胃癌，约 90% 的患者幽门螺杆菌血清学检测呈阳性 。此外，不良的生活习惯，诸如过度饮酒、吸烟，以及长期摄入高盐、含大量防腐剂的食物等，均在胃癌的发生发展进程中扮演着推波助澜的角色 。在分子机制层面，肿瘤的形成与演进涉及多个复杂环节，其中肿瘤突变负荷增加、免疫逃逸现象以及表观遗传修饰改变等，都与胃癌的发生发展密切相关 。比如，DNA、RNA 以及蛋白质层面的甲基化修饰，作为常见的表观遗传修饰方式，在胃癌的发生发展中发挥着重要作用 。然而，尽管目前对胃癌发病机制有了一定程度的认识，但距离全面清晰地阐明仍有很长的路要走，诸多细节与潜在机制仍有待深入挖掘。​ 胃癌的临床诊疗现状同样面临着诸多严峻挑战。由于胃癌早期症状隐匿，缺乏特异性表现，多数患者确诊时病情已进展至中晚期。以我国为例，高达 70% 的患者在确诊时已处于进展期 。这一现状极大地限制了治疗手段的选择与疗效。在传统治疗方案方面，以铂类药物为代表的一线治疗方案，对于晚期胃癌的疗效极为有限，且往往伴随着显著的副作用，极大地降低了患者的生活质量 。即便近年来免疫治疗如程序性死亡受体 1（Programmed Death Receptor 1, PD-1）抑制剂联合化疗等方案的出现，在一定程度上改善了部分患者的预后，但整体效果仍不尽人意。例如，PD-1 抑制剂联合化疗的方案，患者的总生存期（Overall Survival, OS）仅为 12.9 个月 ，且免疫治疗的响应率有限，并非所有患者都能从中获益 。在围手术期治疗领域，虽然新辅助化疗联合免疫治疗在部分 Ⅱ 期研究中展现出一定的缩瘤降期效果，但在 Ⅲ 期临床研究中，如 KEYNOTE-585 研究，未能在全人群中将围手术期病理缓解转化为长期生存获益 。这一系列问题充分表明，当前胃癌的治疗手段远未达到理想状态，亟待创新治疗靶点与策略的出现。​ 在这样的背景下，针对胃癌的深入研究显得尤为必要且意义重大。一方面，深入探究胃癌发生发展的分子机制，有望挖掘出全新的治疗靶点，为开发更具针对性、更有效的治疗手段奠定基础 。另一方面，优化现有治疗方案，精准筛选出能够从不同治疗手段中获益的人群，提高治疗的有效性与安全性，也是当务之急 。此外，开发新的诊断技术，实现胃癌的早期精准诊断，对于改善患者预后、降低死亡率具有不可估量的价值 。本研究聚焦于胃癌治疗难题，围绕致密基质微环境导致的治疗抵抗问题展开，致力于发现新的治疗靶点，开发创新治疗策略，以期为胃癌的临床治疗带来新的曙光，这对于填补当前胃癌研究空白、突破治疗瓶颈、提升患者生存质量与延长生存期，无疑具有深远的科学意义与临床应用价值。​   实验技术方法   1. 胃癌类器官（Gastric Cancer Organoids）的分离与培养 样本来源 从胃癌患者获取新鲜肿瘤组织（临床特征见表 S1），用于构建患者来源类器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）。 关键试剂 DMEM/F12 培养基（含 2 mM 谷氨酰胺、10% 胎牛血清（FBS））、0.1 mg/mL 胶原酶 IV、100 μm 细胞筛、Matrigel（R&D, BME001-05）、类器官专用培养基（BioGenous, K2179-GC）。 详细步骤 肿瘤组织用含 2 mM 谷氨酰胺和 10% FBS 的 DMEM/F12 洗涤后，用剪刀剪碎为小块； 加入 0.1 mg/mL 胶原酶 IV，37°C 恒温消化 30 分钟，期间轻柔震荡； 加入等量洗涤培养基终止消化，通过 100 μm 细胞筛过滤，收集筛上的细胞团； 300 g 离心 5 分钟，弃上清，细胞团重悬于 50% Matrigel 与 50% 类器官培养基的混合液中； 以 50 μL 液滴形式接种到预热的 24 孔板中央，37°C、5% CO₂培养箱中静置 30 分钟使 Matrigel 固化； 每孔加入 0.5 mL 类器官培养基，每 3-4 天更换一次培养基，观察类器官生长状态。 2. 类器官与癌相关成纤维细胞（CAFs）的共培养 目的 模拟肿瘤微环境中类器官与 CAFs 的相互作用，研究 ULBP2 对 CAF 活化的影响。 关键试剂 预冷磷酸盐缓冲液（PBS）、胰酶、共培养培养基、Matrigel。 详细步骤 类器官从 Matrigel 中解离，用预冷 PBS 反复洗涤以去除残留基质，计数后重悬于共培养培养基； 贴壁培养的 CAFs 用胰酶消化，离心后重悬于共培养培养基并计数； 按比例混合类器官与 CAFs，加入 Matrigel 和共培养培养基，制成 50 μL 液滴接种到 24 孔板； 37°C、5% CO₂下固化 30 分钟，加入 0.5 mL 共培养培养基，每 2-3 天换液； 共培养 6 天后，收集培养基、类器官及 CAFs，用于后续检测（如 α-SMA 免疫荧光染色、细胞因子检测等）。 3. 类器官的检测方法 形态学观察 通过倒置显微镜观察类器官的大小、形态及增殖状态，记录生长动力学。 免疫荧光染色 固定类器官后，用抗 Ki-67（增殖标志物）、抗 ULBP2 抗体孵育，荧光二抗显色，DAPI 染核，通过共聚焦显微镜观察蛋白表达与定位。 细胞毒性实验 将 ULBP2 CAR-T 细胞与类器官按不同效靶比（E:T）共培养，通过 LDH 释放法检测类器官杀伤率，计算 CAR-T 细胞的特异性杀伤能力。 二、CAR-T 细胞制备与功能检测技术 1. 抗 ULBP2 单克隆抗体（mAb）的制备 免疫方案 6 周龄 C57BL/6 小鼠经皮下多点注射 1×10⁶稳定表达 ULBP2 的 HEK-293T 细胞，共免疫 3 次；末次免疫后 5 天，用 2×10⁶相同细胞加强免疫。 抗体生产 采用 Microfluid-based Antibody Tech（MBAT）技术，通过脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤，筛选特异性识别 ULBP2 的单克隆抗体。 2. ULBP2 CAR 的构建与慢病毒生产 CAR 结构 第二代 CAR，包含抗 ULBP2 单链可变片段（scFv）、人 CD8 铰链区和跨膜区、4-1BB 共刺激域、CD3ζ 信号域（图 5A）。 慢病毒生产 关键试剂：HEK-293T 细胞、Lenti-CAR 质粒、psPAX2（包装质粒）、pMD2G（包膜质粒）、Lipofectamine 2000、0.45 μm 滤膜。 步骤：HEK-293T 细胞接种于 10 cm 培养皿，18 小时后按比例共转染 CAR 质粒、psPAX2 和 pMD2G；6 小时后换液，60 小时后收集上清，1000×g 离心 10 分钟去除细胞碎片，0.45 μm 滤膜过滤，浓缩病毒液备用。 3. ULBP2 CAR-T 细胞的制备与功能验证 T 细胞分离 从人外周血单个核细胞（PBMCs）中用 EasySep Human T Cell Isolation Kit（STEMCELL, 17951）富集 CD3⁺ T 细胞。 活化与转导 T 细胞用 CD3/CD28 磁珠（Gibco, 11131D）以 1:2 比例活化，加入 10 ng/mL IL-2；24 小时后加入慢病毒液，32°C、1000×g 离心 90 分钟转导，10 小时后换液。 功能检测 杀伤实验：LDH 法检测 CAR-T 细胞对 ULBP2⁺胃癌细胞系（如 MKN-45）及类器官的杀伤效率（图 5D、G）。 细胞因子检测：ELISA 法检测共培养上清中 IFN-γ 和颗粒酶 B 的浓度，评估 CAR-T 细胞的活化程度（图 5E）。 三、动物模型构建技术 1. 细胞系衍生异种移植（CDX）模型 细胞准备 MKN-45 细胞稳定表达 ULBP2 和萤火虫荧光素酶（MKN-45-ULBP2-T2A-Luc），调整浓度为 3×10⁶ cells/100 μL。 接种与处理 6 周龄 NSG 小鼠右侧皮下注射 100 μL 细胞悬液（含 50% Matrigel）；待肿瘤体积达 90 mm³ 时，尾静脉注射 6×10⁶ ULBP2 CAR-T 细胞，联合组每 5 天腹腔注射 10 mg/kg 抗 PD-1 抗体。 监测 通过生物发光成像监测肿瘤生长，定期测量肿瘤体积和小鼠体重，记录生存期（图 6B-D）。 2. 患者来源异种移植（PDX）模型 组织接种 新鲜胃癌组织切成 10 mm³ 小块，皮下接种到 6 周龄 NSG 小鼠，进行 serial transplantation 至第三代（P3）。 治疗与检测 P3 代小鼠肿瘤达 90 mm³ 时，按 CDX 模型方案处理；终点时收集肿瘤组织，进行 HE 染色、Ki-67 免疫组化及 CD8⁺ T 细胞浸润检测（图 7E-G）。 四、分子与细胞生物学检测技术 1. 基因编辑技术（CRISPR/Cas9） 目的 敲除胃癌细胞系（如 SNU-216、MKN-45）中的 ULBP2 基因，研究其功能。 步骤 设计 ULBP2 特异性 gRNA（序列见表 S2），构建 pLentiCRISPR-V2 载体；转染胃癌细胞，嘌呤霉素筛选稳定敲除细胞系，通过流式细胞术和 Western blot 验证敲除效率（图 2A）。 2. 转录组与通路分析 RNA 测序 提取 ULBP2 敲除与野生型 MKN-45 细胞的总 RNA，进行转录组测序，筛选差异表达基因（DEGs）。 通路富集 利用 GO 和 KEGG 数据库对 DEGs 进行富集分析，发现 TGF-β 信号通路和 ECM - 受体相互作用是主要受影响的通路（图 3B、C）。 3. 免疫组织化学（IHC）与组织染色 IHC 检测 肿瘤组织石蜡切片脱蜡后，用抗 ULBP2、Ki-67、CD8 抗体孵育，DAB 显色，苏木素复染；通过 H-score（染色强度 × 阳性细胞比例）定量蛋白表达（图 1G、7F）。 基质染色 Masson 三色染色和 Sirius 红染色检测肿瘤组织中胶原的沉积量，评估基质致密程度（图 1I、7H）。 科普说明 类器官 一种在体外由干细胞或肿瘤细胞培养形成的 3D 结构，具有与来源器官相似的组织学特征和功能，能更好地模拟体内微环境，是研究肿瘤生物学和药物筛选的理想模型。 CAR-T 细胞 通过基因工程改造的 T 细胞，表达能特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR），可精准杀伤肿瘤细胞，目前在血液肿瘤中疗效显著，本研究探索其在实体瘤（胃癌）中的应用。 PDX 模型 将患者肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内，保留了原肿瘤的异质性和微环境特征，是评估新疗法临床转化潜力的 “金标准” 模型。 关键结果图表 该研究针对胃癌（GC）治疗中存在的致密基质微环境、缺乏有效治疗靶点及 CAR-T 细胞疗法在实体瘤中疗效有限等问题展开，提出猜想：ULBP2 可能通过激活 TGF-β 信号通路促进癌相关成纤维细胞（CAFs）活化，参与胃癌进展，而靶向 ULBP2 的 CAR-T 细胞或许能有效抑制胃癌，联合抗 PD-1 抗体可增强疗效。 为验证上述猜想，研究者首先通过 mRNA 芯片和单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析，对比 16 例胃癌患者肿瘤与邻近正常组织的差异表达基因，结合 ECM 相关基因和免疫相关基因筛选，发现 ULBP2 在胃癌中高表达且与 ECM 通路相关（图 1A、B）。随后，通过 Western blot、免疫组织化学（IHC）等实验，证实 ULBP2 在胃癌组织中 mRNA 和蛋白水平均显著升高，且高表达与更差的总生存期（OS）及胶原沉积正相关（图 1E-J）。为探究 ULBP2 的功能，研究者利用 CRISPR/Cas9 技术在 SNU-216 和 MKN-45 细胞中敲除 ULBP2，发现其显著降低细胞增殖、侵袭和迁移能力，诱导凋亡；而过表达 ULBP2 则促进 AGS 和 HGC-27 细胞的恶性表型，在类器官模型中也观察到类似结果（图 2B-E），动物实验中 ULBP2 敲除的 MKN-45 细胞在细胞系衍生异种移植（CDX）模型中生长更慢（图 2F-G）。 进一步探究机制时，转录组分析显示 ULBP2 敲除显著影响 TGF-β 信号通路和 ECM - 受体相互作用（图 3B、C），qRT-PCR 和 Western blot 证实 ULBP2 敲除降低 TGF-β1 mRNA 及蛋白水平，减少 SMAD2 磷酸化（图 3G-H），且影响上皮间质转化（EMT）相关分子表达。通过条件培养基和 Transwell 共培养实验，发现 ULBP2 敲除的胃癌细胞上清液显著抑制 CAF 增殖，减少 TGF-β 和胶原水平（图 4B-G），类器官与 CAF 共培养显示 ULBP2 敲除抑制 α-SMA 活化（图 4H-I），表明 ULBP2 通过 TGF-β 通路促进 CAF 活化和基质沉积。 在治疗策略方面，研究者构建了第二代 ULBP2 CAR-T 细胞（含抗 ULBP2 scFv、CD8 铰链、4-1BB 共刺激域和 CD3ζ 信号域），转导效率达 90.7%（图 5B），其能特异性识别并杀伤 ULBP2⁺胃癌细胞（MKN-45、SNU-216）及患者来源类器官，释放 IFN-γ 和颗粒酶 B（图 5D-G），且在类器官与 CAF 共培养中抑制 CAF 活化（图 5H）。动物实验中，ULBP2 CAR-T 细胞在 CDX 模型中单独或联合抗 PD-1 均显著抑制肿瘤生长，延长生存期，增加血清中 IFN-γ 和颗粒酶 B 水平，减少 T 细胞耗竭标志物（PD-1、LAG-3、TIM-3）表达（图 6B-F）；在患者来源异种移植（PDX）模型中，联合治疗显著延长生存期，增加 CD8⁺T 细胞浸润，减少基质沉积和 CAF 活化（图 7B-I），且无严重细胞因子释放综合征（CRS）。 总结与结论：该研究证实 ULBP2 在胃癌中高表达，通过激活 TGF-β 信号通路促进 CAF 活化和胶原沉积，形成致密基质微环境，促进肿瘤进展；开发的 ULBP2 CAR-T 细胞能特异性杀伤胃癌细胞和类器官，单独或联合抗 PD-1 在 CDX 和 PDX 模型中显著抑制肿瘤生长，延长生存期，为胃癌治疗提供了新靶点和联合策略。未来可进一步探索 ULBP2 CAR-T 在临床中的剂量优化、与其他疗法的联合效果，以及 ULBP2 调控 TGF-β 通路的更精细机制等问题。   特色与创新之处   该研究在胃癌免疫治疗领域展现出多方面特色与创新，具体如下： 其一，识别 ULBP2 作为胃癌新的特异性治疗靶点。研究通过 mRNA 芯片、单细胞 RNA 测序及临床样本验证，发现 ULBP2 在胃癌组织中显著高表达，而在正常组织中几乎不表达，且其高表达与患者不良预后及胶原沉积密切相关。这一发现突破了现有胃癌治疗靶点（如 CLDN18.2）的局限，为胃癌的精准靶向治疗提供了新的特异性分子，其组织表达的特异性也降低了治疗相关毒副作用的潜在风险。 其二，揭示 ULBP2 调控胃癌致密基质微环境的全新机制。研究首次证实，ULBP2 通过激活 TGF-β 信号通路，促进癌相关成纤维细胞（CAFs）活化及胶原沉积，进而形成不利于免疫细胞浸润的致密基质微环境。这一机制将 ULBP2 的 oncogenic 作用与肿瘤微环境重塑关联，深化了对胃癌进展中 “肿瘤细胞 - 基质细胞” 相互作用的理解，为通过靶向分子打破基质屏障、改善免疫治疗响应提供了理论依据。 其三，开发 ULBP2 CAR-T 细胞疗法并验证其协同抗 PD-1 的增效价值。研究构建了基于抗 ULBP2 单克隆抗体的第二代 CAR-T 细胞，该细胞能特异性识别并杀伤 ULBP2 阳性胃癌细胞及患者来源类器官，且在细胞系衍生异种移植（CDX）和患者来源异种移植（PDX）模型中，单独或与抗 PD-1 联合使用均显著抑制肿瘤生长、延长生存期。尤为重要的是，联合治疗可减少 T 细胞耗竭标志物（PD-1、LAG-3、TIM-3）的表达，增加 CD8⁺T 细胞浸润，这为实体瘤中 CAR-T 与免疫检查点抑制剂的协同应用提供了新范式。 其四，多维度模型验证提升研究的临床转化价值。研究结合胃癌细胞系、患者来源类器官、CDX 模型及 PDX 模型，从体外到体内、从标准化模型到临床相关性更高的个体化模型，系统验证了 ULBP2 的作用及 ULBP2 CAR-T 的疗效。特别是患者来源类器官和 PDX 模型的应用，最大限度保留了肿瘤的异质性和微环境特征，使研究结果更贴近临床实际，为后续临床转化奠定了坚实基础。 其五，证实 ULBP2 CAR-T 对肿瘤微环境的调节作用。不同于传统 CAR-T 仅靶向杀伤肿瘤细胞的单一机制，该研究发现 ULBP2 CAR-T 细胞还能减少基质沉积、抑制 CAF 活化，改善肿瘤微环境的免疫抑制状态。这一 “双重作用”（直接杀伤肿瘤细胞 + 调节微环境）提升了 CAR-T 在实体瘤中的治疗潜力，为解决实体瘤中 CAR-T 疗效受限的难题提供了新思路。   可以改进的地方[AI基于大数据总结，仅供参考]   该研究虽在胃癌靶向治疗领域取得重要进展，但仍存在以下不足，结合研究实际可从多方面优化完善： 其一，动物模型的免疫环境模拟有限。研究采用的 NSG 小鼠（NOD-Prkdc scid / Il2rg^em1）缺乏成熟 T、B 和 NK 细胞，虽能支持异种移植，但无法完全模拟人类免疫系统的复杂性。这导致 CAR-T 细胞在体内的存活、扩增及与宿主免疫细胞的交互作用难以真实反映临床情况，例如细胞因子释放综合征（CRS）的潜在风险可能被低估 —— 研究中虽未观察到严重 CRS，但在更接近人类免疫环境的模型中可能呈现不同结果。建议后续使用人源化小鼠模型（如 NSG-SGM3，具备功能性髓系细胞和 NK 细胞），更精准评估 CAR-T 的安全性及与内源性免疫的协同效应。 其二，ULBP2 调控 TGF-β 通路的分子机制尚未完全阐明。研究证实 ULBP2 敲除可降低 TGF-β1 表达及 SMAD2 磷酸化，但未明确 ULBP2 与 TGF-β 通路的直接分子互作（如是否通过结合 TGF-β 受体或上游调控因子发挥作用）。此外，ULBP2 作为 GPI 锚定蛋白，其胞外域是否通过旁分泌或自分泌方式影响 CAF 活化，仍缺乏直接证据。建议通过免疫共沉淀、表面等离子体共振（SPR）等技术验证 ULBP2 与 TGF-β 通路关键分子的结合，结合磷酸化蛋白组学解析下游信号级联，明确其调控的具体节点。 其三，CAR-T 细胞的体内持久性与肿瘤微环境适应能力数据不足。研究提到 CAR-T 细胞在小鼠体内有扩增，但未提供长期（如超过 4 周）的存活及功能状态跟踪。实体瘤微环境中的免疫抑制因子（如 IL-10、TGF-β）可能导致 CAR-T 细胞耗竭，而研究中仅检测了治疗后 21 天的耗竭标志物（PD-1、LAG-3 等），长期持久性数据的缺失限制了对治疗效果稳定性的评估。建议延长动物实验周期，通过流式细胞术动态监测 CAR-T 细胞的比例、表型（如 CD4/CD8 比例、记忆细胞标志物）及细胞因子分泌能力，同时检测肿瘤微环境中代谢物（如腺苷、乳酸）对 CAR-T 功能的影响。 其四，患者样本的异质性覆盖不足。研究中类器官、PDX 模型主要来自少数患者（如 PDX 模型仅提及 1 例患者样本），且未按胃癌亚型（如弥漫型、肠型）或分子分型（如 EBV 阳性、微卫星不稳定型）分层分析。胃癌的高度异质性可能导致不同亚型对 ULBP2 CAR-T 的响应存在差异，而现有数据难以支撑对不同患者群体的疗效预测。建议扩大患者样本量（至少纳入 10 例以上不同亚型患者），通过单细胞测序分析不同亚型中 ULBP2 的表达模式及与疗效的关联，明确 ULBP2 CAR-T 的适用人群。 其五，联合治疗的协同机制解析不充分。研究显示 ULBP2 CAR-T 与抗 PD-1 联合可增强疗效，但未明确协同作用的核心机制：是 CAR-T 细胞减少导致免疫抑制的 CAF，间接增强抗 PD-1 的响应；还是通过上调 CD8⁺T 细胞的效应功能，或下调肿瘤细胞 PD-L1 表达？虽检测到 CD8⁺T 细胞浸润增加和耗竭标志物减少，但缺乏对免疫检查点分子（如 PD-L1、CTLA-4）表达变化及细胞因子（如 IL-2、IFN-γ）网络的系统分析。建议通过流式细胞术检测肿瘤细胞和免疫细胞表面 PD-L1 的表达，结合 RNA 测序分析联合治疗后免疫相关通路的富集情况，明确协同作用的关键分子机制。 综上，通过优化动物模型、深化分子机制、扩大样本覆盖及解析协同机制，可进一步提升研究的临床转化价值，为胃癌精准免疫治疗提供更坚实的理论和实验依据。 该研究明确 UL16 结合蛋白 2（ULBP2）为胃癌潜在治疗靶点，揭示其通过激活转化生长因子 -β（TGF-β）信号通路促进癌相关成纤维细胞（CAFs）活化及肿瘤进展的机制。开发的 ULBP2 CAR-T 细胞能有效清除胃癌细胞和类器官，单独或联合抗 PD-1 抗体在细胞系及患者来源异种移植模型中显著抑制肿瘤生长、延长生存期，减少基质沉积并促进 T 细胞浸润。为胃癌免疫治疗提供新靶点与联合策略，对实体瘤 CAR-T 疗法发展具重要参考价值。