Blebbistatin

组织微环境的黏弹性——即“弹性-稳定性”与“应力松弛-可重塑性”的动态平衡——决定细胞如何感知并改造其周围基质；然而现有合成水凝胶大多只能提供缓慢（数百秒以上）或不可调节的应力松弛，也难以在光固化打印过程中同时保持结构保真与细胞活性。 科罗拉多大学博尔德分校Kristi S. Anseth和Jason A. Burdick等人开发一类“BELA”双网络PEG水凝胶：它将超快（数秒级）动态硼酸酯交换与可光聚合的硫辛烷-烯反应耦合，实现黏弹性、交联密度和光图案化时空精度的独立调控。相关内容以“Ultrafast-relaxing and photopolymerizable PEG hydrogels enable viscoelasticity-mediated cell remodeling in synthetic matrices”为题发表在《Matter》上。 【本文背景】 一、BELA水凝胶的设计思路 BELA水凝胶由三种主要PEG大分子组成： 1. BLA：八臂PEG，部分臂修饰为硫辛酸，其余为硼酸； 2. GLA：八臂PEG，部分臂为硫辛酸，其余为葡萄糖内酯； 3. GNX：线性PEG，一端为降冰片烯，另一端为葡萄糖内酯。 这三者通过硼酸酯交换反应形成动态交联网络，并在光照下通过二硫杂环-烯光聚合反应形成永久性共价交联网络，构成双网络结构。 图1 BELA水凝胶设计 二、力学性能调控与表征 模量可调：通过改变总聚合物浓度（5–20 wt%），可实现储能模量（G'）从数百帕到数十千帕的调控； 快速应力松弛：在10%应变下，5 wt%凝胶的松弛半衰期约为2秒，20 wt%凝胶在20秒内可松弛约1/3应力； 频率响应可调：低频下出现储能模量与损耗模量交叉，表现出典型的黏弹性行为； 黏弹性可调：通过调节GNX与GX（非交联竞争分子）比例，或引入额外PEG-norbornene，可系统调控弹性与动态交联比例（C:D比）。 图2 BELA 水凝胶在网络形成过程中不同大分子浓度下的机械性能 三、细胞重塑行为研究 1. 细胞介导的基质重塑 使用数字光处理（DLP）打印包裹人源间充质干细胞（hMSCs）的BELA水凝胶；低C:D比（高动态性）凝胶在48小时内出现显著收缩，面积减少约3倍，细胞密度增加；高C:D比（高弹性）凝胶中细胞铺展更好，收缩受限；粒子图像测速（PIV）显示细胞牵引力在最初24小时内最强，随后趋于平稳。 图3 封装的hMSC会主动压缩DLP打印的BELA水凝胶 2. 形状稳定性与细胞铺展 打印不同几何形状（圆、三角、正方形）观察细胞重塑；黏弹性水凝胶中细胞可引发显著形状变化，而纯弹性对照组几乎无变化；拓扑数据分析（TDA）显示，随着弹性增加，细胞骨架结构的空间组织尺度增大（环状结构直径从25 μm增至100 μm）。 图4 分析C:D比对水凝胶和细胞水平空间指标的影响 3. 光控力学调控 同一配方下，通过改变曝光时间（16 s vs 24 s）调控交联密度；较短曝光导致更强收缩与细胞铺展，较长曝光则抑制收缩。 图5 光聚合时间调节基质力学并指导人类间充质干细胞在单一BELA配方中的反应 四、细胞-基质相互作用机制 整合素结合必需：RGD肽促进细胞铺展与收缩，去除RGD或加入HAVDI（N-钙黏蛋白模拟肽）则抑制； 肌动蛋白聚合关键：细胞骨架抑制剂Cytochalasin D完全阻断重塑，而Blebbistatin（肌球蛋白抑制剂）或ROCK抑制剂仅部分影响； 图6 整合素结合与F-肌动蛋白调控hMSC对BELA水凝胶的重塑 五、多细胞类型适用性 C2C12成肌细胞与3T3成纤维细胞在BELA中表现出不同重塑行为；HUVEC与hMSC共培养可自组织成VE-钙黏蛋白阳性的内皮单层；厘米级大尺寸构建体中，细胞沿打印图案方向排列；小肠类器官在BELA中可分化为含潘氏细胞的隐窝样结构，表明其支持组织形态发生。 图7 BELA 水凝胶中的动态细胞反应在多种组织模型中是普遍适用的 【全文总结】 该研究不仅推进了合成水凝胶模拟动态细胞外基质（ECM）的能力，也为组织工程、类器官建模、细胞力学生物学提供了强大的工具平台。未来可进一步探索其在疾病模型、再生医学、细胞命运调控等方面的应用潜力。 「BioMed科技」关注生物医药×化学材料交叉前沿研究进展！交流、合作，请添加杨主编微信！ 原文链接： https://doi.org/10.1016/j.matt.2025.102524 来源：BioMed科技声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！

胶质母细胞瘤（GBM, Glioblastoma）是原发性脑肿瘤中最致命的一种。Mayo 诊所研究人员在 Cell 报道了一种新型非肌肉型肌球蛋白 II（non-muscle myosin II（NMIIA/IIB ）抑制剂：MT-125。MT-125 具有高脑穿透性和优异的安全性，能够阻断胶质母细胞瘤侵袭和细胞分裂，并延长小鼠胶质母细胞瘤模型的生存期。通过损害线粒体分裂，MT-125 增加氧化还原应激和随之而来的 DNA 损伤，并与放疗协同作用。 1. 背景介绍 肌球蛋白是一类广泛表达的分子马达超家族。 这包括肌球蛋白 II 类，由骨骼肌、平滑肌和心肌肌球蛋白 II、以及三种非肌肉肌球蛋白 II（NMII）同源物（NMIIA、IIB 和 IIC）组成。NMII 在正常细胞生理学中发挥多种作用，包括运动性、胞质分裂、线粒体分裂和信号传导。NMIIs 也参与病理状态，如胶质母细胞瘤（GBM），这是最常见的原发性脑肿瘤且恶性程度最高。虽然在 GBM 中经常发现致癌激酶的异常信号传导，但致癌激酶抑制剂的临床试验令人失望，可能是由于信号通路的冗余性。相比之下，NMII 同源物位于许多这些通路下游的汇聚点，这表明直接靶向 NMII 应产生持续的表型，无论有多少致癌激酶处于活跃状态。 为此，作者发现使用 blebbistatin（一种广谱肌球蛋白 II 抑制剂）直接抑制非肌肉型肌球蛋白 II（NMII）可以阻断胶质母细胞瘤的扩散，即使 PDGFR和EGFR 同时被激活也是如此。在胶质母细胞瘤的基因工程小鼠模型中共同敲除 NMIIA 和 IIB 可以预防肿瘤发生，表明，针对 NMIIA 和 NMIIB 的双重抑制剂可能对 GBM 具有高度活性，并为治疗应用提供了一种有效方法。 MT-125 对 NMIIA 和 NMIIB 具有高度选择性 筛选此前 blebbistatin 来源的 NMII 抑制剂库，并选择了 MT-125（ 图 1A），因为它对 NMIIA（Ki, NMIIA = 2.7 ± 0.2 μM； 图 1B）和 NMIIB（EC50 = 1.7 ± 0.1 μM；图 1C）的效力非常相似，对正常细胞无细胞毒性，并且对心脏肌球蛋白 II（CMII；KI,CMII = 50 ± 10 μM）的活性非常有限。这种对 NMIIA/IIB 的 20–30 倍选择性将转化为优异的体内耐受性（bioRxiv. 2024;, doi: 10.1101/2024.10.07.617018                  ）。 图 1 MT-125 对 NMIIA 和 NMIIB 具有高特异性。 MT-125 的药代动力学、代谢和安全性评价 MT-125 与肝微粒体蛋白孵育后的代谢物鉴定表明，非临床物种中的主要代谢物也是人体中的主要代谢物。在hERG-CHO试验中，MT-125 的 IC50 大于 10 μM，显示出可接受的药物开发选择性特征。 体内药效学评价 MT-125 以确定最佳给药途径、脑内滞留程度、药代动力学和耐受性。在静脉注射 2 mg/kg（ [i.v.]）剂量下，MT-125 的 Cmax 为 5.45 ± 0.18 μM， AUClast 为 4.46 ± 0.14 μM⋅h，血浆半衰期为 10.3 小时，且耐受性良好，无不良临床体征。 口服给药（PO）10 mg/kg 也耐受良好，但生物利用度较低（Cmax = 0.72 ± 0.21 μM，AUClast = 1.44 ± 0.14 μM⋅h，T1/2 = 10.3 小时）。由于溶解度限制，更高剂量的口服给药形成悬浮液，吸收不良。 皮下（s.c.）给药（2、5 和 10 mg/kg）耐受性良好，表现出优异的系统暴露度，给药后脑内水平迅速升高。 例如，在 5 mg/kg 皮下注射剂量下，注射后 10 分钟（Tmax）时，大脑中达到的最大浓度为 9.1 ± 1.0 μM，是同时点血浆中浓度（脑:血浆浓度比 B:P = 2.0）的两倍。此外，注射后 MT-125 在大脑中仍保持可测量的水平，导致大脑 AUClast 为 5.4 ± 0.8 μM⋅h，T1/2为 10.5 小时。无论如何，两种情况下均观察到优异的大脑穿透性。 MT-125 在体内表现出低毒性，具有良好的治疗指数 连续 2 周每天以 10 mg/kg 剂量（皮下注射）给予 MT-125 的小鼠耐受性良好，体重无变化，临床化学指标和血液学指标也无变化。为确定最大耐受剂量（MTD），大鼠接受一次 60、70 或 90 mg/kg 剂量（皮下注射）的 MT-125 注射。1 小时后采集血液进行毒代动力学分析，24 小时后采集血液进行血液学和临床化学检测。在所有测试剂量下均未观察到可观察的临床不良效应或体重变化。给药后 1 小时的血浆浓度表明 MT-125 被吸收。然而，各剂量水平的浓度相似性表明 60 mg/kg 可能含有单次皮下注射可吸收的最大化合物量。 接下来，MT-125（20 或 40 mg/kg，皮下注射）连续 7 天的每日重复给药，未观察到与药物相关的副作用。所有组的临床化学和血液学值在连续 7 天治疗后及 7 天恢复期后均正常。 在给药后 0.5-24 小时的 6 个时间点（第 1 天图 1 G 和第 7 天图 1 H）以及第 7 天的给药前采集样本，评估了毒性药代动力学。观察到血浆浓度随剂量增加而升高，且无性别差异（ 图 1 H）。 图 1 MT-125 对 NMIIA 和 NMIIB 具有安全性。 MT-125在小鼠 GBM 模型中延长了生存期 为确定 MT-125 是否与 blebbistatin 一样有效抑制侵袭性，，MT-125 均显著抑制了 Transwell 侵袭（ 图 1J 和 1K）。 在 GEMM 模型，该模型通过将编码 PDGFbb-HA 融合蛋白和 cre 重组酶的逆转录病毒载体正位注射到肿瘤抑制因子（如 Trp53 或 Pten）条件性敲除的小鼠体内创建而成。这产生了一种神经前体细胞型、异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型、甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（MGMT）未甲基化的胶质母细胞瘤，具有 100%的穿透率和致死率。对 Trp53(‒/‒)肿瘤小鼠每日腹腔注射溶剂或 10 mg/kg MT-125，持续 14 天，然后对大脑进行切片并用 H&E 染色（图 2A 和 2B）。MT-125 诱导了多核化（图 2B，白色箭头），并将平均核横截面积增加了 53%（图 2C）。 图 2 MT-125 对胶质母细胞瘤具有治疗活性。 用载体或 MT-125（剂量为 2、5 和 10 mg/kg，每日一次，腹腔注射）处理 GEMM 模型，从逆转录病毒原位注射后 7 天开始，持续治疗至发病。所得 Kaplan-Meier 生存曲线表明，MT-125 在所有三个剂量下均作为单一药物延长了中位生存期（ 图 2G）。因此，2 mg/kg 被设定为最小有效剂量（MED）。 MT-125 诱导氧化还原介导的细胞毒性和放射敏感性 MT-125 在约 10 μM 剂量下对多种小鼠和人胶质母细胞瘤（GBM）细胞系产生>90%的细胞毒性，但对正常细胞无影响（ 图 1C）。由于 DNA 片段化是多种细胞死亡形式的特点，检测了 MT-125 对PARP和磷酸化 H2AX（γH2AX）水平的影响。在 Trp53(‒/‒)细胞中，这两种指标在 MT-125 处理后均增加（ 图 3A），并且这种增加可以通过抗氧化剂 N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）逆转。此外，NMIIA 或 NMIIB 的缺失足以使γH2AX 增加 6 倍以上（ 图 3B），表明这不是脱靶效应。MT-125 也在 胶质母细胞瘤细胞系中增加了γH2AX（ 图 3C）。这些变化与裂解 caspase 3 的表达相一致（ 图 3E），表明 MT-125 诱导细胞凋亡。 图 3 MT-125 诱导氧化还原介导的细胞毒性和放射敏感性。 NMIIA 通过 ROS 调节 PDGFR 信号 NMIIA 缺失抑制致癌激酶信号， 这预示着 NMII 抑制应增强受体酪氨酸激酶（RTK）信号。用 5 μM MT-125 处理Trp53(‒/‒)细胞 48 小时。MT-125 使 PDGFRα和 pY849 PDGFRα的表达增加 2-3 倍( 图 4A 和 4C)。NMIIA 缺失也使 PDGFRα表达增加 7 倍( 图 4D)，证实这一效应并非脱靶作用。MT-125 或 NMIIA 缺失还使 AKT (S473)、mTOR(T2446)和 S6K（T389）的磷酸化水平增加 2-4 倍( 图 4E–4I)。 图 4 非肌肉型肌球蛋白 IIA 和 IIB 通过活性氧调节 PDGFR 信号通路 MT-125 与致癌激酶抑制剂在体外协同作用 在两个关键致癌信号通路模型中（ 图 6A）,MT-125 通过其对活性氧（ROS）的影响间接增强 PDGFR 信号，进而激活 mTOR。由于 mTOR 上调 PDGFRα的表达，这将形成一个正反馈回路，上调的 mTOR 增强 PDGFRα的表达，进一步增强 PI3K 活性。然而，通过 mTOR 调节 NMIIA 的表达为这一回路提供了制动。通过释放这种制动，MT-125 增加了 RTK-PI3K-AKT-mTOR 和 MAPK 信号通路。这两条通路通过至少两个层面的激活相互作用相联系——一方面是 PDGFRα、SRC 和 RAS 之间的相互作用，另一方面是 ERK1/2 和 mTOR 之间的相互作用。 用 PDGFR 抑制剂舒尼替尼处理 Trp53（‒/‒）细胞降低了 AKT、mTOR 磷酸化、RAS 和 SRC 的磷酸化（ 图 6B–6E）。此外，用 ERK1/2 抑制剂 SCH772984（ 图 6F）处理这些细胞即使在存在 MT-125 的情况下也降低了 mTOR 磷酸化（ 图 6G）。 图 6 MT-125 与致癌信号通路抑制剂在体外协同作用 肿瘤细胞可能对其上调的致癌通路产生依赖，这种现象被称为“癌基因成瘾”，这意味着 MT-125 在与 RTK-PI3K-AKT-mTOR 信号通路抑制剂联合使用时可能更有效。MT-125 使sunitinib的效价提高了 1.6 倍（ 图 6H），使everolimus的效价提高了 1.5 倍（ 图 6J），而 MT-125 的效价分别被sunitinib提高了 8.5 倍（ 图 6H）和被everolimus提高了 132 倍（ 图 6I）。此外，NMIIA 的基因敲除也使 Pten（‒/‒）胶质母细胞对sunitinib（图 6I）和everolimus（图 6K）更加敏感。 MT-125 与致癌激酶抑制剂在体内协同作用 在 Trp53 缺失的 GEMMs 模型中，10 mg/kg MT-125（每日腹腔注射）、40 mg/kg sunitinib（每周经口灌胃 5 天）或 sunitinib 治疗 7 天后接受 sunitinib + MT-125。MT-125 治疗组的脑部 GBM（图 7B）明显较小。sunitinib 治疗（图 7C）在载体治疗的基础上增强了肿瘤扩散，肿瘤细胞 PDGF 阳性巢在对侧半球深处可见（图 7D）。相比之下，sunitinib + MT-125 治疗显著减小了肿瘤大小，并延长中位生存期（图 7E-J）。 图 7 MT-125 与致癌信号通路抑制剂在体内协同作用 讨论与总结 文章表明 MT-125 对胶质母细胞瘤（GBM）具有活性。然而，靶点可能具有促肿瘤发生和抗肿瘤发生双重作用。因此，MT-125 抑制的长期影响是否会总体上构成问题、提供治疗机会或两者兼有，目前尚不明确。总体来说，属于研究性论文，有效性还行，但是讲述的机制也过于复杂。 参考：10.1016/j.cell.2025.05.019     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