Antithrombin alfa

本文内容译自《Cell Culture Bioprocess Engineering》第二版，作者Wei-Shou Hu。 1 细胞培养工艺概述1.1 细胞培养简介-基于历史视角1.1.1 促进细胞培养的早期创新 哺乳动物细胞是一系列药品的生产用细胞株，如众所周知的生物制剂，包括病毒疫苗和许多蛋白药物。许多人可能不知道的是，在细胞培养初期细胞培养技术具有艺术性，这种细胞培养技能需要大量的创造力、好奇心、激情和毅力，以及科学家的优秀品质。大约在20世纪初，动物组织的外植体开始在浸泡于动物组织液中的玻璃表面上培养。细胞从组织团块中生长出来，并在几天内保持存活和可观察的状态。从组织团块的生长物中，一些细胞可以被分离出来，最终被剥离并扩增到新的玻璃表面。传代或扩大细胞群的能力是迈向真正细胞培养的重要一步。在第一个建立的细胞系中，可以在培养中不断扩增的是小鼠L细胞。早期的细胞系只能通过持续的传代才能在实验室中持续存活下去，不能冻存和复苏。在那个时代，复杂的营养混合物不能高温灭菌，只能通过将血清、腹水或鸡胚提取物从动物体内小心地分离出来以保证细胞培养的无菌性（Figure1.1）。维持培养细胞所需要的工作量可想而知！ 冷冻动物精子和后来的冷冻细胞等冷冻保存技术的发明，使得实验室中细胞生长可被暂停并能够复苏。另一个重要的进展是使用胰蛋白酶进行细胞传代，而不是依靠解剖来将细胞从表面分离出来。第一个来自人类宫颈癌的细胞系HeLa就充分利用了这一点。 细胞培养进展的关键是基于膜过滤的培养基除菌技术的到来，首先是用硝化纤维素（NC）膜超滤除菌，之后是微滤除菌。虽然生理盐水和微生物培养基可以高压灭菌，但动物细胞所需的复杂营养物质在高温下会被破坏。膜过滤除菌加速了由葡萄糖、氨基酸、维生素和缓冲盐组成的培养基的发展。这不仅提高了我们对细胞营养需求的认识，而且大大简化了生长细胞的物资保障，加速了许多重要细胞系的建立，并最终实现了细胞培养的工业化。可以持续传代的早期细胞系，包括小鼠L细胞和HeLa细胞，均来源于癌变组织。它们形态上异常，与最初从正常组织中生长出来的原代细胞不同。 可以连续传代的早期细胞系，包括小鼠L和HeLa，来源于癌组织（Panel 1.1）。从形态学上看，它们看起来异常，与最初从正常组织生长的原代细胞不同。随后从各种动物组织中分离出连续细胞系，包括来自叙利亚仓鼠的乳仓鼠肾（BHK）细胞、来自绿猴肾的 Vero细胞、来自中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。这些细胞系携带基因突变，使得它们能够绕过细胞的内部生长控制机制。这些细胞在表型上并不正常。它们通常没有表现出接触抑制（接触抑制是指细胞培养过程中出现的一种现象。在培养开始后,分散的细胞悬液在培养瓶中不久就会贴附在瓶壁上,原来呈圆形的细胞一经贴壁便会迅速铺展而变成多种形态,随即细胞开始分裂,贴壁生长形成致密的单层细胞。当细胞分裂、生长到表面相互接触时,就会停止增殖,彼此之间维持相互接触的单层细胞状态直至衰老）。如有丰富的营养供应，它们可以在表面上生长成多层细胞。后来，3T3（从Swiss系小鼠胎儿里得到的细胞株。由于它显示出强烈的接触抑制作用，所以能明确地识别已发生转化的细胞，并作为一种重要的细胞材料使用于由肿瘤病毒和致癌剂等所引起的体外致癌研究。这一细胞系是将3E5 （300000）细胞（第二个“3”）接种在底部面积为20平方厘米的培养皿上，是因为鼠纤维原细胞每3（第一个“3”）天传代（transfer-“T”）一次，并进行连续培养的方法而建立的。），一种黏附依赖（同类细胞发生聚集形成细胞团或组织的过程成为细胞黏附，是通过黏附分子介导的细胞之间或细胞与胞外基质之间的相互接触和结合），存在接触抑制，不老化的细胞系被建立。但3T3细胞以及其他连续细胞系（指的是具有无限生存能力的细胞系，也称无限细胞系或永久细胞系）的核型（或染色体组成）是非整倍体，而不是二倍体。大约在同一时间，我们分离出了表型正常的人类成纤维细胞，如WI-38以及后来的MRC-5和FS-4。这些细胞是二倍体，表现出接触抑制，但不是像3T3这样的连续细胞系。它们在培养过程中反复传代后就衰老了。几十年来，这些细胞系和细胞株在生物科学和医学研究中发挥着重要作用，许多被用于病毒疫苗和其他生物制剂的工业生产。 1.1.2 分化细胞系 早期细胞系是体外研究细胞生理学、生化机制和癌症的重要工具。然而，这些细胞系并不具有组织那样的分化功能。后来，各种分化的细胞包括来源于肝细胞癌的HepG2、人T细胞白血病的Jurkat、大鼠嗜铬细胞瘤的PC12被分离出来。这些分化的细胞系大多数是从癌组织中分离出来的，而不是正常的组织。与正常的同类细胞相比，它们更容易被分离出来，因为它们对体外生长所需的各种生长因子和细胞因子的依赖性减少。尽管它们携带着它们所来自的组织的表型特征，这些分化的细胞系成仍为了生物医学研究的有价值的工具。1.1.3 培养中的分化细胞 20世纪70年代rDNA技术的发明使得各种蛋白质试剂的生产变得更加简单。它扩大了生化试剂的制备能力，并大大提高了我们培养依赖生长因子和/或细胞因子的细胞的能力。原代细胞，如内皮细胞、角质形成细胞、软骨细胞和肝细胞，开始从正常的人体组织中分离出来并在体外培养。从组织中分离出来的原代组织细胞通常保留了许多组织特异性的活性，因此可以用于组织工程应用，如修复组织或增强组织功能。然而，大多数分化细胞的增殖潜能非常有限，并在培养过程中表现出表型不稳定。1.1.4 干细胞 对具有分化特性的细胞的探索，很快从分离已分化的细胞扩展到可以分化到特定谱系的干细胞。干细胞根据其分化潜能可以分为全能性干细胞、多能性干细胞和专能性干细胞。全能性细胞可以分化为任何类型的细胞，包括胚胎外组织。多能细胞（胚胎干细胞，诱导多能干细胞）可以成为在外胚层、中胚层和内胚层的三个胚层中发现的任何一种类型的细胞。专能性细胞可以分化为同一谱系的不同细胞类型。例如，造血干细胞（HSCs）可以通过暴露于不同的生长因子组合而分化成为任何类型的血细胞，生长因子可以是干细胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）。专能性HSCs已经可以从多能造血干细胞的骨髓、外周血和脐带血中已分离出来。间充质干细胞（MSCs），也是专能性的，最早从成人骨髓中分离出来，但现在发现几乎存在于所有的组织中。它们具备分化成成骨、软骨和成脂细胞的能力。它们也有产生大量生物活性分子的能力，并正在被发现作为可能的免疫调节和营养效应的信号细胞。1.1.5 多能性干细胞 稳定的小鼠胚胎干细胞（mESCs）首先来源于小鼠早期胚胎的内细胞团（ICM）。近20年后，两个实验室才获得了人类胚胎干细胞系（hESCs）。这些胚胎干细胞具有多能性，并能够分化为所有三个胚层的细胞类型。当它们在适当的培养条件下生长时，它们的核型特征是正常的。然而，hESCs来源于人类受精卵，这使得它们的使用在伦理上存在争议。相比之下，诱导多能干细胞（iPSCs）是通过将4个外源基因（OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc（OSKM））导入成人体细胞而获得的。它们可以很容易地来自不同的个体，因此没有伦理争议。在这些基因的引入后，一小部分转染的细胞增殖，绕过了细胞凋亡和细胞衰老，失去了体细胞的特性，并被重新编程为多能性细胞。从那时起，将成人体细胞重构成iPSCs，可以通过不同基因组合来修饰而成，甚至可以通过可以诱导表观变化的小分子的混合物的方式来完成。1.1.6 在体外诱导细胞分化 当一些细胞系暴露于适当的信号下时，它们可以在体外发生分化。例如，3T3细胞的亚克隆3T3-L1，能被诱导分化为脂肪细胞。PC12细胞在暴露于神经生长因子或地塞米松后，可最终分化为神经元样细胞。利用能够分化的细胞系用于体外药物测试，甚至用于治疗的潜力早已被认识到。大多数从组织中分离出来的原代细胞的增殖能力非常有限。原代肝细胞、软骨细胞和神经元细胞在培养中增殖的程度都非常有限，不能长时间培养。在某些情况下，可以从组织中分离出来的细胞混合物中富集细胞亚群。例如，从外周血中分离出来的T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞可以被培养并扩展到更大的细胞群。20年前，从免疫系统中分离和培养的细胞为今天的细胞治疗铺平了道路。从组织中分离出来的成体干细胞，如造血干细胞和间充质干细胞，也可以被引导分化为相关谱系的细胞（间充质干细胞分化为骨和肌肉细胞系，造血干细胞分化为淋巴系细胞）。这些成体干细胞是多能性的，只能被定向分化成它们各自相关的细胞系。有了多能干细胞，定向分化到所有三个胚层的细胞系现在是可能的，尽管大多数分化方案仍只产生成熟程度不足的组织样细胞。 将成年体细胞从一个细胞系直接重组到另一个细胞系也是可以的。细胞不是上升到ESC（胚胎干细胞）样状态，而是被基因因子的组合转导，并在分化培养基中培养后直接重新编程到目标分化状态。贝塔细胞、心肌细胞、神经元和肝细胞都是直接来源于体细胞的。1.2 细胞培养是一门工艺技术 早期的细胞培养渴望为科学研究建立一个生物平台，但即使如此，细胞培养的潜在应用也从未远离相关科学家的想法。在原代细胞可培养后不久，病毒在原代细胞培养中产生。细胞培养很快开始取代动物和鸡胚作为病毒疫苗的生产载体。值得注意的是，在20世纪50年代口蹄疫（FMD）病毒在小牛肾细胞中产生，脊髓灰质炎疫苗是在猴肾细胞中产生。随后，连续细胞系成为病毒的生产载体，包括生产FMD病毒的BHK细胞和生产脊髓灰质炎病毒的Vero细胞。人成纤维细胞MRC-5用于人疫苗的生产，而干扰素是由FS-4细胞生产。然而，正如我们在过去的20年里所看到的，是重组DNA（rDNA）技术和使用哺乳动物细胞生产治疗性蛋白质推动细胞培养成为了一个主要的制造方式。T细胞治疗的最新进展为治疗性细胞成为细胞培养过程的一类新产物带来了希望。1.2.1 病毒性疫苗 对抗病毒性疾病最有效的方法是广泛接种疫苗。现在大多数病毒疫苗都是利用细胞培养生产的。虽然动物组织不再被使用，但胚胎卵仍然是许多病毒生产方式，包括流感病毒。由于疫苗具有预防性和对公共卫生的影响，其价格与治疗性蛋白质不同。疫苗的综合商业价值远远低于药品总额，2015年全球的年总销售额约为300亿美元。流感病毒疫苗是为数不多的年销售额超过10亿美元的病毒性疫苗之一，但只有大约10%的疫苗是利用细胞培养生产的。其余的仍在用鸡胚生产。Table1.1列出了一些人用的病毒性疫苗。虽然病毒性疫苗在推进卫生保健方面取得了重大进展，但许多病毒性疾病，如艾滋病毒，仍然需要疫苗。 大多数病毒疫苗使用全病毒，要么是减毒活病毒，要么是被福尔马林灭活的病毒颗粒，从而使病毒丧失感染能力，但仍能引起免疫反应。用于免疫的减毒活病毒已被改造，通常通过在非人类宿主中长时间连续传代，以减少其对人类的毒性。减毒的病毒仍然能够复制，但速度往往较慢。它们在给药后继续复制，因此比使用灭活病毒所需要的免疫量更少。病毒疫苗也可以是由微生物或昆虫细胞系统中产生的蛋白质亚单位组成的、保留抗原性的亚单位疫苗。另一种疫苗，VLP（病毒样颗粒）在微生物或细胞系统中通过重组DNA技术产生的，但组装成没有病毒基因组的病毒蛋白质粒子。一个突出的例子是针对人乳头瘤病毒病毒的VLP疫苗，它是在酵母或昆虫细胞中产生的。 每次免疫接种的病毒疫苗的剂量都很低。因此，与蛋白质生物制剂相比，用于病毒疫苗生产的细胞培养设施相对较小。然而，20世纪60年代和70年代用于疫苗生产的细胞培养技术为随后治疗性蛋白生产的大规模生物加工奠定了基础。为了疫苗的生产，首先建立了细胞培养、培养基设计、过程控制、悬浮培养、搅拌式生物反应器中微载体粘附培养等基本细胞培养技术，后来这些技术被用于重组蛋白的生产。由于疫苗的供应，工业化国家的许多病毒性疾病在过去几十年里几乎都消失了。然而，在工业化国家中常规接种给普通人口的许多基本疫苗是世界上很大一部分人口无法获得的。降低这些疫苗的成本和改善其分配，使每个人都能获得这一基本的人类需要仍然是一项重大挑战。如今，一种传染病在世界任何地方的爆发都有可能迅速全球大流行。建立快速生产新病毒疫苗的技术，并在大流行期间对受影响地区提供快速反应机制仍然是一项挑战。1.2.2 蛋白质分子作为治疗方法 早在重组DNA技术到来之前，从血液、组织和细胞培养中提取的蛋白质就被用于治疗。例如，治疗治疗糖尿病的胰岛素，治疗中风的尿激酶，治疗凝血功能障碍的血友病的因子VIII，以及用于病毒感染的干扰素。第一波重组DNA治疗用蛋白，包括在大肠杆菌中生产的人生长激素和胰岛素（Table1.2）。随后的产物是人源的，但需要复杂的翻译后修饰，如复杂的二硫键形成和糖基化，这是微生物细胞无法完成的（Table1.3）。因此，我们使用了哺乳动物细胞。基于细胞培养技术的治疗用蛋白的早期发展集中于杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。杂交瘤细胞由骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而来，骨髓瘤细胞不能分泌抗体但能持续增殖，而B淋巴细胞能分泌特异性抗体但不能增殖。那些既能增殖又能产生所需抗体的融合细胞被分离出来进行抗体生产。由于B细胞是从免疫小鼠中获得的，该方法产生的是鼠源抗体，而不是人或人源化抗体。因此，杂交瘤技术很快让位于利用中国仓鼠卵巢（CHO）上皮细胞、小鼠骨髓瘤细胞和其他一些细胞系的重组DNA技术。通过转染目的基因和扩增其拷贝数的方式，转染的CHO细胞可以成为转基因产物的高生产者。此外，该基因可以经过设计来增加其与抗原的亲和力或将其蛋白质序列人源化。1987年，基因泰克公司引入组织型纤溶酶原激活剂（tPA）后，促红细胞生成素（EPO）和细胞因子VIII很快进入市场（Figure1.1）。 早期重组细胞培养产物是天然的人类蛋白，用于因同源疾病或某些疾病条件而缺乏蛋白质的患者（Panel1.2）。第二波治疗性蛋白是抗体。抗体产品占目前临床使用的蛋白质药物的大部分。早期的抗体产物，称为嵌合抗体，在分子的可变区域保留了的免疫物种的序列（主要是小鼠，因为小鼠杂交瘤是抗体分子的主要来源），而在恒定区域使用人类序列。后来的重组抗体分子是人源化（只保留小鼠序列的高变区域）或全人源的。Table1.4列出了一些基于抗体的治疗性蛋白的例子。曲妥珠单抗（商品名赫赛汀）与一种过表达的蛋白HER2结合，HER2之所以得名，是因为它与乳腺癌细胞表面的人类上皮生长因子受体1（HER1）结构相似。约20%的乳腺癌细胞过表达HER2蛋白，可以用该抗体治疗。它在临床上的成功为随后的抗体药物和基于抗体Fc片段的药物的增长铺平了道路。最近，针对在许多癌细胞中过表达的PD-L1（程序性死亡配体1）的抗体成为了一种重要的药物。PD-L1存在于许多正常细胞中，它与T细胞上的PD-1结合，抑制T细胞介导的免疫反应。然而，一些癌细胞也表达PD-L1，以逃避T细胞的免疫应答。抗体与PD-L1或PD-1的结合阻止了癌细胞对T细胞激活的抑制，从而允许癌细胞被T细胞杀死。联邦政府几十年来对生物医学研究的大量投资和对疾病机制的更好了解，促进了抗体作为一种治疗方法的成功。一旦确定了疾病途径中的结合靶点并分离出该抗原，就可以获得针对该抗原的抗体，并优化其对该抗原的亲和力。因此，基于抗体的药物发现是基于疾病机制的和以设计为导向的。这种方法与传统的生化药物的发现是不同的，如抗生素、免疫抑制剂和抗癌药，这些生化药物的筛选主要依赖于结合分析法或生物测定法。候选抗体生物制剂的成功率远远高于生化药物。然而，令人警醒的是，一些人已经把1992年治疗感染性休克的抗体（抗金黄色葡萄球菌毒素）临床试验的失败，作为抗体治疗的讣告。抗体治疗的真正成功和FDA批准的生物制剂数量的快速增长直到90年代下半叶才真正出现，也就是重组DNA技术和第一波风险投资的生物技术公司到来近20年后。 抗体是血液循环中最丰富的蛋白质之一。它们可溶性高，可以由B细胞高水平分泌。抗体分子的一部分，即Fc区域，是许多治疗性融合蛋白的主要成分。在这些融合蛋白中，蛋白质的功能结构域（或片段）通过一个连接体片段连接到载体结构域上（Figure1.2）。Fc片段为抗体提供了许多特性。一个突出的例子是IgG的Fc片段和TNFα受体结合片段（能与TNFRα肿瘤坏死因子α（TNFα）结合）的融合分子。该分子与TNFα结合并抑制其炎症作用。这种非天然蛋白质正被越来越多地作为药品进行探索。双特异性抗体（BsAbs），顾名思义，利用两个不同抗体分子的抗原结合位点，同时靶向细胞通路的两个组成部分，从而提高临床疗效。双特异性T细胞衔接子（BiTEs）是一种特殊的双特异性抗体，它通过衔接宿主免疫系统的T细胞来治疗癌症。越来越多的抗体被衍生化以连接药物。这些抗体-药物偶联物（ADCs）通过识别细胞表面的特定抗原，将细胞毒性药物特异性地传递到病变细胞中。许多正在开发的生物制剂包括抗体-药物偶联物、双特异性抗体和双特异性或三特异性免疫细胞衔接子。 图1.2 常规抗体和新一代抗体 （a）传统的单克隆抗体（mAb），由两个重链和两个轻链组成的四聚体; （b）融合蛋白，抗体的Fc区域与不同的蛋白质/受体融合; （c）双特异性抗体，它将两个抗原识别元件结合到一个结构上，使其能够与两个或多个目标结合。在本例中，一个抗原识别元件识别凝血因子X，另一个结合凝血因子IXa，模拟凝血因子VIII的功能来发挥凝血功能； （d）双特异性T细胞衔接子，一种专门招募T细胞活性的双特异性抗体，BiTEs没有Fc区域； （e）ADC，或一种与化学毒素共价连接的抗体。1.2.3 生物仿制药和蛋白质治疗的扩展 以哺乳动物细胞为基础的治疗蛋白在专利授权后，其市场排他性有限寿命为20年。在一种特定蛋白质治疗的专利到期后，该产品的仿制药，可以不经原药创新者的许可而由其他制造商销售。仿制药的上市降低了该药物的价格，并使工业化国家以外的患者更容易获得。生物仿制药的要求与一般的仿制药不同。化学药物（如控制胆固醇的他汀类药物和杀灭病原体的抗生素）的分子量相对于蛋白质较小，一旦确定其化学结构和纯度，通常会得到保护。这些小分子药物的仿制药，在对其化学性质、纯度和药品质量进行验证后，并在原药的专利到期后进入市场（Panel1.3）。相比之下，蛋白质生物制剂的结构和制造过程都是复杂的。当一种治疗性蛋白由不同的制造商使用不同的细胞系和不同的工艺生产时，生物制品的生物活性和临床疗效是不容易预测的。分子折叠的状态、聚糖的组成，甚至微小杂质的组成都可能影响活性和免疫原性。因此，即使其规模小于原始的（创新者）药物，生物仿制药也需要监管部门的批准，并且必须进行临床试验。 生物仿制药必须符合原药物产品质量标准——它必须具有相同的蛋白质序列、相似的翻译后修饰模式（如糖基化、磷酸化、硫酸化）和其他质量指标。然而，这些信息无法从原始创新药物的制造商那里获得。因此，生物仿制药制造商需从市场上获得产品（通常在不同的时间和地点，以涵盖广泛的变化），并进行广泛的产品表征，以开发产品质量概况。他们还必须建立一个生产细胞系并开发生产工艺，生产的产品需满足创新药质量指标。与创新药分子相比，生物仿制药可能提高了临床表现；这些被称为“生物改良药”。 生产具有可接受的翻译后糖基化的生物仿制药是一项具有挑战性的任务，但这对获得监管批准是至关重要的。糖基化的途径是非常复杂的。许多因素可以影响产物的糖基化，包括糖基化基因的表达、细胞的代谢状态和核糖的供应。控制通量，甚至只是调节糖基化途径中的通量，都不是一项容易的任务。将基于“组学”的分析与系统方法相结合，可能会创建一个预测工具，以帮助引导生物仿制药的糖基化，以更好地匹配创新分子。1.2.4 基因治疗 基因治疗的目的是通过引入具有正确基因序列的DNA分子，将正确的基因拷贝传递到患者的细胞来治疗同源疾病。受影响的组织可以被“纠正”以执行其正常的功能，或者，如果受影响的基因产物是一种分泌的蛋白质，则可以在患者体内表达一定水平的正确的蛋白质。由于大量的遗传性疾病可能受益于基因治疗，许多研究和临床试验正在开展。大多数研究都集中在由单一基因突变引起的疾病上。例如，囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）基因治疗囊性纤维化，凝血因子VIII基因治疗血友病。一些研究寻求将纠正后的基因拷贝“永久”纳入患者的细胞，而另一些研究则旨在短暂表达正确的基因，以在有限的时间内纠正疾病状况。随着基因组工程技术的进步，基因治疗的探索已经从提供一个正确的拷贝扩展到修复或沉默宿主细胞中的错误拷贝。 基因治疗可以通过分离患者的靶细胞，在体外进行基因转导，并将“纠正后”的细胞返回给患者来实现（Panel1.4），也可以通过将替代基因（或其他DNA元件）整合在纳米颗粒或质粒或病毒载体中，然后将它们注射到患者体内，并允许DNA元件进入体内的部分细胞并执行其功能来实现。大多数用病毒载体进行的临床试验都使用了腺病毒、慢病毒或腺相关病毒。 生产用于基因传递的病毒类似于生产用于疫苗的病毒。然而，两者也有一些重要的区别。每剂疫苗的病毒数量相当少，但在大多数应用中，基因治疗的病毒数量非常高（高出100到1000倍）。因此，对于一剂基因治疗所需的培养液量要比疫苗应用要大得多。这也意味着，在基因治疗产品中，必须从最终产品中去除的培养液中所携带的杂质的数量要比疫苗大得多。在活病毒的生产中，在生产结束时，培养液不能采用在治疗性蛋白生产中采用的纯化方式。因此，用于基因治疗的病毒的纯化和浓缩面临着更大的挑战。在一个典型的病毒生产过程中，产生的很大一部分病毒颗粒不包含完整的病毒基因组，也不具有传染性。虽然空病毒颗粒仍然具有免疫原性，并且可以有效地进行疫苗接种，但这些非传染性病毒颗粒不能提供基因治疗所需的DNA载体。 对细胞培养的生物加工技术来说，最近由监管机构批准的基因治疗产品非常令人鼓舞。然而，细胞培养生物加工技术专业仍然面临着基因治疗所需的病毒生产制造技术的重大挑战。 1.2.5 细胞治疗 骨髓移植已经实践了30多年，是最古老的细胞治疗形式之一（Panel1.5）。在发现HSC后，其扩展和分化为单独的谱系以供移植是长期设想的。一些人还预测了特定谱系细胞的富集和扩增，如血小板、T细胞或NK细胞。随着科学家分离和培养各种分化细胞的能力的提高，许多人还试图培养和扩增肝细胞或β细胞，用于细胞移植，以在功能上纠正肝衰竭或糖尿病。功能分化细胞也被掺入支架中，以构建用于植入的组织模拟物。利用功能细胞构建组织类似物的研究领域通常被称为组织工程。 各种多能和全能干细胞的出现给再生医学带来了希望。在细胞治疗中，使用干细胞作为分化细胞的来源，可以潜在地缓解这些应用中供体细胞获取的问题。全能干细胞可以为再生应用提供几乎无限的肝脏和NK细胞供应。许多这样的应用可以将分化细胞融合形成组织或器官。因此，细胞治疗是组织工程、再生医学等方面的重叠应用。 细胞治疗的一个领域已经显示出很大希望，即用来自免疫系统的细胞来治疗癌症，无论是天然细胞还是基因工程细胞。免疫系统的细胞可以在体外培养并通过基因修饰来表达细胞因子、受体和嵌合的肿瘤抗原受体，用于癌症免疫治疗。T细胞被设计后可以表达嵌合T细胞受体，该受体具有单链可变片段（scFv），并对对肿瘤抗原（TAA）具有高亲和力，这种T细胞称为嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞，已成功用于识别和杀死肿瘤细胞。 细胞治疗，尽管在临床上取得成功、在癌症治疗方面的巨大前景，但仍然面临着重大挑战。这些挑战不仅在于生产大量的细胞并将其移植到靶部位，还在于用于细胞的分离、扩增和作为药物产品的最终制备。在需要大量细胞的自体（来自患者）移植应用中，挑战尤其重大。如果没有生产规模的经济性，生产大剂量的细胞对自体治疗来说将是极高的商业成本。即使是异体（来自外部供体）移植的应用，对于细胞培养生物过程技术人员来说也存在很多挑战。制造工艺必须能产生具有高活力和治疗活性的细胞。这与蛋白质疗法的生产形成了鲜明的对比，在蛋白质疗法中，补料分批培养结束时的细胞活力有时仅略高于50%。纯化这些高活性的细胞用于细胞治疗也提出了另一个挑战。与蛋白质生物制剂的生产不同，在各种盐、pH、渗透压等对细胞有害的条件下，细胞治疗的细胞只能经过最少的步骤，同时达到必要的纯化程度。因此，在细胞治疗的广泛应用中，工艺技术中的许多挑战有待克服。 1.3 工业生产用细胞系 半个多世纪以来，细胞系一直被用于人类和动物疫苗的工业生产。对于人病毒疫苗的生产，人二倍体细胞株（特别是MRC-5）是最优选的细胞。传统病毒疫苗由整个病毒颗粒组成，其中病毒基因组被包装在病毒颗粒中，在生产细胞中复制其遗传物质。然后将整个病毒颗粒注射到患者体内以引发免疫反应。病毒基因组可能与生产细胞的遗传成分重组，并将宿主细胞的遗传元素带入病毒颗粒中，这是一种低水平的风险。这造成了将激活的致癌或其他偶然遗传因素传递给患者的潜在风险。为了将这种风险降至最低，绝大多数人类病毒疫苗都是在正常的二倍体人类细胞中生产的。Vero和MDCK细胞（以及鸡胚）是用于人类疫苗生产的非人连续细胞系的显著例外（Table1.5），对其传代次数进行了仔细监测和控制，以降低Vero细胞长时间传代会增加肿瘤形成的风险。对于动物疫苗来说，宿主细胞的数量要大得多。寿命有限的细胞系和组织衍生的细胞株（Table1.6）都被广泛使用。 用于生产重组治疗蛋白的大多数细胞系来源于啮齿动物，包括小鼠、中国仓鼠和叙利亚仓鼠。人类细胞只用于生产少数产品。绝大多数是使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系生产的（Panel 1.6）。CHO细胞在被普遍用于治疗性蛋白质生产之前就已经是细胞遗传学研究的宠儿。细胞遗传学研究中分离出大量CHO细胞突变体。这与其他哺乳动物细胞系形成对比（由于哺乳动物细胞是二倍体，突变体通常很难获得，因为只有显性表型是可观察到的。）然而，CHO细胞获得突变体的速率相对较高。它们有时被描述为功能性单倍体。 使用非人类细胞系生产治疗性蛋白质会带来宿主细胞的污染物（核酸、蛋白质）的风险，即使在经过多步纯化后，产品中也会有残留。这需要将产品中的污染宿主细胞蛋白质和DNA减少到可接受的水平，以将其引起任何免疫原性反应或其他不良影响的可能性降至最低。所需水平基于剂量，而不是每单位质量或体积的治疗蛋白。因此，蛋白质剂量越高，就越难将宿主细胞污染物减少到可接受的水平。许多治疗性抗体是以克/剂的水平给药的，而生长因子和细胞因子是几十毫克（Table1.7）。对于这种高剂量的产品，使用人类细胞系进行生产可能是有利的。然而，迄今为止，容易进行基因操作和获得高产细胞系的高概率的优势远远超过了去除残留宿主细胞蛋白质的要求。 许多病毒，包括慢病毒、腺病毒和腺相关病毒，被用作载体，在体内或体外将遗传物质递送到宿主组织或宿主细胞，用于基因治疗。这些病毒的产生通常在HEK293细胞中进行。HEK293细胞系来源于通过将5型腺病毒DNA片段插入其基因组而永生化的人类胚胎肾细胞。在某些情况下，昆虫细胞也用于病毒载体的生产。 在涉及干细胞或其他组织细胞的临床试验中，胚胎干细胞、iPSC或MSC的特定细胞系尚未成为常用或“标准”细胞系。在生物制品的工业生产中，用于生产的细胞的特点在于其细胞遗传学，需对其是否暴露于动物血清、病毒或其他外来因素等方面进行仔细检查，然后才能作为生产细胞制备主细胞库和工作细胞库。 这种细致的细胞表征和储存不适用于自体细胞治疗应用。1.4 其他生产系统 哺乳动物细胞是产生需要翻译后修饰（如糖基化）或复杂折叠的蛋白质的主力。许多不需要大量翻译后修饰的蛋白质是在大肠杆菌或酿酒酵母中产生的，包括胰岛素、人生长激素和一些细胞因子。甚至一些需要糖基化和其他翻译后修饰的蛋白质也在其他能够实现这些功能的宿主细胞系统中产生。其中一些系统已被探索作为治疗蛋白的生产载体（Table1.8，Panel 1.7）。 1.4.1 昆虫细胞培养 利用昆虫细胞进行蛋白质表达可以追溯到30多年前，大约是在酵母细胞和哺乳动物细胞被作为治疗性蛋白质的生产工具的时候。这种表达通常涉及将基因克隆到病毒中，如杆状病毒。然后通过将病毒转染昆虫细胞扩增。然后，所产生的病毒被用来感染生产过程中的宿主细胞。病毒在宿主细胞中的复制导致了大量的转基因拷贝。通过使用一个强启动子来驱动转基因的表达，可以实现高水平的蛋白表达。 一种流行的异源蛋白表达细胞系，Sf9，来源于昆虫果实夜蛾。昆虫细胞具备糖基化的功能，然而，昆虫系统中产生的蛋白质的糖型与哺乳动物中产生的蛋白质有些不同。例如，与哺乳动物相比，昆虫细胞中合成的N-聚糖具有较高的甘露糖含量和具有不同的糖苷键的海藻糖。因此，昆虫细胞系并不用于治疗性蛋白质的生产，尽管它们被用于研究用或毒性实验的蛋白质的生产。它们也经常用于生产重组蛋白，如在疫苗领域用作生产抗原蛋白或病毒样颗粒。此外，它们还被用于生产人类和动物病毒，作为疫苗或作为基因治疗中的转基因载体生产载体。昆虫细胞培养仍然具有吸引力，因为培养相对简单，工艺开发时间可以相对较短。1.4.2 酵母 酿酒酵母已被用于生产血清白蛋白、细胞因子和一些用作疫苗的病毒样颗粒（Table1.8）。然而，酵母中合成的重组蛋白上的聚糖与哺乳动物中的聚糖有显著差异。因此，酿酒酵母不用于生产需要糖基化的治疗性蛋白质。毕赤酵母属的酵母能够合成N-聚糖，但不是酿酒酵母中产生的富含甘露糖的类型。为了生产治疗性蛋白质，巴斯德毕赤酵母的糖基化特性在“人源化”方面取得了一些进展。通过多步骤基因工消除毕赤酵母糖基化修饰过程中的酶，然后引入人糖基化酶，从而可以合成具有人源化聚糖的蛋白质。但毕赤酵母分泌重组蛋白的速率低于重组哺乳动物细胞，这可以通过生物反应器高密度培养来补偿。随着分泌能力和糖基化模式的进一步提高，这些工程酵母菌株可能能够产生具有一致糖基化图谱的蛋白质。1.4.3 转基因动物 利用转基因动物，包括山羊、猪和兔子，来生产治疗性药物已经开发了30年。最常见的是，目的蛋白在乳腺中特异性表达，然后分泌到乳汁中。与生物制剂所需的传统生产系统相比，这些生产系统需要较低的成本。下游的纯化过程相对简单，因为蛋白质是完全糖基化的。由GTC生物疗法公司在转基因羊奶中生产的ATryn（抗凝血酶III）已获得美国和欧洲监管机构的批准。 转基因动物生产的一个优点是其在乳汁中的滴度高，约为2-10g/升。然而，多年来，细胞培养过程中的滴度已经增加到5-10g/L的范围，从而削弱了转基因动物生产的这种特殊优势。1.5 生产1.5.1上游工艺 细胞培养的工艺流程与微生物发酵的工艺流程几乎相同（Figure1.3）。尽管实验室风格的培养设备，包括摇瓶和平板，仍然用于一些疫苗和细胞治疗过程，但绝大多数疫苗、基因载体和蛋白质生产过程使用搅拌式生物反应器。与微生物发酵相比，细胞培养的代谢压力，如单位体积的营养和氧气消耗率，至少要低一个数量级，机械搅拌的功率输入也一样。 对于病毒疫苗、细胞因子和生长因子等，患者使用的剂量相对较少。因此，这些低剂量产品的生产规模也相对较小。相反，如Table1.7所示，抗体通常以高剂量使用，以维持更持久的效果。所以除了一些只用于小群体的孤儿药，抗体产品的生产规模要大于病毒疫苗等产品。 一个典型的工艺是在切换到生产反应器之前使用几个小反应器进行细胞扩增。这个周期往往比微生物发酵过程更长。补料分批培养在生产规模内可持续10-14天，总共可持续30-40天（包括种子培养）。灌流培养是连续的过程，可持续2到6个月。 对于细胞培养和微生物发酵，工艺工程的基本原理几乎是相同的。在这两个工艺中，化学计量关系被用于指导培养基设计，生长和生产动力学为过程优化的基础，物质传递为反应器设计的关键。用于生产生物制剂的反应器技术也大多来源于微生物发酵。然而，细胞培养工程由于其对生物经济的巨大贡献，在工艺创新中超过了微生物发酵。在过去的二十年里，在产品分离、分析和制造设施设计方面的技术进步，在细胞系和工艺开发中的平台概念的采用，一次性反应器的广泛应用，以及最近对连续工艺的探索，都是基于细胞培养驱动的。细胞培养工艺仍在发展，以满足越来越多的、创新的药物和生物仿制药。随着细胞和基因治疗的到来，细胞培养工程将继续成为一个关键的驱动力。1.5.2 一次性系统和连续生产工艺 在过去的十年中，上市产品数量的增加也提高了对生产能力的要求。生产能力要求提高并没有成比例增加工厂的生产规模，而是通过提高生产率和设备的使用效率来满足的。在过去的十年中，细胞培养产品的制造过程经历了一些重要的变化（Panel1.8）。为了缩短细胞扩增时间，一些人在工作细胞库中使用了高密度冻存，以在更大的生物反应器中启动种子链。在某些情况下，生产反应器在前一个种子培养（通常称为N-1）阶段采用某种形式的细胞灌流，以更高的细胞浓度接种，以缩短达到生产力峰值所需的时间。 在过去的十年里，一次性反应器的使用有所增加。十年前，一次性搅拌反应器仅用于接种物制备和少量生产，现在体积高达2000升的生物反应器在生产中变得越来越普遍。这是可行的，因为在细胞培养过程中搅拌所需的功率相对较低，塑料容器承受搅拌的机械应力。而且建设采用一次性生物反应器的工厂所需的成本更低、速度更快，其模块化的设计更能增加设施设备使用的灵活性。 一次性生物反应器也有一些缺点。它们中的大多数不能加压以使用固定管道在容器之间传输流体。许多叶轮的设计选择有限。对于一些细胞，特别是那些生长在微载体上的细胞，搅拌机制可能不是最佳的。尽管如此，一次性生物反应器的广泛应用已经改变了生物制造的格局。由于设备尺寸限制，必须使用多个反应器，或是增加产品的浓度或产量。这可以通过增加细胞密度和延长补料分批培养过程的持续时间或通过以连续方式运行该过程来实现的。 目前大多数细胞培养生物制造工艺都是以补料-分批模式进行的（Figure1.4）。在细胞快速生长几天后，在生产期间多次向培养基中加入含有高浓度的培养基，以逐步将培养体积增加到最大值。培养基的加入增加了培养液的渗透压。这与代谢物积累增加一起，减缓了细胞生长。在缓慢增长和稳定阶段，产品积累到较高水平。 简单的连续细胞培养很少使用，因为稳定状态下的细胞密度太低而无法实现高生产率。连续细胞培养更多使用的是灌流工艺，使用细胞分离器将从一部分培养液中分离细胞，并返回到生物反应器中以增加细胞密度。然而，目前只有少数工艺采用灌流培养。大多数灌流工艺都应用在不稳定的目的蛋白质或表达水平低的蛋白质。缺乏一种能够浓缩细胞并将其返回生物反应器的有效设备，导致了灌流工艺不能被广泛应用。 在过去的十年里，在线细胞分离设备取得了显著的进步。这使得连续灌流培养更容易实施，并允许进行灌流/补料分批的新的混合模式。混合灌流/分批补料培养通常以比典型分批补料工艺接种密度更高。这可以通过使用细胞分离装置来浓缩种子培养液来实现。该模式类似于补料分批培养，但高细胞密度导致了代谢物的高积累，需要连续去除培养基以降低代谢物水平，来缓解生长抑制、延长生产时间。1.5.3 产品纯化 细胞培养产物的纯化过程比细菌表达的重组蛋白的纯化过程更简单。大多数细胞培养过程现在使用具有低浓度蛋白质的培养基。在5-10 g/L的高浓度下，目的蛋白是细胞培养结束时培养液中的主要蛋白质。因此，产物的分离和纯化过程要简单得多，因为只需要去除相对少量的细胞宿主蛋白和其他培养基成分。 抗体IgG纯化的一个例子如Figure1.3所示。在细胞培养结束之后，将来自反应器的细胞悬浮液在储罐中冷却以防止细胞裂解。离心或微滤用于移除细胞。为了随后的层析步骤和膜过滤工艺，先通过微滤去除上清液中的颗粒物质，然后使用超滤浓缩。对于一些生产率非常高的工艺，这一步骤可能没有必要，因为产品浓度已经很高了。然后将超滤产物加入蛋白A亲和层析柱中。该色层析步骤以非常高的产率和纯度捕获产物。洗涤后，用低pH缓冲液洗脱吸附的IgG。这使宿主细胞内可能形成的内源性逆转录病毒失活。在病毒失活后，使用纳滤步骤来去除病毒颗粒。因为有时会发生蛋白质聚集，所以还可以采用凝胶层析步骤来去除聚集的IgG。宿主细胞会有细胞蛋白质和DNA片段脱落到培养基中并污染产物。为了降低这些污染物的水平，可以使用阴离子交换层析法。纯化后，对产品溶液进行过滤，以便在制剂溶液中进行制备最终产品。 随着人们对连续灌流培养的重新关注，进行了连续纯化产物的研究。从典型的纯化过程中可以看出，几乎所有的单元操作都是连续流系统，但以周期性分批模式操作。该策略是连接这些单元操作，并通过在每个单元操作中使用多个较小的设备使其适应来自生物反应器的连续进料。它们将在操作的不同阶段循环，从而始终有一件设备接收来自前一操作的进料。一些人设想使用容量相当低的设备，这种设备在短时间内循环使用，以便设备快速完成其生命周期。通过这种方式，设备可以是一次性的，并且在短时间的连续操作后可以更换。这一愿景是否会得到实施，以及它可能带来多大的运营和成本效益，还有待观察。1.6 细胞培养工艺中的产品质量1.6.1 产品质量 细胞培养产品的质量是根据其对靶标的生物活性能力来判断的，同时需将引起任何生物危害的风险降至最低。在大多数情况下，生物活性的直接测量，以生物测定甚至动物测定的形式，是不容易评估的。人们会检查一些易于测量的生化性质。例如，肽图用于在生产后蛋白质产品的鉴别（Panel1.9）。 产品的质量不是一成不变的，很容易随着时间的推移而变化。由于产物在合成过程中的变化，这种质量变异可能发生在细胞培养过程的不同阶段，也可能发生在产品纯化过程中，或者甚至发生在蛋白质已经纯化并储存在制剂溶液中之后。根据化学或物理变化的性质，产品质量变化可能以快或慢的动力学发生。因此，质量不仅仅取决于原料药和制剂产品。对于缓慢动力学变化的变量，质量也需要在库存条件下进行评估。例如，纯化后的蛋白或制剂在长时间储存后，由于聚集，可能会出现颜色或溶液变得浑浊。这种质量变化只能随着时间的推移进行评估。 一般来说，产品必须没有一些已知的污染物质，或者能够将其保持在一定水平以下。例如，啮齿动物细胞中产生的蛋白质甚至在产品纯化后也可能携带一些宿主细胞成分。宿主的蛋白质、DNA污染物和内源性病毒（在产品纯化过程中未被去除并存在于最终产品中）必须保持在可接受的水平以下，以最大限度地降低这些污染物对患者的风险。 蛋白质的结构变体（例如，蛋白质分子序列中的氨基酸与编码氨基酸不同）经常出现在细胞培养产生的蛋白质中。即使结构变体没有已知的不良影响，变体也必须保持在被认为是低风险的水平以下。 蛋白质的聚糖结构总是表现出异质性。在聚糖结构影响蛋白质生物活性的情况下，期望的聚糖的含量和不期望的聚糖含量必须保持在一定范围内。即使在聚糖结构不会直接影响蛋白质的生物活性的情况下，也必须规定聚糖的异质性程度，并且在不同时间或不同生产地点生产的不同批次的产品都必须符合相同的规范。1.6.2 结构特征和生物活性 细胞培养产生的蛋白质、病毒和细胞的产物结构都是复杂的。对它们的质量进行评估并不容易。最终，用作疫苗的病毒质量取决于其引发免疫原性反应的能力。对于基因治疗，产物病毒的质量由其感染靶细胞和表达递送基因的能力决定。不同的治疗蛋白发挥其生物效应的机制是非常多样的。一些结合并中和或去除靶分子，而另一些结合到靶细胞并引发杀伤细胞的杀伤作用。在工艺环境中直接评估这种生物功能是不可行的。相反，人们根据对生物活性至关重要的结构特征和作用机制来制定产品质量指标。例如，对于流感病毒，除了病毒颗粒计数外，血凝素水平可以用作质量指标。在基因治疗中，转基因拷贝与病毒颗粒的比例可以用作质量指标。在涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC，也称为抗体依赖性的细胞毒性）治疗性IgG的生产中，岩藻糖基化聚糖的比例被用作质量检测，因为聚糖上岩藻糖的存在显著降低了IgG的ADCC活性。因此，在使用产品的结构特征作为质量指标时，了解所涉及产品的作用机制非常重要。1.6.3 糖基化修饰 连接在蛋白上的聚糖在结构上是异质的。这在血液循环的糖蛋白以及细胞培养中产生的治疗性蛋白质中很常见。一些蛋白质的聚糖结构在蛋白质的治疗效果中起着关键作用（Panel1.10）。例如，许多溶酶体中酶的聚糖上存在甘露糖-6-磷酸，这对于介导蛋白质与细胞质膜上的甘露糖6-磷酸受体结合至关重要，这是将酶靶向溶酶体所必需的步骤。因此，这些酶的聚糖上甘露糖6-磷酸的丰度水平对于治疗溶酶体贮积病至关重要。在某些情况下，聚糖结构不会直接影响蛋白质的生物活性，但会影响其药代动力学行为。例如，红细胞生成素和许多其他蛋白质上唾液酸含量较高，会增加这些蛋白质的循环半衰期。如果没有唾液酸，暴露的半乳糖会与肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体结合，导致蛋白质的内化和降解。 一种蛋白质在其糖基化序列中可能具有多个位点。聚糖结构在给定的位点上是不统一的。相反，它由许多不同的结构组成。这种异质性是其在高尔基体中的生物合成反应的结果。聚糖的分布也可能在不同的生产运行中，或在不同的制造条件或细胞系下有所不同。这种变异对其临床疗效的影响取决于蛋白质的作用机制。如上所述，对一些人来说，这是非常重要的；对其他人来说，它可能会影响血液循环的半衰期，但不会影响生物活性。然而，从监管的角度来看，产品的聚糖分布必须在特定的范围内。因此，将聚糖分布限制在可接受的范围内对于产品的质量控制很重要。更好地理解产品的作用机制可以帮助定义产品的可接受的异质性范围。1.6.4 蛋白质结构变异 在选择产品的生产细胞系之前，应验证整合到基因组中的产品基因的所有拷贝的DNA序列，以确保转入基因的完整性。因此，人们期望蛋白质的一级序列和二级、三级甚至四级结构将是始终如一的。然而，在天然蛋白质和重组蛋白质中都会出现蛋白质的结构变体。它们是由翻译错误、翻译后酶促反应不完全、分泌后细胞外的酶促反应或化学反应，修饰后反应引起的（Panel1.11）。在更高阶结构水平上，蛋白质分子可能形成二聚体或低聚物，并可能打乱二硫键，甚至形成大聚集体和沉淀。在一级序列水平上，序列变体包括蛋白质中不正确的氨基酸插入和氨基酸的化学修饰。 许多生产细胞系具有目的基因的多个拷贝。利用高通量DNA测序技术，可以验证候选生产细胞系基因组中多个转基因拷贝的DNA序列，以确保其完整性。一旦选择了细胞系，转基因拷贝随后发生突变的可能性非常低。然而，如果在极少数情况下，其中一个拷贝中发生错义突变（即导致蛋白质中氨基酸变化的突变），将不可避免地导致一部分突变的蛋白质分子的存在。序列变体也可能由培养基中的氨基酸缺失引起，如报道的小部分IgG中的丝氨酸取代天冬酰胺。在极少数情况下，可以看到蛋白质的信号肽切割不完全。 重组蛋白的一些常见结构变体列在Panel1.11中。许多蛋白质在其C末端具有赖氨酸残基。这些赖氨酸残基在细胞内被羧肽酶切除。然而，切除往往是不完整的。C末端未切除的赖氨酸经常出现在天然蛋白质以及重组蛋白质的生产中。 工业补料分批培养通常采用高葡萄糖浓度。因此，分泌的产物蛋白质分子长期暴露于高葡萄糖浓度下。糖化，即糖附着在氨基酸侧链上的氨基上，是常见的。糖化作用也见于人体内循环的蛋白质中。 一些氨基酸修饰导致蛋白质净电荷的变化。这些带电的变体可能是在阴离子交换层析柱中比“正常”或参比品洗脱得更快的酸性峰，也可能是在阳离子交换层析中洗脱更快的碱性峰。酸性的变体也可能由糖基化修饰的变化引起，例如由唾液酸或硫酸盐含量的增加。1.6.5 过程控制与产品质量 蛋白质中聚糖的异质性主要是细胞内生物合成的结果。当细胞活力低时，蛋白质分泌到培养液中后，细胞释放的酶可能会降解聚糖（尤其是唾液酸酶去除唾液酸）。蛋白质结构变异大多发生在蛋白质被翻译后，或细胞内亦或蛋白质被分泌到培养基中后。蛋白质加工酶可以由细胞分泌或由于细胞裂解而释放。细胞外蛋白水解切割已被证明会导致因子VIII的降解，并导致tPA和蛋白质C的单链/双链分子比例的改变。一些更高阶的蛋白质结构变化，如聚集、甲硫氨酸的氧化和天冬酰胺的脱酰胺，甚至可能在产物纯化过程中发生。 对产品质量的日益重视要求了解细胞内反应如何影响聚糖谱，以及细胞外培养环境如何影响蛋白质变体的发生。理想情况下，这可以提高我们控制工艺条件的能力，并提供一致的生产效率和产品质量。对过程技术发展的重视越来越集中在在线监测和控制的分析技术（PAT）上。与PAT齐头并进的是质量源于设计（QbD）。QbD的目的是加强对过程的理解，并确定对产品质量贡献最大的过程变量。可以制定策略来控制这些变量，将产品质量属性限制在可接受的范围内。 为了实现QbD，需要定义产品质量属性，并了解过程变量和质量属性之间的关系。最初，可以依赖于将过程变量和质量属性相关联的经验数据。随着时间的推移，机理模型对于开发控制策略变得至关重要。在这样的努力中，质量和生产效率是不可分割的。基于生产效率和质量，对培养机理的理解被纳入工艺模型，该模型将输入的扰动转化为维持生产效率和产品质量的必要控制措施。基于基因组学、蛋白质组学和代谢组学的系统分析方法的进展，将促进PAT和QbD在细胞培养生物过程中的实施。1.7 从发现到临床产品 开发新药的成本高得惊人。典型的药物发现始于最初的疾病治疗方案，和用于生物和毒性测试以及药代动力学评估的产品开发。然后决定哪些产品推进到临床试验、生产细胞系的构建，上游、下游和制剂的初始工艺开发，产品的化学和生物学检测方法的开发。同时进行的是第一阶段试验、第二阶段试验、商业化生产规划和实施、文件编制，并最终提交给监管机构。传统流程按顺序将不同团队和药物开发的不同阶段交错排列如下图。（Figure1.5a） 降低药物开发成本的一个关点键是缩短时间线，将通常的6-8年开发时间压缩为2-3年，因为监管机构现在许可具有突破性药物的加快上市。这种加速的发展改变了细胞培养技术人员、发现化学家、药剂师和蛋白质工程师的合作方式。药物开发中大多数任务的持续时间不能按比例缩短，以适应缩短的时间表；例如，不能缩短细胞的倍增时间以允许更短的细胞株开发时间。因此，整体开发时间线的压缩不是通过按比例缩短每项任务的完成时间，但要使它们在时间上重叠。在细胞系构建完成之前，必须开始工艺开发和产品分析开发。因此，项目流程从一个任务团队将其完成的对象移交给下一个团队，转变为不同的任务团队同时以交叉的方式共同工作（Figure1.5b）。  这一变化的一个重要结果是，来自不同开发领域的科学家和工程师越来越多地协同工作。每个人都必须获得药物开发过程中其他部分的知识。二十年前，在生物技术的初期，人们呼吁让工程师学习生物学，让科学家了解一些过程控制的知识。 如今，工程师和科学家在同一行业携手合作。这种新的跨学科交流远不止是跨学科还是跨产品开发部门的交叉沟通。上游和下游工艺技术人员都需要理解监管专家和药剂师的行业术语，反之亦然。在未来的几年里，一批新的跨界科学家和工程师将出现，引领我们领域的进步。