Blebbistatin

引言 神经元漫长的生命（几乎伴随我们一生）和精密的功能，要求其自身结构必须具备极高的稳定性。一根轴突(axon)就像一架跨越山海的精密桥梁，需要坚固的支架来抵御机械应力，维持信息高速公路的畅通。然而，神经元又必须是“可塑”的，学习、记忆、适应……这些高级功能都源于其局部结构的动态变化。这种对“稳定”与“可塑”的双重、甚至看似矛盾的需求，是神经科学中最引人入胜的问题之一。长久以来，研究人员认为，神经元轴突膜下的一个被称为“膜相关周期性骨架(membrane-associated periodic skeleton, MPS)”的结构，是其稳定性的核心保障。它如同一副由肌动蛋白环(actin rings)和血影蛋白(spectrin)撑杆搭建的、间距精准的“龙骨”，为神经元提供了坚实的支撑。 然而，凡事皆有例外。8月7日，《Science》的研究报道“The membrane skeleton is constitutively remodeled in neurons by calcium signaling”，彻底颠覆了这一“静态”的认知。研究团队通过巧妙的活细胞超高分辨率成像技术，捕捉到了一个令人震惊的景象：这副被认为是“静态脚手架”的MPS，实际上是一个充满活力的动态系统，时刻在进行着“拆解”与“重建”的循环。该研究不仅揭示了这一前所未见的生命过程，更系统地剖析了其背后的调控机理和重要的生理功能。它告诉我们，神经元的“骨骼”并非静止的钢筋水泥，而是一个会“呼吸”、会“律动”的生命体。 看得见的“心跳”：当“静态骨架”活了起来 如果你能把一根神经元的轴突放大到肉眼可见的尺度，你会期待看到什么？按照以往的认知，那应该是一个像梯子一样规整、静止的结构。为了亲眼验证这一点，研究人员构建了一种巧妙的“报告”小鼠。他们通过基因编辑技术，在小鼠自身的βII-血影蛋白(βII-spectrin)的末端，接上了一个名为mNeonGreen的荧光蛋白。血影蛋白是MPS的关键组成部分，标记了它，就等于给整个骨架装上了“示踪灯”。 随后，他们从这种小鼠身上分离出海马体神经元进行培养，并使用一种名为“晶格结构照明显微镜(lattice structured illumination microscopy, SIM)”的超高分辨率成像技术，对活的神经元进行实时观察。这项技术能够突破普通光学显微镜的衍射极限，让我们看清纳米级别的微观结构。 当研究人员将目光聚焦于屏幕时，惊人的景象出现了。原本应是稳定排列的荧光环状结构，竟然在他们眼前不断地“闪烁”——在某些区域，几节荧光环带会突然变暗、消失，仿佛被凭空抹去；而片刻之后，又在原地重新亮起，恢复如初。这并非整个轴突在漂移或失焦，因为当他们用另一种染料标记细胞膜时，发现细胞膜本身稳如泰山，纹丝不动。这意味着，是MPS骨架本身在经历着一轮又一轮的局部拆解和重组。 为了探究这种动态行为的尺度，研究人员设置了不同的观察“快门速度”。在15秒一帧的拍摄条件下，他们可以清晰地看到一段段MPS在约4分钟的观察窗口内反复消失又重现。当他们将时间分辨率提高到1秒一帧时，甚至能捕捉到单个肌动蛋白环的“生”与“灭”，尽管由于成像时间的限制，这种事件显得较为罕见。而当他们将观察时长拉长到1小时（每5分钟拍摄一帧）时，则看到了更大范围的、更为剧烈的重塑，有些区域的骨架甚至整段消失后再缓慢地重建。 通过严谨的量化分析，研究人员发现，这种重塑现象极为普遍。在长达4分钟的观察窗口内，超过80%的轴突都表现出这种动态性，且发生重塑的区域能占到整个轴突长度的20%至30%。这说明，在任何一个时刻，轴突中都有一部分“骨骼”正处于活跃的“施工”状态，从一个相对长寿的稳定态，转变为一个短暂的、活跃的“可变”状态。 为了排除这是由于荧光蛋白标记本身造成的“假象”，研究人员进行了多重验证。他们用其他方式标记MPS的不同组分，例如用GFP标记的内收蛋白(adducin)或直接标记肌动蛋白的染料SiR-actin，都观察到了相似的动态现象。更有说服力的是，他们猜想，如果这种动态重塑是真实存在的，那么即便在固定（死亡）的细胞中，也应该能看到一些“施工”留下的“不完美”痕迹。果不其然，在完全没有活细胞成像干扰的固定神经元样本中，通过另一种更高分辨率的STORM成像技术，他们发现大约30%的轴突长度上，MPS结构都存在着瑕疵。这一数据与活细胞成像的观察结果惊人地吻合。 这些数据共同指向一个结论：神经元的膜下骨架（MPS）并非一个一成不变的静态结构，而是一个时刻在经历着局部拆解和重建的、具有内在活力的动态网络。它仿佛拥有自己的“心跳”和“呼吸”，在稳定与变化之间维持着一种巧妙的平衡。幕后总指挥：钙信号的“指挥棒” 发现了这一惊人现象后，下一个更重要的问题是：谁是这场宏大重塑工程的总指挥？是什么信号启动并调控着MPS的“拆”与“建”？ 为了高效地筛选出潜在的调控“开关”，研究人员采用了一种高通量的筛选策略。他们暂时放弃了能看清细节但速度较慢的超高分辨率成像，转而使用传统的衍射极限显微镜。在这种分辨率下，虽然单个的MPS环无法被分辨，但它们会融合成一条连续的荧光带。研究人员推断，当一段MPS发生拆解和重建时，这段荧光带的亮度也会随之发生波动。通过计算荧光信号随时间变化的“自相关函数(autocorrelation function)”，他们就能量化这种波动的剧烈程度，从而评估MPS的动态性。自相关函数的振幅越大，就意味着动态重塑越频繁。 利用这一巧妙的方法，他们开始了一场大规模的“嫌疑人排查”。他们测试了多种细胞过程的抑制剂，这些过程都可能与MPS的稳定性有关，包括：内吞作用(endocytosis)、微管(microtubules)及相关运输、肌球蛋白-II(myosin-II)。然而，当他们用相应的药物（如PitStop、dynasore、nocodazole、blebbistatin等）抑制了这些过程后，发现MPS的动态性几乎没有受到影响。自相关曲线依然平稳，波澜不惊。 就在“案情”陷入僵局时，两个关键因素的出现彻底扭转了局面。研究人员发现，当他们扰乱细胞内的钙离子(Ca²⁺)浓度和肌动蛋白的稳定性时，MPS的动态性发生了剧烈的变化。 他们使用了钙离子螯合剂BAPTA，这种药物能像“海绵”一样吸走细胞内游离的钙离子。结果，MPS的动态性被大幅度抑制，荧光信号的波动几乎消失了。反之，当他们使用一种“光控笼锁钙(caged Ca²⁺)”化合物NP-EGTA，并通过光照精确地在神经元中释放钙离子时，MPS的动态性则显著增强。这“一正一反”两个实验，有力地证明了钙离子在驱动MPS重塑中扮演着核心角色，就像乐队指挥手中的那根“指挥棒”。 与此同时，当研究人员使用一种名为“鬼笔环肽(Jasplakinolide)”的药物来强制稳定肌动蛋白丝，使其无法解聚时，MPS的动态性同样受到了强烈抑制。这表明，肌动蛋白环的解聚和聚合是MPS重塑过程的物理基础。 为了再次确认这些发现在纳米尺度上的真实性，研究人员重新回到了超高分辨率的SIM成像。这一次，他们带着明确的目标，直接观察钙离子变化对MPS结构的影响。结果与高通量筛选完全一致：用BAPTA处理后，原本活跃的MPS拆解-重组现象几乎完全停滞；而在持续低强度光照释放钙离子的情况下，MPS的重塑频率则明显增加。 至此，谜底的前半部分已经揭晓：钙信号是启动MPS重塑的关键上游信号，而这一过程的最终执行依赖于肌动蛋白丝的动态变化。钙离子的每一次浓度波动，都像一道命令，指挥着MPS进行局部的“拆卸”与“安装”。追根溯源：钙信号从何而来？ 既然确定了钙离子是“总指挥”，那么下一个问题便是：这些指挥信号是从哪里发出的？在神经元中，钙信号的来源多种多样，最主要的一种与神经活动直接相关，即动作电位(action potentials)。当神经元兴奋并产生动作电位时，会打开细胞膜上的电压门控钙通道，让大量的钙离子涌入细胞内。 为了验证神经活动是否是MPS重塑的驱动力，研究人员使用了一种经典的神经毒素——河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)。TTX能够特异性地阻断动作电位的产生。实验结果显示，TTX处理确实降低了MPS的重塑频率，但其抑制效果远不如之前使用的钙离子螯合剂BAPTA那么彻底。 这个结果非常有启发性。它说明神经活动（动作电位）确实能够促进MPS的重塑，但并非唯一的驱动因素。一定还存在其他来源的钙信号在起作用。研究人员进一步的实验解释了其中的差异：当他们直接监测神经元内的钙信号时，发现TTX和BAPTA都能消除由动作电位引起的短暂钙脉冲(Ca²⁺ spikes)，但BAPTA还会显著降低细胞内基础的、静息状态下的钙离子浓度，而TTX则不会。这表明，驱动MPS重塑的钙信号，既包括与神经兴奋相关的“峰值”信号，也包括更基础、更持久的“背景”信号。 为了进一步追踪这些“背景”钙信号的来源，研究人员测试了多种针对特定钙通道或钙库的抑制剂。他们发现，抑制N型和L型这两种电压门控钙通道同样会减少MPS的动态性。而当他们扰乱细胞内最大的钙库——内质网(endoplasmic reticulum, ER)的钙存储与释放时，却对MPS的动态性影响甚微。 这些证据拼凑出了一幅更完整的图景：驱动MPS重塑的钙信号，主要来源于细胞外部通过细胞膜上的多种电压门控钙通道的流入。这既包括由动作电位引发的大量内流，也包括由自发的、亚阈值的突触活动等引起的局部、小规模的钙内流。神经元似乎利用了这些无处不在的钙波动，作为调节自身骨架结构的“晴雨表”。有趣的是，研究人员还发现，这些钙通道在轴突上与MPS结构存在共定位，这种空间上的毗邻，无疑为钙信号快速、精确地作用于MPS提供了便利。双引擎驱动：PKC与Calpain的协同“破坏” 找到了“总指挥”钙离子，接下来的任务就是找出它手下的两位得力“干将”——那些直接执行“拆解”命令的下游效应分子。研究人员将目光锁定在几种已知的、受钙离子调控并且可能作用于MPS组分的酶。筛选结果很快指向了两个关键的蛋白：蛋白激酶C(Protein Kinase C, PKC)和钙蛋白酶(Calpain)。 第一个引擎：PKC与“松动的螺丝”PKC是一种钙依赖性的激酶，它的作用是在其他蛋白质上添加磷酸基团，从而改变这些蛋白质的功能，这就像是给机器的某个零件“充电”或“断电”。研究人员发现，当用药物(GFX)抑制PKC的活性时，MPS的重塑被显著减少；而用药物(PMA)激活PKC时，重塑则大大增强。 那么，PKC究竟是如何通过磷酸化来破坏MPS的呢？研究指向了一个关键的目标蛋白——内收蛋白(adducin)。内收蛋白在MPS中的作用像一个“瓶盖”或者“卡扣”，它位于肌动蛋白环上，不仅能稳定肌动蛋白丝的末端，还能像“铆钉”一样，将肌动蛋白环与血影蛋白“捆绑”在一起。而已有研究表明，PKC能够磷酸化内收蛋白，导致其与肌动蛋白和血影蛋白的结合力下降。 为了验证这一机制，研究人员通过一系列实验证实，PKC通过磷酸化内收蛋白，松开了稳定MPS的关键“铆钉”，从而为整个结构的拆解铺平了道路。最关键的一步功能验证发现，当通过shRNA技术敲低神经元中内收蛋白的表达后，MPS的重塑反而“增加”了。这个看似矛盾的结果其实非常合理：它说明内收蛋白的正常功能是“稳定”MPS，当这个“稳定器”被移除后，整个结构自然就变得更加不稳定、更容易发生动态变化。 第二个引擎：Calpain的“暴力剪切”与PKC的“巧劲”不同，钙蛋白酶(Calpain)的作用方式则更为“暴力”。它是一种钙依赖性的蛋白水解酶，相当于一把由钙离子激活的“分子剪刀”，能够直接将血影蛋白剪断。研究人员通过抑制剂(MDL)实验证实，抑制Calpain的活性同样能显著减少MPS的重塑。为了更直观地看到Calpain的“破坏力”，他们进行了一个震撼的实验：在装载了笼锁钙的神经元中，用一束强紫外光瞬间在局部区域释放大量钙离子。就在光照的瞬间，他们观察到该区域的血影蛋白荧光信号急剧下降，几乎完全消失，对应着MPS的快速降解。 双引擎的协同作战既然PKC和Calpain都能在钙离子的指挥下促进MPS的拆解，那么它们是各自为战，还是协同作战呢？研究人员发现，这两个过程紧密相连。当他们抑制PKC的活性时，由Calpain介导的血影蛋白剪切也随之减少。更有趣的是，在一个关键实验中，他们发现，如果预先用PKC抑制剂处理神经元，那么即使后续用强光释放大量的钙离子，血影蛋白也变得“刀枪不入”，不再像之前那样被快速降解。 这个结果揭示了一个协同机制：PKC介导的内收蛋白磷酸化，不仅自身能破坏MPS的稳定性，似乎还能“暴露”出原本被保护的血影蛋白切割位点，从而大大增强了Calpain的“剪切”效率。这就像拆一个复杂的机器，你不能直接用大锤硬砸(Calpain)，而是需要先用螺丝刀拧松关键的螺丝(PKC磷酸化adducin)，这样后续的拆解才能顺利进行。“破坏”与“新生”：重建工作的执行者 一个完整的重塑过程，不仅包括“拆解”，还必须有“重建”。否则，MPS只会被不断破坏，最终导致神经元结构的崩溃。那么，谁负责在旧的废墟上重建新的肌动蛋白环呢？研究人员将目光投向了一类被称为“Formin蛋白”的分子。Formin蛋白家族是细胞内构建“线性”肌动蛋白丝的专家。 在该研究中，研究人员发现，多种Formin蛋白（如mDia2, Daam1, Fmn2）确实与MPS的肌动蛋白环相关联。当他们用抑制剂(SMIFH2)短时间抑制Formin活性时，MPS的重塑频率出现了中等程度的下降。而当他们长时间抑制Formin，或者直接敲低其中一个关键成员mDia2时，则观察到了MPS结构的部分丢失。 这些结果表明，Formin蛋白在MPS的生命周期中扮演着一个“双重角色”。一方面，它们是“建设者”，在MPS被拆解后，负责催化新的肌动蛋白丝聚合，完成重建工作，这是维持MPS长期完整的必要条件。另一方面，它们也可能是“破坏的推手”，因为它们在结合肌动蛋白丝时可能会“挤走”起稳定作用的内收蛋白。 因此，MPS的动态平衡，就是在一系列稳定因子（如内收蛋白）和失稳/重建因子（如PKC、Calpain、Formin）之间，通过钙信号的精巧调控，达成的一种动态妥协。为何要折腾？动态重塑的生理意义 至此，研究人员已经清晰地描绘出MPS动态重塑的分子机制。但一个更深层次的问题依然悬而未决：神经元为什么要如此“大费周章”地维持这样一套复杂的系统？这种持续的、耗费能量的“拆了又建”究竟有什么好处？ 研究人员提出了一个极具吸引力的假说：MPS就像一道紧贴着细胞膜的“栅栏”，它在提供结构支持的同时，也阻碍了细胞膜进行某些需要变形的活动，例如内吞作用(endocytosis)。因此，神经元可能需要通过“局部、暂时地拆除一小段栅栏”的方式，来为这些生理活动“开绿灯”。 为了验证这个假说，他们设计了一系列实验来检测内吞作用。他们使用荧光标记的低密度脂蛋白(LDL)作为内吞作用的“货物”，观察在不同条件下，轴突摄取LDL的效率。实验结果为假说提供了强有力的支持： 当他们使用之前证明能够“抑制”MPS重塑的三种药物（PKC抑制剂、Calpain抑制剂和肌动蛋白稳定剂）来“加固”这道栅栏时，轴突对LDL的内吞效率都出现了大幅下降，降幅高达70-80%。反之，当他们通过基因敲低来“移除”整个MPS栅栏（敲低βII-血影蛋白）时，内吞作用则显著“增强”了约30%。 这一系列结果非常说明问题。一个更稳定的、动态性更差的MPS会强烈抑制内吞，而移除MPS则会促进内吞。这证明，MPS的“存在”本身对内吞是抑制性的，而MPS的“动态性”则是为了在功能上克服这种抑制。神经元正是通过这种持续的重塑，为各种需要接触和变形细胞膜的生命活动，打开了一个至关重要的“机会之窗”。不止于此的思考 这项研究让我们得以窥见神经元内部一个前所未见、充满活力的微观世界。它将我们对神经元“骨骼”的认知从一个静态的、类似建筑脚手架的模型，彻底转变为一个动态的、时刻响应环境信号而进行自我改造的生命系统。 这种由钙信号精密调控的重塑机制，其意义可能远不止于促进内吞作用。例如，MPS本身也是一个重要的信号转导平台，许多受体和信号分子都锚定其上。MPS的动态拆解与重组，或许能够调控这些信号分子的聚集与分离，从而调节信号传递的强度和时效。 更重要的是，这项研究在分子、细胞层面与神经系统的宏观功能之间，架起了一座新的桥梁。我们知道，神经元的活动，如学习和记忆，依赖于突触的可塑性变化。而这项研究揭示，神经元的活动能够直接通过钙信号，来调控其最基础的骨架结构。这提示我们，轴突本身的结构可塑性，可能也是神经系统实现学习、适应等高级功能的一个未被充分认识的重要物理基础。 生命总是在看似矛盾的需求中寻找最佳的解决方案。神经元既要稳定地活近百年，又要灵活地响应每一刻的变化。MPS的动态重塑，正是这一哲学在纳米尺度上的完美体现。它不再是一座冰冷的、静止的纪念碑，而更像一座繁华的城市。在这座城市里，基础设施(MPS)坚固可靠，保障着日常的交通与秩序；但同时，它又无时无刻不在进行着局部的维修、改造与升级，以适应城市（神经元）不断发展的需求，支持着其中丰富多彩的生命活动。 参考文献 Heller E, Kurup N, Zhuang X. The membrane skeleton is constitutively remodeled in neurons by calcium signaling. Science. 2025 Aug 7;389(6760):eadn6712. doi: 10.1126/science.adn6712. Epub 2025 Aug 7. PMID: 40773558; PMCID: PMC12333566. 声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ 往期热文： Cell | 告别“单兵作战”！SPIDR技术开启“联合作战”新纪元，一次实验看清数十种RNA调控蛋白的“社交网络” Nature Medicine | 抗体取代放化疗：干细胞移植迎来“温和革命”，范可尼贫血治疗迈出关键一步 Nature Biotechnology | 解密大脑“天书”：ScISOr-ATAC技术，同时窃听细胞内部的“三重宇宙” Nature Medicine | “减肥神药”的另一面：司美格鲁肽如何逆转“脂肪肝”的宿命？ Science | DNA上的“智能泊车系统”：揭秘INO80如何通过“自锁刹车”实现精准定位 Cell | 基因魔剪再进化：一针逆转“交替性偏瘫”，为罕见病患儿点亮希望之光

DRUGAI今天为大家介绍的是来自伦敦癌症研究所癌症生物学系Chris Bakal教授带领团队发表的一篇论文。这项研究介绍了一个名为MorphoMIL的创新计算方法，它结合了几何深度学习（geometric deep learning）和基于注意力的多实例学习（attention-based multiple-instance learning），用于分析细胞及其细胞核的三维形态特征。研究团队采用3D点云数据作为输入，不仅能在单个细胞层面捕捉形态特征，还能分析整个细胞群体的特征，同时考虑了细胞群体中个体差异（表型异质性）。他们对超过95,000个黑色素瘤细胞进行了实验，这些细胞分别接受了具有临床意义的药物处理、基因改造，以及影响细胞内部支架结构的处理。该方法不仅能准确预测药物对细胞的影响和细胞状态，还能发现药物带来的细微形态变化，找出与细胞信号活动相关的关键形状特征，并帮助我们理解为什么同一群细胞会表现出不同状态。MorphoMIL不仅表现出色，而且适用于各种不同类型的数据集，这为未来在药物研发中进行大规模、高效的细胞形态分析开辟了新途径。细胞的形状是如何形成的？这要从细胞内部成分说起。细胞中的蛋白质、代谢物和脂质不断与周围环境互动，最终决定了细胞的形状。细胞形态的异常往往预示着疾病的发生，因此研究细胞形状可以帮助我们了解细胞的状态。传统研究主要关注细胞的二维形态，使用面积、周长等简单的几何特征来描述细胞。但这种方法存在明显局限：首先，它依赖预设的形状测量标准；其次，真实生物体内的细胞是三维的，仅用二维图像难以完整描述细胞形态。随着技术进步，特别是3D显微技术的发展（如斜面显微镜技术），科学家们终于能够观察到细胞的真实三维结构。然而，如何定量分析这些3D形态数据仍然是一个挑战。为此，研究团队开发了一个创新的分析框架——MorphoMIL。这个框架采用了点云数据（即在3D空间中分散的点的集合）来表示细胞形状，并结合了几何深度学习和基于注意力的多实例学习技术。MorphoMIL的应用效果令人惊喜：它不仅能够通过细胞的3D形状预测重要的生化活性（如细胞信号通路MEK-ERK的活性），还能通过定量形态特征（quantitative morphological signatures, QMS）预测基因功能和蛋白质之间的相互作用。这些发现表明，几何深度学习不仅能够识别3D细胞形状的特征，当与注意力机制的多实例学习结合时，还能识别不同处理条件下的特征表型，预测细胞状态，为药物研发提供新的研究思路。这项研究取得了四个重要突破：几何深度学习技术能够在各种实验条件下，准确捕捉细胞的3D形状特征；通过多实例学习技术分析细胞形态的变化规律，成功预测药物的处理效果；通过分析MIL的注意力权重，研究人员发现了药物处理会导致细胞产生特定的形态特征；研究团队开发的3D细胞形状分析模型，成功将细胞的形态特征与其内部的信号传导状态和蛋白质互作联系起来。一种使用GDL对三维细胞形状进行分析的自动化方法研究团队开发了一种创新的方法，用于自动分析细胞的3D形态特征。他们首先使用一种特殊的显微镜技术——阶段扫描斜面显微镜（stage-scanning OPM）对实验样本进行观察。如图1A所示，研究人员将超过65,000个WM266-4黑色素瘤细胞培养在模拟人体组织环境的胶原蛋白水凝胶中。这些细胞被特殊处理，能够发出荧光信号来显示细胞膜、细胞核的位置，以及细胞内ERK激酶的活动情况。图 1为了研究不同条件下细胞的形态变化，研究人员使用了多种临床相关的药物处理细胞，这些药物可以影响细胞骨架的组织和细胞信号通路。如图1B-E所示，研究团队开发了一套完整的数据处理流程：首先对细胞和细胞核进行分割（图1B, C），然后将3D图像数据转换为网格结构（图1D），最后生成点云表示（图1E）。为了准确量化单个细胞的3D形状特征，研究人员开发了一个智能的计算模型——动态FoldingNet（DFN）。如图1F所示，这个模型通过结合动态图卷积神经网络（DGCNN）技术，能够同时学习细胞的局部特征（如突起等）和整体形态特征。如图1G所示，DFN通过“自编码器”的方式工作：先将输入的点云数据压缩成更简单的特征表示，然后尝试从一个基本形状重建原始点云。这种方法使得研究人员能够提取出细胞3D形状的关键特征，为后续分析奠定基础。细胞3D形态分布反映其所处环境以及受到的干扰研究人员首先使用UMAP技术（一种数据可视化工具）将复杂的3D细胞形态数据简化成二维图像（图2A）。这个可视化结果显示，细胞形态的主要差异体现在两个方面：细胞的大小（图2B）和形状的规则程度（偏心率）（图2C）。较小且圆形的细胞会聚集在一起（图2D, E），而较大且形状不规则的细胞则会出现在图的其他区域。图 2研究还发现，细胞在胶原蛋白基质中的位置会显著影响其形态。如图2F所示，研究人员根据细胞核心距离盖玻片的距离，将细胞分为两类：距离小于7微米的“近端”细胞和距离大于7微米的“远端”细胞。这个发现表明，3D细胞形态能够反映细胞所处的物理环境。更有趣的是，不同药物处理会导致细胞呈现不同的形态特征。如图2G-J所示，研究人员比较了对照组（DMSO处理）和不同药物处理组的细胞形态分布。例如，blebbistatin处理的细胞往往会形成更多突起且形状不规则（图2I），而nocodazole处理的细胞则更趋向于圆形且突起较少（图2J）。这项研究的一个重要发现是：药物处理通常不会让细胞产生全新的形状，而是改变了细胞群体中不同形态的分布比例。这个发现提示我们，在研究药物如何影响细胞形态时，需要同时考虑细胞群体内部的差异和不同细胞群体之间的相似性。这种深入理解有助于我们更好地评估药物的作用机制和效果。3D细胞形状反映干扰程度研究团队开发的3D细胞形态分析方法究竟准确吗？为了回答这个问题，他们设计了一系列验证实验。首先，研究人员使用一种叫做支持向量机（Support Vector Machine, SVM）的人工智能算法来识别不同药物处理的细胞。他们采用两个指标来评估模型的表现：平衡准确率（衡量模型正确分类的比例）和AUC值（反映模型区分不同类别的能力）。图 3如图3A和3B所示，模型在识别靠近盖玻片的近端细胞时表现最好。特别是对于三种药物处理：破坏微管动态的nocodazole、抑制肌球蛋白-2的blebbistatin，以及抑制ROCK蛋白的H1152，模型表现出极高的识别准确率。图3C全面展示了模型在不同条件下的分类效果。研究还发现一个有趣的现象：虽然单独使用细胞形状或细胞核形状的特征都能进行预测，但结合两者的信息效果最佳。这说明细胞的整体形态和细胞核的变化都携带着重要的生物学信息。更令人惊讶的是，仅凭细胞的3D形状特征，模型就能以84.9%的高准确率判断出细胞在胶原蛋白基质中的位置（是处于15-60微米还是大于70微米的深度）。这个发现表明，细胞的形态特征与其所处的微环境密切相关，为我们理解细胞如何适应和响应周围环境提供了新的视角。研究团队首先验证了他们开发的DFN方法的普适性。他们不仅在自己的黑色素瘤细胞数据上进行了测试，还将方法应用到了两个公开数据集：825个3D红细胞图像（图3D）和1,908个3D脑血管图像（图3E）。结果显示，DFN在所有数据集上都优于其他方法，证明了这种方法具有良好的通用性。一个基于注意力的多实例框架图 4然而，研究中遇到了一个关键问题：即使是相同的药物处理，不同细胞的形态反应也可能大不相同。为了解决这个问题，研究团队开发了一个创新的分析框架——MorphoMIL（图4B）。这个框架就像一个智能的药物侦探，它不仅能观察单个细胞的变化，还能通过分析细胞群体的整体特征来识别药物处理的效果。如图4C-E所示，它能以极高的准确率（最高达99.3%）识别不同的药物处理。特别值得注意的是，即使是作用机制相似的药物，如blebbistatin（抑制非肌肉肌球蛋白-2）和H1152（抑制ROCK），MorphoMIL也能准确区分（准确率76.2%）。这说明细胞的3D形态变化能够反映出药物作用的细微差异。研究还发现了一个有趣的现象：在大多数情况下，同时分析细胞和细胞核的形态特征能获得最佳的识别效果（图4F）。这就像观察犯罪现场时，需要同时考虑多个线索才能得出最准确的结论。MorphoMIL可推广到其他细胞类型和成像方式图 5为了验证MorphoMIL方法的通用性，研究团队选择了一个具有挑战性的测试对象——人诱导多能干细胞（hiPSC）。这种细胞具有特殊的分化潜能，被广泛应用于药物开发和疾病建模研究。如图5所示，研究人员分析了五种不同药物（blebbistatin、brefeldin、paclitaxel、rapamycin和staurosporine）处理的hiPSC细胞（图5A-E）。他们首先使用CellPose技术对3D图像中的单个细胞进行分割（图5F），然后创建网格模型（图5G）并提取点云数据（图5H）。有趣的是，即使是在完全不同的细胞类型上，MorphoMIL仍然展现出优异的分类性能（图5I和5J）。图 6MorphoMIL的一个独特优势是它能够“解释”自己的决策过程。通过分析模型赋予每个细胞的“注意力权重”（类似于模型对不同细胞特征的关注程度），研究人员发现了一些有趣的规律。如图6A所示，不同药物处理导致的典型细胞形态在UMAP图上呈现出独特的分布模式。进一步分析高注意力细胞（即模型认为最具代表性的细胞）的特征（图6B）揭示了不同药物的独特“形态签名”：nocodazole处理的细胞呈现明显的圆形特征，球形度达到0.71（远高于平均值0.63）；blebbistatin和H1152处理的细胞则表现出扁平（扩展度分别为0.93和0.91）和不规则（偏心率分别为0.97和0.94）的特征。研究团队也探讨了高注意力细胞与信号活性的关系。如图6D-G所示，研究人员使用ERK-KTR报告基因来测量MEK活性：当ERK活跃时，荧光信号在细胞质中增强；当ERK被抑制时，荧光信号在细胞核中增强。ERK比率（细胞核与核周区域的ERK强度比）越高表示ERK活性越低。研究发现，binimetinib分类器的注意力得分与ERK比率呈现显著相关，这一相关性明显高于其他药物和对照组（0.14和0.24）。这表明仅基于3D细胞和细胞核形状的模型能够学习到MEK抑制和活性的特征形态。随后，研究团队使用MorphoMIL分析了167个基因（包括RhoGEFs、RhoGAPs和Rho家族GTPases）敲低后的细胞形态变化。如图7所示，他们为每个基因构建了8维特征向量（MIL-QMS），并将其分为8个簇（图7B）。研究发现MorphoMIL的预测分数与激酶活性相关：binimetinib分类器的得分与pERK水平呈显著相关。此外，通过分析RHOA-ROCK-NM2通路中的基因，研究团队发现3D细胞形态可以预测蛋白质之间的物理相互作用。结论本文介绍并验证了两种新颖的流程：DFN（特征提取）和MorphoMIL（包含分类功能）。这些流程旨在利用3D细胞形态来确定潜在的细胞状态，模拟受治疗干扰的细胞群体的异质性，并提高可解释性。这项工作强调了结合GDL（图深度学习）和MIL（多实例学习）进行3D形态分析的潜力，以推动高通量药物发现工作，并为探索基于形状的细胞状态预测开辟了新途径。作者的所有算法都打包为开源Python包，以便更广泛的研究社区使用。作者已经证明，先进的3D成像技术结合深度学习和多实例学习的模型是一种强大的方法，可以建立对遗传或化学扰动效应的机制性洞察。作者的方法快速、成本效益高且可扩展，使其成为同时查询多个信号通路活动的高效工具。因此，这种方法在小分子药物、生物制剂以及小干扰RNA（siRNA）/CRISPR文库的大规模筛选中具有相当大的潜力。此外，3D形状分析的应用在临床样本的诊断评估中显示出巨大的前景。编译|于洲审稿|王梓旭参考资料De Vries M, Dent L G, Curry N, et al. Geometric deep learning and multiple-instance learning for 3D cell-shape profiling[J]. Cell Systems, 2025, 16(3).