TLR7 agonists(Bristol Myers Squibb)

摘要：大多数疫苗传统上通过肌肉注射给药，但皮肤因含有大量抗原呈递细胞，正逐渐成为更具免疫原性的疫苗接种部位。皮内接种可提高流感疫苗的效力，并在猴痘疫苗短缺时节省剂量 。然而，皮内接种比肌肉注射更容易引发局部反应，因此需要安全有效的佐剂来增强皮内接种效果 。本文将介绍目前已批准用于人类疫苗的佐剂及其皮内接种的反应原性，探讨正在研发的化学和物理佐剂，分析物理佐剂的研发原理、类型及优势，旨在为皮内接种疫苗的佐剂选择提供参考。一、皮肤结构皮肤是人体最大的器官，具有防止热量和水分流失、抵御病原体感染等重要生理功能 。它主要分为三层：角质层、表皮和真皮（插入原文 Fig. 1，展示皮肤结构和驻留的先天免疫细胞的示意图，帮助读者直观理解皮肤的结构组成）。角质层位于皮肤最外层，由角质细胞组成，具有很强的疏水性，是皮肤的主要屏障 。表皮层在角质层下方，主要由角质形成细胞构成，其中还散布着朗格汉斯细胞，这些细胞能作为免疫哨兵发挥作用 。真皮层则包含汗腺、毛囊、血管、淋巴管和神经纤维等多种结构，还有成纤维细胞和树突状细胞、巨噬细胞等先天免疫细胞 。此外，皮肤中还存在大量的 T 淋巴细胞，其中大部分是皮肤驻留记忆 T 细胞。这些驻留的先天免疫细胞不仅是抵御病原体感染的第一道防线，还能诱导针对病原体或疫苗的适应性免疫反应。二、皮内接种疫苗的优势过去，大多数疫苗选择肌肉注射，主要是因为操作方便，无需太多专业培训 。但近二三十年来的大量研究发现，将疫苗接种途径从肌肉注射改为皮内注射，能诱导更强的免疫反应 。这主要是因为皮肤中富含抗原呈递细胞，如表皮的朗格汉斯细胞和真皮的树突状细胞，而肌肉中这类细胞相对较少 。皮内疫苗的抗原会被抗原呈递细胞摄取，并呈现在主要组织相容性复合体（MHC） I 或 II 类分子上，随后这些细胞迁移到引流淋巴结，引发抗原特异性的 T 细胞和 B 细胞反应 。同时，皮内疫苗还能激活局部先天免疫细胞，分泌细胞因子和趋化因子，招募循环中的先天免疫细胞 。多项研究表明，皮内接种流感疫苗比肌肉或皮下接种在老年人中更具免疫原性，低剂量的皮内流感疫苗就能在年轻人中引发与全剂量肌肉注射相当的免疫反应 。此外，皮内接种对狂犬病疫苗、乙肝疫苗等也能增强免疫反应 。在猴痘疫情爆发期间，由于疫苗短缺，美国食品药品监督管理局（FDA）批准皮内注射猴痘疫苗，以扩大疫苗的使用范围，保护更多高危人群。三、皮内接种疫苗的局限性尽管皮内接种能提高疫苗的免疫原性，但提升程度相对有限 。例如，皮内接种流感疫苗仅能节省 40 - 60% 的剂量，在老年人中，其对不同流感毒株的血清转化率提升幅度也较小 。而且，皮内接种疫苗面临诱导显著局部反应的风险 。研究发现，无佐剂的皮内疫苗比肌肉注射疫苗更容易引发频繁且严重的局部不良反应 。这是因为皮肤中存在多种先天免疫细胞，它们在促进抗原摄取和增强适应性免疫的同时，也会通过合成和释放细胞因子、趋化因子，招募外周的中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞，从而导致局部不良反应 。因此，用于皮内接种的佐剂需要比肌肉注射用佐剂具有更好的局部安全性。本文主要聚焦于介绍用于增强针对传染病的皮内接种疫苗的佐剂，且重点关注增强皮内蛋白和亚单位疫苗诱导的免疫反应的佐剂，不涉及疫苗 / 佐剂配方（如聚合物纳米颗粒、脂质体）的相关内容 。四、已批准佐剂及其皮内反应原性疫苗佐剂在 21 世纪受到越来越多的关注，因为它们在新型和改进型疫苗的开发中起着关键作用 。美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）在 2008 年启动了 “佐剂开发计划”，支持新型佐剂的筛选、鉴定和临床前 / 临床开发 。在过去的二十年里，有五种佐剂被批准用于人类疫苗，而在此之前的八十年里仅有两种 。但这些佐剂均是被批准用于肌肉注射，其皮内注射的局部不良反应风险可根据肌肉注射的局部反应原性进行预测（原文 Table 1，展示目前已批准的佐剂及其皮内反应原性的相关信息，包括佐剂名称、描述、批准年份、适用疫苗、Th1/Th2 偏向、粒径和皮内反应原性等级，直观呈现各类佐剂的特点和潜在风险）。铝佐剂：是全球使用最广泛的佐剂，主要基于氢氧化铝或磷酸铝，能增强 Th2 偏向的抗体反应，但诱导细胞介导免疫反应的能力较弱 。肌肉注射铝佐剂会导致显著的组织应激和细胞死亡，引发细胞因子 / 趋化因子释放，招募大量免疫细胞 。皮内注射实验性铝佐剂 Imject 也会导致小鼠皮肤炎症细胞高密度浸润，且持续至少四天。因此，铝佐剂皮内注射有较高风险引发显著局部反应 。AS04 佐剂：是由 MPL 吸附在氢氧化铝佐剂上制成的组合佐剂 。MPL 作为 TLR4 激动剂，能激活相关信号通路，诱导促炎细胞因子基因表达 。AS04 被批准用于增强人乳头瘤病毒疫苗的效力，但研究发现，与无佐剂疫苗相比，AS04 佐剂疫苗会引发更频繁的局部反应，如疼痛、红肿和肿胀 。我们之前的研究也发现，皮内注射 MPL/Alum 佐剂会导致皮肤真皮组织出现红斑、肿胀和大量炎症细胞浸润 。这表明 AS04 佐剂皮内注射有较高风险引发显著局部反应 。AS01 佐剂：是一种脂质体制剂，包含 MPL 和从皂树皮中纯化的皂苷成分 QS21 ，被批准用于增强疟疾 RTS,S 疫苗的效力，能诱导 Th1 为主的免疫反应 。AS01 在肌肉注射后会迅速从注射部位清除，诱导细胞因子短暂表达，并快速招募免疫细胞 。考虑到其成分 MPL 的作用，以及 MPL 和 QS21 的协同效应和对局部炎症的强烈诱导，AS01 佐剂皮内注射后有较高风险引发显著局部反应 。MF59 和 AS03 佐剂：都是基于角鲨烯的水包油纳米乳液佐剂，分别由诺华和葛兰素史克开发 。MF59 用于增强季节性流感疫苗和大流行前 H5N1 疫苗的效力，AS03 则用于增强 2009 年 H1N1 流感大流行疫苗和大流行前 H5N1 疫苗的效力 。这两种佐剂主要诱导 Th2 偏向的免疫反应，且弱诱导 Th1 反应 。肌肉注射 MF59 会导致组织应激和细胞死亡，更强烈地招募免疫细胞，皮内注射类似 MF59 的 AddaVax 佐剂也会引发大量免疫细胞招募和细胞因子、趋化因子的长时间表达 。肌肉注射 AS03 会诱导持续的细胞因子表达，引发内质网应激 。这些都表明 MF59 和 AS03 佐剂皮内注射可能引发显著局部反应 。Matrix-M 佐剂：由两种源自皂苷提取物的 40 纳米颗粒配方组成，已被用于新冠疫苗（NVX-CoV2373） 。Matrix-M 佐剂能诱导 Th1 偏向的免疫反应，但接种该佐剂的新冠疫苗后，局部不良反应的发生率高于安慰剂组 。在猪模型中，肌肉注射 Matrix-M 佐剂会引发急性炎症、出血和坏死 。虽然目前尚无研究探讨其皮内接种的效力和安全性，但相关研究提示其有较高风险引发显著局部反应 。CpG 1018：是一种含未甲基化 CpG 基序的寡核苷酸，能激活 TLR9 和 MyD88 信号通路，刺激 Th1 偏向的抗体反应和细胞介导的免疫反应，已被用于乙肝疫苗 。研究发现，皮内注射小鼠特异性 CpG 会诱导轻微的局部反应和低水平的免疫细胞招募，因此预计 CpG 1018 皮内反应原性较低，有望安全地增强皮内接种效果 。总体而言，大多数已批准的佐剂皮内注射有较高风险引发显著局部反应，而具有高皮内反应原性的化学佐剂大多是颗粒状的，它们会强烈激活局部先天免疫系统 。不过，CpG 1018 可能是个例外，它诱导的炎症较轻，不会引发明显的局部反应。五、其他用于安全皮内接种的化学佐剂鉴于已批准佐剂的高局部反应原性，研究人员探索了其他化学佐剂用于安全皮内接种的可能性，部分佐剂已进入临床试验阶段（原文 Fig. 3，展示用于皮内接种的安全佐剂的化学结构，包括 CpG 1018、GLA-AF、咪喹莫特、Poly (I:C)、cGAMP 和 PCPP 聚合物，帮助读者了解这些佐剂的化学特性）。GLA-AF 佐剂：一些已批准的佐剂（如 AS01 和 AS04）含有 MPL 来增强疫苗效果 。虽然 MPL 未被批准作为单一佐剂，但研究发现皮内注射 MPL 在小鼠模型中仅诱导轻度炎症，无明显局部不良反应 。Carter 等人评估了合成的 TLR4 激动剂 GLA - 水基配方（GLA-AF）对雪貂和人类皮内 H5N1 疫苗接种的增强作用，发现 GLA-AF 对雪貂的单剂量疫苗保护和人类的血清保护至关重要，且在豚鼠和人体临床研究中未引起明显不良反应，这表明 GLA-AF 及其他 TLR4 激动剂在皮内接种方面具有潜力 。局部咪喹莫特佐剂：外用咪喹莫特乳膏（5% Aldara）已被 FDA 批准用于治疗多种疾病，它是 TLR7 激动剂，能激活相关信号通路，诱导促炎细胞因子和 I 型干扰素基因表达 。在一项双盲、随机、对照临床试验中，皮内注射流感疫苗前外用咪喹莫特乳膏，可提高针对疫苗病毒株和非疫苗病毒株的血清转化率 。在炎症性肠病患者中，皮内注射乙肝疫苗前使用外用咪喹莫特乳膏，其血清保护率显著高于肌肉注射组 。虽然外用咪喹莫特组局部不良反应更频繁，但总体安全性良好，表明其可显著提高皮内疫苗效力 。Poly (I:C) 佐剂：Poly (I:C) 是双链 RNA 的合成类似物，根据其所在位置可激活不同的信号通路 。在皮内或透皮疫苗接种中，它被用于诱导针对多种传染病的有效免疫反应 。不同研究中，Poly (I:C) 佐剂的效果有所差异，较低剂量（1µg）时可能效果不明显，而 25µg 的 Poly (I:C) 可显著增强皮内 HIV-1 gp140 或 HSV-2 gD 糖蛋白诱导的全身和黏膜抗体反应 。近期，一项 1 期临床试验测试了与光化学内化技术联合使用的 Poly (I:C)，初步表明该方法安全性良好，这显示了 Poly (I:C) 作为皮内接种佐剂的安全性 。cGAMP 佐剂：2′3′ - 环鸟苷酸 - 腺苷酸（cGAMP）可激活细胞内干扰素基因刺激蛋白（STING）通路，诱导促炎细胞因子和 I 型干扰素基因表达 。在小鼠和猪模型中，皮内注射 cGAMP 与流感 H5N1 或 2009 年大流行 H1N1 疫苗联合使用，可显著增强疫苗诱导的免疫反应，且未引发明显局部不良反应 。研究还发现，cGAMP 在增强皮内 H5N1 免疫方面比 CpG 或 MPL 更有效，这表明 cGAMP 等 STING 激动剂可作为安全的皮内接种佐剂 。PCPP 佐剂：微针是一种有吸引力的皮内疫苗递送技术 。Andrianov 等人发现聚 [二（羧基苯氧基）磷腈]（PCPP）可作为安全的佐剂，用于增强猪的微针介导的皮内乙肝疫苗接种效果 。在该研究中，仅观察到轻微的皮肤发红，无严重不良反应 。此外，一种新的聚磷腈聚合物（PCEP）也被发现可安全地增强仔猪皮内流感 H1N1 疫苗接种的免疫反应 。这些研究表明某些 PRR 激动剂作为皮内佐剂是安全的，且化学性质为水溶性或水基配方的佐剂，通常具有较低的皮内反应原性 。六、用于安全皮内接种的物理佐剂除了化学佐剂，在皮内疫苗接种前对皮肤表面进行短暂的物理能量处理，也被探索用于增强皮内接种效果。研发原理：过去，佐剂的开发很大程度上依赖经验或试错法，尤其是对于非病原体相关分子模式（PAMP）的佐剂，如铝佐剂、MF59 和 QS21 等 。这些佐剂没有特定的细胞受体来介导其佐剂作用，而是通过刺激组织应激和细胞死亡，释放内源性危险信号或损伤相关分子模式（DAMPs）来发挥作用 。“危险理论” 认为，免疫系统会被应激或受损细胞释放的危险信号激活，这解释了在没有外来病原体入侵时，如移植排斥、某些化疗诱导的抗肿瘤免疫激活等情况下，适应性免疫的诱导机制 。近年来发现的多种 DAMPs，如尿酸、ATP、双链 DNA 等，在生理条件下不会被免疫系统识别，但在组织应激或细胞死亡时会释放出来，激活免疫系统 。例如，铝佐剂可刺激尿酸释放，激活 NLRP3 炎性小体和 Caspase 1，部分介导其促炎反应；MF59 佐剂能刺激 ATP 释放，增强免疫反应 。这些发现提示，可控的组织应激或细胞死亡可能诱导内源性危险信号释放，从而增强疫苗接种效果，为物理佐剂的开发提供了理论依据。物理佐剂类型：目前研究最多的用于疫苗佐剂的物理能量是激光和射频，其类型多样（原文 Fig. 4，展示不同类型的激光佐剂（全表面、非剥脱性分数、剥脱性分数）和射频佐剂的简要示意图，帮助读者直观理解不同物理佐剂的作用方式）。激光佐剂：激光发射的窄波长光可被特定组织发色团吸收，在美容和医学领域有广泛应用 。多种激光被探索用于增强皮内接种效果，如铜蒸气激光可通过诱导持续局部炎症增强疫苗免疫反应；非侵入性 Q - 开关 Nd:YAG 532nm 激光治疗可显著增强模型抗原和流感疫苗诱导的免疫反应，且不引起可见或组织学皮肤损伤，其作用机制可能是增强了 MHC II + 细胞的迁移 。近红外激光（NIR）在 1064nm 波长下，可诱导特定趋化因子表达，增加皮肤中 DC 浓度，促进 DC 迁移至引流淋巴结，增强疫苗免疫反应，且在人体试验中显示出良好的安全性 。非剥脱性分数激光（NAFL）通过发射高能微激光束在皮肤表面形成微热区，招募浆细胞样 DCs，与外用咪喹莫特联合使用，可显著增强皮内流感疫苗和疱疹肽疫苗的免疫反应 。此外，基于剥脱性分数激光（AFL）的粉末递送系统（LPD）可实现无针透皮疫苗递送和佐剂作用，AFL 治疗虽会诱导细胞因子和趋化因子释放及免疫细胞招募，但皮肤能在数天内完全恢复，且具有良好的免疫增强效果 。射频佐剂：射频（RF）是一种交变电磁波，在中高频（0.3 - 10MHz）时可产生组织加热，在肿瘤治疗和皮肤重塑等方面有应用 。研究发现，在皮内疫苗接种前进行双极 RF 处理，可诱导短暂、低水平的局部炎症，显著增强抗原摄取、DC 迁移和成熟，增强 OVA 和流感疫苗诱导的免疫反应，且在低剂量疫苗时表现出良好的剂量节省效果 。RF 还能增强重组核蛋白（NP）和基质蛋白 1（M1）为基础的通用 T 细胞疫苗诱导的 CD8 + T 细胞反应，对异源病毒产生交叉保护免疫 。比较组织蛋白质组学研究表明，RF 诱导的局部组织蛋白质组变化最小，这与其诱导的短暂、低水平局部炎症相符 。物理佐剂的优势：物理佐剂在皮内疫苗接种前，通过在皮肤表面短暂应用物理能量来增强免疫反应（原文 Fig. 5，展示化学佐剂和物理佐剂在皮内接种中的不同作用机制，清晰呈现二者的差异，帮助读者理解物理佐剂的独特优势）。与化学佐剂相比，物理佐剂主要由医疗设备递送，可在室温下保存，无需冷链储存；使用的设备可重复使用，且每次使用成本相对较低 。物理佐剂无需与疫苗混合，不会改变或影响疫苗的制造和给药过程 。其作用主要局限于治疗部位，不太可能诱导显著的全身或长期副作用，而化学佐剂可能会迁移至引流淋巴结甚至全身循环，广泛激活免疫系统 。物理佐剂诱导的组织应激可控，能使皮肤快速恢复，通常诱导短暂、低水平的局部炎症，而化学佐剂往往会引发持续且更强烈的局部炎症 。物理佐剂主要通过改变局部环境，增加 DC 的运动性、诱导内源性危险信号释放以增强抗原摄取和 DC 成熟，或促进 DC 迁移到引流淋巴结，从而增强疫苗诱导的免疫反应。在适当开发的情况下，物理佐剂的效果可以与化学佐剂相媲美。七、专家评论皮肤作为疫苗接种部位，具有高度免疫原性，皮内疫苗接种通常能诱导比肌肉注射更强的免疫反应，在提高疫苗效力和节省疫苗剂量方面具有很大潜力。事实上，已有多种疫苗获批用于皮内注射，如流感疫苗、狂犬病疫苗和猴痘疫苗等。然而，皮内接种存在诱导显著局部反应的风险，目前大多数已批准的佐剂因高局部反应原性不适合皮内注射，因此迫切需要开发新型佐剂以安全地增强皮内接种效果，同时避免明显的皮肤反应。近期研究发现了几种有潜力安全增强皮内接种的化学佐剂，包括 CpG 1018、GLA-AF、局部咪喹莫特、Poly (I:C)、cGAMP 和 PCPP 等。其中，CpG 1018 已被批准用于增强肌肉注射乙肝疫苗的效果，GLA-AF 和局部咪喹莫特已在临床试验中用于增强皮内流感疫苗的效果，这些佐剂因其在人体中已建立的安全性，可进一步测试其对皮内接种的增强作用。Poly (I:C) 在肿瘤内、肌肉或皮下注射的临床试验中已显示出良好的耐受性，也可考虑用于评估其对皮内接种的增强效果 。皮内接种佐剂的好处包括进一步提高疫苗效力、节省更多疫苗剂量以及可能诱导交叉保护性免疫 。流感疫苗是测试皮内接种佐剂的理想选择，可解决疫苗不匹配问题，降低每年流感疫苗生产的负担。但在批准佐剂用于皮内接种时，需要仔细评估其效益 / 风险比。除化学佐剂外，不同类型的物理佐剂（如激光、射频）也在探索用于安全增强皮内接种 。物理佐剂是一种相对较新的佐剂类型，利用物理能量诱导组织应激来增强皮内接种效果。尽管其在提高人类疫苗效力方面的潜力仍有待探索，但近期对化学佐剂（如铝佐剂、MF59）中内源性危险信号关键作用的认识，为物理佐剂的开发提供了支持 。目前，物理佐剂在临床前动物模型中的研究显示出良好的安全性和增强皮内接种效果的潜力 。然而，物理佐剂的开发仍面临一些挑战 。首先，物理佐剂基于设备，目前缺乏指导其开发和批准的指南 。其次，物理佐剂的开发需要设备制造商、疫苗公司和监管机构的共同努力，多方参与可能会带来新的挑战 。此外，目前使用物理佐剂的皮内接种需要分两步进行，即物理佐剂处理和皮内疫苗注射，这比使用化学佐剂的接种过程更耗时，公众对这种新型接种方式的接受度也有待研究 。21 世纪以来，佐剂开发受到了极大关注，在新佐剂的批准和佐剂作用机制的阐释方面取得了显著进展 。这些努力有望促进安全的化学和物理佐剂的开发，以增强皮内接种效果，为疫苗接种领域带来新的突破。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。