A-83-01

PROTOCOL ／ 实验手册 iPSC 来源的肝—胆—胰联合类器官培养 从入门到精通 前肠—中肠边界自组织原理 ｜ 30 天全流程 SOP关键质量属性 · 故障排查 · 十大易错点深度解析 适用平台：hiPSC / hESC　｜　体系类型：3D 自组织 + 气液界面　｜　用途：科研与药物研发技术等级：★★★★☆（需具备稳定 iPSC 培养与 3D 类器官经验）　｜　版本 v1.0 把人源 iPSC 变成"一块会分泌白蛋白、会长出毛细胆管、旁边还连着胰岛样结构"的微型器官复合体，这件事在 2019 年之后从"设想"变成了"可复现的技术路线"。但绝大多数实验室在第一次尝试时都会卡在同一个地方：能长出球，但长不出结构；能长出结构，但三个谱系彼此不连。 这篇手册要解决的正是这个断层。它不满足于罗列生长因子，而是把"为什么加这个因子""什么时间点必须撤掉""哪个指标不达标就必须停手"讲清楚。全文约 1.3 万字、33 张操作参数表，关键步骤精确到微升、分钟与离心力，建议收藏后按阶段对照执行。 阅读提示｜本文为科研技术综述与操作参考，所有浓度均为起始参考值，必须按自有细胞系与试剂批次滴定。文中不涉及任何临床治疗方案，类器官不得用于生殖目的或直接回输人体。 本文结构PART 01 　概念与生物学基础PART 06 　故障排查手册PART 02 　实验前准备与试剂清单PART 07 　十大易错点深度解析PART 03 　30 天逐日操作 SOPPART 08 　进阶：血管化与器官芯片PART 04 　三谱系独立分化加强路线PART 09 　合规、伦理与记录PART 05 　鉴定、定量与判读体系PART 10 　参考文献 PART 01 ／ 生物学基础 先搞懂发育，再动手做实验 1.1　"联合类器官"到底指什么 文献中常见的三个词容易被混用，含义差别很大，先做区分： 术语 结构本质 是否有腔道连通共培养（co-culture） 两种及以上类器官放在同一孔/同一基质中，物理相邻但各自独立 否组装体（assembloid） 预先分化的多个细胞群/球体融合，形成有界面但多为"贴合"的连接 部分，需验证肝胆胰类器官（HBPO） 前肠球与后肠球在边界处自主分化出肝、胆、胰三个域，并形成连续上皮是（本手册主线） 概念辨析｜只有第三条才真正复现"器官间连接"。如果你的课题目标是胆道闭锁、胰胆管合流异常、或胆汁反流性胰腺损伤，共培养体系无法回答机制问题——因为疾病的核心恰恰在"连接处"。 1.2　发育学底层逻辑：一条管子的两次"转弯" 整个体系可以压缩成一句话：前肠末端与中肠起始端在边界处相互诱导，肝、胆、胰三个原基沿这条边界依次"出芽"。理解这句话，后面所有培养基配方都只是它的注脚。 在体内，这个过程按四步展开： 第一步｜定形内胚层（DE）形成 Nodal/Activin A 通过 SMAD2/3 诱导 SOX17、FOXA2、GATA4 表达。此阶段的关键不是"分化"，而是纯度——残留的多能细胞会在后期长成畸胎瘤样结构或非内胚层杂细胞。 第二步｜肠管形成与前后轴建立 内胚层折叠成管，沿前后轴出现身份差异。前肠（SOX2⁺）走向肝、胆、胰、肺、甲状腺；后肠（CDX2⁺）走向肠道。这两个身份必须在 2D 阶段就分开培养，这是整个方案最反直觉、也最容易做错的一步。 第三步｜边界处的相互诱导 前肠球与后肠球贴合后，边界区同时接受来自两侧的旁分泌信号，出现 PDX1⁺（胰）与 PROX1⁺（肝/胆）两个相邻的域。这一步不需要外加因子，靠的是细胞自身分泌的 FGF、BMP、RA 梯度——这正是"自组织"的含义。 第四步｜内陷、分支与成熟 PROX1⁺ 上皮向间质内陷并分支，形成胆管树雏形；胰腺域形成分支腺泡；肝域形成肝索样结构。此阶段机械力与氧梯度（气液界面）比生长因子更关键。 1.3　三条谱系的分叉点：一组必须记住的信号对 肝、胆、胰同源于前肠内胚层，分叉取决于几组信号的相对强度，而非"有或无"。这是本领域最难讲清、也最常被简化的部分： 信号轴 肝向 胆向 胰向BMP 高 → 促肝（BMP4 来自横中隔间质） 中低 必须抑制（Noggin）FGF FGF2 中高 → 肝定向 FGF10 支持胆管祖细胞扩增 FGF10 高 → 胰祖细胞扩增视黄酸 RA 低／无 低必需 ，诱导 PDX1SHH 低（需抑制） 中 必须抑制（KAAD-cyclopamine / SANT-1）Notch 成熟期需下调必需激活 （JAG1） 内分泌分化需下调Wnt 早期低，类器官扩增期需维持 维持（Rspo1） 早期需，内分泌期需降 最容易被忽略的冲突｜肝细胞成熟需要抑制 Notch（DAPT 处理可显著提升 ALB、CYP 表达）；而胆管分化依赖 Notch 激活（JAG1-Notch2 轴）。 这意味着："肝-胆同源共培养"在单一培养液里是信号学上自相矛盾的。任何声称用一瓶培养基同时养出成熟肝细胞和高分化胆管细胞的方案，都应当被严格质疑。正确做法只有两条：空间分隔（分区供液、微流控）或时序分隔（先胆管定型、后肝成熟）。 1.4　三条技术路线，怎么选 路线 核心操作 优势 局限 难度A. 分区诱导 + 后期组装 三条线各自分化成熟，再共培养或嵌入同一支架 每一条线可单独优化，成熟度高 无天然腔道连通；界面为瘢痕样贴合 ★★★B. 边界自组织（HBPO） 前肠球 + 后肠球融合，靠边界互诱导生成三域 唯一能形成连续上皮与连接结构的方案 周期长（≥30 天）；对球体质量极敏感 ★★★★C. 血管化肝芽 / 器官芯片 内胚层细胞 + 内皮 + 间充质自组装，或芯片分区灌流 可灌流、可长期维持、支持免疫共培养 设备与工艺门槛高；通量低 ★★★★★ 选型建议：首次建立体系走 B 线，它能在 30 天内给出"是否成功"的明确判据；若目标是药物肝毒性 + 胰腺毒性联合评估，走 A 线更快出数据；若目标是感染或免疫机制，直接上 C 线，不要在中途反复迁移。 PART 02 ／ 实验前准备 八成的失败，在开工前就已注定 2.1　iPSC 起始质量：不可妥协的四项 分化效率的天花板由起始细胞决定。以下四项必须在 D-7 前完成，任何一项不合格，后面的优化都是徒劳： 项目 方法 放行标准 多能性 流式 OCT4 / NANOG / SSEA4 / TRA-1-60 双阳性 ≥ 95%，SSEA4⁺ ≥ 90% 核型 G 显带，每 10 代一次 46,XX 或 46,XY，无克隆性异常 微生物 支原体 PCR / 培养法，每 4 周 阴性（支原体污染会显著降低 DE 效率且不易察觉） 自发分化 镜下形态 + 碱性磷酸酶 克隆边界锐利，无中心坏死、无扁平铺展 实操建议｜不要用"传了很多代、状态还行"的细胞做首次尝试。挑一支传代 ≤ 25 代、刚复苏 2–3 代、克隆形态教科书级的细胞系作为基准线，先把 DE 效率做到 85% 以上，再谈后面。这一步省下的时间，会在 D7 之后加倍还给你。 2.2　培养基配方总表（起始参考浓度） 下表综合了 Koike 等（Nature 2019；Nature Protocols 2021）的 HBPO 体系、Takebe 等肝芽体系、Huch 等肝类器官体系，以及胰腺定向分化的通用做法。标注"滴定"的项目务必自行做剂量爬坡。 阶段 基础培养基 关键添加物（起始浓度）DE D0–D3 RPMI-1640 + GlutaMAX（或 DMEM/F12） Activin A 100 ng/mL；CHIR99021 3 µM（仅 D0）；丁酸钠 0.5 mM（可选）；FBS 0 → 0.2% 阶梯，或 B27（无胰岛素）前肠身份 D3–D7 RPMI-1640 + B27 Noggin 100 ng/mL；SB431542 10 µM；FGF4 低剂量或省略 → SOX2⁺后肠身份 D3–D7 RPMI-1640 + B27 FGF4 500 ng/mL；CHIR99021 2–3 µM → CDX2⁺球体重聚 D7–D8 DMEM/F12 + 10% KSR Y-27632 10 µM（必需，仅此 24 h）边界融合 D8–D9 DMEM/F12 + B27 Y-27632 10 µM（过夜）；不额外加形态发生素极化 / 成熟 D9–D30 DMEM/F12 + B27 + N2 HGF 20；EGF 20；FGF10 50；Rspo1 250；Noggin 50；A83-01 0.5 µM；地塞米松 1 µM；胰岛素 10 µg/mL（均为 ng/mL 除标注）ALI 长期 D13+ 同上，减血清 保留 HGF / EGF / FGF10；可加 VEGF 50 ng/mL 促血管化 基础培养基为何反复切换｜RPMI-1640 的葡萄糖与氨基酸配比更适合内胚层早期定向；DMEM/F12 的脂质与微量元素更适合 3D 长期维持。切换本身就是一个"选择压力"——它能筛掉不适应新代谢环境的杂细胞。 2.3　关键耗材与设备清单 基质胶 生长因子减量型 Matrigel（GFR），蛋白浓度 8–11 mg/mL。需按批次预筛（见 7.1） 低吸附板 96 孔圆底超低吸附板（球体成型专用），U 底优于 V 底 解离试剂 Accutase 或 TrypLE Express（温和）；回收类器官用胶原酶 II 2 mg/mL + Dispase 滤网 40 µm / 100 µm 细胞筛，用于去除团块与单细胞分级 气液界面 Transwell insert（0.4 µm 孔径）或自制凝胶柱；需配 6/12 孔板 显微操作 体视显微镜 + 显微镊/手术刀（用于 D13 切除 PROX1⁺ 域） PART 03 ／ 核心 SOP 30 天全流程：精确到微升与分钟 本章按"可以照着做"的标准编写。所有体积、转速、时间均给出具体数值，并标注哪些参数必须自行滴定、哪些照做即可。建议先通读 3.1–3.2 完成试剂准备，再按 3.3 之后的阶段推进。 开工前必读｜本 SOP 以 24 孔板为 2D 阶段主载体、96 孔超低吸附圆底板为球体成型载体、12 孔 Transwell（0.4 µm）为 ALI 载体。若改用其他规格，请按 3.3.4 的面积换算表调整体积，不要按孔数简单等比缩放——孔越小，蒸发与边缘效应越强。 3.0　逐日操作总表（可直接打印） 先看全景。这张表决定了你未来 30 天的作息，建议在排实验计划时就按它预留时间——中间任何一天断档，后面都要重来。 日 上午操作 下午／加做 耗时D-7 复苏或传代，接种 2 个 6 孔 — 1.5 hD-6～D-4 每日换 mTeSR1（2 mL/孔），镜下记录克隆形态 D-5 做支原体快检 0.4 hD-3 传代一次（1:6），去除自发分化区 — 1.5 hD-2～D-1 每日换液，D-1 下午评估融合度 D-1 预冷分装 Matrigel、配 D0 培养基 1 hD0 Accutase 消化 → 计数 → 铺 24 孔 → 加 D0 培养基 留 1 孔做 D0 基线 qPCR 2 hD1 换 DE 培养基（不含 CHIR），镜下记录死亡比例 — 0.6 hD2 换 DE 培养基，观察是否出现梭形中胚层灶 — 0.6 hD3取样判 DE （1 孔做流式/qPCR）→ 换前肠或后肠培养基 流式样本需 2×10⁵ 细胞 3 hD4 换液（前/后肠各自培养基） — 0.6 hD5 换液，重点观察后肠孔囊泡出现情况 — 0.6 hD6 换液；预冷 96 孔板，准备重聚 配重聚培养基 0.8 hD7 分别消化前肠孔/后肠孔 → 计数 → 接种 96 孔 取样做 SOX2/CDX2 qPCR 4 hD8 镜下确认球体；挑取直径 150–300 µm 者配对 Matrigel 融合（冰上操作） 3 hD9 镜下确认融合；换极化培养基（撤 Y-27632） — 0.8 hD11 换液；取样验证 PDX1/PROX1 边界 整装免疫荧光（至少 3 枚） 5 hD13显微切除 PROX1⁺ 域  → 转 Transwell 记录切除前后尺寸 3 hD16 换液（下室 1 mL） — 0.5 hD19 换液；首次可见分支芽 拍照记录分支数 1 hD23 换液；分支结构成形 — 0.5 hD26 换液；准备终点检测耗材 — 0.5 hD30终点 ：形态成像 → 固定 → 石蜡/冰冻切片 收集 24 h 上清做功能检测 6 h 时间管理提醒｜D3、D7、D8、D13 四个节点是硬节点，不能顺延。其余换液日可浮动 ±4 h。若 D3 的 DE 效率不合格，正确做法是当天重开一批，而不是"先往下做看看"——带着 60% 纯度的内胚层往下走，D30 一定拿不到结构，且会浪费 3 周。 3.1　储备液配制：先解决"加多少微升" 所有因子按单次使用量分装，避免反复冻融。细胞因子类（Activin A、FGF、HGF、EGF、Rspo1、Noggin）建议加 0.1% BSA 作为载体蛋白，防止吸附到管壁导致实际浓度低于标称值——这是"明明加了足量因子却没效果"的常见原因。 试剂 溶剂 储备浓度 工作浓度 稀释比与备注 Activin A PBS + 0.1% BSA 100 µg/mL 100 ng/mL 1:1000；−80 ℃，5 µL/管 CHIR99021 DMSO 10 mM 3 µM 1:3333；仅 D0 使用 Y-27632 DMSO 或水 10 mM 10 µM 1:1000；仅解离后 24–48 h Noggin PBS + 0.1% BSA 100 µg/mL 50–100 ng/mL 1:1000～1:2000 SB431542 DMSO 10 mM 10 µM 1:1000；TGFβ 抑制剂 FGF4 PBS + 0.1% BSA 100 µg/mL 500 ng/mL 1:200；后肠身份关键 FGF2 / BMP4 PBS + 0.1% BSA 100 µg/mL 10 / 20 ng/mL 1:10000 / 1:5000；肝向用 全反式视黄酸（RA） DMSO 10 mM 0.5–2 µM避光 ；棕色管；现配 SANT-1 DMSO 10 mM 0.25 µM 1:40000；SHH 抑制 LDN193189 DMSO 10 mM 200 nM 1:50000；BMP 抑制 HGF / EGF PBS + 0.1% BSA 100 µg/mL 20–50 ng/mL 1:2000～1:5000 FGF10 PBS + 0.1% BSA 100 µg/mL 50–100 ng/mL 1:1000～1:2000；加肝素 10 µg/mL 稳定 Rspo1 PBS + 0.1% BSA 500 µg/mL 250–500 ng/mL 1:1000～1:2000；Wnt 增强 A83-01 DMSO 10 mM 0.5 µM 1:20000；ALK4/5/7 抑制 Forskolin DMSO 10 mM 10 µM 1:1000；cAMP 升高 烟酰胺 水 1 M 10 mM 1:100；0.22 µm 过滤 N-乙酰半胱氨酸 水 500 mM 1.25 mM 1:400；现配，pH 调至 7.2 地塞米松 DMSO 10 mM 1 µM 1:10000；促肝成熟 DMSO 总量必须核算｜本方案在 D0 需同时加入 CHIR99021 与 Y-27632（若铺板培养基含 ROCKi），DMSO 终浓度约 0.1%。培养体系中 DMSO 超过 0.5% 会产生明显细胞毒性，超过 1% 会显著改变分化轨迹。 建议做法：把同一阶段所有 DMSO 溶解的因子算一个总和，若 ＞ 0.3%，先用少量基础培养基预混成 10× 中间液，再补足体积。切勿把 5 种 1:1000 的 DMSO 储备液直接连续加进同一孔。 3.2　培养基定量配方（以 50 mL 为一批） 按 50 mL 配制，可在 4 ℃ 保存 1 周（含 RA 的培养基现配现用，不超过 24 h）。以下四种为全程核心培养基，其余为变体。 DE 培养基（D0–D3） 加入量 / 50 mL 终浓度 RPMI-1640 + GlutaMAX 48.9 mL 补足至 50 mL B27（50×，无胰岛素） 1 mL 1× Activin A（100 µg/mL） 50 µL 100 ng/mL CHIR99021（10 mM）仅 D0 15 µL 3 µM 丁酸钠（1 M，可选） 25 µL 0.5 mM 青霉素-链霉素（100×） 500 µL 1×（可选） 前肠培养基（D3–D7） 加入量 / 50 mL 终浓度 RPMI-1640 + GlutaMAX 48.85 mL 补足至 50 mL B27（50×） 1 mL 1× Noggin（100 µg/mL） 50 µL 100 ng/mL SB431542（10 mM） 50 µL 10 µM FGF4（100 µg/mL，可选低剂量） 0–25 µL 0–250 ng/mL 后肠培养基（D3–D7） 加入量 / 50 mL 终浓度 RPMI-1640 + GlutaMAX 48.85 mL 补足至 50 mL B27（50×） 1 mL 1× FGF4（100 µg/mL） 250 µL 500 ng/mL CHIR99021（10 mM） 10–15 µL 2–3 µM 极化／成熟培养基（D9–D30） 加入量 / 50 mL 终浓度 DMEM/F12 + GlutaMAX 46.2 mL 补足至 50 mL B27（50×）+ N2（100×） 1 mL + 0.5 mL 1× / 1× HEPES（1 M） 0.5 mL 10 mM HGF / EGF / FGF10 10 / 10 / 25 µL 20 / 20 / 50 ng/mL Rspo1 / Noggin 25 / 25 µL 250 / 50 ng/mL A83-01 / 地塞米松 2.5 / 5 µL 0.5 µM / 1 µM 胰岛素（10 mg/mL） 50 µL 10 µg/mL 配制顺序｜先加基础培养基与补充剂（B27/N2/HEPES/抗生素），混匀；再加入小分子抑制剂（DMSO 溶解）；最后加细胞因子。细胞因子直接加入高浓度 DMSO 环境会部分变性。配好后 0.22 µm 过滤（含蛋白的培养基过滤会损失 5–10%，若因子昂贵可只过滤基础部分）。 3.3　包被、铺板与面积换算 3.3.1　Matrigel 包被（D-1 或 D0 提前 1 h） 冰上操作：取 1 份 Matrigel 原液，加 29 份冰冷 DMEM/F12（1:30），用预冷枪头缓慢混匀，避免产生气泡。24 孔板每孔加 300 µL，轻晃铺满孔底，37 ℃ 静置 ≥ 1 h。使用前吸弃多余液体，不要洗涤（洗涤会破坏薄层）。 3.3.2　D0 消化与计数 吸弃培养基，PBS 洗 1 次；24 孔板每孔加 Accutase 300 µL，37 ℃ 4–6 min；镜下见克隆边缘卷起、细胞间隙变宽即终止（不要等到完全脱落）。加等体积 DMEM/F12 + 10% FBS 终止，用 1000 µL 枪头轻吹 3–5 次；加样枪距孔底约 2 mm，不要贴着底吹。 过 40 µm 滤网去除团块，100 g × 3 min 离心（注意：是 100 g，不是 300 g；过高离心力会损伤 iPSC）。台盼蓝计数，活率须 ＞ 90%，否则重做。 3.3.3　接种密度换算 板型 生长面积 接种细胞数 培养基体积 6 孔 9.6 cm² 1.2–1.9×10⁶ 2 mL 12 孔 3.8 cm² 4.6–7.6×10⁵ 1 mL24 孔（本方案） 1.9 cm²2.3–3.8×10⁵500 µL 48 孔 1.1 cm² 1.3–2.2×10⁵ 300 µL 96 孔（2D） 0.32 cm² 3.8–6.4×10⁴ 100 µL 3.3.4　铺板手法（决定"均匀"与"不均"） 加液后前后左右各推 5 次（十字法），不画圈。画圈会使细胞向孔中央聚集，形成"中间厚、四周空"的分布，D3 时中央区必然过度融合并转向中胚层。放入培养箱后 前 30 min 不要开门，让细胞完成贴壁。 边缘效应｜24 孔板最外一圈孔的蒸发速率比中央孔高 30–50%，DMSO 与小分子浓度会因此被动升高。最外圈只放 PBS 作"湿化孔"，不放实验样本。同理，96 孔板最外两圈不放样本。这是很多"同一个实验条件却出现两极结果"的真实原因。 3.4　Stage 1｜D0–D3 定形内胚层 D0（接种当日）｜铺板后直接加 D0 培养基（含 CHIR 3 µM + Activin A 100 ng/mL + Y-27632 10 µM），500 µL/孔。CHIR 与 ROCKi 同时存在时 DMSO 约 0.1%，可接受。 D1｜镜下先拍照记录。吸弃培养基（动作要轻，此时贴壁尚不牢固），沿孔壁加 DE 培养基（不含 CHIR，不含 ROCKi） 500 µL。预期：可见大量漂浮死细胞与碎片，贴壁层完整，细胞变为紧密多角形。 D2｜换液一次，同 D1。重点观察是否出现旋涡状、长梭形细胞灶——这是中胚层旁路的形态学信号。若仅在边缘零星出现，可继续；若成片出现（＞ 20% 面积），本批作废。 D3（判定日）｜先取样再换液。取样方案： 流式（首选） 消化 1 孔，取 2×10⁵ 细胞，染 SOX17-PE / FOXA2-AF647 / CXCR4-APC；同管加 OCT4 与 BRACHYURY 作阴性门 qPCR（备选） 1 孔提 RNA，检测 SOX17、FOXA2、GATA4（阳）与 OCT4、NANOG、BRACHYURY、MESP1（阴） 免疫荧光（形态） 96 孔或盖玻片，4% PFA 固定 15 min，染色后估算阳性率 放行阈值：SOX17⁺FOXA2⁺ 双阳 ≥ 80%；OCT4⁺ ＜ 5%；BRACHYURY⁺ ＜ 10%。三条同时满足才进入 Stage 2。判读完成后立即换前肠/后肠培养基（按预先分好的孔）。 3.5　Stage 2｜D3–D7 前后肠分流 D3 换液时按孔分派：一半孔换前肠培养基，一半换后肠培养基。从此刻起，两套培养基的枪头、吸管、废液缸全部分开——交叉污染是身份混乱的隐形来源。 D4、D5｜每日换液，500 µL/孔。不要吹打，此时细胞已开始形成多层结构，机械扰动会造成局部脱落。 D6｜换液并观察。判定要点见下表： 观察项 理想状态 异常与处置 前肠孔 致密多层上皮，边界整齐，无大囊泡 出现 ＞ 300 µm 囊泡 → 身份后移，提高 Noggin 至 200 ng/mL 或降 FGF4 后肠孔 D5 起出现 100–400 µm 透明囊泡，数量渐增 囊泡 ＞ 500 µm → 提前 24 h 进入 D7 流程，否则解离后活率 ＜ 70% 两类共有 EpCAM⁺ 上皮比例 70–90% ＜ 60% → 间质化，检查 FBS/B27 批次与密度 3.6　Stage 3｜D7–D8 单细胞重聚 D7 上午｜吸弃培养基，PBS 洗 1 次。24 孔板每孔加 Accutase 300 µL，37 ℃ 8–12 min；每 4 min 轻晃一次，不吹打。见片状结构松散、边缘卷起时，加等体积 DMEM/F12 + 10% FBS 终止。 D7 上午｜用 1000 µL 枪头缓慢吹打 5–8 次至单细胞。过 40 µm 滤网。100 g × 3 min 离心，弃上清，重悬于 重聚培养基（DMEM/F12 + 10% KSR + Y-27632 10 µM）。 D7 下午｜计数并按 3000–5000 个细胞 / 100 µL / 孔接种于 96 孔超低吸附圆底板。150–200 g × 3 min 离心使细胞沉底成锥。前 24 h 绝对静置，不观察、不移动、不换液。 为什么 3000–5000｜＜ 2000 个细胞时，球体过小（＜ 100 µm），边界区细胞数不足以形成可检测的 PDX1/PROX1 域；＞ 8000 个细胞时，球体中心缺氧，出现坏死核，融合后边界模糊。这个区间是"能长出结构"的窗口，不是随意取值。 D8 上午｜镜下确认。合格球体：单枚、圆形、边界光滑、直径 150–300 µm、中心透亮无暗核。同时统计成球率（每孔 1 枚的比例）与直径 CV（应 ＜ 25%）。不合格球体直接弃用，不要"凑数"——一枚劣质球会毁掉整个融合体。 3.7　Stage 4｜D8–D9 边界融合 D8 下午｜冰上预冷 Matrigel 与枪头。24 孔板每孔先铺 15 µL Matrigel 打底，37 ℃ 15 min 固化（形成薄底，防止后续凝胶滴摊平）。 D8 下午｜体视镜下用口吸管（拉制口径约 300 µm）或剪宽口的 200 µL 枪头，从 96 孔中吸取一枚前肠球与一枚后肠球，转移至同一滴 Matrigel（总量 30–40 µL）中，用显微镊轻推使两球直接接触。 D8 下午｜37 ℃ 固化 20 min（不可延长，否则凝胶过度交联限制迁移），加 DMEM/F12 + B27 + Y-27632 10 µM，500 µL/孔，过夜。 D9 上午｜镜下确认融合。合格标准：两球间出现连续的细胞桥，接触面变平，整体呈"花生形"。若仍为两个分离球体（间距 ＞ 100 µm），可延长 12 h；若 48 h 仍未融合，弃用该对。 融合当天的三个禁忌｜① 禁忌加因子：加入 BMP/FGF/RA 会强行指定命运，破坏边界自发梯度；② 禁忌吹打：凝胶滴一旦碎裂，两球会分离并各自贴壁；③ 禁忌延迟固化：Matrigel 在室温下会缓慢自交联，操作须在冰上、5 min 内完成。 3.8　Stage 5｜D9–D13 极化与边界验证 D9｜换极化培养基，撤除 Y-27632（关键：ROCK 抑制剂会干扰极性建立）。此后隔日换液，每次 500 µL，沿孔壁缓慢加，不触碰凝胶滴。 D11（边界验证日）｜取 3–5 枚融合体做整装免疫荧光，检测 PDX1、PROX1、ECAD、DAPI。合格：边界两侧分别出现 PDX1⁺ 与 PROX1⁺ 域，且各占融合体体积 15–35%。 整装免疫荧光操作｜4% PFA 室温固定 30 min → PBS 洗 3×5 min → 0.5% Triton X-100/PBS 透化 30 min → 封闭液（5% BSA + 0.3% Triton）1 h → 一抗 4 ℃ 过夜 → PBS 洗 3×20 min → 二抗室温 2 h（避光）→ DAPI 10 min → 透明化（可选，50% 甘油或折射率匹配液）→ 共聚焦成像。 D13 前判断｜若 D11 无边界域，不必等到 D30，直接回溯 Stage 2 的身份标志物。此时止损，成本远低于继续培养 17 天。 3.9　Stage 6｜D13–D30 显微切除与气液界面 D13 准备｜预冷 PBS、预冷手术刀（#11 刀片）或 27G 针头、口吸管、Transwell 12 孔板（0.4 µm）、预热培养基。 D13 切除｜将含融合体的凝胶滴整块挑入预冷 PBS 培养皿中（冰上，全程 ＜ 5 min）。体视镜下定位 PROX1⁺ 域（若用荧光报告系，可直接在荧光体视镜下操作；若无，按形态判断：该域通常位于融合体一侧、较致密、颜色偏深）。用刀片沿域边缘切下约 1/3，保留含边界的最小组织块（约 300–500 µm）。 D13 上样｜将组织块置于 Transwell 上室中央（可先在上室铺 10 µL Matrigel 固定），下室加 1 mL 极化培养基。上室不加液态培养基——仅靠下室经膜孔渗透供液，使上表面暴露于空气。 D16–D30｜每 2–3 天换下室培养基 1 mL。观察：D19 前后出现分支芽（budding），D23 形成明显分支网络。分支数按每视野计数，作为形态学半定量指标。 ALI 的本质｜不是"少加点培养基"，而是建立顶端-基底极性梯度：基底面从下室获取营养，顶端面接触气相。这个梯度驱动上皮向内陷、向外分支。若上室误加液体，组织会"摊平"成二维片层，分支永不发生——这是 ALI 阶段最常见的失败。 D30 终点｜先做活体成像（明场 + 荧光），再固定。取一半做石蜡切片（H&E、免疫组化：ALB、CK19、PDX1、DBA），一半做整装荧光或 RNA 测序。同时收集最后 24 h 上清，用于白蛋白、尿素、淀粉酶检测。 3.10　取样与检测节点表 按此表预留样本，避免"到最后发现没有对照"。以起始 24 孔板 × 8 孔为例（前肠 4 孔、后肠 4 孔）： 节点 取样内容 用途D0 消化前留 1 孔细胞，冻存 RNA 基线转录组（多能性）D3 1 孔流式 + 1 孔 RNA DE 放行判定（必做）D7 消化时各留 2×10⁵ 细胞SOX2 /CDX2 身份确认D8 多余球体冻存（每组 ≥ 10 枚） 备用，避免后期无样本D11 3–5 枚整装 IF；2 枚 RNA 边界域判定（止损点）D19 明场/荧光活体成像 分支起始记录D23 成像 + 1–2 枚固定 分支形态定量D30 全部：切片 + 整装 + 上清 + RNA 终点表型与功能 样本量规划｜按 24 孔起始，D7 重聚后约可得 200–300 枚球体，融合后约 80–120 个融合体。建议分配：30% 用于过程监测，40% 用于终点形态与分子检测，20% 用于功能试验，10% 留作备份。不要把所有融合体都留到 D30——中途无样本可查，等于盲飞。 3.11　批次记录模板（每批一张，缺项即视为无效批次） 这六项元数据几乎可以解释 90% 的批次间差异。把它做成固定表单，比任何"经验"都可靠。 字段 记录内容 为什么重要 细胞系 系名、来源、代数、核型日期 同一"系"不同代数分化效率可差 20% 基质胶 品牌、货号、批号、蛋白浓度 批次差异是"成腔率"波动的首位原因 因子 各因子批号、配制日期、冻融次数 反复冻融 3 次以上活性可降 50% D0 密度 接种数/cm²、D1 实测融合度（%） 唯一可提前干预的变量 D3 DE 效率 SOX17⁺FOXA2⁺ 双阳率、OCT4⁺、BRACHYURY⁺ 后续所有表型的"上游解释变量" D7 / D11 球体直径均值与 CV、边界标志物阳性率 决定"要不要止损"的唯一客观依据 反向用法｜当某批结果异常时，先不要改配方。把这一批的六个字段与"最好的一批"逐项对比，通常能直接定位到唯一变量（多数情况是基质胶批号或 D0 融合度）。没有表单的"优化"，本质是在噪声里找规律。 PART 04 ／ 加强路线 三谱系单独深挖：需要成熟度时怎么办 HBPO 的优势是"连接"，劣势是"每个域都不够成熟"。若课题需要高成熟度的肝细胞或功能性 β 细胞，应走独立分化路线，再组装。 4.1　肝向：BMP4 + FGF2 起手，后期"去 Notch" DE 之后转入肝向：BMP4 20 ng/mL + FGF2 10 ng/mL（或 bFGF），持续 4–5 天，获得肝祖细胞（HNF4A⁺、AFP⁺、PROX1⁺、TBX3⁺）。随后转 3D，用肝类器官培养基长期扩增： 肝类器官基础配方 Advanced DMEM/F12 + HEPES 10 mM + GlutaMAX + B27 + N2 + N-乙酰半胱氨酸 1.25 mM 促增殖 EGF 50 ng/mL、HGF 25 ng/mL、FGF10 100 ng/mL、Rspo1 500 ng/mL、Noggin 100 ng/mL 维持与成熟 A83-01 5 µM、Forskolin 10 µM、烟酰胺 10 mM、胃泌素 10 nM；成熟期加地塞米松 1 µM、Oncostatin M 10 ng/mL 传代 每 7–10 天，胶原酶 II 2 mg/mL 消化 10–15 min，1:3–1:4 传代；首 48 h 加 Y-27632 10 µM 成熟化的关键一步｜加 DAPT（γ-分泌酶抑制剂，10 µM）处理 3–5 天可显著提升白蛋白分泌与 CYP3A4 活性，机制是解除 Notch 对肝细胞成熟的抑制。但 DAPT 会摧毁胆管分化——所以这一步必须在"胆管已经定型之后"再做，或干脆在独立孔中进行。 4.2　胆向：Notch 是主轴，JAG1 不可省 胆管细胞的分化核心是 JAG1–NOTCH2 轴。从肝祖细胞出发，激活 Notch 并配合 TGFβ，可获得 SOX9⁺、CK19⁺、HNF1B⁺ 的胆管细胞。 要点 1｜JAG1 需固相化（包被于板底或微珠）才能有效激活 Notch，可溶性 JAG1 效果差，这是极常见的操作失误。 要点 2｜胆管类器官培养基：EGF 10–50 ng/mL、HGF 50 ng/mL、FGF10 100 ng/mL、Rspo1 250 ng/mL、Noggin 100 ng/mL、Wnt3a 50 ng/mL、烟酰胺 10 mM、A83-01 5 µM、Forskolin 10 µM、胃泌素 10 nM。 要点 3｜功能验证不能只看标志物，必须做 Forskolin 诱导肿胀试验（FIS）——CFTR 依赖的液体分泌会使类器官在 30–60 min 内明显膨胀，这是胆管上皮极性与转运功能的金标准。 4.3　胰向：六步法，RA 与 SHH 抑制缺一不可 胰腺分化步骤更多、更依赖精确时序。以下为通用六阶段框架（浓度需按系滴定）： 阶段 关键因子 目标 S1 内胚层 Activin A 100 ng/mL、CHIR 3 µMSOX17 ⁺ S2 原肠管 KGF（FGF7）50 ng/mLHNF1B ⁺、PDX1 起始 S3 后前肠 KGF + RA 0.2–2 µM + SANT-1 0.25 µM + LDN193189 200 nMPDX1 ⁺ ＞ 80% S4 胰祖细胞 KGF + RA + SANT-1 + LDN + PdBU 500 nMPDX1 ⁺NKX6.1⁺ ＞ 50% S5 内分泌前体 RA + SANT-1 + LDN + XXI 1 µM + Alk5i 10 µM + T3 1 µM + Betacellulin 20 ng/mLNGN3 ⁺、NEUROD1⁺ S6 成熟 XXI + Alk5i + T3 + Heparin + IGF-1 50 ng/mLC-PEPTIDE ⁺、NKX6.1⁺INS⁺ 最难懂的一点｜为什么必须同时抑制 SHH 又抑制 BMP？因为内胚层默认程序是"变成肠管"。SHH 信号维持肠管身份，BMP 信号推向肝/肠命运。只有同时关掉这两条"默认路径"，细胞才会落入胰腺程序。很多方案只加 RA 不加 SANT-1，结果是 PDX1 一过性升高后迅速回落——不是没诱导，而是被默认程序"拉回去了"。 PART 05 ／ 鉴定与分析 怎么证明它真是肝、胆、胰，并且把它测准 鉴定不是"找阳性"，而是做排除。一个标志物亮起来，只能说明"可能有这类细胞"；只有把"不是这类细胞"的可能性逐条排除，结论才成立。本章按这个逻辑组织：先给判断框架，再给每个节点的预期结果，然后逐项讲怎么测、怎么定量、以及最容易被误读的地方。 本章的读法｜若你只有 10 分钟，读 5.0（四问框架）与 5.1（阶段预期表）——这两节能立刻判断"当前这批到底成不成"。若要做完整表征，再依次读 5.3–5.7 的方法细节与 5.10 的判读陷阱。 5.0　鉴定的四问框架 整套表征可以压缩成四个递进的问题。每一问都有明确的判据、方法、不通过时的处置；前一问不通过，后一问的结论一律无效。 序 问题 判据 方法 不通过时Q1 是不是内胚层？纯不纯？ SOX17⁺FOXA2⁺ ≥ 80%；OCT4⁺ ＜ 5%；T⁺ ＜ 10% 流式（首选）、qPCR当批作废 ，重开一批；不进入 Q2Q2 前肠还是后肠？身份是否单一？ SOX2⁺ 或 CDX2⁺ 各 ≥ 80%，互斥 qPCR（主）、整体 IF 回溯 Stage 2 因子；身份混杂则重做 D3–D7Q3 三个域是否真的分开出现？ 边界两侧 PDX1⁺ 与 PROX1⁺ 相邻，各占 15–35% 整装 IF + 共聚焦（D11）D11 止损点 ；调两球比例或回退 Q2Q4 是否连通？是否有功能？ 示踪可跨域 + 至少两项功能试验达标 示踪、切片重建、ELISA/FIS/GSIS 只能称"结构相邻"，不得称"联合器官" 为什么强调递进｜本领域大量"成功构建"的报道，实际只完成了 Q1 与 Q3，就宣称得到了"肝胆胰类器官"。若 Q2 的身份是混杂的，Q3 出现的"边界"很可能只是两个随机细胞团贴合，而非发育学意义上的边界。审稿人常问的第一个问题就是："你怎么排除这是两个独立类器官的机械接触？" 5.1　阶段预期结果表：每个节点应该看到什么 这是最实用的一张表。它把"鉴定"从终点回溯到过程——每个节点都有预期，偏离即可早期止损，不必等到 D30 才发现方向错了。 节点 应观察到 未观察到意味着 处置D0 均匀单细胞贴壁，分布均一 消化不足（团块多）或过度（碎片多） 调整 Accutase 时长 ±2 minD1 大量漂浮死细胞（20–40%），贴壁层完整、细胞变紧密多角形 死亡 ＜ 10%：诱导不足；死亡 ＞ 80%：密度过低 核对 D0 融合度与 Activin A 批号D2 致密多角形单层，无梭形灶 出现旋涡状梭形灶 → 中胚层旁路 成片（＞ 20% 面积）则当批作废D3 SOX17⁺FOXA2⁺ ≥ 80%；OCT4⁺ ＜ 5% 效率 70–80% 可勉强推进但风险高；＜ 70% 不可用硬判据 ，不达标重开D4–D6 前肠：致密多层、无大囊泡；后肠：出现 100–400 µm 透明囊泡 前肠出现大囊泡 → 身份后移；后肠无囊泡 → 身份前移 调 Noggin 与 FGF4 的平衡D7 SOX2 或 CDX2 单阳性 ≥ 80%，互斥；EpCAM⁺ 70–90% 双阳性 → 身份未定型；均阴性 → 非上皮 补做 qPCR 确认后再决定D8 单枚圆球，直径 150–300 µm，CV ＜ 25%，中心透亮 多枚小球 → 接种过少；暗核 → 接种过多 按 3000–5000/孔重新滴定D9 两球间出现连续细胞桥，整体"花生形" 仍分离 → 未接触或凝胶过浓 延长 12 h；48 h 仍不融合则弃用D11 边界两侧 PDX1⁺ 与 PROX1⁺ 相邻出现 只有一侧 → 对应球体身份不足止损点 ，回退 Q2D13 切除后组织块边缘整齐、上皮面向外 切除过多 → 失去边界；过少 → 无法分支 按体积 1/3 为基准微调D16 贴附稳固、无漂浮；上皮开始增厚 漂浮 → 上室误加液体或未固定 重新贴附，检查 ALI 设置D19 出现分支芽（每枚 1–2 个） 无芽 → 机械约束未解除或缺少 HGF/FGF10 扩大切除；补足因子D23 分支网络成形，≥ 3 支/枚；腔道可见 分支 ＜ 2 → 成熟不足 延长至 D30 观察，或优化 ALID30 三域分离且连续；功能试验至少两项达标 有结构无功能 → 成熟度不足，非构建失败 延长成熟期或加成熟因子 5.2　形态学：把"看起来不错"变成分数 形态评价最大的问题是主观。解决办法是固定维度、固定分级、双人盲评。以下评分量表共 5 项、每项 0–3 分，总分 15 分。 维度 0 分 1 分 2 分 3 分 整体形状 不规则、摊平 圆形度 ＜ 0.6 0.6–0.85 ＞ 0.85 且边界光滑 腔道占比 无可见腔 ＜ 5% 或 ＞ 50% 5–10% 或 30–50% 10–30%，且腔道连续 边界清晰度 不可辨 模糊、需推测 可辨但不锐利 锐利、两侧形态明显不同 分支复杂度 无分支 1–2 支 3–4 支 ≥ 5 支或二级分支 坏死面积 ＞ 30% 暗核 10–30% ＜ 10% 无可见坏死 判定规则：总分 ≥ 11 且"腔道占比"与"边界清晰度"均 ≥ 2 分，方可进入功能验证；总分 8–10 视为"结构不完整"，可用于机制探索但不建议用于药物筛选；≤ 7 分弃用。两位评分者的加权 Kappa 应 ≥ 0.6，否则说明标准不够明确，需重新定义分级。 成像参数必须锁定｜4× 看整体、10× 看边界、20× 看腔道；同批实验固定曝光、白平衡、光强与 Z 步进（5 µm）。形态评分若用不同曝光拍摄，亮度差异会被误读为"坏死面积"差异。建议每次开机先用标准灰度片校准。 5.3　免疫荧光：定位比"阳性"更重要 这是本章最关键的一节。在极性上皮体系中，同一个蛋白出现在错误的亚细胞位置，等于功能缺失，但常规"阳性/阴性"判读会把它算作阳性。下表给出每个标志物的正确位置，以及"位置错了"意味着什么。 标志物 正确定位 位置异常的含义 PDX1 / NKX6-1 / PROX1 / HNF4A / SOX9 / CDX2 / SOX2细胞核 ，边界清晰、与 DAPI 共定位 胞质弥散着色多为抗体浓度过高或非特异吸附，不能计为阳性 ALB / AFP / A1AT 胞质，呈颗粒状/网状（粗面内质网与分泌泡） 均匀弱胞质着色需与未染色对照比较，排除自发荧光 CK19 / KRT7 胞质丝状网络，环绕核周 核内着色 = 假阳性；肝祖细胞亦表达 CK19，单凭它不能定胆管 ECAD（E-钙黏蛋白） 细胞侧膜/基底膜，连续线状 胞质弥散 = 上皮极性丧失或切片伪影CFTR / MRP2 / BSEP顶端膜 （面向管腔一侧）若位于基底面 = 极性反转 ，FIS 与胆汁分泌试验必然假阴性 ZO-1 顶端紧密连接，呈点状/环状位于腔面边缘 缺失 = 屏障功能不成立，通透性试验结果不可信 极性反转是"隐性失败"｜当上皮的顶端面朝向间质而非管腔时，所有转运体（CFTR、MRP2、BSEP）都装在了错误的一侧。此时：形态学评分可能很高、标志物全部阳性、但胆汁无法排出、FIS 完全无反应。 判据：在同一 Z 平面上，CFTR 与 ZO-1 应共定位于腔面；若 CFTR 与基底标志物（如 laminin、integrin β1）同侧，即为反转。这是"有结构无功能"最常见的真实原因，比"成熟度不足"更常见。 抗体对照三件套（缺一不可）｜ 同型对照 用同种属、同亚型、同浓度的非免疫 Ig，排除 Fc 受体结合与非特异吸附 二级对照 只加二抗不加一抗，排除二抗与组织的非特异结合（Matrigel 常吸附二抗） 未染色对照 用于评估自发荧光：Matrigel、坏死核心、红细胞在 488/561 通道均有明显自发荧光 切片方式的选择｜冰冻切片（5–8 µm）适合多重荧光，抗原保存好，但形态略差；石蜡切片（4 µm）形态优、可长期保存，但需抗原修复，PDX1、NKX6-1 等核转录因子对修复条件敏感，修复不足则假阴性。建议：荧光共定位用冰冻，H&E 与免疫组化用石蜡，同一结论用两种切片互证。 5.4　流式：门控顺序决定结论对错 流式的可靠性取决于门控是否规范。推荐固定顺序： 门 设门依据 目的G1 FSC-A vs SSC-A 排除碎片与凝胶颗粒G2 FSC-H vs FSC-A 去除粘连细胞（联合体消化后必做，否则双细胞被误判为双阳性）G3 7-AAD 或 DAPI 阴性 活细胞门（死细胞非特异吸附强，会抬高假阳性）G4 EpCAM⁺ 上皮门，排除间质与内皮G5 ALB / CK19 / PDX1 等 亚群比例（注意：胞内染色需固定透化） "平均陷阱"｜把整个融合体消化后做流式，会得到"三群都有、每群都不纯"的结果（如 ALB⁺ 40%、CK19⁺ 35%、PDX1⁺ 20%）。这不是失败，而是联合体系的正常特征——它本来就含三个域。 正确做法：先按空间分区（激光显微切割，或镜下用针尖手工分割）再分区检测。直接对整体求平均，会同时掩盖"分区是否正确"与"某一域是否缺失"两个关键信息。 补偿与对照｜补偿必须用单染 + 全阴，不可沿用"经验矩阵"（不同批次的激光功率与 PMT 电压会变）。多色 panel 建议加 FMO 对照（荧光减一）确定阳性边界，尤其是胞内转录因子这类弱信号。报告时须写明"阳性率的分母"——是全部活细胞、还是 EpCAM⁺ 门内细胞。 5.5　qPCR：panel、内参与解释陷阱 qPCR 是最经济、最容易做错的鉴定手段。三个技术要点先立规矩： ① 内参｜GAPDH、ACTB、B2M 三者取几何平均。分化过程中细胞代谢状态剧变，单内参可能波动 2–3 个 Ct。 ② 引物｜扩增效率 90–110%（标准曲线斜率 −3.1 至 −3.6）；熔解曲线单峰；每板必设无模板对照（NTC）与无逆转录对照（−RT）。 ③ 计算｜用 ΔΔCt，报告倍数变化而非 ΔCt；Ct ＞ 35 视为未检出，不要用"很高的倍数"包装一个接近噪声的值。 类别 基因 期望 多能性（阴性门）POU5F1 (OCT4)、NANOG、LIN28A D3 后 ＜ 基线 5% 中胚层（阴性门）T (BRACHYURY)、MESP1、HAND1 D3 ＜ 10% 定形内胚层SOX17 、FOXA2、GATA4、CXCR4 D3 显著升高 前后轴身份SOX2 （前）／CDX2、HOXA13（后） D7 各自 ≥ 10 倍上调 肝HNF4A 、ALB、AFP、TTR、APOA1、CYP3A4 D30 肝域阳性 胆SOX9 、KRT19、KRT7、HNF1B、CFTR、JAG1 D30 胆管域阳性 胰PDX1 、NKX6-1、PTF1A、CPA1、INS、GCG D30 胰域阳性 解释陷阱｜整体组织提 RNA 做 qPCR 时，表达量 ≠ 细胞比例。肝细胞的 ALB 表达量比胆管细胞的 KRT19 高出 1–2 个数量级，因此"ALB 很高"完全可能只对应 20% 的肝域，而"KRT19 中等"可能对应 40% 的胆管域。 结论：qPCR 只能回答"有没有"，不能回答"占多少"。要定量域比例，必须用形态学（面积比）或分区取材，不能靠整体 qPCR 的相对表达量。 5.6　单细胞与空间组学：能回答什么、不能回答什么 当需要证明"边界区存在过渡态细胞"或"三域转录组确实不同"时，单细胞测序是最有力的证据。但它有两个前提：解离质量与污染控制。 分析环节 必做检查 不合格的表现 解离质量 活率 ≥ 85%；解离偏好评估（肝细胞体积大、易碎，可能系统性丢失） 肝域比例显著低于形态学估计 环境 RNA 去除 Matrigel 与培养基来源转录本（Col4a1、Lama1、胎牛血清基因） 出现"基质细胞"聚类，实为凝胶污染 双细胞 DoubletFinder / scDblFinder；双细胞率通常 5–10% 出现"同时高表达 ALB 与 INS"的假过渡细胞 基因组稳定性 inferCNV 或 CopyKAT，与未分化 iPSC 对比 出现克隆性大片段获得/缺失 → 需核型复核 聚类注释 用 3–5 个 canonical marker 交叉确认，而非单一 marker 同一簇同时表达两个谱系 → 注释可疑 域比例 与形态学面积比对照，偏差应 ＜ 15% 偏差 ＞ 30% → 解离偏好严重 空间转录组是更契合本体系的工具——它不需要解离，能直接在切片上定位边界区。取样建议：选取含完整边界的切片，重点关注边界前后各 100 µm 的条带，比较两侧与过渡区的差异基因。局限：分辨率通常 10–55 µm（低于单细胞），低丰度转录本（如 INS）检出率低，需与免疫荧光互补。 5.7　图像定量：ImageJ 五步法 "肉眼看起来差不多"无法写进论文。以下五个测量流程覆盖了本体系 90% 的定量需求。 测量项 操作 输出指标 面积与直径 转 8-bit → 阈值 Otsu → Analyze Particles（size ≥ 500 px²） 面积、等效直径、圆形度（4πA/P²） 腔道占比 对腔道区域单独阈值化，除以组织总面积 管腔面积比（%） 分支复杂度 骨架化（Skeletonize）→ Analyze Skeleton 分支数、分支长度、端点、分支密度 共定位 JACoP 插件，阈值化后计算 Pearson 系数、Manders M1/M2 域体积比 Z-stack 逐层分割 → 3D 重建（3D Viewer / Imaris） 各域体积占比（应 15–35%） 盲法与一致性：图像随机编号后交第三方测量；两名评分者独立评分并计算加权 Kappa（≥ 0.6）；对阈值敏感的参数（如腔道占比）固定同一阈值规则并写入方法学。不要只展示"最好看的那一枚"——应报告所测样本的分布（散点图或箱线图），并注明 n。 5.8　功能鉴定：六个必做试验的完整操作 以下每项均给出样本准备、试剂浓度、孵育条件、计算方式、判读阈值、常见陷阱。建议至少完成前三项（肝）与 FIS（胆）或 GSIS（胰）之一。 ① 白蛋白分泌（ELISA） 样本：D28 换无血清培养基，孵育 24 h，收集上清，1000 g × 5 min 去碎片，−80 ℃ 保存。检测前 1:50–1:200 梯度稀释（首次务必做梯度，否则极易超出标准曲线）。 计算：标准曲线四参数拟合；按 DNA 含量（PicoGreen）或细胞数归一化，报告 µg/24 h/10⁶ 细胞。阈值 ＞ 1 µg/24 h/10⁶（原代肝细胞通常 5–15）。 陷阱：含 FBS 的培养基会因牛白蛋白交叉反应导致假性偏高；抗人 ALB 抗体与牛 ALB 的交叉反应率需先验证。 ② 尿素合成 方法：脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联比色法（或二乙酰一肟法）。上清稀释 1:10，37 ℃ 反应 15–30 min，340 nm 读数。刺激：换液时加 NH₄Cl 5 mM，可提高产量 2–3 倍。阈值 ＞ 100 µg/24 h/10⁶。 陷阱：培养基中的酚红与高浓度谷氨酰胺干扰比色；该实验建议用无酚红 DMEM/F12。 ③ CYP3A4 活性（荧光素-PFBE 法） 诱导：利福平 10 µM 或地塞米松 10 µM 处理 72 h，每 24 h 换含药培养基；溶剂对照加等量 DMSO（≤ 0.1%）。检测：换无酚红培养基，加荧光素-PFBE 50 µM，37 ℃ 30 min，读化学发光。计算：诱导倍数 = 诱导组 / 溶剂对照组，阈值 ＞ 3。 陷阱：底物需现配避光；培养基本底荧光须设空白孔扣除；诱导不足常见于类器官未充分成熟（可延长至 D35）。 ④ ICG 摄取与外排 摄取：ICG 储液 1 mg/mL（水，避光），工作浓度 1 µg/mL–0.1 mg/mL（需滴定），37 ℃ 15–30 min，PBS 洗 3 次，荧光成像（Ex 780 / Em 810–830 nm）。外排：换新鲜培养基再培养 30–60 min 复成像。 阈值：摄取后强度 ＞ 对照 3 倍；60 min 内下降 ＞ 50%。陷阱：ICG 非特异吸附于 Matrigel 与塑料，必须设无细胞凝胶对照。 ⑤ Forskolin 诱导肿胀（FIS，胆管功能金标准） 操作：类器官置于 8 孔腔室载玻片或 96 孔板，加含 Forskolin 10 µM 的培养基；在 0、15、30、60 min 定点明场拍照（同焦平面、同曝光）。对照：预孵 CFTRinh-172 10 µM 30 min。计算：肿胀率 = A(t)/A(0)。 阈值：60 min 肿胀率 ＞ 1.5，抑制剂逆转 ＞ 70%。陷阱：已形成大囊腔（＞ 500 µm）者基线接近最大体积，肿胀率假性偏低，应选 100–300 µm 样本。 ⑥ 葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS） 缓冲液（KRBB）：NaCl 129 mM、KCl 4.7 mM、CaCl₂ 2.5 mM、KH₂PO₄ 1.2 mM、MgSO₄ 1.2 mM、NaHCO₃ 5 mM、HEPES 10 mM、BSA 0.1%，pH 7.4。 流程：低糖（2.8 mM）预孵 60 min → 2.8 mM 孵育 60 min 收上清 → 16.8 mM 孵育 60 min 收上清 → ELISA 测胰岛素与 C 肽。 阈值：刺激指数 ＞ 2；PDX1⁺NKX6-1⁺ 双阳 ＞ 30%。陷阱：预孵不充分会因残余高糖压低刺激指数；BSA 批次影响胰岛素吸附，须固定批号。 5.9　联合体系特有：证明"真的连上了" 这是 HBPO 区别于"三个类器官放一起"的唯一硬证据，也是最容易被审稿人追问的部分。三条独立证据链： 证据 1｜腔道示踪（必要条件）｜显微注射将 dextran-FITC（40 kDa）或荧光微球注入肝域腔道，30–60 min 后成像，观察是否出现在胆管域与胰管域。40 kDa 可排除简单扩散，只有真正连通才可通行。 证据 2｜连续切片重建｜连续切片（4 µm，间隔 40 µm 取片）做 ECAD 染色，三维重建确认上皮层无断裂。若两域被间质完全隔开，则只是"贴合"。 证据 3｜过渡型上皮｜边界区应存在同时表达 SOX9 与 PDX1、或 CK19 与 HNF4A 的过渡细胞群（占比 1–5%）。用共聚焦 Z-stack 做单细胞水平共定位，并排除双细胞假象。 用词要严格｜仅有"相邻 + 连续上皮"而无示踪，只能称 structural continuity（结构连续），不能称 luminal connectivity（腔道连通）。这两个词在审稿中的分量完全不同，混用会被直接质疑。 5.10　判读陷阱：六种"看起来阳性，其实不成立" 现象 真实原因 如何排除 CK19 全胞质强阳性，判为"胆管分化好"肝祖细胞亦表达 CK19 ；且 CK19 与 CK8/18 存在抗体交叉反应 加 HNF1B、SOX9、CFTR 与 DBA 联合判定；查抗体交叉反应表 核标志物"阳性"但胞质也亮 一抗浓度过高导致非特异吸附 稀释梯度滴定；只计核信号 ＞ 背景 2 倍的细胞 坏死区呈绿色"阳性" 坏死核心与 Matrigel 的自发荧光 必设未染色对照；坏死区排除在计数之外 切片边缘一圈亮信号 刀痕、组织折叠、封片剂气泡 换焦平面；边缘 20 µm 不计入统计 流式"双阳性"过渡细胞很多 细胞粘连（未做 FSC-H/FSC-A 单细胞门） 补单细胞门；用成像流式验证 整体 qPCR 显示三谱系均高 混合样本的平均效应，掩盖了分区是否正确 分区取材或形态学面积比对照 5.11　统计与报告规范 n 的定义｜本领域最常见的统计错误，是把"同一批次的 20 枚类器官"当作 n=20，而实际独立重复只有 1。正确做法：以独立分化批次为统计单位（n ≥ 3），枚数作为批内重复；或使用混合效应模型把"批次"设为随机效应。 最低证据强度｜≥ 3 个独立分化批次 × 2 个 iPSC 系；关键指标批间 CV ＜ 30%；图像定量盲法；随机化分组（处理与对照来自同一批融合体）。 报告清单｜细胞系与代数、Matrigel 货号与批号、各因子货号与终浓度、换液频率、抗体货号与稀释比、切片方式与抗原修复条件、阳性判定阈值、n 的定义、统计方法与效应量。缺项越多，可重复性越差——这也是本领域论文难以复现的首要原因。 图形呈现｜必须给分布而非仅给均值：散点图叠加均值线，或箱线图；每组标注 n；代表性图像须说明"来自 n 个批次中的第几批"，避免"只挑最好看的一张"。 5.12　放行清单（可直接打印勾选） ☐ 项目 方法 阈值 ☐ DE 纯度 流式 SOX17/FOXA2 双阳 ≥ 80% ☐ 多能性残留 流式 OCT4 ＜ 5% ☐ 中胚层旁路 qPCR BRACHYURY ＜ 10% ☐ 前后轴身份 qPCR SOX2 / CDX2 各自 ≥ 10 倍，互斥 ☐ 球体均一性 明场测径 直径 CV ＜ 25% ☐ 边界域形成 整装 IF PDX1 / PROX1 双域各占 15–35% ☐ 极性正确 CFTR/ZO-1 共定位 顶端膜，非基底面 ☐ 形态评分 5 维量表双人盲评 ≥ 11/15，Kappa ≥ 0.6 ☐ 分支形态 骨架化定量 D23 ≥ 3 支/枚 ☐ 腔道连通 dextran-FITC 示踪 可跨域通行 ☐ 肝功能 ALB / 尿素 / CYP3A4 见 5.8 阈值 ☐ 胆管功能 FIS 肿胀率 ＞ 1.5 ☐ 胰腺功能 GSIS 刺激指数 ＞ 2 ☐ 批次重现性 ≥ 3 批 × 2 系 关键指标批间 CV ＜ 30% PART 06 ／ 故障排查 出问题时，先查这张表 现象 最可能原因 处置 D3 DE 效率 ＜ 70% 铺板密度不均；Activin A 反复冻融失活；血清批次差异 按细胞系滴定接种量；分装单次使用；换批次做预实验 D2–D3 出现旋涡状梭形细胞 中胚层旁路（BRACHYURY⁺），多为起始过融合 无法挽救；下次降至 80% 融合，D0 后不再加 CHIR D1 细胞几乎全部脱落 起始密度过低（＜ 70%）；Matrigel 包被不均 提高接种密度；检查包被液是否完全覆盖孔底 D7 球体大小悬殊（CV ＞ 40%） 计数不准；未离心；孔板非超低吸附 二次计数；固定 150 g × 3 min；确认板型 D9 两球不融合 未物理接触；Matrigel 过浓；球体表面有细胞碎片层 镜下确认贴合；稀释 Matrigel 至 8 mg/mL；融合前用培养基轻洗球体 D11 边界无 PDX1⁺ 后肠球 CDX2 不足（后肠身份未建立） 回溯 D3–D7：提高 FGF4 / CHIR，延长 1 天 D11 边界无 PROX1⁺ 前肠球 SOX2 不足；BMP 抑制过度 降低 Noggin 至 50 ng/mL，或在前肠阶段短时加入低剂量 BMP4 类器官中心发黑坏死 凝胶滴过大（＞ 50 µL）；换液间隔过长；接种密度过高 控制滴体积 30–40 µL；隔日换液；降低接种量 D23 无分支 未做 ALI；切除不彻底；缺少 HGF/FGF10 确认上表面接触空气；扩大切除范围；补足 HGF 20 / FGF10 50 ng/mL 传代后逐渐失去标志物 传代过频；长期使用 Y-27632；Wnt 过度激活导致去分化 延长至 10–14 天传代；Y-27632 仅用 48 h；滴定 CHIR/Rspo1 PART 07 ／ 深度解析 十个反复踩坑的地方 7.1　Matrigel 的批次差异，比你想象的大 同一品牌不同批次的 Matrigel，蛋白浓度、生长因子残留、聚合动力学都不同，直接导致球体成腔率相差数倍。正确做法：一次购入同批次大包装，分装后做"批次准入测试"——用标准细胞系跑一次 D0–D8，比较球体直径 CV 与成腔率，达标批次才进入正式实验。不要在不同批次之间比较实验结果。 7.2　Y-27632 不是"万能保命剂" ROCK 抑制剂只在单细胞解离后的 24–48 h 有意义，作用是抑制失巢凋亡。持续添加会改变细胞骨架张力、干扰极性建立，进而破坏管腔形成。判断标准：球体成型后（D8）必须撤除。 7.3　换液手法：不要吹散凝胶滴 3D 培养最常见的隐性损伤来自换液。正确顺序：枪头贴孔壁、缓慢吸弃旧液（保留 10 µL 防干）→ 沿壁缓慢加入新液 → 不做任何吹打。凝胶滴一旦碎裂，类器官失去三维约束，会贴壁铺展并迅速去分化。 7.4　"球体越大越好"是错觉 直径 ＞ 600 µm 后，中心区氧分压降至 ＜ 2%，出现坏死核心与自发分化（常见为软骨样或纤维化样改变）。理想直径 150–400 µm。若生长过快，应缩短传代周期或降低生长因子，而不是"等它再长大一点"。 7.5　血清是"必要的恶" DE 阶段微量血清可显著提高存活率，但血清批次差异是重现性差的主要来源之一。折中方案：用 B27（无胰岛素）替代，或在关键验证实验中改用化学成分明确的基础培养基 + 白蛋白。若必须用血清，务必固定单一批次并留样。 7.6　生长因子的"半衰期陷阱" FGF2、FGF10、Activin A 在 37 ℃ 下半衰期通常只有数小时到十几小时。每日换液不是"勤快"，而是维持有效浓度的必需操作。若做 3 天不换液的"懒人法"，实际有效浓度可能已降至初始的 10% 以下。可考虑加肝素稳定 FGF，或使用缓释微球。 7.7　解离过度与"隐性核型漂移" 每次单细胞化都是一次选择压力。长期反复"单细胞 → 重聚"会富集耐受失巢凋亡的克隆，常伴随 17q、20q 获得或 1p 缺失。建议：每 5 次单细胞化做一次核型；尽量用"团块传代"替代单细胞传代。 7.8　把"没有表型"当成"实验失败" 联合体系里，某个域发育不良常常不是"没诱导出来"，而是被邻近域的信号压制。例如肝域过强时分泌的 BMP 会抑制胰腺域。此时正确的调整是改变两球的比例（如 1 前肠球 : 2 后肠球），而不是继续加因子。 7.9　无菌操作之外的生物安全 iPSC 来源类器官按 BSL-2 管理。涉及病毒（HBV、HCV、SARS-CoV-2）感染实验须升级至 BSL-3 并在备案实验室进行。所有含人源细胞的废弃物须经灭活处理，不得直接排入常规垃圾流。 7.10　记录：把"失败"变成资产 建议为每一批实验记录六项元数据：细胞系与代数、Matrigel 批号、因子批号与配制日期、D3 的 DE 效率、D7 球体直径分布、D11 边界标志物阳性率。这六项几乎可以解释 90% 的批次间差异。没有这些记录，任何"优化"都是盲调。 PART 08 ／ 进阶 从"长出来"到"能用起来" 当 D30 的 HBPO 稳定产出后，可沿四个方向升级： 血管化 加入 iPSC 来源内皮细胞（CD31⁺）与间充质祖细胞（PDGFRβ⁺），比例约 1:0.5:0.5，可显著延长存活并提升成熟度。参考肝芽体系（Takebe 等）。 免疫共培养 加入 iPSC 来源巨噬细胞（Kupffer 样）可复现药物性肝损伤中的炎症放大效应，这是单纯肝类器官无法模拟的关键环节。 器官芯片 双腔/三腔微流控芯片，分别灌注肝域与胰域培养基，实现"空间分隔供液"，从工程上解决 1.3 节所述的 Notch 信号冲突。 疾病建模 胆道闭锁（JAG1/NOTCH2 突变）、Alagille 综合征、囊性纤维化（CFTR）、胰胆管合流异常、1 型糖尿病合并肝病。基因编辑（CRISPR）与患者 iPSC 双路径均可。 最有价值的应用方向｜不是"再造一个器官"，而是研究器官之间的病理耦联：胆汁反流如何损伤胰腺导管、胰岛素抵抗如何改变肝的胆汁酸合成、胆道梗阻如何反向影响 β 细胞功能。这些问题在动物模型中种属差异极大，在单器官类器官中又无法提出——正是 HBPO 的独特生态位。 PART 09 ／ 合规 伦理、法规与可重复性 伦理审查｜使用人源 iPSC 须经机构伦理委员会（IRB）与干细胞研究监督委员会批准；供者须签署知情同意，明确涵盖"衍生类器官与基因编辑"用途。 国际规范｜遵循 ISSCR《干细胞研究与临床应用指南》（2021 版）关于类器官与胚胎模型的规定，特别是"类器官不得培养至可感知痛觉或具备生殖潜能"的边界条款。 国内法规｜涉及人遗传资源采集、保藏与对外提供，须遵守《人类遗传资源管理条例》；涉及临床转化研究，须符合《干细胞临床研究管理办法（试行）》并完成机构与省级备案。类器官本身不属于药品，但若用于细胞治疗产品开发，则纳入 IND 路径管理。 可重复性｜建议在论文方法学中至少报告：iPSC 系来源与代数、Matrigel 货号与批号、所有生长因子货号与浓度、换液频率、判定阳性的阈值与抗体货号。这些细节的缺失，是本领域论文难以复现的首要原因。 PART 10 ／ 参考文献 关键文献与延伸阅读 [1] Koike H, Iwasawa K, Ouchi R, et al. Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary. Nature, 2019, 574: 112–116. [2] Koike H, Iwasawa K, Ouchi R, et al. Engineering human hepato-biliary-pancreatic organoids from pluripotent stem cells. Nature Protocols, 2021, 16: 919–936. [3] Takebe T, Sekine K, Enomura M, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature, 2013, 499: 481–484. [4] Takebe T, Zhang RR, Koike H, et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols, 2014, 9: 396–409. [5] Huch M, Gehart H, van Boxtel R, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell, 2015, 160: 299–312. [6] Sampaziotis F, Cardoso de Brito M, Madrigal P, et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology, 2015, 33: 845–852. [7] Rezania A, Bruin JE, Arora P, et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology, 2014, 32: 1121–1133. [8] Pagliuca FW, Millman JR, Gürtler M, et al. Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell, 2014, 159: 428–439. [9] Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science, 2014, 345: 1247125. [10] Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell, 2016, 165: 1586–1597. [11] Zorn AM, Wells JM. Vertebrate endoderm development and organ formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2009, 25: 221–251. [12] Dong X, Wang F, Liu C, et al. (相关综述) 肝脏类器官构建策略与生物医学应用. 生物工程学报 / 中华肝脏病杂志 系列综述. [13] ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation, 2021. 写在最后 这套体系真正的门槛，不在配方，而在对"时序"和"空间"的耐心。同一个因子，早一天加是肝，晚一天加是胰；同一个球，贴着放是融合，隔着放是共存。把它当成一次为期 30 天的发育学实验来设计，而不是当成一次"加因子"的操作流程，成功率会完全不同。 免责声明：本文为科研技术综述，所载浓度、时长与判据均为文献与常规实践基础上的参考值，不构成任何具体实验方案承诺。实际执行前请依据自有细胞系、试剂批次与机构规范完成验证。本文不涉及临床诊疗建议，类器官不得用于人体回输或生殖相关用途。 类器官培养操作指南系列 SCIENTIFIC ▲ 人类正常类器官 ▲ 癌症类器官 ▲ 疾病类器官 ▲ 小鼠类器官 ▲ 家畜类器官 ▲ 家禽类器官 ▲ IPSC类器官 ▲ 类器官芯片 行业报告  中国类器官培养基与试剂产品市场调研报告   ► 点击阅读 中国类器官仪器设备制造与检测服务市场调研报告  ► 点击阅读  中国类器官近五年市场需求分析报告   ► 点击阅读 中国类器官与器官芯片行业发展报告（2023—2026）   ► 点击阅读  /  科学技术普及新媒体矩阵  肠道类器官（Organoid Bulletin） 本公众号由AI智能体ORGANOID AGENT驱动赋能，您可以直接与公众号对话，获得最专业的类器官知识指导与信息。      我们致力于发布本领域优质资讯与评述，推送国内外类器官及干细胞相关领域最新研究论文、综述与技术进展。发布科普文章、专家观点评论、行业分析、招聘信息和会议通知。您可以在微信、小红书、百家号、企鹅号、今日头条、知乎和Bilibili关注我们。秉承类器官创新计划组织愿景，我们积极传播科学知识，促进同行交流，推动产业发展，服务国家战略，积极为类器官与干细胞技术发展提供助力。欢迎各位关注、分享、转载、投稿！原创内容欢迎转载，直接私信即可，完全免费授权。内容多来自学术论文或网络公开资源，如有侵权还请联系删除。 编辑部联系邮箱：zj@organoid.ac.cn 关注更多微信公众号 2026年度合作品牌       类器官科学与技术创新联盟（Organoid Science and Technology Innovation Alliance，简称 OSTIA），是由中国科学院、北京大学、清华大学、浙江大学、复旦大学等科研院所和高校相关研究团队共同发起的民间公益性学术交流与技术合作平台。  联盟成员主要包括类器官领域的科研人员、企业管理者、技术负责人及高级研究者，致力于推动类器官相关研究、技术开发与产业协同发展。联盟坚持开放、共享、协作、公益的原则，围绕类器官研究与应用中的关键问题，持续促进资源互通、经验交流、方法优化与跨界合作。      加入 OSTIA 后，成员可在较低合作成本下参与类器官资源、研究经验和技术方法的交流共享，并依托肠道类器官及 OSTIA 相关学术传播平台，获得来自行业内不同方向的专业支持与实践参考。联盟鼓励围绕类器官标准化制备、质量评价、检测分析、模型构建及应用转化等关键环节开展协作交流，助力研究工作的规范化、高效化推进。为加强成员之间的互动与协同，联盟已建立“技术研发”“开源公益”“产品服务”等多个专题交流社群，方便成员围绕类器官培养、品系互换、干细胞研究工具、技术优化及实际应用等问题开展及时讨论，促进资源对接与经验共享，并为技术难点提供协同支持。目前，OSTIA 已汇聚来自全国多家科研机构、高校和企业的众多注册成员。联盟持续推动类器官领域的开放合作与生态建设，希望通过跨机构、跨学科、跨产业联动，进一步促进类器官技术创新与行业发展。      此外，OSTIA 还发起了 AI 知识问答、开源类器官分析工具等公益项目，为相关研究提供辅助支持，努力构建开放、共享、包容的类器官创新生态。面向未来，联盟将继续坚持前沿探索与协同创新，积极推动更优技术方案与更高标准体系的形成，为类器官科学研究与产业发展持续贡献力量。 官方网站：www.organoid.ac.cn 联系邮箱：info@isco.ac.cn   组织愿景 1. 共建开放协作的类器官创新生态 搭建面向科研机构、医疗机构与企业的开放共享平台，促进资源互通、技术协作与经验交流，持续降低类器官研究与应用门槛，推动形成开放、包容、共建共享的领域生态。 2. 推动类器官标准与规范建设 推动类器官培养、检测、评价、存储及应用等关键环节的标准化建设，促进相关团体规范、行业共识与技术准则的形成和落地，提升类器官研究与应用的规范性、可重复性和可推广性。 3. 打造具有广泛影响力的学术与资源枢纽 推动建设高质量、可持续连接的类器官资源库、知识库与交流平台，汇聚前沿学术成果、关键技术路线和产业实践经验，提升我国类器官领域的学术影响力与资源整合能力。 4. 驱动多学科融合与关键技术创新 促进类器官与生物材料、智能装备、微流控、人工智能及高端制造等工程技术深度融合，突破规模化制备、功能重建、质量控制与场景适配等关键瓶颈，提升类器官技术创新能力与工程化水平。 5. 强化核心技术自主能力与产业支撑能力 推动国产试剂、仪器设备、分析工具和技术体系的研发与应用，增强类器官研发链条的自主能力，夯实产业基础，提升关键技术领域的支撑能力与发展韧性。 6. 加速类器官技术应用转化与场景落地 面向精准医学、药物研发、毒理评价、再生医学和个体化诊疗等方向，推动类器官技术从实验室研究走向临床前研究与产业应用，促进创新成果转化，提升类器官技术的实际应用价值与社会效益。 加入交流       本联盟面向类器官全领域同行提供交流平台和会员身份认证服务，可以加入“技术研发”、“开源公益”、“产品服务”和“专属领域”等多个类型的交流群，涵盖科学研究技术、开源工具和公益、销售产品与服务、细分领域如类器官芯片、生物材料等专属群等平台，参与讨论。高级研究员或独立PI可以申请成为荣誉发起人，成为类器官创新计划贡献者与受益者。本联盟目前已有10000+会员，期待您加入讨论分享，让我们共同促进类器官产业发展。      现在，您只需添加发起人微信，备注自己的真实姓名与单位和必要信息，例如“张三-中国科学院大学”，说明申请加入类器官创新计划，提供有效身份证件如学生证、身份证、工作证或其他任何可以证明身份的真实性的证件，即可加入对应社群。而这一切都是公益的，免费的，不收取任何费用。 扫描添加微信以进群交流 加入知识星球 面向专业科研需求和企业级资源共享，现在扫描二维码加入“肠道类器官”知识星球，就能获得来自顶级研究机构分享的类器官培养基配方和方案，类器官创新计划组织发布的官方标准指南、AI类器官分析工具等更加专业的资料。与1000+位行业精英共同交换类器官技术资料和资源，向行业专家提问，免费参与国内领先的类器官品牌产品内测试用，获得类器官工程师认证等。全行业最专业的类器官知识社区和公益平台，让您的类器官研究少走弯路！ #为什么要加入知识星球？ 1.最新最专业的培养基配方和技术资料即时获取。 2.标准类器官培养方案和技术标准材料发布唯一渠道。 3.最强AI智能体和类器官分析软件和工具解析和下载。 4.类器官领域TOP专家一对一沟通，权威资料触手可及。 5.类器官企业新产品评测和免费试用特权通道。 6.定期发放免费会议入场券和资料，提供演讲机会。  更多福利，请移步知识星球内部了解。 扫二维码｜获取资源 标准类器官培养基配方 高级类器官AI分析软件 高水平类器官文章资料 ...... 注册正式会员 OSTIA注册会员是面向所有人的公益身份识别项目。如需以会员身份获取各种资源与免费福利。您只需访问www.organoid.ac.cn注册会员，并补充个人真实有效身份信息，经人工审核后，即可获得注册会员认证。通过“类器官科学与技术创新联盟”和“肠道类器官公众号”的“身份认证”菜单就能找到查询入口。也可以下载专属的身份二维码用于各种需要出示本组织身份的场合如学术会议、合作商提供的免费产品申请。加入“注册认证会员群”优先享受本组织提供的学术界与产业界资源。特别的，您所有的信息仅用于身份识别，不会被进行任何形式的商业用途，且对您的信息采用算法加密和安全防护。     欢迎监督举报（邮箱：zj@organoid.ac.cn）。未进行注册的，不被认为是我联盟正式会员，合作方有权拒绝提供任何服务和或产品。 扫码获取您的电子会员证 访问www.organoid.ac.cn注册会员， 填写必要信息，人工审核后获得会员证。 求点赞 求分享 求推荐

Nature Protocols 最新教程精读：从肠道隐窝到人脑皮层，类器官如何改写我们追问生物学的方式 原文：Bugter, J. M., Schafer, S. T. & Rad, R. Tutorial: interrogating biology using organoid technologies. Nature Protocols (2026). DOI: 10.1038/s41596-026-01447-6　｜　慕尼黑工业大学分子肿瘤学与功能基因组学研究所等 2026 年，Nature Protocols 发表了一篇由 Jeroen M. Bugter、Simon T. Schafer 与 Roland Rad 共同撰写的教程综述。它没有停留在"怎么养类器官"，而是系统回答了另一个问题：有了类器官，我们能问哪些以前问不了的生物学问题？本文是该教程的中文科普解读，保留关键机制、浓度与实验数据，供非专业读者建立这一领域的完整认知地图。 一、为什么需要"第三种模型" 生物医学研究长期依靠两类模型，而它们各有硬伤。 二维细胞系便宜、易扩增、好操控，但它丢掉了组织最要紧的东西——三维结构、细胞之间的空间关系，以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的力学对话。一个长在塑料皿底、被摊平成一片的细胞，很难告诉你"隐窝和绒毛有什么区别"。 动物模型保留了完整体内环境，却受物种差异、伦理约束、成本与周期所限。更关键的是，许多人类特有的生物学过程在小鼠体内根本不存在——例如被认为是驱动人类皮层扩张的关键细胞类型"外放射状胶质细胞"。 类器官（organoid）提供了第三条路。它是由干细胞衍生、能够自组织（self-organize）成三维结构、在体外模拟原生组织形态与功能的培养体系。这里需要划清一条界线：类器官不同于简化三维聚集体"球体"（spheroid）——前者具备自组织能力与组织样结构，后者通常只是细胞的简单堆叠。 "在体外重建自组织三维结构"的设想并不新，最早可追溯到 20 世纪初。真正引爆领域的是 2008—2009 年：Eiraku 等报道胚胎干细胞自组织形成极性皮层组织，Sato 等建立了由小鼠成体干细胞衍生、可长期培养的肠道类器官。此后，干细胞生物学、三维基质材料与定义化分化方案的进步，让类器官覆盖了越来越多的组织、物种与疾病状态。 它们能做的事，可以概括为：比细胞系更接近生理，比动物模型更快、更可扩展、伦理约束更少，并且支持那些在体内难以执行的受控扰动实验。 二、六个阶段，一条完整链路 一个类器官实验通常沿着六个阶段推进。理解这条链路，比记住任何单个方案都重要。 图 1　类器官实验的六个阶段（依据原文 Fig. 1 重绘） 贯穿这六个阶段的核心主题，是复杂度与可控性之间的张力。给类器官加进免疫细胞、血管、微生物，它就更接近真实器官；但每加一层复杂度，你就少一分对变量的掌控。原文反复强调的一句话是：最精巧的系统，并不总是最有信息量的系统。 接下来的问题是：面对这么多选择，该从哪两个模型入手？教程的答案是——肠道和脑。 三、两大主角：肠道与脑 教程选择这两个系统，是因为它们恰好代表了组织生物学的两个极端。 图 2　两大原型系统对比：高再生型组织 vs 静止型组织（依据原文 Fig. 2 与正文重绘） 肠道是高度再生的组织。隐窝里的成体干细胞（ASC）持续分裂，沿着"隐窝—绒毛轴"向上迁移、分化、脱落，几天就完成一次更新。它的微架构在稳态中被精密调控，在炎症和癌症中被打乱。因此肠道类器官天然适合研究细胞命运决定：成体组织稳态、再生与肿瘤发生。 脑则几乎不可再生，大多数神经元是有丝分裂后细胞，组织架构在胚胎期就已塑形。它的"微架构"生物学并不清晰，所以脑类器官的应用重心落在宏架构上——也就是皮层、中脑、下丘脑等区域身份是如何被指定的。它由多能干细胞（PSC）衍生，是研究胚胎脑区特化与发育性疾病的理想平台。 一个管"细胞比例"，一个管"空间格局"。理解这个分工，后面所有应用都会顺理成章。 四、用类器官复刻"组织架构" 4.1 微架构：培养基配方就是"指令" 小鼠小肠类器官的原始方案只用四种成分，合称 ENR： ● EGF：激活 MAPK 通路，驱动肠上皮增殖； ● Noggin：BMP 拮抗剂，阻止终末分化、扩大隐窝数量； ● R-spondin1：WNT 通路激动剂，维持干性； ● Matrigel：富含层粘连蛋白，模拟肠道基底膜，支撑三维生长。 这套组合足以维持包含全部主要分化细胞类型的小鼠小肠类器官。再追加 Wnt3a（即 WENR），扩增能力提升、细胞被锁在增殖态，代价是分化能力受限——形态上也会从"芽状"（对应体内的隐窝—绒毛组织）变成"囊状"。 人类肠道类器官的长期培养要求更高，需要额外成分来保住足够的成体干细胞：A-83-01（TGF-β 通路抑制剂）与 SB202190（p38 MAPK 抑制剂）抑制终末分化，加上烟酰胺，以及可选的胃泌素。后续优化进一步用 IGF-1 与 FGF-2 替换 EGF 与 SB202190，以更好地呈现分化细胞类型。 真正有意思的地方在于：一旦理解了信号通路，培养基就变成了"指令系统"。加减几个因子或小分子，就能把同一个类器官导向完全不同的细胞命运。 图 3　培养基配方与细胞命运的对应关系（依据原文 Table 1 重绘） 几个具体例子，可以看清这套逻辑的严密程度： ● 用 NOTCH 抑制剂（如 DAPT）处理野生型小肠类器官，可富集分泌型前体细胞； ● 在 NOTCH 抑制基础上药理激活 WNT（模拟隐窝底部的 Wnt-ON 状态），分泌前体被推向潘氏细胞；而抑制内源 WNT 分泌（模拟隐窝上部与绒毛的 Wnt-OFF 状态），则把它们推向杯状细胞； ● 肠内分泌细胞（EEC）在肠道中本就很稀有，抑制 WNT、NOTCH、MEK 三条通路即可富集；BMP 信号则决定它们向隐窝型（Glp1+）还是绒毛型（Sct+）极化——撤去 Noggin 并加入 BMP4，即可富集绒毛型亚型； ● 同理，簇状细胞可用 IL-4／IL-13 富集，M 细胞可用 RankL 富集。 为什么要费这么大劲富集稀有细胞？因为它们能支撑过去做不到的研究。例如，正是借助这类富集方案，研究者才得以构建不同人类 EEC 亚型的单细胞转录组与质谱分泌组图谱——而 EEC 在人肠道中占比不到百分之一。 4.2 宏架构：脑区如何被"指定" 胚胎神经管中，形态发生素梯度决定不同脑区的形成。体外复现这一过程有两条路线。 非引导（unguided）路线：放任 PSC 聚集体自己发挥。2013 年的经典方案把 PSC 聚集体包埋进 Matrigel，让神经上皮芽得以扩展，生成包含大脑皮层、脉络丛、海马和视网膜等多种区域的"大脑类器官"。区域多样性是它的优势——可以研究区域间互作；但过程本质上是随机的，可重复性受限，系统分析困难。 引导（guided）路线：外源施加模式因子与小分子，把前体细胞的命运导向特定脑区。规则与胚胎发育一致——WNT 与 BMP 提供背侧／后侧身份，SHH 提供腹侧身份，视黄酸（RA）强化尾侧后脑与脊髓轨迹。体外用激动剂（SAG 激活 SHH、CHIR99021 激活 WNT）或抑制剂（双 SMAD 抑制启动神经外胚层、WNT 抑制偏向吻侧／背侧端脑）来调配，通过选择给药的时机与剂量，把类器官导向确定的区域前体。 代价是：强模式化会压缩发育异质性，产出的组织可能"区域身份很纯"，却缺少了本该有的输入——比如远程连接。 脑区 核心策略 关键优势 视杯 / 视网膜 SFEBq 体系下视网膜原基三维自组织，无需外力塑形 极强的内在自组织能力，形成分层神经视网膜样结构 背侧前脑 / 皮层 早期 WNT 抑制 + TGF-β 抑制促进背侧端脑身份；或双 SMAD 抑制 + CHIR99021 提高可重复性 形成皮层板样结构，具备"由内向外"分层特征，区域身份更稳定 小脑 FGF2 后化 → 依次加入 FGF19 与 SDF1，自组织形成带菱脑唇的极性小脑板 可获得含浦肯野细胞的人源组织，支持长期成熟 丘脑 BMP7 联合 MEK/ERK 抑制进行丘脑模式化 与皮层类器官融合后可形成双向丘脑—皮层投射 中脑 双 SMAD 抑制后以 SHH + FGF8 指定腹侧中脑 富集腹侧中脑身份，多巴胺能神经元存活期长于多数二维体系 脊髓 RA 后化，SAG/SHH 腹侧化或 BMP4 背侧化 可在三维中可控地指定背腹身份，形成多个前体结构域 表 1　部分脑区特异性类器官方案（依据原文 Table 2 整理） 4.3 脑类器官最大的难题：变异性 脑类器官在方案之间与方案内部都存在显著变异，来源尚未完全厘清，目前认为至少有三条：其一，体外使用的形态发生素浓度往往超出体内生理范围，无法完全模拟真实梯度；其二，自组织与对称性破缺本身具有内在随机性；其三，起始多能性状态存在异质性，细胞系之间存在遗传与表观遗传差异。 近些年才开始有针对可重复性的系统性努力，方法包括：用纤维微丝支架约束组织几何形状；用气液界面培养或切片培养改善氧与营养供应；用标准化流程降低操作者敏感性；以及从分离出的单个神经玫瑰花环出发衍生类器官，提高细胞架构的可预测性。 但重要局限依然存在，解读表型时必须纳入考虑：特定人类皮层细胞类型（如外放射状胶质与浅层神经元）代表性不足或不稳定；细胞架构频繁失序，出现多个管腔或脑室区；组织生长依赖"融合"而非持续的神经发生。正因如此，来自胎儿与成人脑的大规模单细胞参考图谱成了关键的基准——它告诉你，某个方案到底抓住了哪些细胞程序、比例是多少。 4.4 还有第三种形态：分支 肺、乳腺、胆管、肾和胰腺的发育都依赖分支形态发生。ASC 类器官在扩增时通常呈囊状生长，但改变条件就能诱导分支：胆管类器官中激活非经典 WNT，或乳腺类器官中交替施加 EGF 与 FGF2。癌性类器官同样可以分支——研究者通过比较小鼠胰腺导管腺癌类器官的异质分支行为，定义出与分子亚型相关的不同形态。 到这里可以小结一句：调整培养条件，就能让类器官模拟组织架构的不同层级。但原文提醒——更高的复杂度往往以实验可控性为代价，这个权衡必须逐个实验地认真对待。 五、追问：细胞为什么会变成"它" 类器官能生成对应器官中的多数细胞类型，因此可以拿来研究分化、成熟与可塑性的机制。手段分三类：看得见、看得全、改得动。 5.1 看得见：从染色到 AI 追踪 最基础的是免疫染色，用体内沿用已久的经典标志物识别细胞类型，但只能看固定样本，拿不到时间信息。要"看动态"，就得靠遗传编码的荧光报告基因。例如源自 Lgr5-EGFP 小鼠的肠道类器官，能实时观察干细胞群体的变化。 建立敲入报告系有若干相对高效的基因标记方案；另一条更轻的路子是"微基因报告系统"，例如由 ASCL2 驱动的肠道干细胞活性报告，可通过慢病毒或转座子系统整合进基因组——技术门槛更低、效率更高，对难培养的类器官尤其有价值。 报告类器官还能揭示组织内部的信号动态。基于 FRET 的 ERK 报告揭示了结直肠癌类器官中依赖 EGFR 的信号振荡；携带 Hes1 报告的类器官则显示出细胞类型依赖的 NOTCH 信号振荡，而研究者用脉冲式抑制剂处理成功复现了这一节奏，并据此引导细胞命运。 更进一步是高通量时空成像。已有成像筛选平台能结合形态与两个标志物（醛缩酶标记肠上皮细胞、溶菌酶标记潘氏细胞）的染色模式，自动对肠道类器官表型分类；正是靠它完成的大规模化合物筛选，发现了视黄酸信号是肠上皮细胞分化的关键驱动因素，而 RXR 抑制可以阻止类器官再生过程中的对称性破缺。另一个筛选体系把分泌型溶菌酶的荧光检测与 ATP 测定结合，用于寻找促进潘氏细胞分化的化合物。近来，人工智能模型让无标记的类器官细胞追踪成为可能；结合终点抗体染色，研究者实现了对细胞分化在时间与空间上的分辨追踪，并得到一个重要结论：在肠道类器官中，细胞类型的"承诺"发生在终末分化之前。 5.2 看得全：三种组学各有取舍 方法 优势 局限 整体（bulk）转录组 成本低、通量高，可映射到参考图谱推断整体组成与成熟度 缺少单细胞分辨率，只能看到标志基因的相对变化 单细胞转录组 / 表观组 分辨率高，能识别稀有与过渡状态，可推断基因调控网络 昂贵、通量低，存在解离伪迹，低表达基因易丢失 单细胞蛋白组（CyTOF） 可同时定量多条通路的翻译后修饰与细胞类型标志物；兼容先固定再解离 需要专用仪器，抗体验证工作量大 表 2　三类组学方法在类器官研究中的取舍（依据原文 Table 4 整理） 组学还能把类器官放进"环境"里考察。胎鼠肠道类器官的单细胞转录组揭示了不同 Wnt 配体对肠道成熟的影响；结肠类器官的单细胞 CyTOF 则把致癌突变与微环境线索对干细胞极化的作用拆开来看。在脑类器官中，把实验数据映射到注释过的参考数据集上，可以评估细胞类型组成与区域身份的保真度；整合多个发育时间点的单细胞转录组与染色质可及性，还能重建调控早期人脑发育的基因调控网络。 类器官在这里的价值不可替代：等价的人类样本极难获得，而模式动物的脑发育与人类差异显著。 5.3 改得动：消融与 CRISPR 筛选 要验证某类细胞在组织稳态中的作用，最直接的办法是把它去掉。源自 Lgr5-DTR 小鼠的类器官可用白喉毒素选择性清除 Lgr5+ 细胞；但这套系统无法移植到人类体系——人类细胞本身就表达 DTR。替代方案是在标志基因位点敲入诱导型 Caspase-9，实现人类类器官中特定细胞类型的靶向清除。 CRISPR 筛选则把扰动提升到基因组规模，并直接与表型挂钩： ● 在带荧光分泌细胞报告的人肠道类器官中，用转录因子 gRNA 文库筛选并结合 FACS 分选，鉴定出 ZNF800 是肠内分泌细胞分化的主抑制因子； ● 用靶向转录与表观遗传调控因子的聚焦文库筛选胎鼠肠道类器官，依据胎儿标志物 Sca1 的丢失，鉴定出 Smarca1 与 Smarca4 是肠上皮成熟的"守门人"； ● 把单细胞 RNA 测序与 CRISPR 扰动偶联（Perturb-seq），在脑类器官中靶向 20 个转录因子验证了基因调控网络，并鉴定出 GLI3 是 SHH 介导端脑区域化的关键调控因子； ● 对 36 个自闭症相关基因的筛选揭示了神经前体分化失衡，其中 ARID1B 突变可复现患者的 MRI 表型。 原文 Box 2：在类器官里做 CRISPR 筛选，难在哪？ 难点一：gRNA 文库递送效率低。不同细胞类型的转导效率不均一；分化程度更高、更致密的体系（如脑类器官）转导效率普遍偏低。对策是把递送时机提前到状态更均一的阶段——例如在扩增培养基中培养肠道类器官时转导，之后再诱导分化；PSC 类器官则可在二维培养的多能干细胞阶段转导。需要时间控制时，改用诱导型核酸酶在特定发育阶段施加扰动。 难点二：可扩展性与覆盖度受限。全基因组文库需要极多细胞才能保证统计效力，而类器官培养的细胞数与转导效率都有限，放大规模往往既不现实也不经济。因此多数类器官筛选使用只覆盖几十到几百个基因的聚焦文库。负选择筛选比正选择筛选需要更高覆盖度；使用较大文库的类器官筛选通常是正选择，通过改变培养基成分施加选择压力。其他思路包括悬浮培养以降低操作时间与成本，或在体内移植后借助生物体天然扩增。 难点三：生长模式本身是随机的。二维筛选默认"生长差异＝扰动效应"，但类器官个体之间、同一类器官内不同细胞之间的生长高度异质；传代或分化过程中的瓶颈会造成大量细胞丢失，引入与生物学效应无关的噪声。对策包括：手工挑取经正选择存活的单克隆逐一测序 gRNA；用带唯一分子标识（UMI）的 gRNA 校正克隆漂移、剔除离群值；以及用 CRISPR 谱系追踪在细胞分辨率上定量扰动细胞的克隆生长。 六、细胞之间，到底在"说"什么 细胞间通讯是多层级的：局部微环境内的短程信号、不同组织区域之间的对话，以及跨越不同发育来源的相互作用。肠道和脑恰好又是两个极端——前者靠隐窝内的短程信号，后者由空间上分离、随后被远程连接起来的区域构成。 6.1 隐窝内的短程信号：一个 20 倍的数字 潘氏细胞构成 LGR5+ 隐窝底部干细胞的"巢"，这是肠道类器官技术驱动的早期重大发现之一。单个游离的 Lgr5+ 细胞在没有外源 WNT 时也能形成类器官，但如果把干细胞与潘氏细胞成对接种，成球效率提高约 20 倍。潘氏细胞产生 WNT、NOTCH 与 EGFR 配体；向培养基中外源补加 Wnt3a，即可解除对潘氏细胞的依赖。 这里有一个容易被混淆的区别："生长因子完全独立"与"生长因子自给自足"不是一回事。Rnf43 与 Znrf3 这两个 E3 连接酶基因失活后，肠道类器官可以在无 WNT/RSPO 的条件下生长；但它们依然依赖自身产生的 WNT——证据是它们对 WNT 分泌抑制剂仍然敏感。顺着这条线，研究者发现 RNF43 突变结直肠癌类器官中存在一个"肿瘤内在的巢细胞"群体，用诱导型 Caspase-9 报告系统特异清除它们后，类器官在无外源生长因子时生长受损，而补回 WNT、RSPO 与 EGF 可以完全挽救——说明这些细胞提供着不可或缺的巢信号。 6.2 与非上皮成分共培养 已有方案支持类器官与血源免疫细胞以三维或单层形式共培养。借助这些方案，研究者考察了巨噬细胞对肠道稳态的影响，以及肠上皮对淋巴细胞成熟的塑造。人肠上皮中有一大群组织驻留 T 细胞（TRM）；由 iPSC 衍生的人结肠类器官会同时发育出 TRM 细胞与间充质成纤维细胞，而 iPSC 来源的小肠类器官不会自发产生免疫细胞，但可以接纳从结肠类器官转移来的免疫细胞。更进一步，来自人体活检的 TRM 细胞——而非血源 T 细胞——能有效整合进肠道类器官，形成"肠道免疫类器官"。上皮类器官与成纤维细胞、内皮细胞的共培养方案也已建立。 不过这类共培养只能短暂维持，直到上皮类器官需要传代、或非上皮细胞过度生长把培养体系占据。微加工与组织工程的进展用"器官芯片"解决了这一限制：所谓"迷你肠道""迷你结肠"，是在可灌流的微流控装置上持续补充肠上皮、并把凋亡细胞冲走，从而可稳定培养数周。患者来源的迷你结肠最近已能整合其原生微环境——肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤浸润淋巴细胞——用于研究三者之间的免疫调节互作。 6.3 ECM 不只是"支架" 胶原、层粘连蛋白等基底膜结构蛋白提供的不只是物理支撑，还有化学与力学信号。传统二维硬表面培养无法准确再现这些效应；而类器官培养的标配 Matrigel 成分未定义、批次差异明显。为此，定义化基质与合成水凝胶被开发出来。已经有几个漂亮的例子：把类器官培养在硬度更高的水凝胶上（模拟炎症性肠病条件）会促进杯状细胞分化；在分支形成过程中，分支内细胞的往复运动会产张力并重塑周围胶原；在微流控装置中给单细胞施加剪切应力与压力梯度，发现 LGR5+ 结直肠癌细胞比 LGR5− 细胞更硬，且与侵袭潜能相关；把结直肠癌类器官从 Matrigel 转移到 I 型胶原（模拟向间质基质浸润）会通过 YAP 介导的机械转导，把 Lgr5+ 干细胞推向 Sca1+ 的胎儿样状态。 原文也坦承：ECM 与上皮之间的复杂互作，目前仍难以在体外准确建模。 6.4 健康细胞与癌细胞的竞争 理解肿瘤起始与转移，必须研究正常细胞与癌细胞之间的竞争。这类互作常依赖短程信号或细胞间力学信号，因此把不同类器官放在同一个孔里共培养、或者交换条件培养基，往往不够。为此研究者建立了混合类器官或混合单层模型，让健康细胞与癌细胞共存并可通过活体成像长期追踪。用这些模型研究肠道腺瘤或癌细胞与野生型肠细胞的竞争，发现了野生型细胞的主动清除过程；把肠癌细胞与野生型肝细胞混合，则可模拟转移灶中的细胞竞争。 6.5 脑区之间：组合体（assembloid） 皮层发育依赖来自皮层原基之外的输入与细胞群体，因此脑类器官模型越来越需要表现解剖上不同神经区域之间的互作，而不只是孤立的区域身份。两条互补路线：非引导的大脑类器官可以在同一自组织组织内自发出现多个脑样区域（皮层、脉络丛、神经节隆起、海马、视网膜），便于观察区域身份如何共存与互动；组合体路线则先用引导方案把类器官定向到确定的区域命运，再把它们拼在一起，从而更有针对性地分析连接、迁移与区域间通讯。 背侧与腹侧前脑类器官融合后，组织保留了两个可区分的区域区室，而腹侧产生的中间神经元优先向背侧迁移。这套体系还被用于功能性基因解析：一项基于 CRISPR 的筛选鉴定出 LNPK 是中间神经元迁移的重要调控因子——这正体现了三维人类组织模型的价值，因为它能揭示依赖空间组织背景、在二维培养中难以捕捉的机制。迁移进入背侧区域后，中间神经元表现出明显的钙活动，并与兴奋性神经元建立突触连接。另一套把皮层与丘脑类器官融合的策略显示两个组织之间出现双向轴突延伸，复现了丘脑—皮层与皮层—丘脑连接的关键特征。这类多区域模型还揭示了更简单的单区域类器官观察不到的新兴神经特性，比如更高的放电频率。 未来要复刻区域间连接，必须认真处理生物物理特性与轴突生长的方向性。核心难题之一是复现体内驱动区域模式化的形态发生素梯度空间组织——常规三维培养让细胞暴露于均匀信号中，缺少必要的空间控制。一个有前景的策略是引入"局部组织中心"，按空间定义的方式分泌形态发生素：把多西环素诱导表达 Sonic hedgehog 的小 PSC 聚集体包埋进更大的 PSC 聚集体中，或用光遗传学激活，已被证明可促进类器官内的时空组织化——诱导后，靠近信号中心的细胞获得腹侧身份，较远的细胞保持背侧身份。但要复现发育脑中那种区域间锐利的边界，体外仍然困难。 6.6 神经元之外的细胞：小胶质与血管 当前脑类器官主要复现源自神经外胚层的过程。要逼近完整脑的复杂度，必须纳入非神经元细胞——小胶质细胞与血管元件。 小胶质细胞是脑内常驻免疫细胞，对神经发育、稳态与神经炎症至关重要。与神经元和胶质不同，它来自卵黄囊前体，在发育早期侵入脑内。非引导方案生成的大脑类器官中会自发出现小胶质样细胞，提示存在中胚层来源，但其一致性与身份仍不确定；短期共培养也可把这类细胞加进去，说明技术上可行。但关键疑问尚未解决：它们究竟在多大程度上反映真正的卵黄囊来源小胶质细胞？现有证据中，不同大脑类器官体系检测到的小胶质样群体多样性，以及它们未能完全获得静息小胶质细胞典型的高度分支形态，都说明还需要与原生人类小胶质细胞做系统基准比对。较新的工作把人脑—小胶质细胞模型推进到体内异种移植环境：在这样一个环境里，类器官内的小胶质细胞获得了人类小胶质细胞在体内特有的转录特征，并表现出脑内常驻免疫细胞应有的功能行为——主动巡视周围人类组织、对局灶损伤作出反应、对全身炎症刺激敏感。 血管方面，经典脑类器官缺少功能性血管网络，尺寸与存活受氧与营养扩散限制（通常约 100—200 微米），深部区域易缺氧坏死，进而损害成熟、组织架构与长期存活。策略之一是移植到体内血管丰富的环境，促进血管新生与宿主血管整合，从而支持长期存活、改善氧合并实现结构与功能整合；另一条路是与内皮细胞共培养或借助生物工程实现体外血管化。原文指出，目前肾与肝等其他 PSC 类器官的血管化方案更成熟；而能模拟动态神经血管互作、包括完整血脑屏障的"完全功能性血管化脑类器官"，仍是这一领域的关键目标。 七、与微生物共处：五种"开门"方式 肠道、胃、肺等上皮组织栖息着复杂的微生物组，它们对稳态与疾病都必不可少。癌细胞系是转化过的细胞，无法反映健康上皮，因此类器官—微生物共培养是更接近生理的替代方案。真正的难点在于：类器官的管腔面朝向内部，而这里正是微生物作用的主要位点。围绕这个难题，领域发展出五种方法。 图 4　五种研究细胞—微生物互作的方法及其优缺点（依据原文 Fig. 6 重绘） 这些方法主要在人胃肠类器官上得到验证，但只要顶端特征适合目标微生物，同样可推广到其他上皮类器官。值得单独一提的是第四个方法：用显微注射把细菌直接送入管腔，可以精确控制感染率，并通过抗生素处理防止类器官外的病原过度生长；自动化微注射平台每小时可注射多达 90 个类器官，从而支持稍大规模的筛选。研究者用人结肠类器官与产基因毒性的 pks+ 大肠杆菌共培养超过 5 个月，最终发现了同样出现在人类癌症中的 pks+ 大肠杆菌突变特征——这是把"细菌"与"致癌突变"连成因果链条的直接证据。 器官芯片则解决了前述方法的部分局限：由缺氧的顶端腔与含富氧培养基的基底腔组成的 Transwell 或微流控系统，可让二维生长的肠道类器官与厌氧菌共培养；肠芯片还能施加可控的蠕动与流动，一项研究发现志贺菌成功侵入肠上皮依赖这些机械力的存在；这类模型还可支持包含 200 种以上细菌、更接近体内多样性的复杂菌群。 八、疾病建模：患者替身与基因模拟 类器官提供了生理相关的疾病模型。患者来源的模型可以充当"患者替身"（patient avatar），而基因编辑让疾病相关突变能在受控环境中被复制，也就是"基因模拟"（genetic mimicry）。这两条路适用于 PSC 与 ASC 两类类器官，选择哪条取决于研究问题，本质上还是那个"可控性与复杂度"的权衡：工程化的等基因体系偏向实验可控，患者来源模型承载更高的生物学复杂度。 图 5　基因模拟与患者替身两条疾病建模路径（依据原文 Fig. 5 与 Box 3 重绘） 8.1 单基因病：从囊性纤维化开始 类器官最早的临床应用之一出现在囊性纤维化（CF）领域。CF 由 CFTR 基因突变引起，该基因编码一个对肺、肠等上皮组织稳态至关重要的阴离子通道。虽然患者最严重的症状出现在肺部，但肠道类器官提供了评估 CFTR 功能的平台：在福斯高林诱导肿胀试验（FIS）中，药物福斯高林会引起快速的、CFTR 依赖的类器官肿胀。CFTR 突变类型很多，效应从功能完全丧失到部分丧失不等，其中一部分可被药物挽救。研究者把 FIS 应用到大规模患者类器官生物库，刻画突变特异的 CFTR 活性、识别现有药物的应答者、并筛选新的 CFTR 恢复剂。这些结果已推动一项针对罕见 CFTR 变异患者的个体化治疗临床试验（NCT06468527）。 8.2 结直肠癌：把因果关系做出来 类器官方案能以远高于二维细胞系的建系效率，培养患者来源的肿瘤及其配对正常组织，从而建立覆盖不同肿瘤亚型的大规模生物库，或聚焦于神经内分泌癌等罕见类型。与二维细胞系不同，类器官更忠实地保留了原肿瘤的遗传异质性与细胞组成，可用于回答基础与转化研究问题——结直肠癌类器官生物库因此支持了对基因型—表型关系的系统考察与功能验证。 但证明因果关系需要改造模型。基因工程小鼠仍是肿瘤建模的金标准、实验灵活性广，但组合多个突变等位基因在技术上要求高、耗时长；相比之下，类器官的 CRISPR 编辑相对直接，并且能直接在人组织中建模。作为原理验证：在人结肠类器官中依次引入 APC、KRAS、TP53、SMAD4 四个突变，即可启动结直肠癌的关键特征——生态位因子非依赖、非整倍化的诱导，以及原位移植后的体内成瘤与转移。反向操作同样可行：修复患者来源类器官中的突变，可拆解复杂癌症基因组中单个突变的贡献（例如 BRAF 与 RNF43 突变在锯齿状癌中的作用）。 类器官还让肿瘤基因组演化变得可观测。用带荧光 H2B 的类器官做三维活体成像，可以实时追踪有丝分裂错误与染色体不稳定；单细胞低覆盖全基因组测序揭示了单个类器官内部的核型异质性；两者结合，能够重建染色体不稳定的系统发生树。健康结肠类器官则被用来把诱因与特定突变特征做因果关联，已在 DNA 修复基因敲除、化疗处理、以及产基因毒性细菌等场景中得到验证。 在功能癌症基因组学方面，两项研究利用 TGF-β 对健康结肠或早期腺瘤类器官的毒性做正选择筛选，筛选出能赋予抗性的抑癌基因敲除；存活的类器官携带靶向已知通路组分或 SWI/SNF 复合物的 gRNA。把转导了聚焦 gRNA 文库的类器官移植到体内，还可鉴定促进肿瘤生长的突变，发现 TGFBR2、TP53 与 STK11 等抑癌基因。另一项研究用 MLH1 敲除的结肠类器官模拟错配修复缺陷中的自发突变累积：通过生长因子撤除选择带有致癌驱动突变的克隆，培养两年后，四个主要结直肠癌通路中都出现了突变。 不过原文也给出了冷静的判断：这些原理验证研究展示了类器官在小规模功能基因组学中的应用，但对肿瘤生物学的新洞见仍然有限；受体外规模限制，大规模功能癌症基因组学目前仍限于体内模型。 8.3 神经发育疾病与精神疾病 全基因组关联研究、全基因组与全外显子测序已经确认遗传变异是自闭症、精神分裂症、双相障碍等疾病的主要驱动因素。动物模型对拆解高外显率突变仍不可或缺，而脑类器官提供了补充平台——在人类发育背景中考察遗传风险如何显现。患者来源脑类器官已被用于研究疾病相关变异如何塑造神经发育轨迹：与自闭症相关的 16p11.2 与 22q11.2 拷贝数变异会改变前体动态与神经元成熟；精神分裂症的多基因风险背景则影响脑室区前体的存活与神经发生。与此同时，高通量 CRISPR 筛选、以及把多个患者来源细胞系混合培养的"chimeroid"等新策略，使在可扩展的人类体系中系统考察遗传风险成为可能。 九、走向体内：移植带来的新维度 类器官无法完全取代体内模型，但它能通过提供人类特有的组织背景来延伸和丰富体内研究。移植策略既用于机制研究（如肿瘤进展、脑环路整合），也用于再生医学。 9.1 三种原位移植，各有各的问题 ● 手术移植到小鼠盲肠壁：更接近生理。已被用于研究工程化结肠类器官的进展，并确认四条通路同时突变即可启动转移；还可结合活体成像与光转换荧光报告追踪特定细胞群，用于研究工程化癌细胞的迁移行为，以及肝转移灶生长过程中的干细胞可塑性。 ● 结肠镜引导注射到结肠黏膜：更快、创伤更小，因此通量更高。对一大批等基因类器官系做连续移植，可以前瞻性地考察癌症演化过程，并揭示腺瘤—癌转变中的遗传变化，例如致癌 Kras 基因剂量的增加。 ● DSS 植入试验：适合把健康类器官原位移植。有效植入的前提是清除宿主干细胞区，做法是在移植前向结肠注射葡聚糖硫酸钠（DSS）。该方法实现了健康结肠类器官在小鼠体内的长期（不少于 6 个月）植入，并可研究工程化类器官的肿瘤进展，同时避免"进展程度越高越容易植入"带来的偏倚。 三种互补策略提供了不同的实验优势——研究肿瘤进展与转移、演化动力学，或早期转化，取决于你要回答哪个生物学问题。 9.2 脑类器官移植：不只是"活着" 目前脑类器官移植主要基于向啮齿类脑内植入，因此实验决策的重点不在于选择哪种移植范式，而在于选择最匹配应用目标的移植阶段、解剖位点与分析策略。早期研究借鉴了胎儿组织移植的脑内移植技术，并证明类器官移植物比解离的前体细胞更容易血管化。 移植后发生了什么？移植物中神经元成分增加，组织显著重塑——富含前体的玫瑰花环结构让位于以神经元与星形胶质为主的更成熟组成；同时，体内环境降低了长期体外培养中常见的应激相关特征，并改善了外放射状胶质与新生神经元的特化。功能上，对 AAV8-CaMKII-jRGECO1a 标记神经元做纵向双光子成像，记录到移植物内自发的、反复的、节律性的钙活动；多电极阵列的胞外记录检测到动作电位与同步网络活动；晚期移植物的跨记录位点互相关分析显示活动模式日趋协调，与网络逐步成熟一致。另一项独立的膜片钳实验显示，人类谷氨酸能神经元的电生理特性随时间推移而趋于成熟。 更引人注目的是连接。已有报道显示，人源类器官衍生轴突可延伸穿过皮层与胼胝体、沿皮质脊髓束走行、并伸向基底脑区；病毒示踪与光遗传学实验进一步支持移植物衍生神经元与小鼠宿主神经元之间存在突触通讯。移植物内的神经元会对环境刺激产生放电变化；携带大脑类器官移植物的小鼠在听觉条件化后表现出增强的惊跳恐惧反应。这些观察支持一个结论：移植的人脑类器官不只在体内成熟，还能与宿主神经环路连接并参与其中。 移植也让人类非神经元成分（小胶质细胞与其他脑内常驻免疫细胞）变得可研究，这些细胞在体外一直难以捕捉。但宿主细胞对移植环境的贡献会干扰解读。原文的判断是：未来移植最有信息量的用法，是把它与含有明确非神经元成分的工程化类器官模型结合，从而更可控地拆解人体与宿主之间的相互作用。 十、物种演化：类器官能回答"人为什么是人"吗 脑类器官特别适合跨物种比较，因为它能在受控实验环境中保留三维组织架构、前体组织方式与发育时序——这些在二维培养、简单球体或死后材料中都难以捕捉。对刚进入这一方向的研究者，原文给了一个实用起点：在不同物种间使用尽可能匹配的类器官分化方案，然后比较形态、谱系进程、细胞状态与扰动反应，以此区分保守的与物种特异的发育程序。 从非人灵长类神经类器官出发，研究者已识别出物种特异性特征，把人类特有特征与更广泛的灵长类适应区分开来。对来自人、黑猩猩与猕猴的 iPSC 培养做比较，发现人与黑猩猩的神经发生比猕猴更慢，提示猿类脑扩大背后存在一个保守机制。尽管人与非人猿类的大脑在解剖上相似，人类的皮层显著更大，神经元数量约多出 100 亿。 类器官研究把这种扩张与早期神经上皮细胞形态的差异联系起来：人类细胞维持更大的顶端表面，延缓了向放射状胶质细胞的转变，从而扩大了前体池。类器官还允许在人源与灵长类来源的模型中做遗传扰动，进一步锁定分子调控因子——ZEB2 被鉴定为控制这一转变时机的转录因子：在人与猿的类器官中操纵 ZEB2 表达显示，延迟表达延长了人类的神经上皮阶段，而在猿类中提前激活则加速了向放射状胶质的推进。与此并行，在人源与黑猩猩 PSC 中进行的全基因组 CRISPR 干扰筛选，鉴定出物种特异的遗传依赖关系，包括细胞周期调控因子。 除扰动研究外，若干人类独有的基因组位点也被牵涉进皮层扩张，包括人类加速区（HAR）以及 SRGAP2C、NOTCH2NL、ARHGAP11B 等新基因。早期功能研究显示，把人类特有序列引入小鼠会增加神经发生；而类器官中的基因"交换"实验给出了更直接的证据——NOTCH2NL 缺失会加速神经元成熟，在黑猩猩类器官中表达 ARHGAP11B 则扩大前体细胞群体。这些工作共同说明，类器官模型能够拆解人类特有的遗传贡献，尤其是在检验非编码区调控变化方面——而这类变化被假设为许多人类获得性适应的驱动力。 脑之外同样有发现。一项使用人与黑猩猩肠道类器官的研究揭示了上皮基因调控的演化变化，尤其在代谢与屏障功能方面，并将其与人类特有的调控变异联系起来。 十一、临床转化：走到哪一步了 教程的主线是基础生物学，但也用一节专门梳理了临床应用的最新进展。 个体化用药。患者来源肿瘤类器官可用于直接测试特定疗法的疗效。类器官优于传统二维培养，因为它能捕捉患者内部异质性、更好地保留肿瘤的遗传与表型特征、且建系更可靠。自首项研究显示患者反应与匹配类器官相关以来，大量（多为前瞻性观察性的）共临床研究总体上支持类器官的预测潜力。但研究之间结果并不一致，反映出培养条件与读出方法的差异。目前有多项临床试验正在评估类器官在各类癌症个体化医疗中的应用，包括两项 III 期研究，但类器官指导的精准医疗尚未获得批准。 药物代谢与毒理。除在疾病类器官中做药物筛选外，正常类器官可用于在健康细胞上测试药物毒性。类器官还被探索作为药物代谢模型，尤其是肝类器官——它们表达药物代谢酶，能对多种化合物进行生物转化。这些应用前景可观，但仍处于临床前阶段，尚未获得监管机构批准。 细胞治疗。免疫肿瘤学领域对"在体外测试细胞毒性 T 细胞对患者实体瘤的活性"有浓厚兴趣。例如，自体错配修复缺陷肿瘤类器官与外周血淋巴细胞的共培养可用于富集肿瘤反应性 T 细胞；扩增后的 T 细胞可回到共培养体系中评估杀伤能力。多色三维活体成像平台能捕捉 T 细胞群体内部行为表型的异质性；微阵列系统支持肿瘤类器官与 T 细胞的高通量共培养，用于免疫调节药物研究。近期，一项用于快速生成患者来源胶质母细胞瘤类器官的方案，使得在 I 期临床研究中实时评估 CAR-T 细胞治疗成为可能。 再生医学。脑与肠道类器官在这一领域的探索已在临床前模型中取得可观结果。在创伤性脑损伤与脑动脉闭塞的大鼠模型中，移植的皮层类器官支持受损运动皮层的区域特异重建、改善运动功能并减少组织丢失；移植物中的细胞沿胼胝体广泛迁移至多个脑区。在控制性皮层撞击模型中，移植的类器官促进了血管化并减少了胶质瘢痕。在短肠综合征（因小肠大量缺失导致严重营养吸收障碍）大鼠模型中，研究者把小肠类器官植入经 DSS 处理的结肠组织，构建出"小肠化的结肠"，并保留了吸收营养的功能。DSS 模型在小鼠中常被用作溃疡性结肠炎模型，而健康类器官在 DSS 处理小鼠中的成功长期植入，为人体试验打开了大门：2022 年，首个使用类器官的人体临床试验启动，把溃疡性结肠炎患者的健康结肠类器官培养后回植，以修复受损上皮（临床试验编号 jRCTb032190207）。 原文 Box 4：类器官药筛的三个陷阱 其一，培养条件本身会改变药敏。例如 N-乙酰半胱氨酸——人源类器官培养基中的常见成分——会严重影响对铂类化疗药（如奥沙利铂）的反应。因此建系方案与肿瘤保真度验证需要标准化。 其二，读出方法决定你能看到什么。多数研究使用基于 ATP 的活力测定（如 CellTiter-Glo），快速且可扩展，但它并不总与细胞数相关、测量的是延迟响应，无法区分治疗的细胞毒与细胞静止效应，也不测量样本内异质性——而后者正是耐药的主要决定因素。 其三，成像能补上细节。基于成像的筛选平台可在单类器官层面提供更多关于药物细胞效应的信息：例如用明场成像通过尺寸推断增殖、通过圆度推断活力；从染色类器官中提取形态学特征；或实时追踪单个类器官的生长动态。 十二、结语：一个诚实的定位 培养方案的诸多进展，让类器官的应用横跨了广阔的生物学研究领域——从模拟基础发育过程，到研究疾病机制与测试疗法。但原文给出了一个相当克制的结论：类器官无法完整捕捉系统层面的生物学，因此最好的定位是动物模型的补充，而不是替代。反过来同样成立——有些人类生物学过程无法被动物模型充分复现，在这些情况下，类器官提供了可扩展的实验入口。 先进方案确实提升了类器官体系的生理保真度：纳入缺失的细胞类型、细化空间模式化、增强长期成熟、整合生物工程与移植手段。但复杂度上升往往以实验可控性下降为代价。类器官方案分布在一个"可控性—复杂度"的光谱上，而最精巧的系统并不总是最有信息量的系统。选择正确的方案，永远取决于你要问的生物学问题。 如果说这篇教程留下了什么最值得记住的话，大概是这一句：类器官的价值不在于"像不像真器官"，而在于它把原本只能在活体、在病人身上、在漫长演化尺度上观察的过程，变成了一个可以被操控、被测量、被重复的实验对象。 参考资料与说明 1. Bugter, J. M., Schafer, S. T. & Rad, R. Tutorial: interrogating biology using organoid technologies. Nature Protocols (2026). DOI: 10.1038/s41596-026-01447-6 2. 作者单位：慕尼黑工业大学医学院分子肿瘤学与功能基因组学研究所；慕尼黑转化癌症研究中心（TranslaTUM）；慕尼黑工业大学精神病学与心理治疗学系；慕尼黑类器官系统中心；慕尼黑系统神经学集群；德国癌症联盟（DKTK）／德国癌症研究中心（DKFZ）。  /  科学技术普及新媒体矩阵  肠道类器官（Organoid Bulletin） 本公众号由AI智能体ORGANOID AGENT驱动赋能，您可以直接与公众号对话，获得最专业的类器官知识指导与信息。      我们致力于发布本领域优质资讯与评述，推送国内外类器官及干细胞相关领域最新研究论文、综述与技术进展。发布科普文章、专家观点评论、行业分析、招聘信息和会议通知。您可以在微信、小红书、百家号、企鹅号、今日头条、知乎和Bilibili关注我们。秉承类器官创新计划组织愿景，我们积极传播科学知识，促进同行交流，推动产业发展，服务国家战略，积极为类器官与干细胞技术发展提供助力。欢迎各位关注、分享、转载、投稿！原创内容欢迎转载，直接私信即可，完全免费授权。内容多来自学术论文或网络公开资源，如有侵权还请联系删除。 编辑部联系邮箱：zj@organoid.ac.cn 关注更多微信公众号 2026年度合作品牌 类器官科学与技术创新联盟（Organoid Science and Technology Innovation Alliance，简称 OSTIA），是由中国科学院、北京大学、清华大学、浙江大学、复旦大学等科研院所和高校相关研究团队共同发起的民间公益性学术交流与技术合作平台。  联盟成员主要包括类器官领域的科研人员、企业管理者、技术负责人及高级研究者，致力于推动类器官相关研究、技术开发与产业协同发展。联盟坚持开放、共享、协作、公益的原则，围绕类器官研究与应用中的关键问题，持续促进资源互通、经验交流、方法优化与跨界合作。      加入 OSTIA 后，成员可在较低合作成本下参与类器官资源、研究经验和技术方法的交流共享，并依托肠道类器官及 OSTIA 相关学术传播平台，获得来自行业内不同方向的专业支持与实践参考。联盟鼓励围绕类器官标准化制备、质量评价、检测分析、模型构建及应用转化等关键环节开展协作交流，助力研究工作的规范化、高效化推进。为加强成员之间的互动与协同，联盟已建立“技术研发”“开源公益”“产品服务”等多个专题交流社群，方便成员围绕类器官培养、品系互换、干细胞研究工具、技术优化及实际应用等问题开展及时讨论，促进资源对接与经验共享，并为技术难点提供协同支持。目前，OSTIA 已汇聚来自全国多家科研机构、高校和企业的众多注册成员。联盟持续推动类器官领域的开放合作与生态建设，希望通过跨机构、跨学科、跨产业联动，进一步促进类器官技术创新与行业发展。      此外，OSTIA 还发起了 AI 知识问答、开源类器官分析工具等公益项目，为相关研究提供辅助支持，努力构建开放、共享、包容的类器官创新生态。面向未来，联盟将继续坚持前沿探索与协同创新，积极推动更优技术方案与更高标准体系的形成，为类器官科学研究与产业发展持续贡献力量。 官方网站：www.organoid.ac.cn 联系邮箱：info@isco.ac.cn   组织愿景 1. 共建开放协作的类器官创新生态 搭建面向科研机构、医疗机构与企业的开放共享平台，促进资源互通、技术协作与经验交流，持续降低类器官研究与应用门槛，推动形成开放、包容、共建共享的领域生态。 2. 推动类器官标准与规范建设 推动类器官培养、检测、评价、存储及应用等关键环节的标准化建设，促进相关团体规范、行业共识与技术准则的形成和落地，提升类器官研究与应用的规范性、可重复性和可推广性。 3. 打造具有广泛影响力的学术与资源枢纽 推动建设高质量、可持续连接的类器官资源库、知识库与交流平台，汇聚前沿学术成果、关键技术路线和产业实践经验，提升我国类器官领域的学术影响力与资源整合能力。 4. 驱动多学科融合与关键技术创新 促进类器官与生物材料、智能装备、微流控、人工智能及高端制造等工程技术深度融合，突破规模化制备、功能重建、质量控制与场景适配等关键瓶颈，提升类器官技术创新能力与工程化水平。 5. 强化核心技术自主能力与产业支撑能力 推动国产试剂、仪器设备、分析工具和技术体系的研发与应用，增强类器官研发链条的自主能力，夯实产业基础，提升关键技术领域的支撑能力与发展韧性。 6. 加速类器官技术应用转化与场景落地 面向精准医学、药物研发、毒理评价、再生医学和个体化诊疗等方向，推动类器官技术从实验室研究走向临床前研究与产业应用，促进创新成果转化，提升类器官技术的实际应用价值与社会效益。 加入交流       本联盟面向类器官全领域同行提供交流平台和会员身份认证服务，可以加入“技术研发”、“开源公益”、“产品服务”和“专属领域”等多个类型的交流群，涵盖科学研究技术、开源工具和公益、销售产品与服务、细分领域如类器官芯片、生物材料等专属群等平台，参与讨论。高级研究员或独立PI可以申请成为荣誉发起人，成为类器官创新计划贡献者与受益者。本联盟目前已有10000+会员，期待您加入讨论分享，让我们共同促进类器官产业发展。      现在，您只需添加发起人微信，备注自己的真实姓名与单位和必要信息，例如“张三-中国科学院大学”，说明申请加入类器官创新计划，提供有效身份证件如学生证、身份证、工作证或其他任何可以证明身份的真实性的证件，即可加入对应社群。而这一切都是公益的，免费的，不收取任何费用。 扫描添加微信以进群交流 加入知识星球 面向专业科研需求和企业级资源共享，现在扫描二维码加入“肠道类器官”知识星球，就能获得来自顶级研究机构分享的类器官培养基配方和方案，类器官创新计划组织发布的官方标准指南、AI类器官分析工具等更加专业的资料。与1000+位行业精英共同交换类器官技术资料和资源，向行业专家提问，免费参与国内领先的类器官品牌产品内测试用，获得类器官工程师认证等。全行业最专业的类器官知识社区和公益平台，让您的类器官研究少走弯路！ #为什么要加入知识星球？ 1.最新最专业的培养基配方和技术资料即时获取。 2.标准类器官培养方案和技术标准材料发布唯一渠道。 3.最强AI智能体和类器官分析软件和工具解析和下载。 4.类器官领域TOP专家一对一沟通，权威资料触手可及。 5.类器官企业新产品评测和免费试用特权通道。 6.定期发放免费会议入场券和资料，提供演讲机会。  更多福利，请移步知识星球内部了解。 扫二维码｜获取资源 标准类器官培养基配方 高级类器官AI分析软件 高水平类器官文章资料 ...... 注册正式会员 OSTIA注册会员是面向所有人的公益身份识别项目。如需以会员身份获取各种资源与免费福利。您只需访问www.organoid.ac.cn注册会员，并补充个人真实有效身份信息，经人工审核后，即可获得注册会员认证。通过“类器官科学与技术创新联盟”和“肠道类器官公众号”的“身份认证”菜单就能找到查询入口。也可以下载专属的身份二维码用于各种需要出示本组织身份的场合如学术会议、合作商提供的免费产品申请。加入“注册认证会员群”优先享受本组织提供的学术界与产业界资源。特别的，您所有的信息仅用于身份识别，不会被进行任何形式的商业用途，且对您的信息采用算法加密和安全防护。     欢迎监督举报（邮箱：zj@organoid.ac.cn）。未进行注册的，不被认为是我联盟正式会员，合作方有权拒绝提供任何服务和或产品。 扫码获取您的电子会员证 访问www.organoid.ac.cn注册会员， 填写必要信息，人工审核后获得会员证。 求点赞 求分享 求推荐