Rho-associated kinases inhibitors(Beijing Puqi)

神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病等）的共同特征是神经元进行性丧失，但其上游死亡机制尚不明确。近年来，铁死亡（一种铁依赖的、脂质过氧化驱动的细胞死亡方式）被提出可能在神经退行中起关键作用。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是细胞内抵御铁死亡的核心酶，但其如何定位并保护细胞膜免受脂质过氧化的结构机制尚不清楚。 然而，一个关键机制问题依然悬而未决：GPX4作为一种可溶性酶，是如何精确地定位到其作用靶点——细胞膜脂质双分子层上，从而及时清除致命的脂质过氧化物的？这一“空间定位”问题对于理解其在高度极化、膜脂丰富的神经元中的保护作用至关重要。与此同时，临床遗传学研究提供了天然的“实验模型”：2014年，Smith等人发现，GPX4的失活突变会导致一种罕见的致命性疾病——Sedaghatian型脊柱干骺端发育不良（SSMD），患者表现出严重的神经退行性变。值得注意的是，不同于完全丧失功能的截短突变，一种错义突变p.R152H 在部分患者中被发现，其病程相对缓和，提示该变异可能保留部分功能，却依然致病。 这为破解上述机制谜题提供了绝佳契机：R152H突变是否像一把“结构钥匙”，通过破坏GPX4的某个特定功能域（而非其催化活性），从而揭示了其膜定位与神经保护的全新机制？ 来自德国亥姆霍兹国家研究中心联合会以及其他多个国家的国际联合团队从这一临床遗传学线索出发，整合结构生物学、患者来源的细胞模型、条件性基因工程小鼠及系统蛋白质组学，首次揭示了GPX4通过一个独特的“鳍环”结构域锚定于细胞膜，并阐明了该结构破坏如何直接驱动铁死亡依赖的神经退行过程，从而在原子水平至整体动物层面，将蛋白质结构、亚细胞定位与人类疾病病理完美衔接。这项工作不仅阐明了一种超罕见病的分子病因，更将铁死亡确立为连接遗传缺陷与常见神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）病理特征的关键桥梁。 中文标题：GPX4中的鳍环样结构是其神经保护作用的结构基础，可抑制铁死亡 期刊名称：Cell 影响因子：42.5 发表时间：2026年1月8日(提前在线发表) 01 研究思路与流程 临床样本分析：收集携带GPX4 R152H突变的患者样本，进行影像学、遗传学与细胞表型分析。 患者来源模型建立：利用患者成纤维细胞重编程为iPSC，再分化为皮质神经元与大脑类器官，模拟疾病表型。 小鼠模型构建：构建条件性敲除或携带R152H点突变的小鼠模型，研究其神经退行表型。 结构生物学解析：通过X射线晶体学与NMR解析GPX4野生型与R152H突变体的结构差异。 膜结合功能验证：利用双分子层模拟系统（双细胞、GUV）与细胞成像技术，验证结构变化对膜定位的影响。 蛋白质组学分析：对GPX4缺失或突变的小鼠脑组织进行蛋白质组学分析，揭示其与阿尔茨海默病等神经退行疾病的分子相似性。 药理学干预：使用铁死亡抑制剂Lip-1验证铁死亡是否为神经元死亡的主要机制。 02 患者器官核心构建 关键步骤与技术细节： 起始细胞：使用来自纯合子患者（GPX4^R152H/R152H） 和其杂合子父亲（GPX4^WT/R152H） 的诱导多能干细胞（hiPSCs）。 拟胚体形成： 将hiPSCs解离为单细胞。 在V底超低吸附96孔板中，每孔接种9000个细胞。 使用含ROCK抑制剂（Y-27632）和铁死亡抑制剂Lip-1的iPSC培养基培养，离心促进聚集，形成拟胚体。 神经诱导与早期发育（第0-18天）： 培养基：换用Essential 6基础培养基，并添加： SB-431542（TGF-β通路抑制剂） XAV939（Wnt通路抑制剂） Lip-1（关键步骤：此阶段所有类器官均添加Lip-1，以防止因GPX4功能缺陷导致的铁死亡，确保神经上皮结构能够正常形成）。 每天进行部分换液。从第4天起，移除XAV939。 成熟培养与疾病表型诱导（第18天及以后）： 将类器官转移至悬浮培养体系（摇床）。 培养基切换：使用基础类器官培养基，并分为两组： 对照组（B27-AO + Lip-1）：持续补充抗氧化剂缺失的B27和Lip-1，以维持类器官存活与正常发育。 实验组（B27-AO）：撤除Lip-1。这是触发疾病表型的关键。对于纯合突变类器官，撤除Lip-1意味着其自身有缺陷的GPX4无法抵抗脂质过氧化。 在此条件下，突变类器官开始表现出退化迹象。 表型分析与终点评估： 形态学：观察并测量类器官直径，突变类器官在撤除Lip-1后出现萎缩、停止生长直至分解。 组织结构：通过冰冻切片和CTIP2等皮质层标志物的免疫荧光染色，评估类器官的皮质板分层是否正常。 定量分析：将发育中的皮层划分为5个区域（如文章所述，Bin1代表心室区，Bin4-5代表皮质板），量化神经元在这些区域的分布，以评估皮层分层是否成功。该流程在本研究中的核心作用 模拟人类发育：在三维空间中重现了人前脑皮层的早期发育和结构组织。 触发疾病表型：通过撤除Lip-1这一操作，特异性地在携带致病突变的人类细胞中“启动”了铁死亡过程，从而模拟了患者神经元在体内可能经历的进行性退化。 建立挽救模型：通过在培养基中重新加入Lip-1，可以“挽救”类器官的死亡表型，从而在人类细胞模型中直接证明了铁死亡是导致退化的原因，并验证了药物干预的有效性。 小结：本文构建的患者来源大脑类器官，是一个将人类遗传背景、三维脑发育结构和可控的铁死亡应激相结合的强大模型。它直接从患者细胞出发，在培养皿中重现了由特定分子机制（GPX4膜定位缺陷）驱动的神经退行过程，为在人体外研究疾病机制和测试治疗方法提供了重要平台。 03 研究结果 ▏起点：一个“奇怪”的致病突变 临床发现三名SSMD患者携带GPX4基因的R152H错义突变（而非常见的功能完全缺失突变）。患者表现出严重的神经退行（如小脑萎缩）和骨骼畸形。 发现：患者的成纤维细胞和由iPSC分化的皮质神经元都发生快速死亡，但这种死亡能被铁死亡抑制剂（如Lip-1）完全挽救。然而，检测发现GPX4-R152H突变体的蛋白表达量和体外催化活性与野生型几乎无异。 小结：这提出了一个关键问题——如果酶还在，也有活性，为什么不能保护细胞？这暗示R152H突变导致了一种非催化活性的功能缺陷。研究者由此建立了患者iPSC来源的神经元和大脑类器官模型，证实了该突变导致神经元对铁死亡异常敏感 (图1F-K)。 图1：GPX4 R152H等位基因诱发铁死亡 A. 患者影像学显示典型的SSMD骨骼畸形。 B. GPX4基因图谱与R152H突变位点的Sanger测序验证。 C. 两个受累家庭的系谱图，显示R152H等位基因的传递。 D. 患者脑部MRI影像，显示进行性小脑与皮层萎缩。 E. 由患者成纤维细胞生成iPSC、皮质神经元与前脑类器官的流程示意图。 F. 皮质神经元表达成熟神经元标志物（如CTIP2、MAP2），证明分化成功。 G. 仅纯合R152H皮质神经元在撤除铁死亡抑制剂Lip-1后死亡，可被Lip-1挽救。 H. 活细胞成像显示纯合R152H神经元在无Lip-1时发生死亡。 I. 纯合R152H大脑类器官在撤除Lip-1后出现萎缩和降解。 J. 定量分析显示纯合R152H类器官直径显著缩小。 K. 类器官切片免疫荧光显示，在Lip-1存在时皮层分层正常（CTIP2聚集于皮质板）；无Lip-1时分层紊乱。 ▏突破：结构生物学揭示“鳍环”塌陷 为了探究上述非催化功能缺陷的根源，研究者转向结构分析。 发现：通过X射线晶体学和核磁共振（NMR）对比野生型与R152H突变体GPX4的结构，发现一个关键差异。在野生型GPX4表面，有一个由疏水氨基酸I129和L130构成的突出环状结构，因其形状被称为“鳍环”。R152的精氨酸侧链通过氢键网络，像“支柱”一样稳定着这个鳍环的基部，使其伸展。 小结：R152H突变将精氨酸变为组氨酸，破坏了这一氢键网络，导致鳍环结构塌陷，其顶端的疏水残基取向发生改变 (图2C-G)。这是首次在结构上观察到该突变的具体影响。 图2：GPX4 R152H突变导致疏水鳍环塌陷 A. 基于亲和纯化GPX4的酶活性测定流程图。 B. LC-MS/MS分析显示，R152H突变体与野生型GPX4具有相同的磷脂氢过氧化物还原活性。 C. 野生型与R152H突变体GPX4的NMR谱图叠加，显示整体结构正确折叠。 D-E. 将NMR动态数据映射到晶体结构上。野生型中，R152（紫色）与N132/A133形成氢键（黄色虚线），稳定延伸的鳍环（红色区域显示一定柔性）。R152H突变导致该氢键网络破坏，鳍环塌陷，I129侧链填充了原R152的空间。 F-G. 化学位移扰动分析表明，结构变化主要集中于鳍环区域（残基~130）。 ▏机制：塌陷的鳍环破坏膜定位  前因：疏水的鳍环结构提示，它可能介导GPX4与脂质膜（铁死亡发生的主要场所）的相互作用。 验证实验发现： NMR膜结合实验：将GPX4与膜模拟物（双细胞）共孵育。野生型GPX4的鳍环区域信号显著减弱，表明其与膜紧密结合；而R152H突变体几乎不结合 (图3B, C)。 功能验证突变：将鳍环顶端的I129和L130直接突变为亲水性的丝氨酸（I129S/L130S）。该突变体催化活性正常、鳍环结构依然伸展，但疏水性丧失。实验表明，它同样不能结合膜，且无法在细胞中抑制铁死亡 (图3E, F)。这反向证明了鳍环的疏水性是其膜定位的关键。 细胞成像：超分辨显微镜显示，野生型GPX4在细胞膜上形成离散的纳米簇，而R152H突变体则呈弥散分布，表明其膜定位和组织方式受损 (图3L)。 图3：疏水鳍环介导GPX4的膜结合 A. 野生型与R152H突变体GPX4的结构叠加，显示鳍环区域的构象变化。 B-C. NMR双细胞结合实验。野生型GPX4在鳍环区域信号显著减弱（强度比低），表明直接结合；而R152H突变体信号无变化，表明不结合。 D. I129S/L130S双突变体晶体结构显示，其鳍环结构仍被R152稳定，但亲水性增加。 E-F. 在GPX4敲除细胞中回补表达野生型或突变体GPX4。仅野生型能挽救细胞存活，R152H及I129S/L130S双突变体均失效。 G. 酶活测定再次证实所有突变体催化活性正常。 H-I. R152K突变体晶体结构显示，其鳍环稳定性部分被水分子介导的氢键恢复，功能得以部分保留。 J-K. 细胞亚组分馏实验显示，与野生型相比，R152H突变体在膜组分中的富集程度显著降低。 L. 超分辨显微镜显示，野生型GPX4在质膜上形成纳米簇，而R152H突变体分布弥散。 M. 体外膜结合实验证实，野生型GPX4与含磷脂酰丝氨酸的囊泡结合更强，而R152H结合能力显著减弱。 N. 在PM sheets模型上定量证实，R152H突变体在质膜上的定位密度降低。 小结：研究揭示了R152H致病的全新机制：突变→鳍环结构塌陷/疏水性丧失→GPX4无法有效锚定在细胞膜上→无法及时清除膜上的脂质过氧化物→铁死亡发生。这完美解释了为何“有酶有活性却无法保护细胞”。 ▏验证：在动物模型中重现神经退行 前因：需要在活体动物中验证上述机制能否导致神经系统病变。 模型构建：由于纯合R152H小鼠胚胎致死，研究者构建了神经元特异性条件性敲除GPX4（模拟完全失活）和敲入R152H（模拟患者突变）的小鼠。 表型发现： 大脑结构：两种小鼠均出现进行性大脑皮层萎缩、脑室扩大，敲入小鼠表型相对温和（亚等位基因效应）(图4A-D)。 细胞死亡与炎症：皮层中出现大量TUNEL阳性的死亡细胞，并伴随强烈的星形胶质细胞增生和小胶质细胞激活（神经炎症）(图4E, H, I)。 生物标志物：血液中的神经丝轻链（NfL） 水平急剧上升，这是人类神经退行疾病的经典标志 (图4G)。 功能挽救：使用铁死亡抑制剂Lip-1治疗，可显著降低NfL水平，延缓神经退行，直接证明铁死亡是核心驱动因素 (图4J)。 图4： GPX4对维持皮层与小脑神经元完整性至关重要 A-C. 神经元特异性敲除GPX4小鼠的脑部MRI及体积量化，显示进行性皮层萎缩与脑室扩大。 D. 尼氏染色显示敲除小鼠皮层变薄、结构紊乱。 E. TUNEL染色显示敲除小鼠皮层中存在大量凋亡/坏死细胞。 F. 体成分分析显示小鼠消瘦源于中枢病变，而非外周组织消耗。 G. 血浆神经丝轻链（NfL）水平在敲除后急剧升高，作为神经损伤的生物标志物。 H-I. 免疫印迹与染色显示，神经元死亡后伴随显著的星形胶质细胞增生（GFAP）和小胶质细胞激活（IBA1）。 J. Lip-1治疗可显著降低血浆NfL水平，证实铁死亡是神经元死亡的主要驱动因素。 K-L. 小脑Purkinje细胞特异性敲除GPX4导致细胞丢失、胶质增生、运动失调及血浆NfL升高。 小结：动物模型成功复现了患者的核心神经病理特征，并将GPX4功能缺失/膜定位缺陷与铁死亡驱动的神经炎症、萎缩和行为学缺陷直接联系起来。 ▏延伸：与常见神经退行疾病的分子联系 前因：GPX4突变导致的是罕见病，但其机制是否与常见的阿尔茨海默病（AD）等有共通之处？ 发现：对GPX4缺失小鼠的大脑皮层进行蛋白质组学分析，发现其差异表达蛋白组与AD患者的脑蛋白组存在显著重叠。例如，APOE（载脂蛋白E）和CLU（簇蛋白）等AD关键风险因子在小鼠模型中同样上调 (图5H)。 图5：神经蛋白质组学分析将GPX4缺陷与痴呆样分子特征联系起来 A. 皮层组织蛋白质组学数据的主成分分析，显示随敲除时间推移，分子差异愈发显著。 B. 差异蛋白的通路富集分析显示，“阿尔茨海默病”通路在敲除后期显著富集。 C. 包含R152H敲入小鼠的蛋白质组学主成分分析。 D. R152H敲入小鼠同样显示“阿尔茨海默病”通路富集。 E. 关键差异表达基因（如APOE, CLU）在敲除、敲入与野生型小鼠中的表达变化对比。 F. 维恩图展示小鼠差异蛋白组与人类阿尔茨海默病脑蛋白组数据的重叠程度，随时间推移或突变引入而增加。 G. 基因集富集分析曲线，证实人类AD相关蛋白集在小鼠模型中显著富集。 H. 散点图直接展示小鼠模型与人类AD之间差异表达蛋白的高度正相关。 I. 通路网络分析显示，GPX4缺陷小鼠与人类AD大脑在核心神经退行相关通路上具有高度相似的调控模式。 小结：这表明，由GPX4功能障碍引发的铁死亡，可能驱动了一套与常见神经退行疾病高度相似的分子程序。从而将罕见遗传病的研究发现，提升到了对阿尔茨海默病等重大疾病机制理解的普遍高度。 04 研究亮点 结构生物学与疾病机制深度融合：从原子结构到细胞表型再到整体动物模型，系统阐释GPX4膜定位的结构与功能。 转化医学价值突出：为SSMD及其他GPX4相关神经退行疾病提供了精准机制解释与潜在治疗策略。 提出“膜定位功能丧失”新概念：拓展了对酶功能调控的理解，提示蛋白质亚细胞定位的精准调控对细胞存活至关重要。 为神经退行疾病的铁死亡靶向治疗提供强有力证据：支持开发针对铁死亡通路（尤其是膜定位环节）的神经保护药物。 05 总结 本文揭示GPX4通过其“鳍环”结构域锚定于细胞膜以清除脂质过氧化物，是抵抗铁死亡的关键。患者来源的R152H突变导致该结构塌陷，使GPX4虽具催化活性却无法定位膜上，从而引发铁死亡驱动的神经退行。动物与类器官模型证实此机制，且其分子特征与阿尔茨海默病等常见神经退行疾病高度重叠。 展望：未来需在活体神经元中直接可视化GPX4的膜定位动态；需探究人类是否存在特有补偿机制使R152H患者得以存活；最重要的是，需开展临床研究，验证靶向铁死亡（如增强膜定位或使用新型抑制剂）能否延缓或治疗神经退行性疾病。本研究为从结构机制出发开发神经保护疗法提供了全新范式。 参考文献 Lorenz SM, Wahida A, Bostock MJ, Seibt T, Santos Dias Mourão A, Levkina A, Trümbach D, Soudy M, Emler D, Rothammer N, Woo MS, Sonner JK, Novikova M, Henkelmann B, Aldrovandi M, Kaemena DF, Mishima E, Vermonden P, Zong Z, Cheng D, Nakamura T, Ito J, Doll S, Proneth B, Bürkle E, Rizzollo F, Escamilla Ayala A, Napolitano V, Kolonko-Adamska M, Gaussmann S, Merl-Pham J, Hauck S, Pertek A, Orschmann T, van San E, Vanden Berghe T, Hass D, Maida A, Frenz JM, Pedrera L, Dolga A, Kraiger M, Hrabé de Angelis M, Fuchs H, Ebert G, Lenberg J, Friedman J, Scale C, Agostinis P, Zimprich A, Vogt-Weisenhorn D, Garrett L, Hölter SM, Wurst W, Glaab E, Lewerenz J, Popper B, Sieben C, Steinacker P, Zischka H, Garcia-Saez AJ, Tietze A, Ramesh SK, Ayton S, Vincendeau M, Friese MA, Wigby K, Sattler M, Mann M, Ingold I, Jayavelu AK, Popowicz GM, Conrad M. A fin-loop-like structure in GPX4 underlies neuroprotection from ferroptosis. Cell. 2025 Dec 4:S0092-8674(25)01310-8. doi: 10.1016/j.cell.2025.11.014. Epub ahead of print. PMID: 41349546. 扫描添加小助手获取原文 A BOUT Ark Future 关于方舟未来 Ark Future方舟未来生命科学（上海）有限公司是一家专注于类器官技术、基因编辑及细胞治疗研发与应用的创新型生物科技企业。公司以“生命方舟，健康未来”为愿景，致力于成为全球领先的疾病模型构建与个性化治疗方案服务商。 Ark Future构建了集成类器官、基因编辑与细胞治疗技术的综合性研发平台，已成功建立覆盖视网膜、心脏、消化道、肝脏、肺部、乳腺、前列腺、睾丸等数十种组织来源的类器官模型库，涵盖数百例源自肿瘤及正常组织的生物样本，搭建了覆盖科研探索、药物研发与临床精准医疗的全链条业务体系，为科研机构、医药企业及医疗机构提供标准化产品与定制化解决方案。 公司高度重视研发创新与知识产权保护，目前已累计申请10余项国内发明专利与实用新型专利。同时，Ark Future积极构建产业生态，已与国内外数家顶尖药企、知名科研机构及三甲医院建立深度战略合作，共同推动类器官技术在多个领域的标准化与临床应用。 Ark Future以创新为引擎，以疾病模型与治疗服务为双翼，持续推动类器官技术在药物研发、精准医疗与再生医学等领域的产业化进程，携手全球合作伙伴，共同驶向生命科学的未来。 公司地址：上海市浦东新区金科路4218号诺华上海园区4号楼 邮箱：service@arkfuture.com.cn 电话：400-668-8274 官网：www.arkfuture.com.cn END 编辑丨月亮 排版丨舟舟 审核丨舟舟 往期推荐: Cell Stem Cell 重磅 | 成功培育“全人源微型骨髓”，造血研究迎来革命性模型 Nature Biomedical Engineering丨新型“智能凝胶”成功实现中风后脑再生 Nature综述 | Hans Clevers团队：类器官重塑药物研发全流程 下一代骨修复术：从患者脂肪中快速获得“即取即用”的个性化活性骨移植物 科学十字路口的抉择：CDC终止猴子研究，动物模型的功过与未来何去何从？ Nature Communications | 斯坦福重磅研究：患者类器官揭示，儿童肠炎的治疗新靶点不在免疫，而在代谢！