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胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是最具侵袭性且最常见的原发性恶性脑肿瘤。目前，手术、放疗和化疗仍是主要治疗手段。在GBM中，EGFR变异体III（EGFRvIII）是EGFR最常见的基因改变形式，可导致该蛋白持续活化。EGFRvIII约出现在30%的GBM病例中，且在正常组织中完全不存在，因此被视为理想的肿瘤特异性免疫治疗靶点。
由于EGFRvIII在健康动物中不表达，传统非临床安全性评估（如在转基因小鼠或食蟹猴中）仅能评估脱靶毒性。而对EGFRvIII/CD3双特异性分子而言，在药理学无关物种中进行毒理研究价值有限。
GBM中EGFRvIII的表达具有高度异质性，导致药物反应差异大，使得首次人体试验（FIH）剂量的选择极具挑战——既不能过低（无效），也不能过高（不安全）。对于免疫激动类分子，起始剂量通常基于最小预期生物学效应水平（MABEL），主要依据最敏感的2D体外系统数据。但这往往导致起始剂量极低，需多次剂量递增才能达到治疗窗。此外，肿瘤引起的血脑屏障（BBB）破坏具有区域异质性，部分区域BBB完整、部分破坏，进一步增加了剂量选择的复杂性。
根据ICH指南，FIH前的非临床研究通常需在药理相关动物种属中评估靶点相关及脱靶毒性。若无相关种属，则建议使用表达人源受体的转基因动物；若仍不可行，ICH S6指南允许在单一物种中开展有限毒性评估。
来看罗氏团队分享的一个案例，该案例以体外实验为核心，成功替代了传统非临床安全评估策略，成功支持了新型EGFRvIII靶向T细胞双特异性抗体EGFRvIII-TCB（也称RO7428731或RG6156）的FIH临床试验（NCT05187624）。这一以体外实验为主导的转化策略获得了欧洲、美国、加拿大和澳大利亚监管机构的批准。截至报告时，该FIH I期临床试验已对超过30名患者给予EGFRvIII-TCB治疗。
研究方法
EGFRvIII-TCB和DP47-TCB均为基于IgG的2:1双特异性抗体（两个肿瘤靶点结合域+一个CD3结合域）。AMG596 BiTE（双特异性T细胞衔接器）根据专利WO/2017/021370中的SEQID NO:160合成。
非临床研究内容总结如下表所示：
起始剂量确定策略
MABEL：基于3D模型中最敏感读出指标（肿瘤杀伤）的30%药理活性（PA30），对应人体起始剂量的Cmax。
最小药理活性剂量（mPAD）：定义为在异种移植模型中产生最小肿瘤生长抑制（TGI）所需的暴露量。
预期治疗剂量（ATD）范围：设定为脑ISF中药物浓度达到体外2D/3D模型EC90及体内TGI所需浓度的剂量区间。
结果
一、体外细胞杀伤实验
1.EGFRvIII-TCB的靶向杀伤作用
EGFRvIII-TCB在与PBMC共培养体系中，以剂量依赖方式特异性裂解表达EGFRvIII的靶细胞。
EGFRvIII表达水平影响敏感性：高表达细胞（U87MGhigh）对杀伤更敏感；低表达细胞（U87MGlow）敏感性较低。
与AMG596的效力比较，在低EGFRvIII表达细胞中，EGFRvIII-TCB与AMG596的EC50相当；但在高表达细胞中，EGFRvIII-TCB药效更优，AMG596效力明显更低。
2.GBM-BBB类器官模型中的药物渗透与定位
非靶向IgG无法穿透正常BBB类器官，说明其低通透性。但当类器官中加入U87MG-EGFRvIII肿瘤细胞后，非靶向IgG可在内部积累，表明肿瘤导致BBB通透性增加。
EGFRvIII-TCB在GBM-BBB类器官中呈剂量依赖性积累，并特异性富集于部分细胞。相比之下，非靶向对照TCB呈弥散分布。
3.肿瘤细胞杀伤的特异性与剂量效应
EGFRvIII-TCB和AMG596均诱导剂量依赖性肿瘤杀伤（图2）：0.1nM EGFRvIII-TCB即可显著降低U87MG-EGFRvIII细胞的RFP荧光信号；AMG596需要1nM才达到类似效果。
定量分析显示：EGFRvIII-TCB的平均EC50为0.016–0.03nM；AMG596为0.3nM，进一步证明EGFRvIII-TCB更高效。
二、人体剂量范围预测（基于PK/PD模型）
1.人体PK预测方法
结合体外共培养系统（人肿瘤细胞+免疫效应细胞）与体内异种移植模型，采用基于生理的药代动力学（PBPK）模型，考虑脑内局部药物浓度。系统暴露通过异速缩放法预测（假设BBB完整）。
线性PK假设基于表达人FcRn的转基因小鼠（hFcRntg32）单次给药研究。
脑内药物浓度校正
在健康大鼠中，前额叶皮层ISF中的药物浓度约为血清的1.2%；该比例用于预测BBB完整患者的有效剂量范围。
2.MABEL策略
采用最敏感读出指标——肿瘤细胞杀伤。
在3D GBM-BBB模型中设定30%药理活性（PA30）作为MABEL目标（FDA. Bispecific Antibody Development Programs Guidance for Industry. 2021）；
基于EC50=0.016nM，根据Hill等式，推算PA30≈0.007nM（即0.0013μg/mL）；
假设初始分布容积为3100mL血清，计算出起始剂量为0.004mg，可达到Cmax=0.0013μg/mL（如下表）。
该Cmax比3D模型中IL-6释放的EC50低约6倍。比人源化NSG小鼠皮下模型中产生最小TGI所需的稳态浓度（Cavg,ss）低约18倍；比人全血实验（WBA）中引发细胞因子释放的浓度低>7000倍；也远低于在表达胃泌素的HEK细胞中引起颗粒酶B和IFNγ升高的浓度。
通过AMG596临床数据验证MABEL方法可靠性
在相同3D模型中，AMG596的PA30为7ng/mL（分子量55kDa），其I期临床起始剂量（4.5μg /天）对应的Cavg,ss仅为PA30的～1/7.4。临床试验中，从4.5μg /天到1000μg /天均未报告药物相关不良反应。提示起始剂量45–150μg /天是安全的，从而增强了MABEL策略的可信度。
3.治疗剂量范围预测
最小药理活性剂量（mPAD）：预测为0.4mg，Q3W，对应小鼠模型中观察到TGI的暴露水平（0.02mg/kg）。
预期治疗剂量（ATD）范围（假设BBB完整，为疗效高壁垒场景）：预测为80–330mg Q3W，确保脑ISF中药物浓度达到高EGFRvIII表达3D模型的EC90，或低表达2D细胞系的EC90，或皮下异种移植模型中的有效浓度。
三、潜在脱靶毒性评估
1.对EGFRwt的交叉反应性评估
使用原代人肝细胞构建的肝类器官，与人PBMC共培养，检测EGFRvIII-TCB是否对表达EGFRwt的正常肝细胞产生杀伤。
结果：EGFRvIII-TCB在所有测试浓度下引起的LDH释放水平与非靶向对照TCB（DP47-TCB）相当，表明其对人肝细胞无脱靶毒性，不识别EGFRwt。
2.人正常组织交叉反应性研究
EGFRvIII-TCB在多种人正常组织切片中产生染色：预期染色在淋巴组织和部分非淋巴组织的单核白细胞膜和胞浆（因其含CD3）；非预期染色在多种上皮细胞、平滑肌、神经元、视网膜神经上皮、心肌和骨骼肌的胞浆中观察到信号。
毒理学意义评估：根据监管共识，抗体药物通常无法进入活细胞胞浆，因此胞浆结合一般被认为无显著毒理风险。
3.人质膜蛋白微阵列筛选（Retrogenix™）
EGFRvIII-TCB特异性结合两个已知靶点：EGFRvIII；CD3ε（当与CD3δ形成异源二聚体时）。
意外发现：与前胃泌素有强相互作用。该结合也被EGFRvIII-IgG阳性对照抗体检出，并通过流式细胞术验证。
无序列同源性：EGFRvIII与前胃泌素之间无氨基酸序列相似性，提示为构象依赖性交叉反应。
开展了进一步的机制验证。SPR显示，EGFRvIII-TCB可结合重组人前胃泌素。对膜锚定形式的胃泌素-71表现出双价结合（表观亲合力KD≈7.5nM）；而对EGFRvIII抗原的亲合力高达40pM，显示对真实靶点选择性远高于胃泌素。
氢氘交换质谱（HDX-MS）定位结合表位：结合区域包括氨基酸69–72（存在于除胃泌素-17外的所有分泌型胃泌素中）；氨基酸81–92（存在于所有分泌型胃泌素中）。
4.胃泌素介导的潜在T细胞杀伤风险评估
胃泌素是分泌型肽，正常情况下不表达于细胞膜表面。为评估最坏情况，使用Retrogenix构建的膜锚定胃泌素-71或前胃泌素的HEK293细胞（模拟“理论上的最不利场景”）。
结果显示：
HEK-EGFRvIII+PBMC：EGFRvIII-TCB引起显著LDH释放和Granzyme B、IFNγ、IL-2、IL-6、IL-10、TNFα等细胞因子升高。
HEK-胃泌素（膜锚定）+PBMC：无LDH释放，表明无细胞杀伤；在10μg/mL浓度下，可检测到轻度GranzymeB和IFNγ释放，但显著低于EGFRvIII阳性组。
结论：即使在人为强制胃泌素表达于细胞膜的极端条件下，EGFRvIII-TCB也未引发有效T细胞介导的杀伤。考虑到体内胃泌素几乎不可能锚定于细胞表面，该脱靶结合临床相关性极低。
5.人全血细胞因子释放实验（WBA）
EGFRvIII-TCB在人全血中诱导的细胞因子释放水平：与非靶向TCB（DP47-TCB）相当；远低于高风险阳性对照alemtuzumab。
原因：人全血中无EGFRvIII表达细胞，故无靶向激活。
额外测试：在全血中加入胃泌素-17或胃泌素-34，未增强EGFRvIII-TCB的非靶依赖性细胞因子释放，进一步排除胃泌素介导的系统性免疫激活风险。
6.对人心肌细胞的潜在毒性（hiPSC-CMs模型）
使用人诱导多能干细胞来源的搏动心肌细胞（iCell Cardiomyocytes）+PBMC共培养体系。检测指标包括自发搏动频率、细胞完整性、活力（通过阻抗和场电位监测）。
结果显示，EGFRvIII-TCB和DP47-TCB不影响心肌细胞搏动频率、完整性和活力。EGFRvIII-TCB无直接心脏毒性。
讨论
以体外新方法（NAMs）替代动物实验：EGFRvIII-TCB的非临床安全评估策略。
1.行业趋势与挑战
制药行业致力于减少或替代动物实验，推动采用新方法学（New Approach Methodologies, NAMs）。尽管体外系统在靶点药理机制研究方面已较成熟，但脱靶毒性可能影响任意分子、细胞或组织。
要完全替代动物模型，理想的体外系统需具备：血管化的多器官芯片（“人体芯片”），完整模拟器官功能，包含组织驻留免疫细胞、神经支配和封闭循环系统，整合神经、内分泌和免疫系统的复杂信号。
现状局限：当前多数体外模型仅模拟器官局部区域，缺乏关键细胞类型、神经支配和系统交互，无法完全复现体内复杂性。
2.为何适用于EGFRvIII-TCB？
抗体药物通常高度特异于人源靶点。当无药理相关动物种属（如EGFRvIII在健康动物中不表达）时，人源体外系统成为必要选择。
T细胞招募型双抗（如EGFRvIII-TCB）具有明确的毒性读出指标（如细胞因子释放、T细胞激活），便于体外评估。然而，因体外系统简化，其毒性预测风险更高，需通过严格的临床风险管理弥补，例如基于MABEL设定极低的FIH起始剂量。
3.EGFRvIII-TCB的FIH开发包获全球监管认可
非临床安全性、起始剂量及有效剂量预测完全基于体外数据，该策略已获FDA、EMA等全球多个监管机构批准。
截至目前，I期临床试验（NCT05187624）已对>30名胶质母细胞瘤（GBM）患者给药，未报告重大安全问题。
4.PK预测策略
因EGFRvIII在健康动物中不表达，无法在非人灵长类中建立可外推至人的PK/PD关系；
改用hFcRn转基因小鼠（Tg32）预测人体PK：该模型缺失鼠源FcRn，表达人FcRn，遗传背景均一（C57BL/6J），适用于预测线性清除过程下的系统暴露。
保守性假设：未考虑靶点介导的药物清除（TMDD），因此预测的是最大可能暴露量，偏安全。
5.有效剂量（ATD）范围预测：聚焦脑内局部暴露
考虑到GBM患者即使手术切除强化病灶后仍会复发，假设BBB完整是评估疗效的最高壁垒。有效剂量需确保在BBB完整条件下，脑组织间液（ISF）中药物浓度达到体外模型中的药理活性水平（如EC90）。
6.起始剂量选择：平衡安全与临床紧迫性
起始剂量定为0.004mg（无预激或阶梯递增），旨在避免传统MABEL方法导致起始剂量过低、延误治疗的问题。对GBM患者而言，所有患者均存在BBB完整的肿瘤区域，亟需快速进入有效剂量窗。
7.为何选择3D GBM-BBB模型而非传统2D模型？
3D模型更生理相关，模拟肿瘤诱导的BBB破坏；更准确预测体内药效。2D模型则显著高估抗肿瘤效应。
监管机构起初要求以2D模型作为起始剂量依据，为此团队进行了回溯性验证。使用同类药物AMG596（相同作用机制，已有临床数据）在3D模型中预测PA30。结果显示，预测浓度与AMG596 I期起始剂量对应的稳态浓度一致，且临床耐受良好，无药物相关不良反应。由此验证了3D模型的可靠性，增强监管信心。
8.监管对体外终点选择的反馈与最终决策
最初提议以3D模型中细胞因子释放的EC50作为MABEL基础。监管机构要求提供更多2D与3D模型中细胞因子上调的对比数据。团队证明两者细胞因子释放模式定性一致。
最终采纳FDA《双特异性抗体开发指南》建议：以最敏感读出指标——肿瘤细胞杀伤的PA30作为MABEL目标。该建议基于对17个CD3双抗FIH剂量的回顾分析：PA30对所有分子均安全，PA50除一个例外外也安全。最终，基于高EGFRvIII表达3D模型的PA30（0.007nM）被全球监管机构广泛接受为EGFRvIII-TCB的起始剂量依据。
9.靶向毒性（On-target Toxicity）的管理
体外模型（如GBM-BBB类器官）缺乏神经元和真实肿瘤微环境，不适合评估靶向毒性（如神经毒性、局部炎症）；
为此，临床方案中纳入：针对性神经系统监测；CRS和神经毒性管理指南。
10.当前体外模型的局限性与未来方向
（1）模型复杂性不足
多数3D模型源自iPSC，分化受培养条件影响，难以包含所有相关细胞类型（如胃类器官中缺乏G细胞），细胞表型可能不完全成熟或偏离体内状态。
（2）脱靶筛选与验证策略
细胞蛋白微阵列（如Retrogenix）可无偏倚筛查脱靶结合。建议采用分层评估策略，仅对表达靶点或脱靶蛋白的细胞/组织进行深入安全性测试。
脱靶结合必须通过功能性实验验证：优先使用原代人细胞（具生理性表达水平）；若不可得（如胃泌素G细胞），可用转染细胞或iPSC分化细胞，但需注意其表达水平可能失真，仅支持定性风险评估。
本研究中，EGFRvIII-TCB与胃泌素的弱结合：未引起HEK细胞杀伤，未增强全血细胞因子释放，组织交叉反应性研究中无对应染色，表明临床风险极低。
（3）微阵列技术的敏感性与解读
该技术基于过表达膜蛋白，可检测至微摩尔级弱相互作用。需更多功能性随访数据，以确定何种亲和力阈值构成“可靠脱靶”，值得下游验证。
11.体外模型“资格认证”（Qualification）的关键：参照化合物
使用体外系统前，必须通过阳性/阴性对照证明其可转化性。理想情况下，应有作用机制相似的临床化合物用于“校准”模型。本研究通过AMG596的已知临床数据成功“认证”了3D GBM-BBB模型。
挑战：对于全新机制药物，往往缺乏参考化合物或临床数据，使体外模型建立和监管接受更具难度。
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