Pyrimethamine

4.30知识分子The Intellectual 导读当地时间4月30日，美国国家科学院（National Academy of Sciences）公布了2025年新当选院士名单。今年共有120位院士和30位外籍院士入选，其中包括中国中医科学院青蒿素研究中心研究员屠呦呦。现年94岁的她，因发现青蒿素治疗疟疾的突破性贡献，于2015年获得诺贝尔生理学或医学奖。她还获得过国家最高科学技术奖、并被授予共和国勋章。不过，她仍未当选中国科学院或中国工程院院士。2015年诺奖揭晓后，公众对屠呦呦未能入选院士的质疑随之而来。获奖后接受《纽约时报》采访时，屠呦呦表示自己过去曾多次申请中国科学院院士，但未能成功。“卫生部长部长曾亲自推荐我当院士。但是，有许多因素在起作用。情况很复杂”。青蒿素发现于大型研究抗疟疾药物的“523任务”中，这个项目规模大、参与人员众多，关于屠呦呦能否成为这个项目成果的代表性人物，一直存在争议。饶毅与合作者曾在《中国科学》发表文章，基于原始中文论文、文件和访谈资料，他们肯定屠呦呦为“发现青蒿素的代表性人物”，在青蒿素的发现过程中起了“关键作用”，青蒿素发现是“中药的科学研究丰碑”。尽管作出如此原创性且具有全球影响的贡献，屠呦呦在很长一段时间内并没有获得国内重要奖项或是类似院士等重要荣誉头衔。诺奖之后，屠呦呦依然未能入选两院院士。年龄或许是一个限制因素。屠呦呦获奖时已84岁，而中国科学院和中国工程院对院士增选设有一定的年龄门槛。根据2014年修订的《中国科学院院士增选工作实施细则》，65周岁以上的候选人需由6名或以上院士推荐，且其中至少4人须来自候选人申请学部，推荐方为有效。2023年改革后对这一标准有所调整，但还是要求至少两位院士推荐。尽管这一规定并未将候选人年龄严格限定在65岁以下，但也为高龄候选人增选院士制造了障碍。以2023年为例，中国工程院院士增选的有效候选人中，最年长者77岁。中国科学院方面，最年长的候选人为68岁。而美国国家科学院院士的入选没有年龄限制。纵观屠呦呦的荣誉历程，国际科学界的认可始终走在国内前面。她先是在2011年、2015年先后获得拉斯克奖与诺贝尔奖，随后才在2016年，数度无缘之后终于获颁国家最高科学技术奖。如今，获得诺奖十年后，先授予这位中国科学家院士荣誉的，仍然是美国国家科学院。2009年4月21日，正在北京大学医学部读硕士学位研究生的黎润红（现任职于北京大学医学人文研究院），在饶毅和张大庆教授指导下，以青蒿素为科学史研究课题，曾在中国中医科学院中药研究所对屠呦呦进行了访谈。访谈中，屠呦呦详细回顾了青蒿素发现的过程，《知识分子》获黎润红授权刊发访谈实录。撰文 ｜ 黎润红●                  ●                   ●黎＝黎润红屠＝屠呦呦黎：请问您当时是怎么参加“523任务”的?主要做了哪些方面的工作？屠：青蒿素研究时间长、牵涉面宽，好在我们编了一本《青蒿及青蒿素类药物》，刚刚出版，现送你们三本，一本请留给饶毅和你、另外两本请转给我母校，你可回去看看，书里有比较详细的叙述，现只能概要地聊聊。我们中药所1967年没有参加“523任务”。早期，中医研究院广安门医院和针灸所搞针灸的同事们参加了。1969年，“523办公室”的领导到中医研究院，我们领导负责接待工作。“523办公室”的领导说：中央领导十分重视抗疟防治的研究工作，为解决问题，希望你们能参加此项任务。院领导当即表示，虽然处于文化大革命，中国中医研究院科研工作全部停顿，但我们不能推辞，要尽最大努力承担工作。后来就指定我为课题组长。当时就是这样一个情况。1969年2月，我先开始收集历代的文献资料、收集单秘验方，从中挑选出要研究的中药，提取后送236部队（军事医学科学院）做药效。当时，我们还没动物试验，到1970年年中，筛了百余种，包括青蒿在内，都没有理想结果。后来，236因其他任务也不再协助我们了，我们这个组也就停了。直到1971年5月广州会议以后，我们这个组经过调整和加强，才重新开展工作。1971年下半年，开始筛了一些中草药、也复筛了一些，都没有大的进展，后在《肘后方》“青蒿一握、绞汁服”的启示下，将青蒿用低沸点溶剂提取，得到“醚中干”［1］（乙醚提取的中性部分）的化学有效部位，当年10月，鼠疟试验全部转阴，年底猴疟也得相同效果；1972年8、9月在海南和北京用青蒿“醚中干”治疗30例间日疟、恶性疟患者，获满意效果。1972年11月，在“523”的全国性会议上做了汇报。与此同时，我们对“醚中干”进行活性成分分离，1972年11月从中获得几个结晶，12月初，鼠疟确认其Ⅱ号结晶是活性成分，曾称“青蒿素Ⅱ”，后定名为“青蒿素”，应用至今。几十毫克剂量就使疟原虫全部转阴。1972年11月得到青蒿素后，即着手其化学结构鉴定研究。经确定其分子式分子量等，并证实其不含氮元素，又结合四大光谱数据，推定为倍半萜类化合物，属于新结构类型抗疟药。为争取时间确定其分子结构，就想找条件好的单位协作，了解到中科院上海有机所刘铸晋对倍半萜类化合物的研究有较多经验，后又了解到中科院生物物理所有先进的X线衍射，先后请他们合作研究青蒿素的结构，到1975年底，确定了青蒿素的立体构型。当然，不是什么事情都会一帆风顺的。有人说我们1973年做的青蒿素不成功，临床效果不好。1973年我们开展对青蒿素化学研究以外，还从北京产的青蒿中大量提取青蒿素。因为我们剂型室没恢复工作，所以提出来的青蒿素是拿出去外加工做的片剂。同年9月到海南疟区对恶性疟患者进行临床试用，结果5例患者，仅1例有效，效果不确切。经研究发现这些片子敲都敲不碎，片剂的崩解度有问题，又赶着将青蒿素原粉直接装胶囊，改用胶囊剂。副所长章国镇同志亲自带着胶囊赴海南昌江现场，做了几例。因为季节比较晚了，海南地区工作即将收尾，只做了3例间日疟，效果都是很好的。证明青蒿素抗疟有效。后来我院医疗队用我们提取的青蒿素继续在全国做了380多例，全部有效。附注一：1973年北京中药所提取的青蒿素II临床试验情况在进行青蒿素Ⅱ的临床试用前，由于急性动物试验的结果存在一定的问题，所内部对青蒿素Ⅱ是否可以进行临床使用产生了分歧。后经3人进行临床试服，未发现明显问题后于当年9月份赴海南开展临床试用。以下为当年的临床试验结果：“1973年9－10月，北京中药所用提取出的青蒿素在海南昌江对外地人口间日疟及恶性疟共8例进行了临床观察，其中外来人口间日疟3例。胶囊总剂量3－3.5g，平均退热时间30小时，复查3周，2例治愈，1例有效（13天原虫再现）。外来人口恶性疟5例，1例有效（原虫7万以上/mm3，片剂用药量4.5g，37小时退热，65小时原虫转阴，第6天后原虫再现）；2例因心脏出现期前收缩而停药（其中1例首次发病，原虫3万以上/mm3，服药3g后32小时退热，停药1天后原虫再现，体温升高），2例无效”。屠呦呦口述的“后来我院医疗队用我们提取的青蒿素继续在全国做了380多例，全部有效。”指的是从1975年成都会议之后，全国进行大协作对青蒿素及其各种制剂进行临床验证时，中医研究院医疗队所做的总病例数。1973年临床试验回来以后就向“523办公室”汇报了。汇报以后，1974年1月，他们就说要开一个中西医结合寻找新药的会议。这个“523办公室”当时起到组织领导作用，因为当时文化大革命全部瘫痪了，只有部队来抓，而且任务期间领导关系也有变化，成为三部一院的领导，后来参加的单位越来越多。中医中药组实际上开始重点抓的是针灸，后来才是中药，中药抗疟传统多用常山，这个常山生物碱有效是有效，但有呕吐副作用，不好用到临床去，所以曾经做过好多改造结构的衍生物。西方1820年从金鸡纳树皮中提取出奎宁，后又研发好多衍生物，如阿的平、乙胺嘧啶，伯氨喹啉，最后的王牌氯喹，都是含氮的喹啉类药物，用了一百多年，已经产生抗药性了。我去了两次海南岛现场，感染疟疾的患者40多度高烧不退，又是恶性疟，后来转为脑型疟。好多年轻同志身体挺棒的，得了疟疾40度以上高烧，两天以后嘴唇都紫了，要不给他药吃，那不就送命了。当时大家都期望搞出一个全新结构的、疗效也很好的药物，来解决氯喹抗药性问题。国外，据报道美国在华盛顿陆军研究所以改造结构为主，有一个比较好的甲氟喹，但还是喹啉类的化合物。国内来说，实际上这个项目60年代中期，就是一个军工项目，军事医学科学院已经做了不少工作。1967年成立“523办公室”，全国七大省市都来做这个项目。据报道已经筛了化合物、中草药等4万多种。我从北医毕业后正好中医研究院建院，就来了中医研究院中药研究所工作。当年毛主席提出来要西学中，所以那时候办了一个西学中班，希望有西医工作经验的参加学习。我从北医毕业后，来到中医研究院中药所，学了两年半的西学中［2］。确实，学完了之后还是很有收获的。当时一些中医老大夫从全国各地请来的，像蒲辅周［3］，他后来成为周总理的保健医生。青蒿素是一个原始性创新，因为它是一个全新的结构，而且疗效也很好。解决了抗性疟疾的治疗问题。所以大家比较重视，也是因为这个道理。但工作也不是一帆风顺的，从我的思路来说，中国有5000年的悠久历史，对医学也是比较重视的。我就开始搜集古代的书籍，地方的经验，我这有一本册子（疟疾单秘验方集）给你看，这是我69年做的。那时候我做了200多张卡片。黎：是否还有卡片?屠：你看看时间你就知道了，1月份开始做的，4月份就做出来了。你看这个第5页就是青蒿了，我编了这个本子，然后给“523办公室”送去，我说，我整理的这个，你们可以看看。七个省市嘛，我拿去了8本，一本给“523办公室”，每个地区一本，请大家来发掘。从青蒿中发掘出青蒿素牵涉到几个问题，一个品种问题，菊科蒿属是个很大的属，市场调查品种也不少，1963年和1977年的中国药典上就写了两种品种［4］。还有药用部位问题，梗没有效果。我就想到各种因素，后来就跑到门头沟药库，找头年新进的青蒿药材，经研究还真跟采收季节有关。早期采集的根本就没有青蒿素，因为植物体内根本就还没生物合成这些有效物质，只在花前叶茂时才合用。所以，后来药厂提取青蒿素都用那个季节的青蒿叶子为原料。还有一个提取方法问题。从青蒿中得到具有100％疟原虫抑制率的提取物是很关键的问题。由于其抗疟活性基团是过氧，在青蒿原药材中含有很多其他化学成分，在一些常用的水、乙醇做溶剂提取时，温度超过60℃就破坏了具有抗疟活性的过氧基团。后经我们实验，其实青蒿素本身是很稳定的，用水煮沸半小时或乙醇回流4小时，其抗疟活性稳定不变。在做青蒿素化学结构研究时，为确认羰基的存在，我们做了还原衍生物，得到双氢青蒿素。由于在青蒿素中引进了羟基，方便做更多的衍生物。通过青蒿素构效关系的研究，我们明确了过氧是抗疟活性基团，也认识到双氢青蒿素的抗疟活性更高，安全性也比较好。 经研究开发临床药效提高了10倍，剂量就可以减少到1/10，总剂量480mg就解决问题。完成双氢青蒿素研发后，中药所终于将1973年9月发现的双氢青蒿素于1992年获得新药证书。1981年WHO（世界卫生组织）来中国开会，安排我做青蒿素化学研究的报告。会议对于青蒿素是一片赞扬。后来，一位法国记者问，当时是为了战争，现在的话世界都在用青蒿素，你什么感想？我说，我很高兴，作为一个医药科技人员，工作就是要为人类健康服务的。国家鼓励原始性创新，加强原始性创新。我觉得要谈论的问题恐怕已经不是发明的问题了，就是一个原始性创新出来以后怎么办的问题。那么这个原始性创新不是说的，是要很多的艰苦的工作。要营造好的气氛，让学术不浮躁，科学和学术要实事求是。所以我们就一直在说，能不能以青蒿素做一个解剖，从里面吸取一些有意义的经验和教训。中药领域还有一个问题，有的人不太重视青蒿素，觉得单药单一成分，他们一下子就把它推到西药里去了。21世纪，现代科学是与时俱进的、不断发展的，你拿现在科学的观点、手段再来挖掘中医药的宝库，你就能发现一些更好的东西出来。我想在自己的书上提出这个观点，要大家多做些原始创新。另外，原始创新出来以后，应该有些政策出来保护它们。青蒿素出来多少年了，整体成果是大协作的产物，当年的协作单位和参与者从不同方面做出了各自的贡献。在北医就有一位赵燏黄［5］专门搞本草研究的。我们是学了本草的，有这个基础又系统学了中医药，“西学中”给了我思路，从祖先古代经验来找，经验还是很多的。77年在《科学通报》上发表了青蒿素结构，这是第一篇，我们打的报告给卫生部，经批准后发表的，马上就被CA（注：美国化学文摘）收载了。我们总共从青蒿中分离鉴定了17种化学成分，以及几个混乱品种的20来个化学成分，在81年后陆续发表。黎：这个国家发明奖的证书当时是发了6张还是只是这一张？屠：这个我就不知道了。我们也看到过网络上出现过与我们持有的不一样的国家发明奖证书，不知是什么道理。出现有关青蒿素成果的不同认识也不奇怪，但客观事实不会是多版本的。首先要认定事实，认识才能正确，不然只能浪费时间和精力做无谓的争议。我们需要向前看，国家需要大力促进科学发展，实现科教兴国。科技工作者要有责任感，要努力创新。附注二：有关国家发明奖的争议一、国家发明奖名单与鉴定会名单的差异1978年在高邮举办青蒿素鉴定会，会上确定的主要研究单位为卫生部中医研究院、山东省中西医结合研究院、云南省药物研究所、广州中医学院、四川省中药研究所、江苏省高邮县卫生局六家，其他单位为协作单位，1979年9月18日、20日、21日，国家发明奖评选委员会召开第三次会议，审定发明项目及相应的奖励等级，审查批准了十五项发明创造，并分别评定为二、三、四等发明奖。其中抗疟新药——青蒿素的制造获国家发明奖（二等）。10月15日《人民日报》第四版报道了卫生部中医研究院中药研究所、山东省中医药研究所、云南省药物研究所、中国科学院生物物理所、上海有机化学研究所，以及广州中医学院发明的抗疟新药——青蒿素的制造获得国家二等发明奖。由于对外公开报道的就是这六家，至于其他的协作单位包括之前在鉴定会上确定在主要研究单位中的四川省中药研究所、江苏省高邮县卫生局两个单位完全没有提到。在《迟到的报告》一书出版后，四川省中药研究所曾经参加过“523任务”的研究人员还给科技部成果局写过相应的文件要求“还历史于本来面目”。他们认为：“当时的评奖是不公正的，尤其是在鉴定书上他们作为第5家主研单位，为青蒿研究做了大量的工作，但是当青蒿素研究获得奖励时，四川一线的科技工作者却无一人授奖。在青蒿素获国家发明证书时，他们所的“523”科技人员均不知道，未将他们排入获奖单位并没有征求他们的意见。”［6］为什么1978年的鉴定会上提出的6家研究单位到了1979年获奖的时候变了，《迟到的报告》一书上认为：鉴定会由于是把青蒿简易制剂和青蒿素的研究两个项目作为一个大项，合并进行鉴定的，因此，青蒿素的研究部分排了4个单位；青蒿简易制剂的研究排了2个单位。后来国家科委发明奖评选委员会在评审中，认为青蒿素作为一个新药的发明，确认药物的化学结构必不可少。一个新药若不清楚其化学结构，就不可能确定为新药。因此，提出负担青蒿素化学结构研究的中国科学院生物物理研究所和中国科学院上海有机化学研究所应列入主要研究单位。四川省中药研究所和江苏省高邮县卫生局，研制的主要成果是青蒿生药片，对于青蒿素成果的研究发明，应列入主要协作单位。在当时的发明奖励条例中有规定：第十三条对发明项目如有争议，可向上级机关反映，上级机关应认真调查审理。第十四条各部门和各单位对群众的发明，应当给予鼓励，采取严肃认真和实事求是的科学态度。在贯彻执行奖励制度时，必须加强思想政治工作，提出社会主义大协作精神，反对本位主义、个人主义互不协作等不良倾向。对打击、压制发明和在发明尚弄虚作假，剽窃他人劳动成果的行为，应当批评教育，加以纠正，情节恶劣者，应给以处分，甚至依法惩办。［7］对于发明权的争议和处理：凡国家科委发明评选委员会通过的奖励项目，自公布之日起三个月内，任何人如有意义，均可向国家科委发明评选委员会办公室提出。公布三个月后如无人提出异议，即行授奖，超过三个月提出的异议，一般不予受理。凡国家科委发明评选委员会通过奖励的项目，自公布之日起三个月内，如有争议，一般由发明申报部门负责处理。为及时解决争议问题。正以任何一方，均应按照争议处理部门的要求，及时地如实的提供有关争议的补充材料和旁证文件。如在六个月内不作答复，即判为弃权，由争议处理部门裁决。［8］四川省中药研究所并没有在1979年公布结果的时候依据发明奖条例上的规定向国家科委提出意见而是到2005年才提出意见。此时国家科委并没有给出明确的解释。对此，笔者认为，这是文革后国家发明奖首次评选，在没有一个十分明确、细致的评审标准的情况下，国家发明奖评选委员会在评审时认为：作为一个新药的发明，确认药物的化学结构必不可少；一个新药若不清楚其化学结构，就不可能确定为新药。这种依据，也符合当时的历史事实。不过，无论是国家发明奖评奖委员会还是“523办公室”在1979年并未对四川和江苏这两家单位排除在获奖名单之外做出公开说明或者说并未告知他们，这说明当时在荣誉分配的问题上处理的不是很好，也从一个侧面反映了“523任务”在快要结束时的收尾工作做的不够完善。虽然后来《迟到的报告》一书中对四川省中药研究所和江苏省高邮县卫生局未能出现在获奖名单名单上做出了解释，也肯定了四川省中药研究所在“523任务”开展过程中的大量工作，但是这样的说明似乎有点晚而且权威性并不够。二、国家发明奖证书编号引发的误解我们在最初拥有的资料中发现《迟到的报告》一书与《青蒿素研究》一书中所使用的青蒿素的发明证书主要内容相同，只有其中的证书号码与排版方式略有不同，《迟到的报告》一书中编号为A00011，而《青蒿素研究》一书中的编号为A00612。为此，笔者在访谈不同的老科学家时也提到这个疑问，但是他们都不清楚这是为什么，有人说可能有真有假，也有人说是所里面弄丢了后来补发的，但是具体什么时候补发的就不知道。随着我们深入了解与资料搜集的完善，终于使该疑问有了一个比较清晰的答案。目前收集到的关于青蒿素的国家发明奖证书有几个不同编号的证书，第一个是中医研究院目前保存的编号为00011的发明证书［9］，其他为保存在其余获奖单位的证书，编号为别为A00609（山东省中医药研究院）［10］、A00610（云南省药物所）［11］、A00612（中国科学院上海有机化学研究所）［12］。这几个单位拥有的证书原件如下：由于条件所限，我们未能获得全部的证书原件，根据证书的编排判断还有两张编号不同的证书，其中之一为中国科学院生物物理所的，证书编号应该为A00611，另一张为广州中医学院的证书编号为A00613，这些证书是连号的。根据发明奖规定的奖金分配原则：集体发明（包括协作单位），所得奖金按照发明者贡献大小，合理分配。几个单位共同完成的发明，其奖金由申报部门负责进行合理分配。针对青蒿素是卫生部作为申报部门申报的，因此奖金分配也由卫生部进行。有关发明奖证书、奖章以及奖金的分配情况，有如下记载［13］：图5青蒿素发明奖奖章（屠呦呦提供）图6卫生部科技局下发青蒿素发明奖奖金分配的通知图7中医研究院中药研究所向其他单位写的通知信函根据卫生部当时的文件指明：国家科委颁发的青蒿素发明证书（见中医研究院的发明证书）、奖章（只有一份，如上图为复制件）［14］，建议由中医研究院照相复制给其他五个单位，原件由中医研究院中药研究所保存。根据中医研究院的信函以及相关单位的档案显示，当时中医研究院中药研究所将影印件给了其他单位。因此，当时虽然是六家单位为发明单位，但是拥有证书和奖章原件的只有中医研究院中药研究所一家。其实卫生部的这份通知为后来的多张证书的出现既提出的异议又为后面的争议埋下的伏笔。既然当时只有一张证书，现在为什么出现了6张，而且编号相差很多，但是后5张却是连号？为此笔者询问了原国家科委的一位对此有所了解的工作人员，据他所述：“青蒿素是1979年获得的国家发明二等奖，但是后来因为获奖单位和发明人的排名问题一直存有争议，后经较长时间的调解，达成较为一致的排名顺序（但还是有些单位和人员不服），重新打印了获奖证书。这就是二个证书的来由，应该是以第二张证书为准。”［15］其实前后的证书，内容都是一样，不同的只是证书编号和排版方式。因此，经过上述的说明，笔者认为，两种版本的4张证书以及还可能出现的两张不同编号的证书从根本上来说都是真的。根据科委工作人员所说的对排名问题一直存在争议，说明这个问题一直未得到很好的解决，就算是重新打印了获奖证书之后，很多研究人员并不知情，有关争议还是存在。注释：（上下滑动可浏览）［1］醚中干，指的是在研究植物药有效成分时用乙醚提取，先将植物中的混合成分按其极性大小粗略地分开，乙醚提取液中含有的主要是极性小的脂溶性混合物，再用不同强度的碱溶液（碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钠溶液）依次提取，将得到强度不同的酸性成分；经过碱提取的残余液可以再用酸溶液（盐酸或硫酸溶液）提取，得到碱性成分（一般是生物碱或其它碱性成分），乙醚残余液中剩下的就只有中性混合成分。这是一种经典的系统分离方法。屠呦呦在分离过程中使用的是2%的氢氧化钠溶液提取，并省略了用酸溶液提取这一步，得到的乙醚中性部分（简称“醚中干”）［2］屠呦呦与余亚纲同为中医研究院西医离职学习中医班第三期学生，学习时间为1959年10月至1962年2月。［3］蒲辅周（1888-1975），四川省梓潼县人。现代中医学家，长期从事中医临床、教学和科研工作，精于内、妇、儿科，尤擅治热病。伤寒、温病学说熔于一炉，经方、时方合宜而施。1955-1975年历任中医研究院广安门医院内科医师、内科主任，中医研究院副院长等职务。曾任全国政协第三、四届委员。［4］《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）1977 版中药青蒿的原植物为黄花蒿（Artemisia annua L.）或青蒿（ArtemisiaapiaceaHance）二种植物，在解释性状时也分为黄花蒿和青蒿两种。不过从《药典》1985版开始，中药青蒿的原植物只有黄花蒿（Artemisia annua L.）一种植物。［5］赵燏黄（1883-1960），江苏省武进县，本草学家和中国生药学先驱者。1909年毕业于日本东京药学专门学校。他毕生致力于本草学和生药学的教学和科学研究，应用现代科学方法整理本草，研究中药，考订本草药品名实，为编修中国新本草做了大量开拓性工作，在澄清中药品种混乱方面做出了贡献，并为中国培育了几代药学科技人才。先后担任过任上海国立中央研究院化学研究所研究员，北京大学医学院药学系教授，中央卫生研究院中医（祖国医学）研究所生药室顾问、中国药学会北平分会副理事长、中医研究院中药研究所研究员等职务。［6］齐尚斌、万尧徳．还历史于本来面目——青蒿素研制中鲜为人知的故事．2005-11-1［7］中华人民共和国发明奖励条例（1978年12月28日国务院发布）［8］中华人民共和国发明奖励条例（1978年12月28日国务院发布，1984年4月25日国务院修订）［9］屠呦呦提供［10］山东省中医药研究院档案处提供［11］罗泽渊提供［12］中国科学院上海有机化学研究所档案处提供［13］中国科学院档案馆．青蒿素的结构和反应．档案号D144-357［14］屠呦呦提供［15］有关获奖证书的回忆．北京大学医学史研究中心．523任务相关档案20101119[16]https://cn.nytimes.com/china/20151010/c10sino-tuyouyou/亲爱的读者们，不星标《知识分子》公众号，会错过每日科学新知！星标《知识分子》，紧跟前沿科学，一起探索科学的奥秘吧！  请戳上图卡片添加星标关注《知识分子》视频号get更多有趣、有料的科普内容END

DRUGAI 今天为大家介绍的是来自澳大利亚悉尼大学、葡萄牙里斯本INESC-ID研究所、英国维康桑格研究所团队的一篇论文。整合不同类型的生物学数据对于全面理解癌症生物学至关重要，但由于数据的异质性、复杂性和稀疏性，这一工作仍然充满挑战。为解决这个问题，作者的研究引入了一个无监督深度学习模型MOSA(Multi-Omic Synthetic Augmentation，多组学合成增强)，该模型专门设计用于整合和增强癌症依赖图谱(Dependency Map，DepMap)。通过利用正交的多组学信息，该模型成功生成了分子和表型谱，使多组学谱的数量增加了32.7%，从而为1523个癌症细胞系生成了完整的DepMap。这些人工合成增强的数据提高了统计检验效能，揭示了与药物耐药性相关的未被深入研究的机制，并完善了癌症细胞系的遗传关联性鉴定和聚类分析。通过应用SHAP进行模型解释，MOSA揭示了对以下两种任务至关重要的多组学特征1）细胞聚类2）与药物及基因依赖性相关的生物标志物鉴定。这种理解对于制定有效策略以优先考虑癌症靶点具有重要意义。 随着对癌细胞系分子和表型特征的深入研究，癌细胞系已成为最受关注的人类细胞模型之一。这些不断增长且丰富的多组学数据持续推动着癌症基因的鉴定和治疗靶点的发现。虽然基因组学一直是寻找癌症预测生物标志物的主要研究方向，但癌症依赖图谱(DepMap)联盟最近开展的功能基因筛选表明，仅有不到20%的RNA干扰癌症依赖性可以通过突变和拷贝数变异来解释。这突出表明了开发整体性机器学习模型的重要性，这类模型需要能够垂直整合正交数据集。在这种情况下，垂直整合不仅涉及基因组学，还包括其他类型的组学数据。 尽管深度学习在多组学整合方面取得了一些成功，但仍面临几个限制，其中最重要的是不同数据类型的高度异质性（例如，离散与连续分布的区别）、内在的技术局限性（例如，缺失值），以及有限的数据可用性（例如，在本研究中，仅有25.8%的癌细胞系具有全部七个组学数据集）。 无监督机器学习在多组学整合方面取得了成功，它能够捕捉不同组学之间共享的数据变化模式。这种方法揭示了与上皮-间质转化(EMT)相关的癌细胞状态，而EMT是药物耐药性和转移过程中的关键过程。基于无监督深度学习的模型可以通过重建缺失测量值和纠正实验误差来生成改进版本的输入数据集，从而增强下游分析。 虽然线性降维模型也是为类似目的而设计的，但深度生成模型在大规模多组学癌细胞模型中的应用仍然滞后。这导致了这些非线性方法在增强数据集和执行统计分析以改善癌症机制、生物标志物和药物靶点特征方面的应用存在空白。 变分自编码器(VAE)等深度学习模型为底层生物学数据提供了更复杂的公式。此外，VAE具有高度灵活的设计，可以稳健地处理数据稀疏性，并且易于扩展以整合不同的数据类型。特别是，基于VAE模型的方法在单细胞多组学整合和增强领域已经取得了显著成功。然而，这些方法通常预设存在特定的数据类型，如来自scRNA-seq和scATAC-seq的计数数据，这限制了它们在更广泛组学领域的应用。 在这项研究中，作者开发了一个多组学合成增强(MOSA) VAE模型，该模型可以整合并合成增强来自DepMap中超过1500个癌细胞系的多组学数据集。 模型部分 图 1 利用DepMap项目，作者整合了七个不同的癌细胞系数据集，包括基因组学、甲基化组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、药物反应和CRISPR-Cas9基因必需性数据（图1a）。这些数据涵盖了1523个癌细胞系，每个细胞系至少有两个可用的数据集。作者设计了针对癌细胞系多组学数据集的MOSA模型，进行了稳健的数据增强，并为生物标志物的发现提供了模型解释（图1b）。 首先，采用后期整合方法，作者为每个数据集训练了单独的编码器，以获得特定于每个组学层的潜在嵌入。这些嵌入随后被连接并进一步简化，形成了联合多组学潜在表示（图1c）。这里的潜在表示是神经网络隐藏层中学习到的抽象特征集（嵌入），它包含了输入数据的主要信息。与多组学线性降维方法MOFA和另一个基于VAE的方法MOVE相比，作者的模型在多组学潜在空间中能够更好地根据组织类型分离细胞系（图1c）。 其次，由于基因组学数据的稀疏性和定性特征，它带来了独特的挑战。为了解决这个问题，作者仅使用癌症驱动事件，并将基因组学分为拷贝数改动和突变两部分。拷贝数事件通过独立的编码器/解码器作为有序数据进行整合（类似于其他组学数据的处理方式），而突变则作为二元条件整合到每个编码器中（图1b）。这样设计的原理是：遗传背景会影响细胞特征和表型，从而调节其他组学层。条件矩阵包含了癌症驱动基因的遗传改变（包括基因融合）、细胞系的组织来源、细胞系生长速率测量值和微卫星不稳定性信息（MSI高），总共237个条件变量。这个条件矩阵进一步与学习到的多组学联合潜在空间连接，作为解码器的输入。因此，遗传背景和细胞信息对于生成潜在表示和重建每个组学数据集都至关重要。 第三，与用于单细胞数据的类似模型相比，DepMap中可用的样本数量有限且组学数据具有异质性，这给训练一个可推广的癌细胞系模型带来了重大挑战。为了降低模型复杂度，MOSA仅将变异性最大的特征作为编码器的输入，而所有特征都由解码器重建用于合成数据生成，这形成了VAE的非对称设计（图1b）。MOSA的这种独特设计使作者能够舍弃低信息量的特征，例如在所有癌细胞系中表达恒定的基因和非必需基因。这种设计将可训练参数减少了39.2%，同时保持了较低的重建误差。 第四，由于多组学数据集的规模差异，可能导致某些数据集在训练过程中占主导地位，从而降低模型的泛化能力和可解释性。作者开发了一个完整组学（视图）丢弃层，该层基于超参数对完整的组学层进行掩蔽。这显著改善了模型的泛化能力，为特定组学的癌细胞系提供了更好的重建结果（图1b）。随后，作者通过计算所有组学输入特征的SHAP值，对多组学模型进行解释，以评估这些特征对潜在空间整合和组学特征重建的重要性。这为探索潜在的非线性癌症基因型-表型关联提供了一个系统性的资源。 多组学合成数据的评估 图 2 使用10折交叉验证策略，MOSA重建的CRISPR-Cas9和药物响应的留出集与原始数据显示出稳健的相关性（特征的平均皮尔逊相关系数分别为0.35和0.65）（图2a）。与类似的系统性监督分析相比，MOSA表现更好。这些监督分析旨在预测每个CRISPR-Cas9基因依赖性，它们分别使用核心组学（如基因组学、转录组学）、仅基因组学或仅功能相关基因进行预测（最佳特征的平均皮尔逊相关系数为0.25）。 MOSA通过利用从原始数据中学习到的多组学潜在空间来重建输入数据矩阵。数据重建生成完整的组学矩阵，从而处理缺失值（部分数据集增强），更重要的是，通过垂直整合重建整个组学数据（完整数据集增强）（本研究中要求每个细胞系至少需要两个组学数据）。 对于部分数据集增强，MOSA可以填补不完整的特征，例如，由于质谱基础蛋白质组学数据常见的技术限制，某些蛋白质的测量数据比较稀疏。对于一个在模型训练期间完全缺失的最新独立药物响应数据集，MOSA准确地进行了重建（IC50值，皮尔逊相关系数r = 0.87，n = 32,659）（图2b），优于MOFA、MOVE和简单平均填充方法（图2c-e）。 MOSA的重建结果与原始数据集之间的显著差异揭示了可能存在的不准确实验测量。例如，对MEK1/2抑制剂曲美替尼的响应与重复测量结果以及同一细胞系中具有相同经典靶点的药物不一致。这些差异还突显出一些药物（如venetoclax）或药物类别（如抗凋亡抑制剂），它们目前缺乏有效的分子生物标志物，这凸显了为其响应开发可靠预测模型的挑战。 此外，蛋白质组学数据存在大量缺失值，主要影响低丰度蛋白质。MOSA使用所有组学的信息填充了原始矩阵约32%的数据，同时保持了与独立蛋白质组学数据集（CCLE）的样本相关性。值得注意的是，MOSA有效重建了SMAD4基因缺失细胞系中的SMAD4蛋白质谱，这类细胞系通常表现为SMAD4基因表达和蛋白质丰度较低。 MOSA增强的蛋白质组学矩阵保持了通过蛋白质配对相关性识别蛋白质相互作用的能力。与存在缺失值的原始矩阵相比，MOSA增强的蛋白质矩阵是完整的，可以直接用于下游分析，如广义线性模型，这改善了蛋白质复合物相互作用的召回率。 MOSA在完整数据集增强方面的效果 图 3 随后，作者评估了完整数据集增强的效果。对于缺乏蛋白质组学测量数据的癌细胞系，MOSA生成的合成蛋白质组学数据与独立的蛋白质组学测量结果显示出相关性，这种相关性与实际拥有蛋白质组学数据的细胞系相当（图3a）。在药物响应方面，107个重叠药物的重建结果与独立数据集（CTD2）的测量结果显示出稳健的相关性（图3b）。 作者通过比较原始数据矩阵和增强数据矩阵来评估下游分析。MOSA将CRISPR-Cas9细胞系筛选数量增加了34.9%，增强后的数据集提高了发现基因关联的统计效力(图3c)。基因必要性特异性(Fisher偏度检验)可用于识别选择性癌症脆弱性，结果显示合成的CRISPR-Cas9筛选细胞系与先前可用的筛选结果之间存在中等程度的正相关(皮尔逊相关系数r = 0.52)(图3d)。然而，由于潜在的非必需基因异常值的存在，这种相关性可能被低估了。MOSA准确重建了基因依赖关系，例如BRAF功能获得性突变癌细胞系中的BRAF依赖性(图3e)，以及携带FLI1-EWSR1融合基因的细胞系中的FLI1依赖性(图3f)。 最后，作者着手评估开发一种能够原生集成两种以上组学数据方法的优势。具体而言，作者关注了转录组学和药物反应数据集，它们分别代表分子和表型数据集。这两类数据集在多组学整合中经常被使用，也是作者基准测试中信息量最丰富的组学类型。在评估的方法列表中，作者考虑了iClusterPlus、JAMIE、scVAEIT和moCluster。MOSA在转录组学和药物反应数据的重建方面表现更好。特别是，向MOSA添加更多组学数据相比现有方法带来了显著改进，支持了使用整体多组学模型的价值。此外，MOSA在组织来源聚类方面持续优于其他方法。仅考虑转录组学和药物反应时，可以获得最佳的组织来源聚类结果，这反映了这些组学数据按组织来源的强结构特征。相比之下，其他组学如蛋白质组学和代谢组学按组织的结构性较弱。因此，包含按组织结构性较弱的组学数据自然会导致较松散的组织聚类。 综上所述，这些多样化的例子展示了MOSA在部分和完整数据集增强方面的能力，这些能力已通过来自不同实验室的各种独立数据集得到验证。大规模多组学数据集的生成既耗时又需要大量资源，因此MOSA成为了一个有价值的工具，可用于药物靶点的计算机模拟测试和优先级排序，为实验验证提供依据。 模型可解释展示了癌症的细胞状态 为了确定最有前景的靶点，模型需要在产生可靠预测之外具有可解释性。因此，作者使用SHAP算法来计算特征重要性，将其定义为每个特征对潜在空间的贡献量(图1b)。当按照相应的组学数据集对特征进行分组时，作者观察到代谢组学、药物反应和拷贝数变异表现出最高的平均特征重要性。关于条件特征，尽管它们的平均特征重要性适中，但某些关键特征，如TP53突变、生长率以及造血和淋巴组织来源，即使与其他组学数据集相比也显示出高度显著性(图4a)。这强调了将条件变量纳入模型的重要性。来自每个组学数据集排名前五的特征也验证了作者的方法能够重现与癌症相关的已知分子过程的能力(图4a)，例如CDKN2A拷贝数变异，以及对SRC家族抑制剂达沙替尼的敏感性。有趣的是，其他排名较高但不太明显的特征揭示了此前较少探索的生物学机制。 一个具体的例子是参与烟酸和烟酰胺代谢的代谢物1-甲基烟酰胺，经计算它是代谢组学中对多组学潜在表征最重要的特征(图4a)。作者观察到1-甲基烟酰胺细胞内含量增加与烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)酶的过表达之间存在强相关性，该酶催化这种代谢物的产生。作者还观察到1-甲基烟酰胺与癌细胞系的EMT状态之间存在关联，这一点通过VIM和CDH111的表达得到证实。这证实了最近一项单细胞研究的发现：携带EGFR激活突变的PC-9非小细胞肺癌细胞系通过EMT标志物的表达和1-甲基烟酰胺的积累，发展出对EGFR抑制剂的耐药性细胞状态。此外，在A549细胞系EMT早期阶段观察到1-甲基烟酰胺显著增加，这种增加与糖酵解代谢物和组蛋白翻译后修饰的变化相关，表明1-甲基烟酰胺与EMT过程中的表观遗传修饰之间存在联系。虽然需要进一步的实验验证，但这可能为识别导致药物耐药性的癌症细胞状态铺平道路。 为了深入研究，作者随后使用SHAP算法专门计算了药物反应重建的特征重要性，从而有助于发现最有前景的生物标志物。如预期的那样，药物反应特征本身平均而言是最重要的特征。值得注意的是，条件特征成为第二重要的组学数据，反映了组织来源、突变和生长率在影响药物反应中的关键作用。 以代谢物1-甲基烟酰胺为中心，已知与EMT相关的药物在1-甲基烟酰胺的特征重要性排名中位列前茅（图4b）。除了Daraprim（Pyrimethamine）这个未被纳入数据集作为抗癌药物的药物外，排名前五的所有药物在近期研究中都被发现与EMT有关。具体来说，UNC0638、Entinostat和BIX02189能够抑制EMT，而甲氨蝶呤则表现出诱导EMT的能力。这一发现表明排名最高的药物Daraprim可能也与EMT密切相关，为癌症治疗中的药物重新定位提供了潜在途径。其他与EMT相关的特征，如GPX1蛋白强度，也在Daraprim的顶级特征中排名靠前，这表明可以利用列表中的其他特征来发现最有前景的药物反应生物标志物（图4c）。 在这些排名靠前药物的其他重要特征中，KRAS和KMT2D被一致识别为具有高度重要性，这两个基因都与EMT有关。最后，作者使用外部代谢组学数据集来验证通过SHAP值与1-甲基烟酰胺相关的药物。虽然在他们的研究中没有直接测量1-甲基烟酰胺的丰度，但作者分析了与烟酸和烟酰胺代谢相关的药物，其中1-甲基烟酰胺是烟酰胺甲基化的直接产物。通过SHAP值识别的几种重要药物，包括Daraprim、UNC0638、Entinostat（MS-275）和PAC-1，也被排名为耐药或敏感药物。 综上所述，作者的发现表明1-甲基烟酰胺和EMT在数百个癌细胞系中存在广泛的关联，并可能在药物耐药性中发挥作用。虽然需要进一步评估来证实这一点，但从更广泛的角度来看，这揭示了使用MOSA作为整体模型的潜力。该模型可以整合癌细胞的分子和表型数据，用于研究癌细胞状态、药物耐药性及其潜在机制。 编译|黄海涛 审稿|王梓旭 参考资料 Cai, Z., Apolinário, S., Baião, A. R., Pacini, C., Sousa, M. D., Vinga, S., ... & Gonçalves, E. (2024). Synthetic augmentation of cancer cell line multi-omic datasets using unsupervised deep learning. Nature Communications, 15(1), 1-12.