Trastuzumab Biobetter (United BioPharma)

1.细胞培养简介：历史视角 1.1.细胞培养中的早期创新 培养的哺乳动物细胞是生产生物制剂这一类药物的主力军，包括病毒疫苗和许多蛋白质药物。许多人可能不知道，在细胞培养的黎明时期，培养细胞具有类似艺术的性质，这项技能需要大量的创造力、好奇心、激情和毅力，以及科学家的所有优秀品质。在二十世纪初，动物组织的外植体开始在浸泡在动物组织液中的玻璃表面上被培养。组织团块中的细胞生长出来，存活并可观察几天。从组织团块的外生长中，一些细胞可以被分离出来，最终被解剖出来并扩展到新的玻璃表面上。传代或扩展细胞群体的能力是真正的细胞培养的重要一步。最早建立的可以连续在培养中扩展的细胞系之一是小鼠L细胞。早期的细胞系只能通过不断的传代在实验室中维持；它们不能被冷冻、储存，然后解冻以恢复生长。在那个时代，复杂的营养混合物不能通过加热来消毒。相反，血清、腹水或鸡胚提取物需要从动物身上小心分离，以保持细胞培养的无菌性（图1.1）。 图 1.1. 细胞培养技术中的里程碑。 想象一下维持培养细胞所涉及的工作量！冷冻动物精子的冷冻保存的发现，以及其他细胞的冷冻保存，允许实验室中的细胞生长暂停和恢复。另一个重要的进步是使用胰蛋白酶进行细胞传代，而不是依赖解剖来分离细胞从表面。第一个人类细胞系，HeLa，源自人类宫颈癌，充分利用了这一点。细胞培养进步的关键之一是膜过滤基础的介质灭菌的到来，首先是使用硝酸纤维素膜的超滤，后来是微滤。虽然用于微生物的盐水和介质可以通过高压灭菌器进行灭菌，但动物细胞所需的复杂营养物质在高温下会被破坏。膜灭菌加速了化学营养介质的发展，包括葡萄糖、氨基酸、维生素和平衡的盐。这不仅推进了我们对细胞营养需求的认识，也极大地简化了培养细胞的物流，导致了许多重要细胞系的建立，最终实现了细胞培养的工业化。能够连续传代的早期细胞系，包括小鼠L和HeLa，都是从癌组织中衍生出来的（面板1.1）。在形态上，它们看起来异常，与最初从正常组织中培养的原代细胞不同。后来，从各种动物组织中分离出连续细胞系，包括来自叙利亚仓鼠的婴儿仓鼠肾（BHK），来自绿猴肾的Vero8，以及来自中国仓鼠卵巢的中国仓鼠卵巢（CHO）。这些细胞系携带了使它们能够绕过细胞内部生长控制机制的突变。这些细胞在表型上并不正常。它们通常不表现出接触抑制。在充足的营养供应下，它们在表面上长成多层细胞。后来，建立了3T3细胞系，该细胞系依赖于粘附，表现出接触抑制，并且不会经历衰老。10但3T3细胞的核型（或染色体组成），以及其他连续细胞系，是异倍体，而不是二倍体。大约在同一时间，表型正常的人类成纤维细胞系，如WI-38，后来的MRC-5和FS-4，被分离出来。这些细胞是二倍体，表现出接触抑制，但不像3T3那样是连续细胞系。它们在培养中经过反复传代后会衰老。几十年来，这些细胞系和细胞株在生物科学和医学研究中发挥了重要作用，许多被用于病毒疫苗和其他生物制剂的工业生产。 1.2.分化的细胞系 早期的细胞系是体外研究细胞生理学、生化机制和癌症的重要工具。然而，这些细胞系并不具备组织所具有的分化功能。后来，各种分化组织的细胞被分离出来，包括来自肝细胞癌的HepG2，来自人类T细胞白血病的Jurkat，以及来自大鼠嗜铬细胞瘤的PC12。大多数这些分化细胞系是从癌组织而不是正常组织中分离出来的。与它们的正常对应物相比，它们更容易被分离，因为它们减少了体外生长所需的各种生长因子和细胞因子的依赖。尽管如此，它们携带了它们所衍生的组织的表型特征，这些分化的细胞系成为了生物医学研究的宝贵工具。 1.3.培养中的分化细胞 20世纪70年代rDNA技术的到来，使得各种蛋白质试剂的生产变得更加简单。它扩大了生化试剂的库存，并大大增加了我们培养需要生长因子和细胞因子的细胞的能力。内皮细胞、角质细胞、软骨细胞和肝细胞等原代细胞开始从正常人体组织中分离出来并在体外培养。从组织中分离出来的原代组织细胞通常保留许多组织特异性活动，因此可以被利用于组织工程应用，如修复组织或增强组织功能。然而，大多数分化细胞在培养中的增殖潜力非常有限，并且表现出表型不稳定性。 1.4.干细胞 对具有分化特性的细胞的追求很快从分离终末分化细胞扩展到能够分化为特定谱系的干细胞。干细胞根据其分化潜能进行分类：全能干细胞、多能干细胞和多能干细胞。全能干细胞可以变成任何类型的细胞，包括胚外组织。多能干细胞（胚胎干细胞、诱导多能干细胞）可以变成外胚层、中胚层和内胚层三种胚层中的任何一种细胞类型。多能干细胞可以分化为同一谱系中的不同细胞类型。例如，造血干细胞（HSCs）可以通过暴露于不同的生长因子组合，如干细胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF），分化为任何类型的血细胞。多能HSCs已从骨髓、外周血和脐带血中分离出来。间充质干细胞（MSCs）也是多能的，最初是从成年骨髓中分离出来的，但现在几乎在所有组织中都发现了它们。它们主要能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。它们还能够产生大量的生物活性分子，并且正在作为信号细胞进行研究，以探索可能的免疫调节和营养效应。 多能干细胞 稳定的小鼠胚胎干细胞（mESCs）最初是从早期小鼠胚胎的内细胞团（ICM）中分离出来的。大约二十年后，两个实验室才从人类胚胎中衍生出人类胚胎干细胞系（hESCs）。这些胚胎干细胞是多能的，能够分化为所有三种胚层的细胞类型。在适当的培养条件下，它们在核型上是正常的。然而，hESCs是从受精的人类卵子中衍生出来的，这使得它们的使用在伦理上存在争议。相比之下，诱导多能干细胞（iPSCs）是通过将四个外源基因（OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc（OSKM））引入成年体细胞中衍生出来的。它们可以轻易地从不同的个体中衍生出来，因此没有伦理争议。在引入这些基因后，一小部分转染的细胞增殖，绕过了凋亡和细胞衰老，失去了体细胞特征，并被重新编程为多能细胞。从那时起，成年体细胞向iPSCs的重新编程已经通过一些基因组合的修改，甚至通过诱导表观遗传变化的小分子混合物来实现。 1.5.体外引导细胞分化 当一些细胞系暴露于适当的信号时，它们可以在体外进行分化。例如，3T3细胞的一个亚克隆，指定为3T3-L1，可以被诱导分化为脂肪细胞。PC12细胞在暴露于神经生长因子或地塞米松时，可以终末分化为类似神经元的细胞。使用能够分化的细胞系进行体外药物测试甚至治疗的潜力早已被认识到。大多数从组织中分离出来的原代细胞的增殖能力非常有限。原代肝细胞、软骨细胞和神经元细胞在培养中增殖非常有限，不能长期培养。在某些情况下，可以通过使用化学信号来富集从组织中分离出来的细胞混合物中的一个亚群，这些化学信号可以优先刺激它们的增殖。例如，从外周血中分离出来的T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞可以被培养和扩增成更大的群体。二十年前从免疫系统中分离和培养这些细胞为今天的细胞治疗铺平了道路。从组织中分离出来的成年干细胞，如HSC和MSC，也可以被引导分化为相关谱系的细胞（MSC到骨骼和肌肉谱系，HSC到淋巴样谱系）。这些成年干细胞是多能的，只能被引导分化为它们各自的相关谱系。有了多能干细胞，现在可以有针对性地分化为所有三种胚层的谱系，尽管大多数分化协议仍然只产生成熟程度不足的类组织细胞。也可以直接将成年体细胞从一个谱系重新编程为另一个谱系。细胞不是上升到ESC样状态，而是通过基因因子的组合进行转导，并在培养分化介质中直接重新编程为目标分化状态。β细胞、心脏细胞、神经元和肝细胞都已直接从体细胞中衍生出来。 2.细胞培养作为过程技术 早期的细胞培养探索旨在建立一个科学研究所的平台，但即使在那时，细胞培养的潜在应用也从未远离科学家们的思想。原生代细胞变得可培养后不久，病毒就在原生代细胞培养中产生。细胞培养很快开始取代动物和孵化的鸡胚，成为病毒疫苗的生产工具。值得注意的是，口蹄疫（FMD）病毒是在原生代小牛肾细胞中产生的，脊髓灰质炎疫苗是在1950年代的原生代猴肾细胞中产生的。随后，连续细胞系成为病毒的生产工具，包括用于FMD病毒的BHK细胞和用于脊髓灰质炎病毒的Vero细胞。人类成纤维细胞MRC-5被用于人类疫苗生产，而干扰素是由FS-4细胞产生的。然而，正如我们在过去二十年中所见证的，重组DNA（rDNA）技术和使用哺乳动物细胞生产治疗蛋白推动了细胞培养成为主要的制造工作马。T细胞治疗的最新进展为治疗性细胞将成为细胞培养过程的新产品类别提供了希望。 2.1.病毒疫苗 对抗病毒性疾病最有效的方法就是通过疫苗进行广泛免疫。目前大多数病毒疫苗是在细胞培养中生产的。虽然不再使用动物组织，但胚胎鸡蛋仍然是包括流感病毒在内的许多病毒生产的一部分。由于它们的预防性质和对公共卫生的影响，疫苗的价格并不像治疗性蛋白那样高。疫苗的总商业价值远低于药品的总和，2015年全球年销售额约为300亿美元。流感病毒疫苗是少数年销售额超过10亿美元的病毒疫苗之一，但只有大约10%的剂量是在细胞培养中生产的。其余的仍在鸡蛋中生产。表1.1列出了一些供人类使用的病毒疫苗。尽管病毒疫苗在推进医疗保健方面取得了重大进展，但许多病毒性疾病，如HIV，仍然需要疫苗。 大多数病毒疫苗使用整个病毒，无论是活减毒病毒还是通过甲醛或其他化学处理灭活的病毒颗粒，使病毒无法感染但仍能引发免疫反应。用于免疫的活减毒病毒已经适应，通常是通过在非人类宿主中长期连续传代，以减少它们对人类的毒力。减毒病毒仍然能够复制，但通常速度较慢。它们在被施用后继续复制，因此需要的免疫剂量比使用灭活病毒要小。 病毒疫苗也可能是由在微生物或昆虫细胞系统中产生的蛋白质亚单位组成的亚单位疫苗，这些蛋白质亚单位保留了免疫原性。另一种疫苗，VLP，由在微生物或细胞系统中通过重组DNA技术生产的蛋白质组成，但组装成不含病毒基因组的病毒颗粒。一个突出的例子是针对人类乳头瘤病毒的VLP疫苗，它在酵母或昆虫细胞中生产。 每次免疫的病毒疫苗剂量很低。因此，与生产蛋白质生物制剂相比，病毒疫苗生产的细胞培养设施相对较小。尽管如此，为疫苗生产建立的细胞培养技术为1970年代和1980年代后续大规模生物处理治疗蛋白生产奠定了基础。细胞库、培养基设计、过程控制、悬浮培养和在搅拌罐生物反应器中微载体上的贴壁生长的基本细胞培养过程都是首先为疫苗生产建立的，后来被采用于重组蛋白生产。 在过去几十年中，由于疫苗的可用性，许多工业化世界的病毒性疾病已经几乎消失。然而，工业化国家常规给予普通人群的许多基础疫苗对于世界很大一部分人口来说是遥不可及的。降低这些疫苗的成本并改善它们的分配，使这一基本人类需求能够为每个人所用，仍然是一个主要挑战。如今，世界任何地方的传染病爆发都有可能迅速成为全球大流行。建立能够快速生产新病毒株疫苗并在大流行期间向受影响地区提供快速响应的制造技术仍然是一个挑战。 2.2.作为治疗剂的蛋白质分子 在重组DNA技术出现之前，来自血液、组织和细胞培养的蛋白质已被用于治疗目的。例子包括用于治疗糖尿病的胰岛素、用于中风的尿激酶、用于血液凝固障碍血友病的因子VIII和用于病毒感染的干扰素。第一波重组DNA治疗蛋白，包括人类生长激素和胰岛素，是在大肠杆菌中生产的（表1.2）。随后的产品也是人类来源的，但需要复杂的翻译后修饰——如复杂的二硫键形成和糖基化——这些修饰不能由微生物细胞进行（表1.3）。因此，使用了哺乳动物细胞。 基于细胞培养的治疗蛋白的早期开发集中在杂交瘤细胞产生的单克隆抗体上。杂交瘤细胞来源于不产生抗体但能持续增殖的骨髓瘤细胞和特定抗体分泌但非分裂的B淋巴细胞的融合。那些既能生长又能产生所需抗体的融合细胞被分离出来用于生产。由于B细胞是从免疫小鼠中获得的，因此该方法产生的是小鼠抗体而不是人类或人源化抗体。杂交瘤技术很快让位于使用中国仓鼠卵巢（CHO）、小鼠骨髓瘤和其他一些细胞系的基于重组DNA的方法。通过引入编码产品的转基因并放大其拷贝数，可以使转导的CHO细胞成为转基因产品的高产者。此外，可以对转基因进行工程改造，以增加其对抗原的结合亲和力或人源化其蛋白质序列。自1987年Genentech引入组织型纤溶酶原激活剂（tPA）以来，促红细胞生成素（EPO）和因子VIII很快进入市场（图1.1）。 早期的重组细胞培养产品是针对因遗传疾病或某些病状导致蛋白质缺乏的患者使用的天然人类蛋白质（Panel 1.2）。第二波治疗蛋白是抗体。抗体产品构成了当今临床使用中的蛋白质药物的大部分。早期的抗体产品，称为嵌合抗体，在分子的可变区保留免疫物种（主要是小鼠，因为小鼠杂交瘤是抗体分子的主要来源）的序列，同时在恒定区使用人类序列。后来的重组抗体分子是人源化的（仅保留小鼠序列的高变区）或完全是人类。表1.4列出了一些基于抗体的治疗蛋白的例子。曲妥珠单抗（商品名赫赛汀）与乳腺癌细胞表面的过度表达蛋白HER2结合，HER2之所以这样命名，是因为其结构与人类上皮生长因子受体1（HER1）相似。大约20%的乳腺癌细胞过度表达HER2蛋白，可以用抗体治疗。它在临床上的成功为后续抗体药物和基于抗体Fc区域的药物的增长铺平了道路。最近，针对在许多癌细胞中过度表达的PD-L1（程序性死亡配体1）的抗体已成为一类重要的药物。PD-L1存在于许多正常细胞中，它与T细胞上的PD-1结合以抑制T细胞介导的免疫反应。然而，一些癌细胞也表达PD-L1以逃避T细胞的免疫反应。抗体与PD-L1或PD-1的结合阻止了癌细胞抑制T细胞激活，从而允许T细胞杀死癌细胞。 作为治疗类别的抗体的成功得益于联邦政府对生物医学研究的数十年巨额投资和对疾病机制的更好理解。一旦在疾病途径中识别出结合靶标并对抗原进行分离，就可以获得针对该抗原的抗体并优化其对抗原的亲和力。因此，基于抗体的药物发现是基于机制的，并且以设计为导向。这与传统的生化药物如抗生素、免疫抑制剂和抗癌药物的发现形成对比，后者主要依赖于使用结合测定或生物测定进行筛选。候选抗体生物制剂的成功率远高于生化药物。然而，回想起1992年Centoxin（一种针对金黄色葡萄球菌毒素的抗体，用于治疗败血症休克）临床试验的失败，一些人将其视为抗体治疗的讣告，这是令人清醒的。抗体治疗的真正成功和FDA批准的生物制剂数量的快速增加直到1990年代后半期才真正发生，这几乎是在重组DNA技术和第一波风险资本资助的生物技术公司到来近二十年后。 抗体是血液循环中最丰富的蛋白质之一。它们高度可溶，并且可以由B细胞以高水平分泌。抗体分子的部分，即Fc区域，是许多治疗性融合蛋白的主要组成部分。在这些融合蛋白中，蛋白质的功能域（或片段）通过连接片段与载体域连接（图1.2）。Fc片段提供了抗体的许多属性。一个突出的例子是IgG的Fc片段和肿瘤坏死因子α（TNFα）受体（TNFRα）的TNFα结合片段的融合分子。该分子与TNFα结合并抑制其炎症效应。这些非天然蛋白质越来越多地被探索作为药物。双特异性抗体（BsAbs）顾名思义，使用来自两个不同抗体分子的抗原结合位点同时靶向细胞途径的两个组分，从而提高临床疗效。双特异性T细胞引导剂（BiTEs）是一种特殊的双特异性抗体，它们激活宿主的免疫系统中的T细胞以治疗癌症。越来越普遍的做法是将抗体衍生化，使其包含药物。这些抗体-药物偶联物（ADCs）通过识别细胞表面的特定抗原，将细胞毒性剂特异性地传递给患病细胞。许多生物制剂的产品线包括抗体-药物偶联物、双特异性抗体以及双特异性或三特异性免疫细胞引导剂。 图 1.2. 传统和新一代抗体。(a) 一种传统的单克隆抗体(mAb)，由两个重链和两个轻链组成的四聚体。(b) 一种融合蛋白，其中抗体的Fc区域与不同的蛋白质/受体融合。(c) 一种双特异性抗体，它将两个抗原识别元素结合到一个单一的结构中，使其能够结合两个或更多的靶标。在这个例子中，一个抗原识别元素识别血液凝血因子X因子，另一个与因子IXa结合，模仿因子VIII的功能以实现血液凝固。(d) 一种专门招募T细胞活性的双特异性抗体被称为双特异性T细胞引导剂(Bispecific T-cell engager, BiTE)。BiTEs没有Fc区域。(e) 一种抗体与化学毒素共价连接，或称为抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugate, ADC)。 2.3.生物类似药和蛋白质治疗的扩展覆盖范围 赋予哺乳动物细胞基于的治疗蛋白市场独占性的专利有有限的20年寿命。在特定蛋白质治疗的专利到期后，该产品的通用版本，称为生物类似药，可以由其他制造商在市场上销售，而无需原创药物的创新者的许可。通用版本的可用性降低了药物的价格，使其更容易被工业化国家以外的患者获得。生物类似药的监管与通用药物不同。化学药物（如控制胆固醇的他汀类药物和杀死病原体的抗生素）的临床有效性，其分子量相对较小，一旦确定了它们的化学结构和纯度，就可以得到保证。这些小分子药物的通用版本，在验证其化学身份、纯度和药物产品质量后，可以在原始药物的专利到期后进入市场（Panel 1.3）。相比之下，蛋白质生物制剂的结构和制造过程都很复杂。当使用不同的细胞系和不同的过程由不同的制造商生产治疗蛋白时，生物药物的生物活性和临床疗效不易预测。分子折叠的状态、糖苷组成，甚至是微小杂质的组成可能会影响活性和免疫原性。因此，生物类似药需要监管批准，并且必须进行临床试验，尽管规模小于原始（创新）药物。 生物类似药必须符合与原药相同的产品质量标准——它必须具有相同的蛋白质序列，类似的翻译后修饰模式（例如糖链、磷酸盐或硫酸盐的轮廓），以及其他质量指标。然而，这些信息无法从原创新药的制造商那里获得。因此，生物类似药制造商必须从市场（通常在不同的时间和地点以涵盖广泛的变异性）获取产品，并进行广泛的产品特性分析，以开发产品质量档案。他们还必须建立一个生产细胞系，并开发一个过程，以生成符合创新药同等质量指标的产品。生物类似药的临床性能可能比创新分子有所提高；这些被称为“生物优品”。 以可接受的翻译后糖基化模式生产生物类似药是一项挑战性任务，但这是获得监管批准的必要条件。糖基化途径非常复杂。许多因素可以影响产品的糖基化模式，包括糖基化基因的表达、细胞的代谢状态和核苷糖的供应。控制或甚至只是调节糖基化途径中的通量并非易事。结合“组学”分析的强大功能与系统方法，可能创建一个预测工具，以帮助引导生物类似药的糖基化模式更好地匹配创新分子。 2.4.基因治疗 基因治疗旨在通过引入具有正确遗传序列的DNA分子，将正确的基因副本传递到患者的细胞中，以治疗遗传性疾病。受影响的组织随后可以被“纠正”以执行其适当的功能，或者，在受影响的基因产物是一种分泌蛋白的情况下，可以在患者的体内以功能水平产生正确的蛋白质。由于可能从基因治疗中受益的遗传性疾病数量众多，因此有许多正在进行的研究和临床试验。大多数工作都集中在由单个基因突变引起的疾病上。例如，囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因治疗囊性纤维化，凝血因子VIII基因治疗血友病。一些方法寻求“永久性”地将修正后的基因副本并入患者的细胞中，而其他方法则旨在短暂表达正确的基因以纠正疾病状况一段时间。随着基因组工程技术的进步，基因治疗的探索已经从提供正确的副本扩展到修复或沉默宿主细胞中的错误副本。 基因治疗可以通过分离患者的靶细胞并在体外进行基因转导来实现，然后将“修正”的细胞返回给患者（Panel 1.4）。也可以通过将替代基因（或其他DNA元素）悬浮在纳米颗粒或质粒或病毒载体中，然后将它们注入患者体内，允许DNA元素进入体内的一部分细胞并发挥其功能。大多数使用病毒载体进行的临床试验使用了腺病毒、慢病毒或腺相关病毒。用于基因传递的病毒生产与用于疫苗的病毒生产类似。然而，也存在重要差异。虽然疫苗每剂所需的病毒数量相对较少，但基因治疗在大多数应用中的病毒数量非常高（比疫苗高100至1000倍）。因此，对于基因治疗，所需的培养液体积比疫苗应用大得多。这也意味着必须从最终产品中去除的培养液中的杂质数量在基因治疗产品中比疫苗多得多。在活病毒的生产中，生产结束时培养液不能经历与治疗蛋白生产中相同的广泛纯化。因此，基因治疗病毒的纯化和浓缩面临更大的挑战。在典型的病毒生产过程中，产生的病毒颗粒中有很大一部分不包含完整的病毒基因组并且不具有传染性。虽然空病毒颗粒仍然具有免疫原性，并且可以有效地用于疫苗接种，但这些非传染性颗粒不传递基因治疗所需的DNA货物。因此，在基因治疗病毒生产中增加传染性病毒颗粒的含量非常重要。 监管机构最近批准基因治疗产品对细胞培养生物加工非常鼓舞人心。然而，细胞培养生物工艺行业在基因治疗病毒生产所需的制造技术方面仍面临重大挑战。 2.5.细胞治疗 骨髓移植已经实践了三十多年，是最早的细胞治疗形式之一（Panel 1.5）。在发现造血干细胞（HSC）之后，人们长期以来一直设想将其扩增和分化为不同的谱系以进行移植。一些人还预测了某种特定谱系的细胞的富集和扩增，如血小板、T细胞或NK细胞。随着科学家分离和培养各种分化细胞的能力增强，许多人也试图培养和扩增肝细胞或β细胞，以通过细胞移植功能上纠正肝功能衰竭或糖尿病。功能性分化细胞也被纳入支架中，以构建用于植入的组织模拟物。使用功能性细胞构建组织类似物的研究领域更常被称为组织工程。 各种多能和全能干细胞的出现为再生医学带来了希望。使用干细胞作为细胞治疗的分化细胞来源，可以潜在地缓解这些应用中供体细胞获取的问题。PSC可以为再生应用提供几乎无限的肝细胞和NK细胞供应。许多这样的应用将涉及将分化的细胞注入再生组织或器官中。因此，细胞治疗涉及与组织工程、再生医学等的重叠应用。 细胞治疗领域中显示出巨大潜力的一个方向是利用免疫系统的细胞来治疗癌症，无论是原生细胞还是经过基因工程改造的细胞。免疫系统的细胞可以在体外培养并经过基因修饰以表达细胞因子、受体和用于癌症免疫治疗的嵌合肿瘤抗原受体。经过工程改造以表达具有单链可变片段（scFv）和对肿瘤相关抗原（TAA）具有高亲和力的嵌合T细胞受体的T细胞，称为嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞，已被成功用于识别和杀死肿瘤细胞。 细胞治疗在最初的临床成功和在癌症治疗方面的巨大潜力下，仍然面临主要挑战。这些挑战不仅包括在目标部位植入大量细胞的生产，还包括细胞分离、扩增和作为药物产品的最终准备。在需要大量细胞的自体（来自患者）应用中，这一挑战尤为严峻。没有规模经济的生产，大量剂量的生产使得这些自体治疗的商品成本异常高昂。即使对于异体（来自外部供体）应用，细胞培养生物工艺技术学家在推动该领域前进时也面临许多挑战。生产过程必须产生具有高活性和治疗活性的细胞。这与蛋白质治疗药物的生产形成对比，在后者中，一批喂养过程结束时的细胞活性有时仅略高于50%。对于细胞治疗，恢复那些高度活跃的细胞面临着另一个挑战。与蛋白质生物制剂的生产不同，后者可以经受各种盐分、pH值和渗透压条件，这些条件对细胞来说是有害的，而细胞治疗的细胞只能经历最少的步骤，同时实现必要的纯化程度。因此，在细胞治疗的广泛应用中，过程技术方面仍有许多挑战需要克服。 3.工业细胞系 细胞系已经被用于人类和兽医疫苗的工业生产超过半个世纪。对于人类病毒疫苗的生产，人二倍体细胞系（特别是MRC-5）是首选的细胞基质。传统的病毒疫苗由整个病毒颗粒组成，病毒基因组在生产细胞中复制其遗传物质后被包装在病毒颗粒中。然后整个病毒颗粒被注入患者体内以引发免疫反应。病毒基因组可能会与生产细胞的遗传元素重组，并把宿主细胞的遗传元素带入病毒颗粒，存在低水平的风险。这带来了将激活的致癌或其他外来遗传元素传播给患者的潜在风险。为了最小化这种风险，绝大多数人类病毒疫苗是在正常的二倍体人类细胞中生产的。Vero和MDCK细胞（连同鸡胚）是人类疫苗生产中使用的非人类连续细胞系的显著例外（表1.5）。在连续细胞系被用于人类疫苗生产的情况下，其传代次数被仔细监控和控制，以缓解报告引起的担忧，即Vero细胞的长期传代增加了肿瘤形成的风险。然而，近年来分子分析的进步正在迅速扩展我们对细胞和产品的特性描述能力。人们越来越有兴趣探索使用连续的甚至肿瘤形成能力的细胞系来生产病毒生物制剂。对于兽医疫苗，宿主细胞的阵容要大得多。细胞系和组织衍生的有限寿命细胞系被广泛使用（表1.6）。 用于生产重组治疗蛋白的大多数细胞系源自啮齿动物，包括小鼠、中国仓鼠和叙利亚仓鼠。人类细胞仅用于少数产品的生产。绝大多数是使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系生产的（Panel 1.6）。CHO细胞甚至在被广泛用于治疗蛋白生产之前，就已是细胞遗传学研究的宠儿。在细胞遗传学研究中分离出了大量的CHO细胞突变体。这与其他哺乳动物细胞系形成对比；由于它们的二倍体性，通常很难获得突变体，因为只有显性表型是可观察的。然而，CHO细胞中获得突变体的比率相对较高。它们有时被描述为功能性单倍体。使用非人类细胞系生产治疗蛋白存在产品中可能含有宿主细胞污染物（核酸、蛋白质）的风险，即使在经过广泛的纯化之后。这就需要将产品中的污染宿主细胞蛋白和DNA减少到可接受的水平，以最小化它们引起任何免疫反应或其他不良反应的可能性。所需水平是基于每次剂量，而不是基于要施用的治疗效果的单位质量或体积。因此，蛋白质剂量越高，降低宿主细胞污染物到可接受水平的难度就越大。许多治疗性抗体的剂量是每次几克，与生长因子和细胞因子的几十毫克形成对比（表1.7）。对于这种高剂量产品，使用人类细胞系进行生产可能是有利的。然而，迄今为止，易于遗传操作和获得高产细胞系的高概率超过了去除残留宿主细胞蛋白的要求。 包括慢病毒、腺病毒和腺相关病毒在内的许多病毒被用作载体，用于在体内或体外宿主细胞中传递纠正性遗传物质，用于基因治疗应用。这些病毒的生产通常是在HEK293细胞中进行的。HEK293细胞系源自人类胚胎肾细胞，通过将一段5型腺病毒DNA插入其基因组而使其永生化。在某些情况下，昆虫细胞也用于病毒载体生产。 在涉及异体干细胞或其他组织细胞的临床试验中，尚未有特定的胚胎干细胞、iPSC或MSC细胞系成为常用或“标准”细胞系。在生物制剂的工业生产中，生产用细胞以其细胞遗传学特征为特征，审查其在动物血清、病毒或其他外来因子等方面的暴露历史，然后扩展为作为主细胞库和工作细胞库的细胞库。这种细致的细胞特性描述和储存对于自体细胞治疗应用可能无法实现。对于异体细胞治疗应用，尽管尚未出现细胞治疗的标准细胞系，但预计这些应用的细胞系库存将遵循类似的严格程序。 4.其他生产系统 哺乳动物细胞是生产需要翻译后修饰（例如，糖基化）或复杂蛋白质折叠的治疗蛋白的主要工作马。许多不需要广泛翻译后修饰的蛋白质是在大肠杆菌或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中生产的，包括胰岛素、人类生长激素和一些细胞因子。甚至一些需要糖基化和其他翻译后修饰的蛋白质也是在其他能够执行这些功能的宿主细胞系统中生产的。一些这些系统已被探索作为治疗蛋白的生产工具（表1.8，Panel1.7）。 4.1.昆虫细胞培养 使用昆虫细胞表达蛋白可以追溯到三十多年前的时间，大约是在酵母和哺乳动物细胞作为治疗蛋白生产工具被探索的时候。表达通常涉及将一个转基因（或转基因）克隆到像杆状病毒这样的病毒载体中。然后将载体通过转染昆虫细胞与载体一起包装在昆虫病毒中。在生产中，生产的病毒被用来感染宿主细胞。病毒在宿主细胞中的复制导致大量转基因副本。通过使用强启动子驱动转基因的表达，可以实现高水平的蛋白表达。 一种流行的用于异源蛋白表达的细胞系Sf9，源自昆虫Spodoptera frugiperda。昆虫细胞能够进行糖基化；然而，在昆虫系统中产生的蛋白质的糖型与哺乳动物产生的有些不同。例如，在昆虫细胞中合成的N-糖链具有高甘露含量和与哺乳动物所见不同的糖苷键的岩藻糖。因此，昆虫细胞系不用于治疗蛋白的生产，尽管它们用于研究用蛋白或毒性研究的生产。它们也常用于疫苗应用中作为抗原蛋白或类病毒颗粒的重组蛋白的生产。此外，它们还用于人类和兽医病毒疫苗的生产，或作为基因治疗中转基因载体生产工具。昆虫细胞培养仍然具有吸引力，因为培养相对简单，且流程开发时间可以相对较短。 4.2.酵母 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）已被用于生产血清白蛋白、细胞因子和一些病毒样颗粒作为疫苗（表1.8）。然而，在酵母中合成的重组蛋白的糖链与哺乳动物中的有显著差异。因此，酿酒酵母不用于需要广泛糖基化的治疗蛋白的生产。属于毕赤酵母属的酵母能够合成不是在酿酒酵母中产生的甘露糖丰富的N-糖链。在毕赤酵母（Pichia pastoris）中进行“人性化”糖基化特性的研究已取得了进展，以生产治疗蛋白。开发了一个多步骤的遗传工程过程，首先从毕赤酵母（Pichia pastoris）中消除非人类糖基化酶，然后引入人类糖基化酶，导致合成具有人性化糖链的蛋白。合成的重组蛋白的分泌率与在重组哺乳动物细胞中看到的不匹配；然而，这可以通过在生物反应器中实现的高细胞浓度来补偿。随着分泌能力和糖基化模式的进一步改进，这些工程化酵母菌株可能能够生产具有一致糖基化模式的蛋白质，甚至具有均匀的糖链。 4.3.转基因动物 使用转基因动物，包括山羊、猪和兔子，生产生物治疗药物已经开发了三十年。最常见的是，产品蛋白在乳腺中组织特异性表达，分泌到乳汁中。与生物制剂所需的传统生产厂相比，这些生产系统需要的初始资本投资较低。下游纯化过程相对简单，因为蛋白质完全糖基化。由GTC Biotherapeutics在转基因山羊奶中生产的ATryn（抗凝血酶III）已获得美国和欧洲监管机构的批准。 转基因动物生产的优势之一是其在乳汁中的高滴度，大约为2-10 g/L。然而，随着时间的推移，细胞培养过程中的滴度已增加到5-10 g/L的范围，从而减少了转基因动物生产的这一特定优势。 5.生产 5.1.上游过程 细胞培养生产的基本流程图与微生物发酵几乎相同（图1.3）。尽管在一些疫苗和细胞治疗过程中仍使用包括滚筒瓶和多孔板在内的实验室风格的培养设备，但绝大多数疫苗、基因载体和蛋白质生产过程使用搅拌式生物反应器。与微生物过程相比，细胞培养的代谢负荷，就单位反应器体积的营养物质和氧气消耗率而言，至少低一个数量级，机械搅拌的功率输入也是如此。 图 1.3. 用于重组抗体的典型细胞培养制造过程。 病毒疫苗、细胞因子和生长因子在患者中的用量相对较小。因此，这些低剂量产品的生产规模也相对较小。相比之下，抗体通常以高剂量给药，如表1.7所示，以引发更持久的效果。因此，一般来说，抗体产品的生产厂规模倾向于比病毒疫苗生产等更大，除了一些仅用于小患者群体的孤儿药。 典型的过程使用几个小反应器进行细胞扩增，然后切换到生产反应器。这个过程周期往往比微生物发酵要长。一批喂养式培养可能在生产规模持续10-14天，总共持续30-40天（包括种子培养）。灌注培养作为连续过程操作，持续时间从两个月到六个月不等。 过程工程的基本原理对于细胞培养和微生物发酵几乎是相同的。在两个过程中，计量关系被用作培养基设计指南，生长和生产动力学作为过程优化的基础，传输现象作为反应器设计的关键。甚至用于生产细胞培养生物制剂的反应器技术大多也是从微生物发酵中借鉴来的。然而，细胞培养工程，以其对生物经济的巨大贡献，在过程创新方面已经超越了微生物发酵。在过去二十年中，产品分离和分析以及生产设施设计方面的技术进步，细胞系和过程开发中平台概念的采用，一次性反应器的广泛应用，以及最近对连续过程的探索，都是由基于细胞培养的生产推动的。细胞培养过程仍在扩展，以满足日益增多的新型创新药物和生物类似药的需求。随着细胞和基因治疗的出现，细胞培养工程将继续是生物过程技术的关键驱动力。 5.2.一次性系统和连续过程 在过去十年中，获得许可的产品数量不断增加，对生产能力的需求也在增加。这种增加的需求并没有在生产设施的容积能力上看到相应的增长，而是通过提高生产力和改善设施利用率来满足。在过去十年中，细胞培养产品的生产过程经历了一些重要的变化（Panel1.8）。为了缩短在达到生产生物反应器之前的细胞扩增时间，一些人使用大量的工作细胞库中的细胞库存来启动种子培养阶段的较大生物反应器。在某些情况下，通过在前一个种子培养阶段（通常称为N-1阶段）使用某种形式的细胞灌注，以更高的细胞浓度接种生产反应器，以缩短达到生产高峰所需的时间。 在过去的十年中，一次性或一次性使用反应器的使用有所增加。一次性搅拌反应器，其体积可达两千升，十年前仅用于接种培养和少量生产，现在已成为生产的常见选择。这是可行的，因为细胞培养过程对搅拌的功率需求相对较低，允许塑料容器承受搅拌的机械应力。基于一次性生物反应器的工厂提供了降低资本投资和加快工厂建设的优势，在建立生产设施时，以及在过程实施中增加了灵活性和模块性。 一次性生物反应器确实有一些缺点。它们中的大多数不能轻易加压，以便使用固定管道在容器之间转移流体。许多对搅拌器设计的选择有限。对于一些细胞，特别是那些在微载体上生长的细胞，搅拌机制可能不是最优的。尽管如此，一次性生物反应器的广泛应用已经改变了生物制造的格局。由于尺寸限制，要增加生产量超过容器的最大尺寸，人们必须使用多个反应器。另一种选择是增加产品的浓度或产量。这是通过增加细胞密度和延长喂养式培养过程的持续时间，或通过连续方式运行过程来实现的。大多数当前的细胞培养生物制造过程以喂养式批次模式运行（图1.4）。在几天的快速细胞生长后，通过在生产期间几次用含有高浓度营养物质的培养基喂养培养，逐步将培养体积增加到最大。培养基的添加增加了培养液的渗透压。这，加上代谢物的积累增加，减缓了细胞生长。在缓慢生长和稳定期期间，产品积累到高水平。 图 1.4. 细胞培养制造过程：批量补料、连续灌流和混合（灌流式批量补料）。 细胞培养过程很少作为简单的连续培养操作，因为在稳态下细胞浓度太低，无法实现高生产率。连续细胞培养过程是作为一种灌注培养进行的，其中使用细胞分离器将从流出物中分离出的浓缩细胞流回收回生物反应器中，以增加细胞浓度。然而，目前只有少数过程采用灌注培养。大多数灌注过程都涉及需要在反应器中短时间停留的不稳定蛋白，或者是仅以非常低水平表达的蛋白。缺乏一种有效且可靠的在线设备，能够集中细胞并将它们返回到生物反应器，这导致了灌注过程的缓慢采用。 在过去的十年中，在线细胞分离设备有了显著的进步。这使得连续灌注培养更容易实施，并允许进行一种新的灌注/补料批处理混合模式。混合灌注/补料批处理培养通常以比典型的补料批处理培养更高的细胞浓度开始。这是通过使用细胞分离设备来浓缩种子培养流，并将更多的细胞接种到反应器中来实现的。操作类似于补料批处理培养，尽管高细胞浓度导致代谢物的高积累，需要连续移除培养基以降低它们的水平。通过介质移除连续冲洗出盐分、代谢物等，可以缓解生长抑制并延长生产阶段。 5.3.产品回收 细胞培养产品的产品回收过程比基于细菌的重组蛋白要简单。大多数细胞培养过程现在使用的培养基蛋白质浓度较低。在5-10克/升的高浓度范围内，产品是细胞培养过程结束时废液中的主要蛋白。因此，产品分离和纯化过程大大简化，因为只需要移除相对较小量的污染细胞蛋白和其他培养基成分。 图1.3显示了抗体IgG的回收示例。细胞培养过程结束后，反应器中的细胞悬浮液在保持罐中冷却，以防止细胞溶解。使用离心或微滤来去除细胞。为了准备后续的色谱和膜过程，通过微滤去除上清液中的颗粒物。然后使用超滤对工艺流进行浓缩。对于某些非常高产量的过程，这一步可能不是必需的，因为产品浓度已经很高。超滤的截留液随后被送入蛋白A亲和色谱柱。这个色谱步骤以非常高的产量和高纯度捕获产品。洗涤后，吸附的IgG用低pH缓冲液洗脱数小时。这使宿主细胞内可能形成病毒颗粒的内源性逆转录病毒失活。有时，使用另一种病毒失活方法。病毒失活后，使用纳滤步骤去除病毒颗粒。由于蛋白质聚集有时发生，可能还需要使用凝胶渗透色谱步骤来去除聚集的IgG（未显示）。非人宿主细胞总是将细胞蛋白和DNA片段脱落到培养基中，并污染产品。为了降低这些污染物的水平，使用阴离子交换色谱。纯化后，产品溶液经过滤灭菌，以进行最终的配方溶液准备。 随着对连续灌注培养的重新兴趣，已经进行了研究，探讨使产品回收过程连续化的可能性。正如典型的回收过程所看到的，几乎所有的单元操作都是连续流动的开放式系统，但以周期性批处理模式运行。策略是使用多个较小的设备将这些单元操作连接起来，并使它们适应来自生物反应器的连续进料流。它们将循环通过操作的不同阶段，以便总会有一个设备接收前一个操作的进料。一些人设想使用循环周期短的低容量设备，以便设备快速完成其生命周期。通过这种方式，设备可以是一次性的，并在短暂的连续运行后被替换。这样的愿景是否会实现，以及它可能带来多少操作和成本效益，还有待观察。 6.细胞培养过程中的产品质量 6.1.产品质量 细胞培养产品的质量是通过其提供目标生物活性的能力来判断的，同时最小化造成任何生物伤害的风险。在大多数情况下，直接测量生物活性，以生物测定或甚至是动物测定的形式，并不是容易评估的。相反，人们检查一些容易测量的物理特性和化学结构特性来评估产品质量。例如，使用肽指纹图谱来建立生产后蛋白质产品的身份（Panel1.9）。 产品的质量并非一成不变，随着时间的推移可能会发生变化。这种质量变异可能发生在细胞培养过程的不同阶段，通过产品合成的变化而发生。它也可能在产品回收过程中发生，甚至在蛋白质被纯化并储存在配方溶液中之后发生。根据化学或物理变化的性质，产品质量变化可能以快速或慢速的动力学发生。因此，质量不仅在药物物质和配制后的产品上进行测量。对于以慢速动力学变化的变量，质量也在库存条件下进行评估。例如，在纯化和配制的蛋白质长时间储存后，颜色可能会发展，或者由于聚集，溶液可能会变得混浊。这些质量变化只能在一段时间内进行评估。 通常，产品必须不含有某些已知的污染物种，或者能够将它们保持在一定水平以下。例如，在啮齿动物细胞中生产的蛋白质治疗剂，即使在产品纯化后，也可能携带一些宿主细胞成分。宿主蛋白、DNA污染物和内源性病毒，这些在产品纯化过程中未被去除并存在于最终产品中的污染物，必须保持在可接受的水平以下，以最小化这些污染物对患者的风险。 蛋白质的结构变体（例如，蛋白质分子序列中与编码序列指定的不同的一种氨基酸）经常在细胞培养产生的蛋白质中看到。即使没有已知的结构变体的不利影响，变体也必须保持在被认为是低风险的一定水平以下。 蛋白质的糖结构不可避免地表现出异质性。在影响蛋白质生物活性的情况下，所需或不想要的糖结构的含量必须保持在一定范围内。即使在糖结构不直接影响蛋白质的生物活性的情况下，糖的异质性程度也必须被指定，不同时间或不同生产地点生产的不同批次的产品都必须满足相同的规格。 结构特征和生物活性 细胞培养过程的产品——蛋白质、病毒和细胞——都是结构复杂的。它们的质量评估并不容易。最终，作为疫苗使用的病毒的质量是由其引发免疫反应的能力决定的。对于基因治疗，产品病毒的质量由其感染目标细胞和表达载体基因的能力决定。不同治疗蛋白传递其生物效应的机制非常多样。一些蛋白通过结合和中和或移除目标分子，而另一些则通过结合到目标细胞并引发杀伤细胞的杀伤来发挥作用。在过程设置中直接评估这样的生物功能是不可行的。相反，人们使用作用模式的机制知识来开发基于对生物功能至关重要的结构特征的产品质量指标。例如，对于流感病毒，除了病毒颗粒计数外，血凝素水平可以用作质量指数。在基因治疗中，转基因拷贝与病毒颗粒的比率可以用作质量度量。在生产用于涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC，也称为抗体依赖性细胞毒性）活性的应用的治疗性IgG时，岩藻糖基化糖的比例用作质量度量，因为糖上的岩藻糖的存在显著降低了IgG的ADCC活性。因此，了解所涉及产品的作用模式对于使用产品的结构属性作为质量指标非常重要。 6.2.糖基化档案 附着在糖蛋白上的糖结构在结构上是异质的。这在血液循环中的糖蛋白以及在细胞培养中生产的治疗蛋白中都可以看到。一些蛋白质的糖结构在蛋白质的治疗效力中起着关键作用（Panel1.10）。例如，糖结构上的甘露糖6-磷酸对于介导蛋白质与细胞质膜上的甘露糖6-磷酸受体结合以吸收是至关重要的，这是将酶靶向溶酶体的必要步骤。因此，这些酶的糖结构上的甘露糖6-磷酸的丰度水平对于治疗溶酶体储存疾病至关重要。在某些情况下，糖结构并不直接影响蛋白质的生物活性，但影响其药代动力学行为。例如，红细胞生成素和其他许多蛋白质上更高的唾液酸含量增加了这些蛋白质的循环半衰期。没有唾液酸，暴露的半乳糖会与肝细胞表面的无唾液酸糖蛋白受体结合，导致蛋白质的内化和降解。 一个蛋白质在其序列中可能有多处糖基化位点。给定位点上的糖结构并不统一。相反，它由一些略有不同的结构组成。这种异质性是其在高尔基体中的生物合成反应的结果。在不同的生产运行中，或在不同的生产条件或细胞系下，糖的档案也可能略有变化。这种变化对其临床效力的影响取决于蛋白质的作用模式。如上所述，对于某些蛋白质来说非常重要；对于其他蛋白质，它可能会影响血液循环的半衰期，但不会影响生物活性。然而，从监管的角度来看，产品的糖分布必须在规定的范围内。因此，将糖分布限制在可接受的范围内对产品的质量管理很重要。更好地了解产品的作用模式可以帮助定义产品可接受的异质性范围。 6.3.蛋白质结构变体 在选定给定产品的生产细胞系之前，应该验证所有整合到基因组中的副本的DNA序列，以确保转基因的完整性。因此，人们期望蛋白质的一级序列和二级、三级甚至四级结构将是统一的。然而，蛋白质的结构变体确实发生了，无论是在天然还是在重组蛋白质中。它们是由翻译错误、不完全的翻译后酶处理、分泌后细胞外酶促或化学反应，甚至是后处理事件引起的（Panel1.11）。在更高级别的结构层面上，蛋白质分子可能形成二聚体或寡聚体，可能混合二硫键，甚至形成大的聚集体并沉淀。在一级序列层面上，序列变体包括蛋白质中氨基酸的错误结合和氨基酸的化学修饰。 许多生产细胞系有多个产品基因的副本。有了高通量DNA测序技术，现在可以验证候选生产细胞系基因组中许多转基因副本的DNA序列，以确保其完整性。一旦选择了细胞系，突变随后发生在转基因副本上的概率就非常低。然而，如果偶尔发生错义突变（即，导致蛋白质中氨基酸变化的突变）在这些副本中的一个上，它将不可避免地导致部分突变蛋白质分子的存在。 序列变异也可能源于培养基中氨基酸的耗尽，正如在一小部分IgG中天冬酰胺被丝氨酸替代的报道。在极少数情况下，可能会观察到蛋白质上未完全切割的前导肽。在第1.11面板中列出了一些常见的重组蛋白的结构变异。许多蛋白质在其C端有赖氨酸残基。这些赖氨酸残基在细胞内被羧肽酶切割。然而，切割往往是不完全的。C端未切割的赖氨酸在循环中的自然蛋白质以及重组蛋白的生产中经常见到。 工业批量培养通常使用高浓度的葡萄糖。因此，分泌的蛋白质分子长时间暴露于高葡萄糖浓度下。糖基化，即将糖附加到氨基酸侧链的氨基上，是常见的。在人体循环中的蛋白质上也可以看到糖基化。一些氨基酸的修饰导致蛋白质的净电荷发生变化。这些带电变异体可能是酸，它们在阴离子交换色谱柱中的洗脱速度比“正常”或参考产品蛋白质快，或者是在阳离子交换柱中洗脱更快的碱基。酸性带电变异体也可能源于糖基化模式的变化，例如通过增加唾液酸或硫酸盐含量。 6.4.过程控制和产品质量 蛋白质的糖基化轮廓的异质性主要是细胞内生物合成事件的结果。当细胞活性低时，蛋白质分泌到培养基后，细胞释放的酶可能会降解糖基化（特别是通过唾液酸酶去除唾液酸）。蛋白质结构变异主要发生在蛋白质翻译后，要么是由于细胞内事件，要么是在蛋白质分泌到培养基后的培养基中。蛋白质处理酶可能通过分泌或由于细胞溶解而被细胞释放。已证明细胞外蛋白水解切割会导致因子VIII的降解，并改变tPA和蛋白C的单链/双链分子比例。一些更高阶的蛋白质结构变化，如聚集、蛋氨酸的氧化和天冬酰胺的脱酰胺作用，甚至可能在产品回收过程中发生。对产品质量的日益重视要求我们更好地了解细胞内事件如何影响糖基化轮廓，以及细胞外培养环境如何影响蛋白质变异的发生。理想情况下，这应该提高我们控制过程条件的能力，并提供一致的生产力和产品质量。对过程技术发展的重点越来越多地集中在过程分析技术（PAT）上，用于在线监测和控制。与PAT携手的是质量源于设计（QbD）。QbD的目标是开发过程理解并识别对产品质量贡献最大的过程变量。这可能导致开发控制这些变量的策略，并将产品质量属性限制在可接受的范围内。为了实施QbD，需要了解定义产品质量的属性以及过程变量与质量属性之间的关系。最初，可能依赖于将过程变量和质量属性相关联的经验数据。随着时间的推移，机械过程模型对于开发预测控制策略至关重要。在这种努力中，质量和生产力是不可分割的。关于生产力和质量的培养环境的机械理解被纳入一个过程模型中，该模型将过程扰动的输入转化为维持生产力和产品质量所需的控制行动。基于基因组学、蛋白质组学和代谢组学的全球分析方法的进步，结合系统方法，将促进PAT和QbD在细胞培养生物加工中的实施。 7.从发现到临床产品 开发新药的成本高得惊人。一个典型的药物发现计划始于疾病治疗的初始概念和生产用于生物和毒性测试以及药代动力学评估的发现量产品。然后是进行临床试验的决定，构建生产细胞系和上游、下游和配方的初始过程开发，以及产品的化学和生物测定的开发。同时进行的是I期试验、II期试验、商业制造规划和实施、文件准备，最后提交给监管机构。传统的流程图将不同的团队和药物开发的不同阶段大致按顺序排列（图1.5a）。 降低药品开发成本的关键是缩短时间线，将典型的6-8年开发时间压缩到2-3年，因为监管机构现在允许突破性药物地位的药物这样做。这种加速开发已经改变了细胞培养技术专家、发现化学家、药剂师和蛋白质工程师的合作方式。大多数药物开发任务的持续时间不能按比例缩短以适应缩短的时间线；例如，细胞的翻倍时间不能缩短以允许更短的细胞系开发时间。因此，整体开发时间线的压缩不是通过成比例地缩短每个任务的完成时间来实现的，而是通过时间上的重叠来实现的。在细胞系构建完成之前，过程开发和产品测定开发都必须开始。因此，项目流程从一任务团队将他们完成的对象交给下一个团队变为不同的任务团队同时以跨通信的方式一起工作（图1.5b）。 图 1.5. (a) 传统的生物制剂开发。(b) 加速的生物制剂开发。毒理学：毒理学；PK：药代动力学；GMP：良好生产规范；CMC：化学、生产和控制；BLA：生物制剂许可申请。 这一变化的一个重要后果是，来自不同开发阶段的科学家和工程师越来越多地协同工作。每个人必须掌握药物开发过程其他阶段的词汇和知识。二十年前，在生物技术之初，要求工程师学习生物学，要求科学家理解一些过程工程的词汇。 如今，工程师和科学家在同一行业领域携手合作。这种新的跨通信远不止是跨学科；它是跨产品开发阶段的通信。上游和下游的过程技术专家都需要理解监管专家的术语，以及开发生物测定的药剂师的术语，反之亦然。在未来几年中，将出现一种新型的交叉受精的科学家和工程师，他们将引领我们领域的进步。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。