UB-VV111

从靶向递送、人工共刺激，到可编程免疫——基于前沿文献，拆解 in vivo CAR-T 的核心技术、七道关卡与未来十年。 2025 年，两个数字震动了细胞治疗界。5 位难治性系统性红斑狼疮患者在接受输液后，循环 B 细胞在 7 至 10 天内被完全清除，疾病活动度全面下降，没有出现一例 3 级及以上严重不良反应——而他们从未进过细胞制备车间：没有单采，没有清淋化疗，没有等待六周的"桥接治疗"。让他们的 T 细胞变成 CAR-T 细胞的，只是一袋包裹着 mRNA 的脂质纳米颗粒 [1,4]。 同年发表的另一项首次人体试验里，4 例复发难治多发性骨髓瘤患者接受了一次针对 BCMA 靶点的工程化慢病毒颗粒静脉输注，一个月后全部达到严格意义上的缓解——其中 2 例为严格完全缓解，代价是 3 例发生了 3 级细胞因子释放综合征 [2,4]。 这就是 in vivo CAR-T（体内生成 CAR-T）：不再把患者的 T 细胞取出体外改造再回输，而是把"改造指令"本身做成药，注射进体内，让患者的免疫系统原地重编程。01 · 一个 50 万美元的悖论 自 2017 年首批产品上市以来，FDA 已批准 7 款 CAR-T 细胞疗法，覆盖 CD19 与 BCMA 两大靶点，在弥漫大 B 细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤等适应症上创造了前所未有的缓解率 [2]。但另一组数字同样醒目：目前获批 CAR-T 的人均治疗成本超过50 万美元；从单采到回输的"静脉到静脉"（vein-to-vein）时间通常需要 6 至 12 周；而由于产能、费用与患者 T 细胞质量的限制，符合适应症的患者中只有一小部分真正用上了这类疗法 [2]。 瓶颈是结构性的。现行 CAR-T 是一种"个体化的活细胞药物"：每位患者都要单独走完单采、T 细胞活化、病毒转导、体外扩增、质控放行、冷冻运输、清淋化疗、回输的全流程，任何一步都可能失败或延误——对侵袭性疾病患者而言，等待本身就是风险。西班牙的院内制备（point-of-care）网络证明成本可以压缩到约9.7 万美元的报销水平，但流程本身并没有被绕开 [2]。而一度被寄予厚望的"现货型"异体 CAR-T，则需要敲除 TCR 与 HLA 来规避移植物抗宿主病（GvHD）与宿主排异，接受更强的清淋预处理，临床结果至今整体逊色于自体产品 [2]。 更深的一层问题在生物学上。体外制备依赖抗 CD3/CD28 磁珠与超生理剂量的细胞因子进行强刺激扩增，这一过程本身就在消耗 T 细胞的"干性"（stemness）：终末分化、耗竭标志物上调、回输后的持久增殖能力受损。临床上反复被验证的规律是——富含初始/记忆亚群、耗竭标志少的 CAR-T 产品，疗效与持久性显著更好 [2]。换句话说，工厂生产的环节，恰恰是伤害产品的环节。 于是问题被倒逼到一个更根本的方向：与其在工厂里费力模仿体内的 T 细胞活化，为什么不直接让活化、转导、扩增发生在体内？02 · 范式转换：把工厂搬进身体 in vivo CAR-T 的定义很直接：将编码 CAR 的基因递送载体——工程化病毒颗粒或非病毒纳米颗粒——直接注入患者体内，选择性转导循环中的 T 细胞，让 CAR-T 在原位生成、增殖并发挥杀伤 [2]。Ex vivo 流程中属于"患者"的那一段（单采、等待、清淋、回输）被整体删除，取代它的是一次注射。 这不只是流程优化，而是药物形态的切换：CAR-T 从个体化细胞药物，变回了药企熟悉的"可批量生产、可库存、可质检放行"的基因药物。业界寄望于由此打破成本与可及性的天花板。 Timeline: major discoveries and milestones leading to clinicaltranslation of in vivo CAR technologies 三个理论优势支撑着这条路线： 其一，免除清淋化疗。清淋是 ex vivo CAR-T 的标配，也是感染、血细胞减少与部分 CRS 风险的来源。in vivo 路线已在非人灵长类（NHP）中证明：无清淋、无外源细胞因子，单次给药即可生成功能性 CAR-T 并深度清除靶细胞 [1]。保留完整免疫系统还有一层收益——CAR-T 攻击释放出的肿瘤抗原可以触发内源性免疫的"表位扩散"（epitope spreading），形成更多克隆、更广的抗癌应答，这被认为是降低抗原逃逸复发的潜在机制。 其二，T 细胞质量更天然。体内重编程直接作用于静息 T 细胞，绕开体外培养的分化伤害；理论上还能触及外周血之外、驻留于骨髓与次级淋巴器官的 T 细胞库，保留更完整的归巢受体与 TCR 多样性 [2]。Umoja 的猴实验中，体内生成的 CAR-T 表现出 CCR7、CD27 等记忆表型标志，并出现了教科书式的记忆应答——B 细胞一冒头，CAR-T 随即再扩增清除 [1]。 其三，剂量动力学更温和。ex vivo 模式将 10⁸ 量级的激活 T 细胞一次性注入体内；in vivo 模式下 CAR-T 数量随转导与增殖渐进爬坡，没有瞬时的大剂量冲击，理论上 CRS 风险更低 [4]——早期临床中 CRS 仍在发生，但总体可用现有药物管理（详见第 07 章）。 还有一个常被忽视的"底气数字"：剂量上限最高的已上市 CAR-T（tisagenlecleucel）给药量约为 6×10⁸ 个 CAR+ 细胞，仅占人体约 5×10¹¹ 个 T 细胞池的 0.12% [2]。换言之，治疗所需的"改造规模"其实很小——即便体内转导效率只有百分之几，也可能达到治疗有效的细胞数量级。这是整个 in vivo 路线在经济学与生物学上的共同支点。 硬币的另一面同样清晰：载体进入血液后面对的是全身的细胞，"送错地方"的后果从浪费变成了危险；体内环境远比培养皿复杂，效率、免疫清除、剂量控制都是全新命题。后文逐一展开。 体外与体内CAR-T细胞治疗示意图 表 01 两种范式的全维度对照 维度 Ex vivo CAR-T In vivo CAR-T 药物形态 个体化活细胞产品 批量生产的工程化颗粒（现货） 生产方式 中心化 GMP 工厂或院内 PoC 生物药产线，可库存、可放行检验 单采与等待 必须；vein-to-vein 6–12 周 不需要；确诊后即可给药 清淋化疗 常规需要（Flu/Cy） 多数平台不需要 [2,4] 剂量控制 输注前定量、全程可 QC 体内生成，经载体剂量间接控制 CAR 表达时长 永久（基因组整合） 可选：瞬时（mRNA）或永久（病毒） T 细胞状态 体外强刺激扩增，偏终末分化 原位重编程静息 T 细胞，保留记忆/干性 [2] 代表成本 > $500,000（PoC 可至约 $97,000）[2] 目标：常规生物药量级（待验证） 主要新风险 制备失败、延迟、清淋毒性 脱靶转导、免疫清除、剂量不可控 [2,4]03 · 地址系统：如何让载体只找 T 细胞 in vivo CAR-T 的第一块技术基石，是把基因递送的细胞选择性做到极致：载体必须"认出"T 细胞并只进入 T 细胞。任何非特异感染都可能是危险的——肝细胞、生殖细胞被装入 CAR 固然是事故，理论上甚至肿瘤细胞本身也可能被转导而获得异常特性 [2,4]。受体盲突变 + 靶向配体 慢病毒颗粒由包膜糖蛋白决定细胞嗜性（tropism）。ex vivo 时代的标准包膜 VSV-G 结合广泛表达的 LDL 受体，转导纯化细胞群时是优点，全身给药时就是灾难。工程路线因此分成两步：先通过点突变（如 K47Q、R54A、I182E）废除 VSV-G 与天然受体的结合，保留其融合机器——得到所谓"受体盲"（receptor-blinded）的 dVSV-G；再在颗粒表面装配识别 T 细胞标志的结合器（scFv 抗体、纳米抗体 VHH 或 DARPin），把嗜性重新定向到 CD3、CD4、CD8、CD7 或 TCR 上 [2,3]。cocal 糖蛋白（VSV-G 的近亲，耐人血清灭活）走的也是同一逻辑 [1]。进入方式的隐形约束 一条常被忽略的工程细节：包膜蛋白的融合触发方式决定了"哪些受体可用"。VSV-G、cocal、辛德毕斯病毒包膜依赖内吞后的低 pH 环境触发融合——因此靶向的受体必须能在结合配体后发生内吞。一个经典失败案例：CD45 靶向的受体盲慢病毒因 CD45 不内吞而完全无法转导 T 细胞 [2]。相反，麻疹病毒（MeV）、尼帕病毒（NiV）等副黏病毒家族的包膜在细胞膜表面直接融合、不依赖 pH，可以靶向非内吞受体，特异性更"干净"——因为不依赖内吞也就避免了非特异内吞带来的旁路转导。Broad 研究所的团队在比较中指出：dVSV-G 颗粒即便在无靶受体的细胞上仍有可检出的转导活性，而麻疹假型几乎没有 [3]。代价是 NiV 系统要求配体结合膜近端表位，MeV 则可容忍较远端的表位 [2]。scFv 的原罪与 VHH 的崛起 把结合器接到包膜上，主流选择长期是 scFv（单链抗体）。但 scFv 有个与生俱来的问题：VH 与 VL 两个结构域靠疏水界面配对，单独表达时这些疏水面会错误配对、聚集。麻疹 H 蛋白以四聚体形式组装，四个 scFv 挤在一起，聚集被进一步放大——结果是融合蛋白在包装细胞表面表达量普遍很低，功能滴度差，每个新靶点都要大海捞针式筛选 [3]。 2026 年 Nature Communications 上的 TaSEL（Targeted and Stimulatory Engineered Lentivirus）研究给出了系统解法：用骆驼科来源的单域抗体（VHH/纳米抗体）替换 scFv。VHH 没有轻链、不含疏水配对界面，可溶性极好——几乎全部测试 VHH 的包膜融合蛋白都能在包装细胞表面达到与野生型 H 蛋白相当的表达水平，转导效率与选择性全面超越 scFv 版本，且可以通过免疫羊驼（或新开发的"纳米小鼠"）快速制备针对任意靶点的结合器 [3]。 右下角为：LV composed of MeV/DMV-H-αCD7VHH, DMV311/312MeV-F, and αCD3/CD80，即Targeted and Stimulatory Engineered Lentivirus (TaSEL)  这里稍微解释下TaSEL的各组成部分，αCD7VHH和MeV/DMV-H让病毒靠近 T cell，MeV的H蛋白负责受体识别receptor recognition，F蛋白负责膜融合membrane fusion，而且这个融合过程由细胞表面受体识别触发，不依赖低 pH/endocytosis，理论上更适合做高特异性 retargeting。αCD3结合TCR激活 T cell，CD80则结合CD28进行co-stimulation。所以，一个 TaSEL particle 在接触 T cell 时，相当于同时完成：定位 + 激活 + 基因递送。躲过疫苗：嵌合包膜的免疫逃逸 麻疹假型还有一个致命软肋——全球麻疹疫苗接种带来的预存中和抗体。TaSEL 团队从 21 例人血清（几乎全部麻疹抗体阳性）证实了抗 H/F 蛋白抗体对颗粒的结合与中和 [3]。他们的解法体现了一种漂亮的工程直觉：麻疹病毒属于麻疹病毒属（morbillivirus），该属病毒（犬瘟热 CDV、海豚麻疹病毒 DMV、牛瘟 RPV 等）的 H/F 蛋白结构高度同源、序列差异很大——人类对 DMV 没有群体免疫。于是用麻疹 H 蛋白骨架（第 1–141 位氨基酸）拼接 DMV 的胞外域（142–586 位），配以 DMV/MeV 嵌合 F 蛋白：嵌合颗粒的功能滴度与全麻疹版本相当，而血清抗体结合下降超过 100 倍，中和水平降至与 VSV-G 对照相当 [3]。作者还顺带论证了备选项的取舍：CDV 的 F 蛋白难以表达，TPMV 太过远源难以嵌合，NiV 虽然目前人类免疫稀少、但世卫组织已将其列为潜在大流行病原并推进疫苗——未来疫苗普及会封死这条路线 [3]。生产端的免疫隐形 除了包膜本身，颗粒还"继承"了包装细胞的膜成分——包括 MHC 分子，这可能诱发异源免疫清除。对策已有实锤：敲除包装细胞的 β2 微球蛋白基因得到"无 MHC"颗粒，明显降低免疫原性；高表达 CD47（"别吃我"信号）抑制巨噬细胞吞噬清除 [2]。EsoBiotec 的 ENaBL 平台正是 MHC-I 敲除 + CD47 高表达 + TCR 靶向 VHH 的组合 [4]。另一个细节：巨噬细胞即便结合了颗粒也常因不增殖而无法完成整合（且载体不含突破 SAMHD1 限制的 Vpx 蛋白），这构成了慢病毒对髓系细胞的一道"天然保险" [2]；在 CAR 序列上加 T 细胞特异启动子、加 miR-122 靶位点（让 CAR 在肝细胞内被沉默），则是转录层面的第二、三道保险 [2,4]。 地址系统解决了"去哪"，但到了门口还要"敲门"——静息的 T 细胞，门是不开的。04 · 激活与共刺激：让颗粒伪装成抗原提呈细胞 免疫学教科书的第一课：T 细胞活化需要双信号——TCR/CD3 传递的抗原信号（信号 1）与 CD28-B7/CD80、CD2-CD58 等共刺激受体传递的"许可"信号（信号 2），外加细胞因子（信号 3）决定其分化命运。只给信号 1 不给信号 2，结果是 T 细胞无能（anergy）或耐受 [1]。 这对 in vivo CAR-T 是硬约束：循环中的 T 细胞绝大多数处于静息记忆状态，LDL 受体低表达、细胞核不分裂，天然抵抗慢病毒转导 [2,3]。Ex vivo 制备用磁珠模拟双信号强行激活；in vivo 模式下，这个任务必须由递送颗粒自己完成。MDF：把突触压进一条多肽链 Umoja Biopharma 2024 年发表于 Blood 的非人灵长类研究，是这一思路迄今最有力的验证。其 VivoVec 平台在慢病毒颗粒表面展示一个多结构域融合蛋白（Multi-Domain Fusion, MDF）：CD58 胞外域 + 抗 CD3 scFv + CD80，串联为一条多肽——等于把抗原提呈细胞（APC）突触上的关键配体整体"移植"到颗粒表面 [1]。 数据链条清晰有力：加入 CD80/CD58 共刺激配体后，颗粒与 T 细胞的结合、CD25 激活标志、IL-2 与 TNF-α 分泌全面上升；生成的 CAR-T 富含 CCR7/CD27 记忆表型；而把三个元件合并成单链 MDF，效果进一步放大——低感染复数（MOI）下的转导效率成倍提升，连续肿瘤刺激实验中，MDF 生成的 CAR-T 控制肿瘤的能力甚至优于使用抗 CD3/CD28 磁珠（Dynabeads）的常规体外制备工艺 [1]。在人源化白血病小鼠模型中，50×10⁶ TU 剂量的 MDF 颗粒带来 100% 的长期存活 [1,2]。 MDF VVPs exhibit enhanced in vivo functionality in a humanized NSG MHCI/II KO Nalm6 mouse model 猴体里的决定性证据 真正的分水岭是四只豚尾猴（Macaca nemestrina）实验。NHP 适配的 MDF 颗粒携带抗 CD20 CAR 构建体，经淋巴结内注射给药——不做清淋、不补细胞因子、只给一次[1]： MDF VVPs administered intranodally induce potent and prolonged B-cell depletion in non-human primates 三只高剂量猴（2.5×10⁸ TU/kg）在第 10 天时，CAR-T 占循环 T 细胞的比例最高达到 65%（外周血 596–11,182 个/µL）；第 7 天起 B 细胞完全检测不到，清除持续 56、63、76 天。作为对照的历史实验里，ex vivo 制备的抗 CD20 CAR-T 联合清淋化疗，B 细胞在 32–43 天即反弹 [1]。 更漂亮的是免疫学细节：一只猴第 42 天外周血出现一小撮回流的 B 细胞，第 49 天 CAR-T 随之再扩增、B 细胞再次归零——教科书级的记忆应答。 CRP、IL-6、铁蛋白的升降曲线与 CAR-T 消长严格同步，证明炎症是 CAR-T 介导而非颗粒介导；两只猴在 CAR-T 峰值时出现短暂震颤与癫痫样活动，被 tocilizumab + anakinra + 地西泮成功控制。 尸检（第 139 天）中，ddPCR 仅在注射侧与下游淋巴结检出载体基因组整合，肝细胞阴性——而 VSV-G 假型的历史数据是明确肝转导 [1]。两条路线的哲学分野 并非所有平台都选择"颗粒即 APC"。Interius（CD7 靶向）与 Sana（CD8 靶向）刻意使用不激活 T 细胞的结合器，理由是避免颗粒驱动全身性 T 细胞活化，安全性谱更干净——代价是转导效率可能依赖患者体内的自发活化窗口 [4]。Broad 的 TaSEL 取中间路线：包装细胞稳定表达膜锚定抗 CD3 scFv 与人 CD80，两者随出芽掺入颗粒，实测可显著激活静息人 T 细胞并提升转导，且不影响 CD7 靶向的选择性 [3]。"要不要激活、激活到什么程度"，是效率与安全之间的活教材，目前尚无定论。 概念上值得记住的是那个升华的表述：MDF 颗粒本质上是一枚分子层面的人工抗原提呈细胞。它在体内复刻了一次生理性的 T 细胞 priming——这解释了为什么它生成的 CAR-T 偏记忆表型、能在无清淋条件下扩增到治疗水平，也解释了为什么其他缺乏共刺激的体内递送方案，迄今难以在血流中检出如此高比例的 CAR-T [1]。05 · 载体平台军备竞赛 全球已有至少 38 家公司、59 个项目布局 in vivo CAR-T，其中 CD19 靶点 22 个、BCMA 靶点 6 个，48 个处于临床前，8 个已进入临床，5 个已有临床数据 [4]。所有这些项目背后，是四类递送平台的正面竞争。 The rapidly evolving, in vivo CAR therapy ecosystem [6]慢病毒阵营：长效与工艺成熟 整合型慢病毒是当前临床进度最深的一支：Umoja（cocal 假型 + MDF）、Interius（dVSV-G + 抗 CD7）、EsoBiotec（ENaBL，MHC 敲除 + CD47 高表达 + TCR 靶向 VHH）、Kelonia（iGPS，工程 VSV-G + 抗 CD3）以及 Broad 的 TaSEL（嵌合麻疹/DMV 假型 + VHH + αCD3/CD80 功能化）各持一种包膜方案，但共同点是随机基因组整合带来的终身 CAR 表达与"一次给药"的便利 [2,3,4]。付出的代价是插入突变的理论风险（现有 ex vivo CAR-T 数据显示此类事件极罕见，但监管要求终身随访）、以及相对更高的免疫原性 [2]。LNP/mRNA 阵营：瞬时、可控、可重复 脂质纳米颗粒递送 mRNA，产物只在胞质翻译、数天内降解，不碰基因组——安全性干净，剂量可滴定、可重复给药。核心障碍有两个：一是 LNP 天然的肝嗜性（血浆 ApoE 蛋白冠介导的肝摄取），需要新一代可电离脂质（如 Capstan 的 L829）做"脱肝"改造；二是抗体/VHH 配体与颗粒的共价偶联工艺，收率、稳定性与存储都受拖累 [2,4]。Capstan 的食蟹猴数据展示了这条路线的天花板：三次给药后最高 85% 的 CD8 T 细胞与 95% 的 CD8 NK 细胞表达 CAR，B 细胞深度清除并在恢复后呈现"免疫重置"样幼稚表型 [4]。环状 RNA（circRNA）进一步延长表达（Sail、Orna 等公司），把"瞬时"阵营的给药间隔从数天拉长到一至两周以上 [4]。边界改写者：从随机整合到定点写入 第三股力量试图同时拿到"LNP 的递送"与"病毒的长效"。NanoCell 用 LNP 共递送 DNA 转座子与 SB100X 转座酶 mRNA（睡眠美人系统），单次 0.05 mg/kg 剂量在人源化小鼠实现 7/12 完全缓解 [4]；Stylus 用工程化大丝氨酸重组酶把 3–13.5 kb 的 CAR 盒定点插入安全港位点，单次给药实现 40 天的持久肿瘤控制，且不产生双链断裂 [4]；Tessera 的 RNA 基因写入器（Gene Writer）做到全 RNA、无 DNA 模板的基因组写入；Create 则改造人类 LINE-1 逆转录转座子实现定点插入 [4]。这些系统尚处早期，但方向明确：把随机整合的致癌理论阴影从根上拆掉。 AAV 受限于 T 细胞转导效率低、容量小（约 5 kb）与预存中和抗体（重复给药几乎不可能），在 CAR-T 主赛道趋于边缘；聚合物纳米粒（PBAE 体系、Velvet 的 DNP、Alaya 的聚合物包覆颗粒）灵活可及，成熟度最低 [2,4]。Ensoma 的病毒样颗粒（VLP）另辟蹊径：靶向 CD46 工程造血干细胞，配合谱系特异启动子，一次给药生成 CAR-M/CAR-NK/CAR-T 的"多细胞"组合 [4]。 表 02 递送平台横向对比 平台 载荷 / 容量 靶向方式 表达时长 核心优势 核心短板 慢病毒 LV ssRNA，整合（~10 kb） 假型糖蛋白 + 配体（scFv / VHH / DARPin） 终身 长效、一次给药、工艺成熟 [2] 随机整合风险、免疫原性、物理滴度偏低 [2,3] LNP / mRNA mRNA（容量灵活） 抗体 / VHH 偶联（CD3 · CD5 · CD7 · CD8） 数天 瞬时可控、可重复给药、无整合风险 [2] 肝嗜性、偶联工艺、需多次给药 [2,4] LNP / circRNA 环状 RNA 抗体偶联 1–2 周以上 较 mRNA 更持久、给药频率低 [4] 环化工艺复杂、临床数据早期 [4] LNP + 定点写入 DNA + mRNA / 全 RNA（3–13.5 kb） 抗体偶联 终身（可定点） 安全港定点插入、无随机整合阴影 [4] 系统复杂、体内验证早期 [4] AAV ssDNA，附加体（~5 kb） 衣壳工程 + 配体 数周–数月 基因治疗安全记录好 [2] T 细胞转导低、预存抗体、几乎无法重复给药 [2] 聚合物纳米粒 mRNA / 质粒 抗体吸附 / 偶联 瞬时或整合 制造简单、灵活、可及 [2,4] 成熟度最低、规模化待验证 [4] 产业侧的信号同样密集：吉利德/Kite 收购 Interius，阿斯利康收购 EsoBiotec，安进收购 Capstan，BMS 收购 Orbital，强生与 Kelonia 达成合作，诺华联手 Vyriad，Moderna 与 Carisma 共建 in vivo CAR-M——跨国大药企在 2024–2025 年间完成了对这个赛道的主要卡位 [4]。中国企业是第二股重要力量：MagicRNA（深圳）、Genocury（深圳）、Grit、Immorna（杭州）、Starna（苏州）、RiboX、Immunofoco（上海）等至少七家入局，其中 MagicRNA 的 HN2301 已贡献了本领域最深的人体数据之一 [4]。 表 03 全球代表性临床阶段管线（截至 2026 年中） 公司 / 机构 管线 平台 靶点 · 适应症 阶段 关键结果 EsoBiotec（阿斯利康） ESO-T01 ENaBL 慢病毒 BCMA · R/R MM I 期 4 例：2 例严格完全缓解 + 2 例部分缓解（均 MRD 阴性）；3 例输液即刻 3 级 CRS [2,4] Kelonia（强生合作） KLN-1010 iGPS 慢病毒 BCMA · R/R MM I 期 4/4 例一个月达 MRD 阴性，1 例持续 5 个月；CRS 可控、无神经毒性 [4] Umoja（艾伯维合作） UB-VV111 VivoVec 慢病毒 CD19 · R/R B 细胞肿瘤 I 期 进行中（淋巴结内 / 静脉 ± 雷帕霉素）[4] Interius（吉利德 / Kite） INT2104 CD7 靶向慢病毒 CD20 · B 细胞肿瘤 I 期 进行中；NHP 中 B 细胞清除后随抗 CAR 抗体出现而回弹 [4] Capstan（安进） CPTX2309 CD8-tLNP / mRNA CD19 · B 细胞介导自身免疫病 I 期 进行中；猴实验 85% CD8 T 表达 CAR、B 细胞深度清除 [4] MagicRNA（深圳） HN2301 CD8-tLNP / mRNA CD19 · R/R SLE I 期 5 例：B 细胞 7–10 天清除，自身抗体下降，3 个月疾病活动度全面降低；无 ≥3 级 CRS [2,4] Genocury（深圳 · 郑大一附院） JY231 CD3 靶向慢病毒 CD19 · R/R DLBCL I 期（单例） 1 例完全缓解（1 个月）并持续 >3 个月；仅 1 级 CRS [4] Legend 生物 未披露 慢病毒 CD19/CD20 双靶 · NHL 早期临床 刚启动，细节未披露 [4] 注：Starna（STR-P004，R/R NHL）、Immorna（JCXH-213，R/R NHL）亦已进入探索性临床 [4]。MM=多发性骨髓瘤；SLE =系统性红斑狼疮；DLBCL =弥漫大 B 细胞淋巴瘤；NHL = 非霍奇金淋巴瘤；CRS = 细胞因子释放综合征；MRD = 微小残留病。06 · 控制论：安全开关与剂量艺术 Ex vivo 模式下，每一袋细胞在回输前都经过表征、定量与放行检验；in vivo 模式下，"产品"是患者体内的一个过程——没有放行检测，没有剂量瓶签。安全性因此不靠单一机制，而是被拆成层层冗余的控制体系 [2,4]。 药理学开关。Umoja 的 RACR（雷帕霉素活化的细胞因子受体）是代表设计：CAR 构建体与 RACR 共表达，给药雷帕霉素后，转导细胞获得 IL-2/IL-15 样增殖信号、未转导细胞被药物抑制——等于用一片药在体内"选中"并扩增 CAR-T 群，把扩增速度交到医生手里 [4]。自杀开关与消除标记（诱导性 Caspase-9、截短 EGFR 等）是从 ex vivo 时代平移过来的成熟方案，为极端不良事件保留"熔断"能力 [2]。转录层面约束：T 细胞特异启动子让 CAR 即便被递送到其他细胞也不表达，miR-122 靶位点让肝细胞内的 CAR mRNA 被主动沉默——递送脱靶与表达脱靶被拆开各自设防 [2,4]。 剂型与路径。Umoja 在 NHP 与临床中采用淋巴结内注射：颗粒与 T 细胞的接触时间最大化、系统暴露最小化，尸检也证实整合信号基本局限在注射与下游淋巴结 [1]。静脉输注胜在操作可及，但需要更精细的颗粒隐形工程。两条路径的取舍仍在临床摸索。 表达时长的适应症匹配。这或许是全领域最重要的设计决策：自身免疫病、心脏纤维化等场景中，目标是一次深度清除后让免疫系统"重置"，瞬时 mRNA 表达天然契合——MagicRNA 与 Capstan 的 SLE 数据都显示 B 细胞清除后以幼稚表型重建，被解读为"免疫重置"的雏形 [4]；而血液肿瘤需要 CAR-T 长期巡逻防止复发，整合型慢病毒仍是主流选择。Genocury 的首例患者采用了清淋 + 自体 T 细胞共输注 + 体内转导的"混合形态"，被综述作者视为 ex vivo 与 in vivo 之间的过渡样本——未来的方案空间可能比二分法更丰富 [4]。07 · 七道关卡：从概念验证到常规疗法 动物数据已经足够漂亮；剩下的七道关卡，每一道都决定这个领域能否真正"出圈"。 GATE 1 ｜ 特异性：脱靶的后果被重新定价 现有证据并不算坏——Umoja 猴尸检仅在注射淋巴结检出整合、肝细胞阴性 [1]；TaSEL 小鼠肝脏多重免疫荧光中 GFP+ 细胞 99.7% 以上为 CD3 阳性 [3]。但"几乎为零"不等于零：生殖系整合意味着可遗传的改变，是监管最深的红线；对肿瘤细胞的意外转导则可能制造携带 CAR 的恶性细胞。受体盲突变 + 配体桥接 + CD47/MHC 隐形 + 细胞特异启动子 + miRNA 沉默，五层防御叠加，才把风险压到可辩护的水平——而最终答案需要大规模、长周期的人群随访 [2,4]。 GATE 2 ｜ 效率：剂量、滴度与个体方差 NHP 有效剂量在 10⁸ TU/kg 量级，意味着对人体需要极高颗粒剂量；麻疹/副黏病毒假型的物理滴度天然低于 VSV-G，大规模生产、浓缩与纯化是实打实的工艺硬骨头 [1,3]。转导效率的个体方差同样惊人——人源化模型中 CAR+ 比例从百分之一到百分之几十不等，患者基线 T 细胞数量与状态直接决定疗效上限。综述们给出的务实建议是：入组前筛查外周血 T 细胞数量与功能 [2]。 GATE 3 ｜ 免疫原性：身体会拒绝这颗药 预存免疫（麻疹疫苗、AAV、VSV 交叉抗体）之外，更麻烦的是诱发免疫：Interius 与 Kelonia 的猴实验都观察到 B 细胞在 30–60 天回弹、与抗 CAR 抗体的出现同步——宿主把自己的"药"当成了抗原 [4]。这对需要长期 CAR 表达的肿瘤适应症是实质性威胁。对策包括 imlifidase（IgG 蛋白酶）临时清除抗体、免疫抑制预用药、以及 TaSEL 提出的"交替假型加强针"策略——首剂用 MeV/DMV 嵌合，复发再给药时换 CDV 嵌合 [2,3]。LNP 阵营在此关有结构性优势，重复给药本就是其常规操作 [2]。 GATE 4 ｜ 毒性：无清淋 ≠ 无毒性 早期临床给出的图景是"可控但绝非无痛"。ESO-T01 的 4 例患者全部在输液即刻出现 CRS（3 例 3 级）——这是颗粒驱动的大量 T 细胞即刻激活，与第 8–12 天 CAR-T 扩增驱动的第二波 CRS 明显是两种机制 [4]；Umoja 猴实验中的震颤与癫痫样事件、Capstan 猴实验中一例高剂量动物发生的 IEC-HS 样综合征死亡，则提醒神经毒性与过度激活仍在射程内 [1,4]。好消息是 tocilizumab、anakinra、激素加预用药的组合拳基本能管理这些事件；坏消息是剂量爬坡必须极度小心——毕竟没有"先质检再回输"这道闸。 GATE 5 ｜ 可控性与监管范式：放行检验消失了 当产品成为患者体内的过程，"成品放行"这个监管概念就失效了。业界将不得不从"产品质控"转向"过程质控 + 密集临床监测"：载体批次的表征、体内药效动力学标志物（CAR+ 比例、细胞因子、拷贝数）的实时追踪、以及整合载体要求的长期甚至终身随访 [2,4]。历史上基因疗法曾有过的安全事故，也让研究者对"靶向免疫系统本身"的体内操作保持敬畏——完全免疫活性动物模型上的长期安全性研究，被两篇综述同时强调为临床前必须项 [2,4]。 GATE 6 ｜ 患者本身：T 细胞不够好怎么办 in vivo CAR-T 的全部前提是患者体内有足够数量与质量的 T 细胞——而晚期、重度化疗后的血液肿瘤患者恰恰常有淋巴细胞减少症。这一人群可能仍然需要 ex vivo 或异体方案兜底。另一个暗面：CD3/CD7 等"泛 T"靶向会把调节性 T 细胞（Treg）一并转导，给本就免疫抑制的肿瘤微环境再添一重压制 [2,4]。亚群精准靶向（CD8 限定、或将来用 pMHC 级克隆型靶向）是明确的改进方向。 GATE 7 ｜ 实体瘤：旧题未解，新牌未验 抗原异质性、on-target off-tumor 毒性、间质屏障、免疫抑制微环境——ex vivo 时代没能解决的实体瘤难题，in vivo 一个也绕不开，甚至更难（无法体外富集亚群、无法预装 armored 功能）。但 in vivo 手里多了两张未经充分验证的新牌：保留天然归巢受体库的 T 细胞可能有更优的肿瘤浸润，以及完整免疫系统下的表位扩散 [2,4]。Immunofoco（CLDN18.2）、Velvet 等公司已在布局实体瘤管线，三五年内应有初步答案 [4]。08 · 未来十年：五条主线 如果把 2017 年第一篇 in vivo CAR-T 动物研究算作起点，这个领域只用了七年就走完了从小鼠到人的距离。接下来十年，看五条主线。 TREND 1 ｜ 隐形载体成为显学 TaSEL 的 MeV/DMV 嵌合包膜只是开头：交替假型规避新生抗体、CD47/MHC 工程压制吞噬与异源免疫、人源化结合器降低自身免疫原性——载体"隐形工程"将像当年的抗体人源化一样，从加分项变成入场券 [3,4]。可重复给药是明确的设计目标，它决定了肿瘤复发再打击、自身免疫病维持治疗这些真实临床场景能否成立。 TREND 2 ｜ 从随机整合到定点写入 大丝氨酸重组酶（Stylus）、RNA 基因写入器（Tessera）、LINE-1 系统（Create）、CRISPR-EDV（Azalea）——四条独立的定点整合路线同时逼近"安全港敲入"这个圣杯 [4]。一旦在体内 T 细胞上验证成功，随机插入突变这个自基因疗法诞生以来悬了三十年的理论阴影将被拆除，in vivo CAR-T 的监管负担与公众接受度都会随之改善。 TREND 3 ｜ 超越 T 细胞：编程整个免疫系统 同一套递送技术正在溢出 T 细胞的边界：Liberate 的单核巨噬细胞靶向 LNP 在猴体内实现 99% B 细胞清除（CAR-M 路线）[4]；Interius 的 CD7 靶向顺带转导 NK 细胞 [4]；Ensoma 一步工程造血干细胞、生成 CAR-M/CAR-NK/CAR-T 混编部队 [4]；而 pMHC 功能化的"抗原提呈纳米颗粒"（APN）甚至能按 TCR 克隆型精准改造指定 T 细胞亚群 [4]。"in vivo CAR-T"只是"in vivo 免疫细胞编程"这本大书的第一章。 TREND 4 ｜ 适应症重心迁移：肿瘤 → 自免 → 更远 逻辑很清楚：自身免疫病患者 T 细胞健康、无需清淋、对瞬时表达耐受良好、且深度清除 B 细胞后观察到的"免疫重置"正是治疗目标 [4]。MagicRNA 与 Capstan 的 SLE 数据、以及更早 Rurik 等人 2022 年用 LNP 在小鼠体内生成抗纤维化 CAR-T 修复心脏的 Science 论文，共同指向一个判断：in vivo CAR-T 的首个爆款适应症可能不是肿瘤，而是自身免疫病 [2,4]。 TREND 5 ｜ 制造与可及性的终局 如果一切顺利，CAR-T 的成本曲线将从"中心化细胞工厂 + 50 万美元"迁移到"生物药产线 + 常规生物药定价"，冷链、库存、质检全部回归制药工业的既有轨道 [2,4]。AI/ML 已经入场：Sail 用机器学习筛选环状 RNA 的 UTR/IRES 变体以提升表达 [4]；未来在脂质设计、包膜工程与个体化剂量预测上，计算将扮演越来越重的角色。就时间线而言，笔者基于现有临床进度的保守判断是：2026–2027 年首批 I 期数据成熟，2028–2030 年出现关键注册研究，若顺利，2030 年前后迎来首个地区获批——而自身免疫病适应症大概率率先撞线。尾声 从 2003 年首次在小鼠体内看到疗效，到 2017 年首批自体CAR-T产品上市，走了14年；从 2017年第一只被in vivo CAR原位改造的小鼠，到 2025 年系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）与骨髓瘤患者上的首批人体数据，用了八年。加速本身，就是这条赛道最硬的证据。 更深的变化发生在"药"的定义上。当一种治疗能够像药物一样被注射、像细胞一样自我扩增、像免疫系统一样学习与记忆，"细胞治疗"与"基因治疗"的边界便不复存在——那将不是 CAR-T 的一个廉价替代版本，而是可编程免疫（programmable immunity）时代的起点：药物不再只是一种被制造的物质，而是一段被安全递送进身体的指令。 工厂还在，只是搬进了每个患者的血液中。参考文献 Nicolai CJ, Parker M, Qin J, et al. In vivo CAR T-cell generation in non-human primates using lentiviral vectors displaying a multi-domain fusion ligand. Blood. 2024;144(9):977–987. Volta L, Gill SI. In vivo generation of CAR T cells: biology, delivery platforms, clinical promise, and translational challenges. Blood Int J Cell Ther. 2026;2(1):100027. Ibrahim KE, Mears KS, Allen PM, et al. In vivo CAR T cell generation using retargeted and functionalized lentiviral vectors with reduced immunogenicity. Nat Commun. 2026;17:4923. Pierini S, Qureshi R, Pustylnikov S, Bartosh Z, Akimova T. In Vivo CAR-T Therapies—A New Era of Programmable Immunity. Int J Mol Sci. 2026;27(4):1737. Xu J, et al. Lancet. 2025;406(10500):228–231（多发性骨髓瘤首次人体试验）；Wang Q, et al. N Engl J Med. 2025;393(15):1542–1544（系统性红斑狼疮 LNP/mRNA 首次人体试验）；Rurik JG, et al. Science. 2022;375(6576):91–96（心脏纤维化体内 CAR-T）. Bot A, et al. In vivo chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy. Nat Rev Drug Discov, 2026. 感谢关注，一起探索生命科学中无限的乐趣~