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Nature Communications | 球蟒气道类器官建模爬行动物病毒感染推荐阅读文案 这项研究建立了首个爬行动物气道类器官模型——球蟒（Python regius）气道类器官。团队通过de novo组装球蟒参考基因组，结合单细胞RNA测序揭示了类器官包含纤毛细胞、杯状细胞、分泌细胞等多样化群体。该类器官支持球蟒尼多病毒（BPNV）的有效复制，并启动干扰素刺激基因和细胞因子介导的上皮抗病毒应答。概念验证显示瑞德西韦可降低感染类器官中BPNV载量，为爬行动物病毒学研究填补了关键空白。科学背景 人畜共患病对全球公共卫生构成重大威胁。据估计，约75%的人类新发传染病源于动物源性传播。病原体的跨物种传播因其可能引发流行病甚至大流行的潜力，已成为全球健康安全的重点关注对象。要有效评估和控制这一风险，需要全面理解病原体的多样性、其自然宿主范围，以及跨物种传播的机制与概率。尽管近年来对自然宿主中病原体的认知取得了长足进展，但仍有大量物种因缺乏适用的实验动物模型或实验可及性有限而处于研究空白。 在这一背景下，利用类器官（organoid）技术研究传统实验动物之外的多种动物物种，尤其是作为重要病毒储库（reservoir）的物种，正受到越来越多的关注。类器官是由干细胞在体外三维培养条件下自组织形成的、能模拟来源器官关键结构和功能的微型组织。近年来，领域内已陆续建立了多种病毒储库动物的类器官模型，包括蝙蝠气道、肾脏和肠道类器官，禽类肠道类器官，牛胃类器官，猪气道类器官以及骆驼科气道类器官等。这些模型为研究相应宿主的病毒感染机制提供了宝贵的体外平台。 然而，尽管病毒储库动物模型取得了上述进展，爬行动物这一大类群却长期被忽视。爬行动物已知可感染多种病原体，并被确认为多种虫媒疾病的储库——这些疾病由同时以爬行动物和人类为食的节肢动物传播。然而，爬行动物病原体的多样性和流行率，以及其对人类的潜在风险，在很大程度上仍未被充分表征。爬行动物同时也是日益流行的异宠（exotic pet），在世界部分地区还作为重要的食物、药材和材料来源，估计约占所有活体动物贸易价值的20%。因此，开发适用于爬行动物相关病毒研究的实验模型，对于理解其多样性并评估其对动物和人类健康的潜在风险具有重要意义。 球蟒（Python regius，Ball Python）原产于西非和中非，因其作为伴侣动物的高人气而频繁与人类接触。虽然目前全球宠物种群数量缺乏系统记录，但在1975年至2018年间，共有390万条活体球蟒被交易，其中绝大多数为野外捕获。这使其成为非洲出口量最大的CITES（濒危野生动植物种国际贸易公约）附录所列活体动物，占全球活蛇贸易的63%。 球蟒尼多病毒（Ball Python Nidovirus，BPNV）是一种属于尼多病毒目（Nidovirales）的蛇 serpentovirus（serpentovirus，蛇 serpentovirus 属病毒）。该病毒最常感染球蟒，但也已在其他蛇类、蜥蜴和龟类中检出。BPNV感染引起呼吸道疾病，临床表现为口腔黏液分泌过多、口腔肿胀、吞咽频繁和厌食，以及呼吸费力。目前对感染 captive（圈养）蛇的治疗仅限于支持性护理，最终往往不得不实施安乐死。此外，亚临床感染可悄然发生，使动物成为隐匿的病毒储库，可能通过活体动物贸易促进病毒传播。Serpentovirus（包括BPNV）对圈养蛇群构成威胁，因其传播迅速且与高发病率和高死亡率相关。在一项近期对约1500条圈养蛇（包括有和无呼吸道症状者）的评估中，约28%检出BPNV阳性。这一高流行率，叠加亚临床感染和全球蛇类贸易规模，凸显了野生和圈养蛇群中病毒传播的风险，以及潜在的人类暴露风险。事实上，已有研究强调了异宠携带病原体的人畜共患潜力。 从呼吸系统解剖学来看，大多数蛇的气道由气管组成，气管首先过渡为支气管，随后进入单腔血管化肺的功能区。肺终止于无血管、非呼吸性的气囊。功能区内的显微结构呈蜂窝状小梁（trabeculae，亦称ediculae），覆盖着更小的分支结构，即faveolae（蜂巢状气室）。Faveolae被认为是哺乳动物肺泡的同源结构，是大多数气体交换发生的部位。Faveolae主要由AT1细胞（介导O₂和CO₂交换）和少量AT2细胞（负责表面活性物质生产）构成。其上的ediculae上皮主要由假复层纤毛细胞组成，缺乏分泌细胞，而上呼吸道上皮则由基底细胞、纤毛细胞和分泌细胞构成。 尽管蛇类呼吸系统在解剖学层面已有较多描述，但其分子层面的详细特征仍十分有限。更重要的是，BPNV等爬行动物病毒的研究长期不足。适用的体外模型——尤其是代表靶器官的模型——对于推动这些病原体的研究至关重要。传统的细胞系往往无法支持某些病毒的有效复制（如人诺如病毒仅在人小肠类器官中有效复制，常规细胞系则不行），这进一步凸显了开发基于原代组织、能保留器官生理特征的体外模型的必要性。在此背景下，本研究将类器官技术应用于球蟒气道，旨在开发用于P. regius气道感染的体外实验平台，为爬行动物病毒学研究开辟新的路径。关键实验技术与方法 本研究涉及多项关键技术，以下按重要性逐一详述。一、球蟒气道类器官的分离、培养与分化 这是本研究的核心实验技术。研究团队从一枚 captive-bred（人工繁育）的球蟒卵中获取近孵化的胚胎材料。在预期孵化日前数日，通过壳体切口取出蛇胚，经颅骨基部脊髓离断法实施安乐死。沿体长轴做横向切口，用手术剪取下约2 cm长的右肺血管化区域组织，剪切为约1 mm²的组织碎块。组织碎块经PBS重悬后，用10 mL玻璃移液管机械吹打进一步分散，随后重力沉降。沉淀经Advanced DMEM-F12（ADF）培养基重悬，加入1 mg/mL胶原酶（collagenase），于32°C恒速摇床孵育1小时。消化后，细胞悬液经100 μm细胞筛过滤，ADF洗涤两次，500×g离心5分钟收集细胞沉淀。 收集的细胞和/或组织碎片直接接种于基底膜提取物（Basement Membrane Extract，BME；Cultrex品牌）中，32°C孵育20分钟使BME固化，随后加入气道类器官扩增培养基（Expansion Medium，EM）。EM配方包含：Advanced DMEM-F12基础培养基、青霉素-链霉素、HEPES、GlutaMAX、Noggin-Fc融合蛋白条件培养基、Rspo3-Fc融合蛋白条件培养基、B-27 Supplement、N-乙酰-L-半胱氨酸、Rho-激酶抑制剂Y-27632（2.5 μM）、TGF-β受体抑制剂A83-01（500 nM）、p38抑制剂SB202190（1 μM）、人FGF-7（25 ng/mL）、人FGF-10（100 ng/mL）和Primocin抗生素。其中，Noggin和R-spondin用于抑制Wnt拮抗和激活Wnt信号以促进干细胞维持，FGF-7/FGF-10促进气道上皮增殖，Rho-激酶抑制剂提高单细胞存活率，A83-01和SB202190分别抑制TGF-β和p38 MAPK信号以减少分化偏向。 初始类器官约3周后形成，之后每1-2周以1:3的分传比例进行传代。传代时，类器官经含2.5 μM Rho-激酶抑制剂的冷TrypLE于37°C消化1分钟获得单细胞，ADF洗涤两次终止消化，500×g离心5分钟后以1:3比例重新接种于BME中。类器官可稳定扩增超过40代而无生长潜力下降迹象。 对于分化培养，类器官经同样消化为单细胞后，接种于预涂5% BME（ADF稀释）的Transwell插入式培养皿（Greiner Bio-One），每孔20万细胞，上室200 μL EM、下室500 μL EM。两天后形成汇合单层。此时吸去EM，下室换为PneumaCult™ ALI（气-液界面）分化培养基（STEMCELL Technologies），上室留空，建立气-液界面（Air-Liquid Interface，ALI）条件。ALI培养基每2-3天更换，分化持续16天。ALI分化促使类器官单层形成更紧密、更明显的假复层上皮结构，并出现纤毛细胞、杯状细胞、分泌细胞和基底细胞等分化标志物。二、De novo基因组组装与注释 由于球蟒缺乏已注释的参考基因组，且验证抗体和试剂匮乏，研究团队首先建立了P. regius参考基因组。DNA来自pooled（混合）的速冻原代胃、肠和结肠组织活检样本。Illumina短读长测序采用ZYMO RESEARCH基因组DNA纯化试剂盒提取DNA，TruSeq DNA nano文库制备试剂盒建库，Illumina NextSeq2000平台进行2×300 bp双端测序。Nanopore长读长测序采用Monarch HMW DNA提取试剂盒（T3060S）提取高分子量DNA，Ligation Sequencing kit V14建库，GridION ONT 10000平台测序。 基因组组装采用WENGAN（v0.2）混合组装方法，结合Illumina短读长和Nanopore长读长数据以兼顾contig连贯性和碱基准确性。转录组由球蟒原代气道组织和类器官的bulk RNA-seq读段构建，使用BRAKER3（v3.0.8）将转录本定位到基因组上。基因注释以NCBI全非冗余真核蛋白数据库为参考，通过BlastP进行功能注释。组装质量经BlobToolKit筛查污染（多数序列来源于脊索动物门，污染极低），BUSCO（v6.1.0，eukaryote odb10数据集）评估完整度为84%。最终参考基因组大小1.37 Gb，注释11,404个独特基因，共28,763个contigs，最长contig超600 Kb，N50长度84 Kb，L50为4,777个contigs。该参考基因组使RNA-seq数据映射效率达到60%–70%。三、单细胞RNA测序（scRNA-seq） 对扩增条件（EM）和分化条件（DM）下的类器官分别进行scRNA-seq。类器官经含2.5 μM Rho-激酶抑制剂的冷TrypLE于37°C消化1分钟获得单细胞，分化类器官直接从Transwell上消化收集以最小化细胞死亡。单细胞悬液经ADF洗涤两次后，按照10X 3'测序标准流程，在GEM-X机器上进行on-chip multiplexing文库制备，Illumina Novaseq6000测序。原始数据用Cellranger（v9.0.0）比对至自建参考基因组。下游分析在R中使用Seurat完成：无监督聚类得到11个Seurat簇，基于已知标记基因注释细胞身份；对未知簇进行差异表达分析以鉴定标记基因。为跨物种比较，将球蟒基因按其最近人类同源基因注释后，投影至已发表注释的人类气道单细胞数据集（Madissoon et al.），该数据集经子集筛选仅保留上皮细胞单细胞数据。此外，还将球蟒数据与11种非模式动物的单细胞图谱整合分析。四、Bulk RNA测序与差异表达分析 对速冻球蟒原代气道组织、BPNV感染的差异化类器官（两个重复）和未感染对照差异化类器官（两个重复）进行bulk RNA-seq。RNA用Nucleospin RNA试剂盒（BIOKÉ）提取，类器官单层经刮取Transwell插入物并吹打裂解液收集，原代组织速冻于TRIzol中，-80°C保存。组织经水浴快速解冻后匀浆处理。文库用TruSeq RNA-stranded polyA文库制备试剂盒构建，Illumina NextSeq 2000双端测序（2×300 bp）。读段用STAR（v2.7.5c）比对至自定义参考基因组，用DESeq2（v1.46.0）进行差异表达分析，显著性阈值为p调整值<0.05且basemean≥50。GO（Gene Ontology）富集分析使用R包clusterProfiler，以人类GO数据库为参照进行生物学通路分析。五、病毒感染与定量检测 分化后类器官单层（或扩增条件下类器官）经5000病毒颗粒（200 μL ADF悬浮）接种BPNV（由美国科罗拉多州立大学Mark Stenglein博士惠赠）或高致病性禽流感（HPAI）H5N1病毒（A/Indonesia/5/2005）。32°C孵育4小时后移除病毒稀释液，ADF洗涤三次。抗病毒药物瑞德西韦（Remdesivir）和利巴韦林（Ribavirin）在接种时同时加入上室，随后与病毒 inoculum 一并移除并洗涤。病毒定量采用qRT-PCR：在4、24、48和72小时采样，分化类器官从上室加入并回收200 μL ADF（29°C孵育20分钟），扩增条件类器官直接采样200 μL ADF并补加新鲜培养基。总RNA经MagnaPure LC裂解液裂解、Agencourt AMPure XP磁珠纯化，BPNV RNA经SuperScript™ IV逆转录为cDNA，SYBR GREEN PCR Mastermix在7500 Real Time PCR Cycler上定量，以滴定病毒 stock 构建的标准曲线进行绝对定量。技术科普：气-液界面（ALI）分化 ALI是气道上皮类器官分化培养的关键技术。其原理是将细胞接种于多孔Transwell膜上，待形成汇合单层后，仅在下室（basolateral侧）提供培养基，上室（apical侧）暴露于空气。这种培养方式模拟了体内气道上皮的生理环境——基底侧接触组织液、顶端面向气道腔，从而诱导细胞极化和分化，形成具有纤毛、分泌功能等特征的假复层上皮。ALI分化是评估气道上皮生理功能和病毒感染响应的金标准体外方法。主要研究结果一、球蟒气道类器官的建系与表征 研究问题：能否从球蟒气道组织建立可长期扩增、可分化的类器官模型？ 研究思路与方法：研究团队取球蟒右肺血管化区域组织，经胶原酶消化后直接接种于BME，在含Noggin、R-spondin和FGF-7的扩增培养基中培养。初始类器官约3周后形成，可稳定传代超过40代。类器官在扩增过程中呈致密球体，逐渐获得不规则形态并形成分支结构。分化时，类器官经消化为单细胞后接种于Transwell，汇合后转为ALI分化培养基培养16天。 结果分析与阐述：扩增培养基（EM）中的2D类器官细胞保持扁平形态，而ALI分化（DM）后形成更紧密、更明显的假复层上皮。免疫荧光和免疫组化染色证实，分化类器官表达了纤毛细胞标志物乙酰化α-微管蛋白（acetylated α-tubulin）、杯状细胞标志物PAS和MUC5B、分泌细胞标志物SFTPA以及基底细胞标志物p63。这些结果综合表明，球蟒气道类器官不仅可 robust 扩增，分化后还能形成包含上呼吸道上皮特征性细胞类型的假复层上皮。图1（Establishment of P. regius organoids）直观展示了从组织取材、类器官形成、长期扩增到ALI分化的完整流程，以及形态学和标志物染色结果。 总结与结论：球蟒气道类器官成功建系，具备长期扩增能力和分化潜能，分化后重现了上呼吸道上皮的关键细胞类型和组织结构特征。二、球蟒参考基因组的de novo组装 研究问题：如何克服球蟒缺乏注释基因组的障碍，以支持类器官的分子表征？ 研究思路与方法：团队采用Illumina短读长+Oxford Nanopore长读长混合测序策略，利用WENGAN（v0.2）进行de novo基因组组装，并用BRAKER3进行转录本定位和BlastP功能注释。 结果分析与阐述：组装得到的球蟒参考基因组大小为1.37 Gb，成功注释11,404个独特基因。BlobToolKit筛查显示绝大多数序列来源于脊索动物门，污染极低；BUSCO（eukaryote odb10）评估组装完整度为84%。组装共28,763个contigs，最长contig超600 Kb，N50为84 Kb。利用该参考基因组，bulk和single-cell RNA-seq数据的映射率均达到60%–70%。这一自建参考基因组为后续所有转录组分析奠定了不可或缺的基础。 总结与结论：研究团队成功构建了球蟒参考基因组，填补了该物种基因组资源的空白，使后续的bulk RNA-seq和scRNA-seq分析成为可能。三、球蟒气道类器官的单细胞转录组学表征 研究问题：球蟒气道类器官包含哪些细胞类型？其分子特征如何？ 研究思路与方法：对EM和DM条件下的类器官进行10X Genomics单细胞RNA测序，Seurat无监督聚类注释细胞类型，并将数据投影至人类气道单细胞图谱和11种非模式动物单细胞图谱进行跨物种比较。 结果分析与阐述：无监督聚类揭示了11个不同的气道细胞群体。EM类器官主要由细胞周期活跃细胞（cycling cells）以及少量早期和晚期纤毛细胞组成，并包含一个以乳酸脱氢酶A（LDHA）高表达为特征的细胞群体，该群体在分化后消失。DM类器官则主要由更成熟的细胞类型构成，包括：内分泌细胞（CHGA+）、离子细胞（FOXI1+）、丛状细胞（AVIL+）、黏液产生杯状细胞（MUC5AC+）、表面活性蛋白A产生分泌细胞（SFTPA+）、早期（FOXJ1MID）和晚期（FOXJ1High）纤毛细胞，以及分化后出现的基底细胞（WNT4+、KRT5+）。此外，还有一个以酒精氧化还原酶HSD17B6高表达为特征的少量细胞群体，功能意义尚不明确。 跨物种整合分析显示，球蟒的cycling cells、基底细胞、纤毛细胞、离子细胞和杯状细胞分别聚类于其人类对应细胞类型附近。SFTPA+分泌细胞未直接与人分泌club细胞聚类，可能代表分泌谱系的不成熟阶段。LDHA+细胞与cycling、基底和分泌细胞重叠，提示其可能是气道上皮分化过程中的中间过渡群体。与11种非模式动物图谱整合后，球蟒细胞远离AT1和AT2细胞聚类，表明该类器官不代表faveolae（蛇类肺泡同源结构），而分泌细胞和纤毛细胞与各物种对应细胞类型聚类。图2（P. regius airway organoids contain diverse cell types）展示了UMAP聚类、各细胞类型占比、标记基因表达谱及跨物种投影结果。 总结与结论：球蟒气道类器官包含多样化的气道上皮细胞类型，其分子特征与人类气道上皮细胞具有可比性，为爬行动物气道上皮的细胞多样性提供了首个分子层面的图谱。四、BPNV在类器官中的复制与上皮免疫应答 研究问题：球蟒气道类器官能否支持BPNV复制？感染后会引发何种上皮免疫应答？ 研究思路与方法：用BPNV感染分化后类器官单层，dsRNA免疫荧光检测病毒感染，qPCR定量病毒基因组水平，bulk RNA-seq分析差异表达基因和GO富集通路。 结果分析与阐述：BPNV能够有效在EM和DM类器官中复制。早期时间点EM类器官病毒基因组水平高于DM，后期时间点两者水平相近。作为对照，禽适应性流感H5N1在类器官中未能有效复制。感染后48小时可观察到细胞病变效应（CPE），但上皮单层保持存活。Bulk RNA-seq显示，感染后上调倍数最高的基因包括干扰素刺激基因RSAD2、ISG15、IFIT5和HERC5，以及促炎基因CCL4、CXCL19和IL17C。GO富集分析（基于人同源基因映射）揭示了抗病毒应答、干扰素信号、先天免疫和模式识别受体信号等相关通路。进一步分析宿主防御通路相关基因显示：多种干扰素刺激基因在BPNV感染后上调，提示存在活跃的干扰素信号或类似抗病毒应答；上皮细胞中多种细胞因子（白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子和转化生长因子β家族成员）及细胞因子受体表达增加；多种模式识别受体（PRRs）在感染后表达上调，但TLR3（双链RNA受体）下调；上皮表现出活跃的非特异性化学免疫应答，表现为cathelicidin抗菌肽（CAMP）和ROS产生基因（NOX1、NOXA1、NOXO1、RAC1/2、DUOXA2）及ROS相关基因（NCF1、MPO）的诱导；多个黏蛋白基因（包括呼吸道相关的MUC5AC）上调，反映了BPNV感染体内标志症状——黏液过度产生——在类器官中的重现。图3（BPNV replicates in P. regius airway organoids and elicits an epithelial immune response）展示了dsRNA染色、病毒定量、差异表达火山图、GO富集分析和宿主防御通路热图。 总结与结论：球蟒气道类器官支持BPNV的有效复制，并能启动以干扰素刺激基因、细胞因子和化学防御基因为核心的 robust 上皮抗病毒先天免疫应答，是研究蛇 serpentovirus 感染的生理相关体外模型。五、类器官作为抗病毒药物测试平台的概念验证 研究问题：球蟒气道类器官能否用于抗病毒药物的药效评估？ 研究思路与方法：在BPNV感染同时，于类器官上室加入不同浓度（500 nM、5 μM、50 μM）的瑞德西韦（Remdesivir）或利巴韦林（Ribavirin），感染后4、24、48小时qPCR定量BPNV基因组水平；免疫荧光评估药物对细胞形态的影响；跨上皮电阻（TEER）测量评估单层完整性。 结果分析与阐述：瑞德西韦（而非利巴韦林）能够在BPNV感染期间降低类器官中的病毒载量，且在5 μM和50 μM浓度下均有效。最高剂量抗病毒药物不影响细胞整体形态，也不损害单层完整性（即使在原实验时长之后的时间点）。TEER测量显示，50 μM瑞德西韦或利巴韦林处理下，跨上皮电阻与未处理对照组相比无显著差异，表明药物在测试浓度下对上皮屏障功能无不良影响。图4（P. regius organoids as a BPNV drug testing platform）展示了病毒载量定量、形态学染色和TEER测量结果。 总结与结论：球蟒气道类器官可作为概念验证的抗病毒药物测试平台。瑞德西韦能有效降低BPNV载量，而利巴韦林无效，这一结果与既往钻石蟒心脏细胞研究部分一致但敏感性存在差异，可能与类器官顶端黏液层阻碍药物渗透有关。该类器官模型为在更生理相关的靶组织中进行抗病毒药效评估提供了新工具。 图 1 球蟒气道类器官的建系。（A）球蟒气道类器官建系流程示意图。（B）第0天接种的组织碎片（左）、初始类器官形成（中）、培养体系建立后传代一次10天的类器官（右）的明场代表性图像。单次独立实验的代表性图像。比例尺=500μm。（C）若每2周以1:3比例传代，类器官的预期累积扩增倍数。（D）扩增条件下不同类器官形态的DAPI和F-actin免疫荧光染色。3次独立实验的代表性图像。（E）分化流程示意图。（F）汇合时扩增培养基（EM）中2D类器官和分化后（DM）2D类器官的DAPI和F-actin免疫荧光染色。2次独立实验的代表性图像。（G）汇合时EM类器官和DM类器官的组织学表征（H&E、PAS、P63、乙酰化α-微管蛋白、MUC5B、SFTPA染色）。3次独立实验的代表性图像。比例尺=20μm。图1的A和E面板使用BioRender创建（van Es, J., 2026,https://BioRender.com/r54n211）。 图 2 球蟒气道类器官包含多样化的细胞类型。（A）球蟒气道类器官鉴定细胞类型的UMAP（均匀流形近似与投影）图。（B）扩增条件（EM）和分化后（DM）类器官中各细胞类型群体的相对占比。（C）显示各细胞簇标记基因平均表达的点图。（D）显示各细胞簇标记基因表达的UMAP图。（E）按细胞类型注释的原代人类数据集UMAP图。（F）将各球蟒细胞类型（彩色）投影至原代人类数据集（灰色）的UMAP图。 图 3 球蟒尼多病毒（BPNV）在球蟒气道类器官中复制并引发上皮免疫应答。（A）感染后72小时，感染扩增（EM）或分化（DM）2D类器官中dsRNA染色。2次独立实验的代表性图像。比例尺=20μm。（B）扩增或分化2D类器官感染后BPNV基因组水平的qPCR定量。数据以均值±SD表示，每个条件n=3个技术重复。TCID50eq=50%组织培养感染剂量当量。（C）分化2D类器官感染后差异表达基因中上调（前15）和下调（前15）的火山图。（D）分化2D类器官感染后2logFC上调基因的富集GO术语。（E）突出关键宿主防御通路中上调基因的热图。仅显示球蟒基因组中已注释的基因；注释缺失的通路相关基因未显示。 图 4 球蟒类器官作为BPNV药物测试平台。（A）感染时以不同浓度抗病毒药物处理的2D分化类器官中BPNV基因组水平的qPCR定量。数据以均值±SD表示，每个处理n=2个技术重复。TCID50eq=50%组织培养感染剂量当量。（B）未处理2D类器官和经最高剂量瑞德西韦或利巴韦林处理120小时的2D类器官DAPI和F-actin免疫荧光染色。2次独立实验的代表性图像。（C）未处理2D类器官和经最高剂量瑞德西韦或利巴韦林在不同时间点处理的2D类器官跨上皮电阻（TEER）。数据以均值±SD表示，每个条件n=4个技术重复。特色与创新之处 首个爬行动物气道类器官模型：本研究建立了迄今首个球蟒（乃至爬行动物）气道类器官模型，填补了爬行动物病毒学研究中长期缺乏适用体外模型的空白。此前类器官技术在蝙蝠、禽类、牛、猪、骆驼科等病毒储库动物中已有应用，但爬行动物领域一直未见报道。该模型的建立拓展了类器官技术的应用边界，为爬行动物这一长期被忽视的病毒储库群体提供了研究工具。 自建球蟒参考基因组支撑分子表征：由于球蟒缺乏已注释参考基因组，且验证抗体和试剂匮乏，研究团队通过Illumina短读长+Nanopore长读长混合组装策略de novo构建了球蟒参考基因组（1.37 Gb，11,404个注释基因，BUSCO完整度84%），并在此基础上利用BRAKER3进行转录本定位和BlastP功能注释。该基因组资源不仅支撑了本研究的所有转录组分析，也为未来球蟒及蛇类基因组学研究提供了公共数据基础（已上传NCBI Bioproject PRJNA1322132）。 单细胞分辨率揭示爬行动物气道上皮细胞多样性：通过10X Genomics单细胞RNA测序，研究团队首次在分子层面绘制了球蟒气道上皮的细胞类型图谱，鉴定出11个细胞群体，包括cycling cells、基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞、分泌细胞、离子细胞、内分泌细胞、丛状细胞以及LDHA+和HSD17B6+两个功能待阐明的群体。通过跨物种整合分析（投影至人类气道单细胞图谱和11种非模式动物图谱），验证了球蟒细胞类型与人类对应类型的可比性，并推断SFTPA+分泌细胞可能处于不成熟阶段、LDHA+细胞可能为分化中间过渡群体。 首个蛇 serpentovirus 感染的生理相关体外模型：类器官支持BPNV有效复制并启动以干扰素刺激基因（RSAD2、ISG15、IFIT5、HERC5）、促炎细胞因子（CCL4、CXCL19、IL17C）和化学防御基因（CAMP、ROS产生基因、黏蛋白基因MUC5AC）为核心的 robust 上皮先天免疫应答。此前BPNV感染研究主要在 organism 水平描述病理，本研究首次在靶组织来源的原代上皮细胞中分子表征了感染应答。 概念验证级抗病毒药物测试平台：以瑞德西韦和利巴韦林为候选药物，证明了类器官可用于抗病毒药效评估——瑞德西韦（5 μM和50 μM）有效降低BPNV载量，利巴韦林无效。虽然既往钻石蟒心脏细胞研究报道两者均有抗病毒活性，但本研究发现类器官中瑞德西韦所需浓度更高，可能与顶端黏液层阻碍药物渗透有关，提示该类器官更接近体内生理环境。不足之处与改进建议 类器官来源于单一近孵化胚胎个体，缺乏个体间变异和发育阶段代表性。研究团队在讨论中明确指出，类器官建系自一枚近孵化胚胎，而细胞内在特性和细胞类型组成已知随年龄变化。因此，该模型可能反映的是球蟒气道生物学的幼年阶段，与成体气道生理可能存在差异。建议：未来应从多个不同年龄阶段（幼体、亚成体、成体）的个体分别建系，系统比较细胞组成和感染响应差异，并纳入个体间生物学重复以提高统计效力。 球蟒基因组注释不完整，限制了抗病毒信号通路的精细解析。由于基因组缺乏部分关键信号通路基因（如I型和II型干扰素）的注释，无法全面评估经典的抗病毒信号通路（如干扰素信号级联），导致对上皮抗病毒应答的分子机制理解不完整。建议：随着基因组注释工具的迭代（如BRAKER3的更新）和更长读长测序技术的发展，应持续完善球蟒基因组注释，特别是补注释免疫相关基因家族，以便更精确地解析爬行动物特有的抗病毒免疫机制。 跨物种GO分析依赖人类同源基因映射，存在物种特异性偏差。GO富集分析和通路热图均基于人类GO数据库和人类同源基因映射，而爬行动物与哺乳动物在免疫基因家族组成和调控网络上可能存在显著差异，这可能导致部分通路被遗漏或误判。建议：未来可结合球蟒基因组注释的完善，构建蛇类特异的GO注释和通路数据库，或采用跨物种保守性分析策略减少映射偏差。 抗病毒药物测试仅纳入两种广谱抗病毒药，且为概念验证性质。实验仅测试了瑞德西韦和利巴韦林两种药物，且每个浓度仅n=2技术重复，样本量有限。此外，药物渗透受黏液层影响的假设尚需直接实验验证。建议：扩大候选药物筛选范围（包括针对nidovirus的特异性抑制剂），增加生物学重复数量，并通过荧光标记药物示踪或黏液层去除实验直接验证药物渗透假说。 类器官来源于肺血管化区域，无法区分上呼吸道与ediculae上皮的贡献。单细胞数据显示类器官不表达AT1/AT2标记基因，提示其代表上呼吸道和/或ediculae而非faveolae，但由于体内这两个区域的分子表征有限，无法明确区分。建议：结合体内原位单细胞转录组学数据，明确类器官细胞类型与体内解剖区域的对应关系；或尝试从特定气道区域（如气管、bronchus、ediculae）分别建系以实现区域特异性建模。价值与意义总结 这项研究建立了首个球蟒气道类器官模型，通过de novo组装参考基因组和单细胞转录组学表征，揭示了类器官包含多样化的气道上皮细胞类型。该类器官支持BPNV有效复制并启动 robust 上皮抗病毒应答，可作为生理相关的体外平台用于爬行动物病毒学研究、宿主—病原体互作解析和抗病毒药物筛选，对爬行动物宠物医疗、蛇类生态学和人畜共患病研究具有积极意义。  /  科学技术普及新媒体矩阵  肠道类器官（Organoid Bulletin） 本公众号由AI智能体ORGANOID AGENT驱动赋能，您可以直接与公众号对话，获得最专业的类器官知识指导与信息。      我们致力于发布本领域优质资讯与评述，推送国内外类器官及干细胞相关领域最新研究论文、综述与技术进展。发布科普文章、专家观点评论、行业分析、招聘信息和会议通知。您可以在微信、小红书、百家号、企鹅号、今日头条、知乎和Bilibili关注我们。秉承类器官创新计划组织愿景，我们积极传播科学知识，促进同行交流，推动产业发展，服务国家战略，积极为类器官与干细胞技术发展提供助力。欢迎各位关注、分享、转载、投稿！原创内容欢迎转载，直接私信即可，完全免费授权。内容多来自学术论文或网络公开资源，如有侵权还请联系删除。 编辑部联系邮箱：zj@organoid.ac.cn 关注更多微信公众号 2026年度合作品牌 类器官科学与技术创新联盟（Organoid Science and Technology Innovation Alliance，简称 OSTIA），是由中国科学院、北京大学、清华大学、浙江大学、复旦大学等科研院所和高校相关研究团队共同发起的民间公益性学术交流与技术合作平台。  联盟成员主要包括类器官领域的科研人员、企业管理者、技术负责人及高级研究者，致力于推动类器官相关研究、技术开发与产业协同发展。联盟坚持开放、共享、协作、公益的原则，围绕类器官研究与应用中的关键问题，持续促进资源互通、经验交流、方法优化与跨界合作。      加入 OSTIA 后，成员可在较低合作成本下参与类器官资源、研究经验和技术方法的交流共享，并依托肠道类器官及 OSTIA 相关学术传播平台，获得来自行业内不同方向的专业支持与实践参考。联盟鼓励围绕类器官标准化制备、质量评价、检测分析、模型构建及应用转化等关键环节开展协作交流，助力研究工作的规范化、高效化推进。为加强成员之间的互动与协同，联盟已建立“技术研发”“开源公益”“产品服务”等多个专题交流社群，方便成员围绕类器官培养、品系互换、干细胞研究工具、技术优化及实际应用等问题开展及时讨论，促进资源对接与经验共享，并为技术难点提供协同支持。目前，OSTIA 已汇聚来自全国多家科研机构、高校和企业的众多注册成员。联盟持续推动类器官领域的开放合作与生态建设，希望通过跨机构、跨学科、跨产业联动，进一步促进类器官技术创新与行业发展。      此外，OSTIA 还发起了 AI 知识问答、开源类器官分析工具等公益项目，为相关研究提供辅助支持，努力构建开放、共享、包容的类器官创新生态。面向未来，联盟将继续坚持前沿探索与协同创新，积极推动更优技术方案与更高标准体系的形成，为类器官科学研究与产业发展持续贡献力量。 官方网站：www.organoid.ac.cn 联系邮箱：info@isco.ac.cn   组织愿景 1. 共建开放协作的类器官创新生态 搭建面向科研机构、医疗机构与企业的开放共享平台，促进资源互通、技术协作与经验交流，持续降低类器官研究与应用门槛，推动形成开放、包容、共建共享的领域生态。 2. 推动类器官标准与规范建设 推动类器官培养、检测、评价、存储及应用等关键环节的标准化建设，促进相关团体规范、行业共识与技术准则的形成和落地，提升类器官研究与应用的规范性、可重复性和可推广性。 3. 打造具有广泛影响力的学术与资源枢纽 推动建设高质量、可持续连接的类器官资源库、知识库与交流平台，汇聚前沿学术成果、关键技术路线和产业实践经验，提升我国类器官领域的学术影响力与资源整合能力。 4. 驱动多学科融合与关键技术创新 促进类器官与生物材料、智能装备、微流控、人工智能及高端制造等工程技术深度融合，突破规模化制备、功能重建、质量控制与场景适配等关键瓶颈，提升类器官技术创新能力与工程化水平。 5. 强化核心技术自主能力与产业支撑能力 推动国产试剂、仪器设备、分析工具和技术体系的研发与应用，增强类器官研发链条的自主能力，夯实产业基础，提升关键技术领域的支撑能力与发展韧性。 6. 加速类器官技术应用转化与场景落地 面向精准医学、药物研发、毒理评价、再生医学和个体化诊疗等方向，推动类器官技术从实验室研究走向临床前研究与产业应用，促进创新成果转化，提升类器官技术的实际应用价值与社会效益。 加入交流       本联盟面向类器官全领域同行提供交流平台和会员身份认证服务，可以加入“技术研发”、“开源公益”、“产品服务”和“专属领域”等多个类型的交流群，涵盖科学研究技术、开源工具和公益、销售产品与服务、细分领域如类器官芯片、生物材料等专属群等平台，参与讨论。高级研究员或独立PI可以申请成为荣誉发起人，成为类器官创新计划贡献者与受益者。本联盟目前已有10000+会员，期待您加入讨论分享，让我们共同促进类器官产业发展。      现在，您只需添加发起人微信，备注自己的真实姓名与单位和必要信息，例如“张三-中国科学院大学”，说明申请加入类器官创新计划，提供有效身份证件如学生证、身份证、工作证或其他任何可以证明身份的真实性的证件，即可加入对应社群。而这一切都是公益的，免费的，不收取任何费用。 扫描添加微信以进群交流 加入知识星球 面向专业科研需求和企业级资源共享，现在扫描二维码加入“肠道类器官”知识星球，就能获得来自顶级研究机构分享的类器官培养基配方和方案，类器官创新计划组织发布的官方标准指南、AI类器官分析工具等更加专业的资料。与1000+位行业精英共同交换类器官技术资料和资源，向行业专家提问，免费参与国内领先的类器官品牌产品内测试用，获得类器官工程师认证等。全行业最专业的类器官知识社区和公益平台，让您的类器官研究少走弯路！ #为什么要加入知识星球？ 1.最新最专业的培养基配方和技术资料即时获取。 2.标准类器官培养方案和技术标准材料发布唯一渠道。 3.最强AI智能体和类器官分析软件和工具解析和下载。 4.类器官领域TOP专家一对一沟通，权威资料触手可及。 5.类器官企业新产品评测和免费试用特权通道。 6.定期发放免费会议入场券和资料，提供演讲机会。  更多福利，请移步知识星球内部了解。 扫二维码｜获取资源 标准类器官培养基配方 高级类器官AI分析软件 高水平类器官文章资料 ...... 注册正式会员 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为什么越来越多实验室开始重新审视自己的肿瘤模型？ 很多抗肿瘤药物都有一个相似的研发轨迹。 在实验室里，它们能够稳定抑制肿瘤细胞增殖；动物实验中，也能观察到一定程度的肿瘤缩小；然而进入临床后，却常常因为疗效不足而终止开发。 过去，人们往往将失败归因于药物本身——剂量不够、药代动力学不理想、靶点选择错误，或患者存在耐药机制。但近年来，越来越多研究开始将目光转向另一个长期被忽视的问题： 我们用于评价药物的模型，是否真正代表了患者体内的肿瘤？ 事实上，任何实验模型都不是肿瘤本身，而只是肿瘤某一特征的"投影"。 传统肿瘤细胞系强调的是稳定性、可重复性和高通量；而患者来源肿瘤类器官（Patient-Derived Organoids，PDO）更强调组织真实性、遗传背景和临床相关性。 因此，"细胞系和类器官谁更先进"并不是一个科学问题。 真正的问题应该是： 你的研究，到底希望回答什么问题？ 如果研究目标是解析某条信号通路，那么一个遗传背景清晰、操作成熟的细胞系往往已经足够；如果希望预测患者是否真正对一种药物产生反应，那么模型是否仍然保留患者肿瘤的生物学特征，就显得至关重要。 近年来，无论是精准医疗、药物研发，还是耐药机制研究，患者来源肿瘤类器官迅速发展，并不是因为细胞系失去了价值，而是因为科研人员越来越意识到： 模型的真实性，决定了研究结果距离临床还有多远。 真正优秀的研究，从来不是选择最复杂的模型，而是选择最适合回答科学问题的模型。 一、为什么越来越多药物在细胞系中成功，却在临床失败？ 对于肿瘤药物研发而言，有一个数字经常被提及： 绝大多数进入临床前研究阶段的候选抗肿瘤药物，最终都无法成功上市。 失败的原因当然很多，包括药代动力学、安全性、剂量窗口、毒副作用以及患者个体差异等。但如果回顾大量失败案例，会发现一个共同特点： 很多药物在传统细胞系中表现优异，却无法在真实患者身上复制同样的疗效。 原因并不是细胞系"错误"，而是细胞系回答的问题，与临床需要回答的问题并不完全一致。 在二维培养条件下，每一个细胞几乎都处于相同的培养环境： 相同的氧浓度； 相同的营养供应； 相同的药物暴露浓度； 相同的生长空间； 相似的增殖状态。 这种高度均一化的实验体系，非常适合比较不同处理条件之间的差异，因此几十年来一直是分子生物学和肿瘤药理学研究的基础模型。 然而，真实肿瘤恰恰相反。 同一个肿瘤组织内部，不同区域可能存在完全不同的微环境： 靠近血管区域，氧气和营养供应充足； 深部区域则长期处于低氧、低营养状态； 外层细胞持续增殖，而中心细胞可能进入静息甚至坏死； 不同克隆之间不断竞争，同时又与成纤维细胞、免疫细胞、血管内皮细胞以及细胞外基质持续相互作用。 换句话说，患者体内的肿瘤，并不是一群完全相同的癌细胞，而是一个高度复杂的生态系统（Tumor Ecosystem）。 药物最终面对的，也不是单一细胞，而是这个复杂系统。 因此，当一种药物在二维培养中表现出良好的抑制作用时，它实际上验证的是： 药物是否能够杀死一群处于理想培养条件下、持续快速增殖的癌细胞。 而临床真正关心的问题却是： 药物是否能够穿透肿瘤组织、克服复杂微环境、覆盖不同克隆，并最终抑制整个肿瘤的发展。 这两者之间，并不能简单画等号。 这也是近年来越来越多药物研发团队，在完成传统细胞系筛选后，会进一步采用患者来源肿瘤类器官、患者来源异种移植模型（PDX）甚至器官芯片等更复杂体系进行验证的重要原因。 因为他们越来越清楚： 真正限制药物成功率的，并不仅仅是药物本身，而是实验模型距离真实患者还有多远。 二、肿瘤细胞系真正改变的，不只是"二维培养" 很多人在比较细胞系与类器官时，喜欢将差异归结为一句简单的话： 二维培养不如三维培养。 事实上，这种理解过于简单。 二维，只是培养形式；真正发生变化的，是细胞长期暴露于人工培养环境后所经历的一系列适应性演化。 绝大多数经典肿瘤细胞系，如 HeLa、MCF-7、A549、HCT116 等，都已经在体外培养多年，部分甚至经历了数百代传代。 在长期培养过程中，培养皿本身就是一种持续存在的"选择压力"。 能够快速适应体外环境的细胞不断扩增，而那些依赖组织微环境、生长速度较慢或具有特殊分化状态的细胞，则逐渐减少甚至消失。 最终留下来的，并不是患者原始肿瘤的完整组成，而是最适合实验室培养条件的一部分细胞。 因此，细胞系发生变化，并不是因为"培养时间长"这一因素本身，而是因为培养环境始终在不断筛选细胞。 这一点，与自然选择非常相似。 实验室提供的是一个极其稳定、且与人体组织截然不同的环境： 持续约20%的氧浓度； 高浓度葡萄糖和谷氨酰胺； 恒定的营养供应； 缺乏真实组织中的空间限制； 几乎不存在细胞外基质梯度和机械应力变化。 对于细胞而言，这样的环境意味着： 只有最适应这种条件的细胞才能长期存活。 随着不断传代，细胞群体会逐渐趋于均一，原本存在于患者肿瘤中的低频亚克隆、缓慢增殖细胞以及部分耐药细胞亚群，都可能逐渐减少。 因此，同一种细胞系在不同实验室长期培养后，其基因表达谱、药物敏感性甚至部分驱动突变的比例，都可能出现一定程度的差异。 这也是为什么国际主流细胞资源库一直强调： 使用STR（Short Tandem Repeat）进行细胞身份鉴定； 尽量采用低代次细胞开展关键实验； 建立Master Cell Bank（MCB）和Working Cell Bank（WCB）管理体系； 定期从冻存库复苏，而不是无限制连续传代。 这些规范的目的，并不是让细胞"更健康"，而是尽可能减缓长期培养带来的生物学漂移（Biological Drift）。 三、二维培养真正改变的，不只是空间，而是细胞的整个生存方式 如果说长期培养改变的是细胞群体，那么二维培养本身，则改变了单个细胞对外界环境的感知方式。 很多研究人员容易忽略一个事实： 细胞不仅能够感知化学信号，也能够感知力学信号。 在人体内，不同组织具有完全不同的力学特性。 例如： 脑组织非常柔软，弹性模量通常只有几百帕； 肝脏、肺组织约为数百至数千帕； 正常乳腺组织约为1～2 kPa，而肿瘤组织由于纤维化可明显升高； 骨组织则远高于软组织。 这些机械特性并不是简单的物理背景，而会持续影响细胞行为，包括： 黏附方式； 极性建立； 迁移能力； 分化状态； 干性维持； 基因表达程序。 然而，实验室最常见的聚苯乙烯培养皿，其刚度通常达到GPa数量级，与人体软组织相比高出数百万倍。 对于细胞而言，这意味着它始终生活在一个"异常坚硬"的环境中。 这种机械刺激能够通过整合素（Integrins）、黏着斑激酶（FAK）、Hippo-YAP/TAZ等机械敏感信号通路，持续影响细胞转录程序、细胞骨架重塑及增殖行为。 换句话说，即使遗传背景完全相同，仅仅改变培养基底的物理性质，细胞的行为就可能发生明显变化。 这也是为什么近年来越来越多研究开始关注： 不仅要重建肿瘤的三维结构，更要重建肿瘤所处的物理微环境。 患者来源肿瘤类器官之所以能够形成更加接近体内的组织样结构，并不仅仅因为它们是"三维球体"，更重要的是，细胞能够在细胞外基质中重新建立极性、形成细胞间连接，并持续接受来自周围微环境的机械和生化信号。 而这些因素，正是传统二维培养体系难以完整模拟的。 四、患者来源肿瘤类器官（PDO），真正保留了什么？ 如果说传统肿瘤细胞系代表的是一种经过长期体外驯化后的"标准化模型"，那么患者来源肿瘤类器官（Patient-Derived Organoids，PDO）更像是把患者肿瘤"搬进了培养皿"。 这里需要强调一点。 很多文章都会写： PDO能够保持患者肿瘤的所有特征。 这种说法并不严谨。 准确地说，PDO能够在一定程度上保留患者肿瘤的重要生物学特征，但它仍然是一个体外模型，并不能完全等同于人体肿瘤。 真正理解PDO的价值，不是神化它，而是理解它究竟比细胞系多保留了哪些信息。 1. 保留患者原始遗传背景，而不是重新"驯化"一批细胞 PDO最大的优势，是直接来源于患者的新鲜组织。 无论是手术切除样本，还是穿刺活检组织，只要经过合理消化和培养，就有机会建立对应患者的类器官。 由于没有经历长期体外适应，大多数PDO在低传代阶段仍能够较好保留患者原发肿瘤的重要分子特征，包括： 驱动基因突变（Driver Mutations） 拷贝数变异（CNV） 染色体异常 转录组特征 部分表观遗传状态 多项研究比较了患者原发肿瘤与对应PDO的全外显子测序（WES）、RNA测序及病理学结果，发现二者具有较高的一致性，尤其是在关键驱动突变和组织学特征方面，这也是PDO能够用于药物敏感性研究的重要基础。 需要注意的是，这种一致性主要建立在低代次培养基础上。 随着持续传代，PDO同样可能发生克隆演化和遗传漂移，因此国际上普遍建议：关键功能实验尽量使用低代次（通常P3～P10以内，具体依癌种和培养体系而定）的PDO完成。 2. 保留异质性，比保留"一个突变"更重要 很多人认为： 只要KRAS、TP53、EGFR这些突变还在，模型就是真实的。 其实并不是。 真正影响患者疗效的，往往不是主导克隆，而是那些数量并不占优势，却决定疾病进展的细胞亚群。 例如： 一个肺癌患者可能同时存在： EGFR敏感克隆； EGFR耐药克隆； EMT状态细胞； 癌症干细胞样群体； 高增殖细胞； 静息细胞。 化疗之后，真正存活下来的，往往不是数量最多的细胞，而是原本比例很低的耐药亚群。 这就是肿瘤异质性的临床意义。 长期培养的细胞系，由于持续受到培养环境的选择压力，细胞组成越来越趋于一致。 而PDO在建立初期，仍能够较好保留不同克隆之间的比例关系，因此更适合研究： 肿瘤克隆演化（Clonal Evolution） 耐药形成过程 肿瘤复发机制 药物选择压力下的克隆竞争 近年来，越来越多单细胞测序研究也证实，PDO能够在一定程度上保留患者肿瘤细胞群体的转录异质性，这也是其区别于传统细胞系的重要优势之一。 3. 保留组织结构，而不仅仅是"长成一个球" 很多初学者容易把类器官理解成： "三维培养出来的细胞球。" 实际上，并不是所有三维球体都是类器官。 真正的类器官，应当能够形成一定程度的组织样结构（Tissue Architecture）。 例如，上皮来源肿瘤类器官通常能够重新建立： 顶端—基底极性（Apical-Basal Polarity）； 细胞间紧密连接（Tight Junctions）； 黏附连接（Adherens Junctions）； E-cadherin介导的细胞黏附； 部分腔道结构（Lumen）。 这些结构不仅影响组织形态，更直接决定细胞行为。 例如： 极性的建立会影响受体分布； 细胞连接会影响药物进入； 腔道形成会改变营养运输方式； 空间位置还会影响细胞命运决定。 这些组织层面的信息，在二维培养中几乎全部丢失。 因此，类器官真正恢复的，并不是一个"立体形状"，而是一种更加接近组织水平的空间组织方式。 4. 重建干细胞龛（Stem Cell Niche），才是PDO能够长期培养的关键 很多研究人员第一次接触PDO都会提出一个问题： 为什么培养细胞系，只需要DMEM加10%胎牛血清（FBS）； 而培养类器官，却需要加入十几种生长因子？ 原因就在于： PDO并没有完全脱离对组织微环境的依赖。 在人体内，组织干细胞并不是孤立存在，而是生活在一个特殊的微环境中，称为干细胞龛（Stem Cell Niche）。 这个微环境持续向细胞提供各种生长和分化信号。 离开这些信号，细胞很快就会： 分化； 停止增殖； 或发生凋亡。 因此，类器官培养的本质，并不是简单提供营养，而是在体外尽可能重建这一微环境。 以消化道肿瘤类器官为例，培养体系通常包含多种关键调控因子： Wnt3a 维持干细胞特性，是肠道上皮更新的重要驱动力。 R-spondin-1（RSPO1） 增强Wnt信号，放大LGR5阳性干细胞的自我更新能力，因此常被称为Wnt信号的"放大器"。 Noggin 抑制BMP信号，避免干细胞过早进入分化程序。 EGF 促进细胞增殖，提高组织更新速度。 此外，根据不同癌种，还可能加入FGF、A83-01、Nicotinamide、Gastrin、PGE₂、SB202190等因子，以满足不同组织来源类器官的生长需求。 这也解释了为什么： 目前并不存在一种适用于所有肿瘤类器官的"万能培养基"。 不同器官、不同癌种，甚至不同患者，其培养体系都需要根据组织来源和生物学特征进行优化。 五、为什么很多药物到了PDO里，疗效突然下降？ 很多实验室第一次做PDO药敏实验时，都会遇到一种情况。 同一种药物： 在细胞系中，IC₅₀只有几十纳摩尔； 到了PDO中，却上升数倍，甚至十几倍。 很多人的第一反应是： 是不是培养失败了？ 其实，更多时候，不是药物变差了，而是模型变真实了。 第一层原因：药物面对的不再是"单层细胞" 二维培养中，每一个细胞几乎都直接暴露于培养液。 药物扩散距离极短。 因此： 所有细胞接受到的药物浓度基本一致。 而在类器官中，情况完全不同。 随着类器官不断增大，药物必须经历： 培养液 → 基质胶（ECM）→ 外层细胞 → 中间细胞 → 中心区域。 扩散路径明显增加。 不同位置细胞接受到的药物浓度开始出现梯度。 因此，即使培养液中的药物浓度完全相同，真正作用于类器官中心细胞的有效浓度，也可能明显降低。 这种现象，其实更接近实体瘤真实发生的情况。 因为人体肿瘤中的药物，同样需要穿过： 血管壁； 间质组织； 致密细胞外基质； 多层癌细胞。 最终才能到达肿瘤深部。 因此，PDO并不是让药物"变弱"了，而是增加了真实组织中的物理屏障。 第二层原因：形成了真实肿瘤中的氧和营养梯度 当类器官体积不断增大时，其内部开始逐渐形成微环境差异。 一般而言，当类器官直径达到约200～300 μm甚至更大时，由于氧气和营养主要依赖扩散供给，中心区域可能出现： 氧浓度下降； 葡萄糖供应减少； 乳酸积累； pH降低； 局部缺氧。 这种环境会诱导HIF-1α等缺氧应答通路激活，促进糖酵解代谢重编程，并使部分细胞进入低增殖甚至静息状态。 而很多经典化疗药物，例如针对DNA复制或细胞分裂的药物，本身就更倾向于杀伤快速增殖细胞。 当大量细胞进入低增殖状态后，药物敏感性自然下降。 因此，这种"耐药"很多时候并不是获得了新的耐药突变，而是微环境本身改变了细胞状态。 这一现象，也是传统二维培养体系难以模拟的重要生物学特征。 第三层原因：细胞开始"交流"，而不是各自生长 二维培养中的细胞，更多表现为独立个体。 而在类器官中，细胞之间重新建立了紧密的空间联系。 它们不仅通过黏附连接维持组织结构，还持续进行信息交换，包括： Wnt； Notch； EGF； TGF-β； Hippo； 炎症因子及旁分泌信号。 这些细胞间通讯会共同影响： 干性维持； 增殖速度； 分化方向； 对药物刺激的应答。 换句话说，在PDO中，药物面对的不再是一个个孤立细胞，而是一个能够彼此调节、共同响应外界刺激的小型组织。 这也是为什么越来越多研究认为，PDO提供的不仅是三维培养环境，更是一种更接近真实肿瘤组织生物学行为的实验平台。 六、类器官不是"万能模型"，这些技术陷阱比培养失败更值得关注 随着PDO越来越普及，很多实验室开始建立自己的类器官平台。 然而，一个现象也越来越明显： 真正影响实验质量的，很多时候不是建系，而是标准化。 如果说细胞系最大的优势是"标准"，那么PDO目前最大的挑战，就是如何建立真正可重复、可比较、可验证的标准体系。 对于刚开始开展类器官研究的实验室而言，下面几个问题，往往比培养成功与否更加重要。 1. Matrigel不是"培养基"，它本身就是实验变量 很多刚接触类器官的人都会把注意力放在培养基配方上，却忽略了另一个更重要的因素——细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）。 目前，大多数PDO仍然依赖Matrigel或BME（Basement Membrane Extract）进行培养。 Matrigel来源于小鼠EHS肉瘤，其主要成分包括： Laminin Collagen IV Entactin（Nidogen） Heparan sulfate proteoglycans 同时还含有不同水平的： TGF-β EGF IGF FGF PDGF VEGF 等多种生长因子。 也就是说，Matrigel并不是一种单纯的"支架"，它本身就是一个具有生物活性的复杂体系。 因此，不同批次之间可能存在： 生长速度不同； 出芽能力不同； 分化程度不同； 药物敏感性轻微变化。 对于基础培养来说，这种差异可能影响有限；但对于药敏实验、药效评价或多中心研究而言，即使轻微变化，也可能带来统计学偏差。 因此，目前国际上越来越多实验室开始采用： Growth Factor Reduced（GFR）Matrigel BME Type 2 定义明确的合成水凝胶（Synthetic Hydrogel） PEG（聚乙二醇）基水凝胶 可调控力学性能的人工ECM 目的并不是提高生长速度，而是降低批次差异，提高实验重复性。 对于未来临床级类器官培养而言，完全化学定义的人工基质，很可能会逐步替代来源复杂的天然基质。 2. 为什么同样做CTG，别人数据漂亮，你的数据总是偏低？ 这是很多实验室第一次开展PDO药敏实验都会遇到的问题。 他们仍然按照二维细胞的方法： 加入CellTiter-Glo（CTG）。 摇匀。 读板。 结果发现： ATP信号明显偏低。 重复性很差。 于是怀疑： 是不是药物杀伤太强？ 其实，很可能不是。 原因在于： 二维细胞和类器官的裂解难度完全不同。 二维培养时： 细胞只有一层。 裂解液几秒钟就能进入细胞。 而PDO需要依次穿透： 培养液 ↓ Matrigel ↓ 类器官外层 ↓ 中层细胞 ↓ 中心区域 裂解效率明显下降。 因此，目前针对三维培养体系，Promega推出了CellTiter-Glo® 3D（CTG 3D），其配方针对ECM和三维结构进行了优化。 即便如此，在实际实验中仍建议： 充分吹打混匀； 延长裂解孵育时间； 必要时增加振荡步骤； 保证所有样本采用完全一致的操作流程。 否则，检测到的ATP水平可能更多反映的是裂解效率，而不是细胞活力。 很多实验室在比较不同论文的数据时，往往忽略了这一技术细节。 事实上，检测方法是否适配三维体系，本身就是实验设计的一部分。 3. "长出来了"并不代表建系成功 很多研究人员第一次培养PDO时，只要看到球状结构，就认为： 建系成功了。 事实上，并非如此。 真正意义上的PDO建系，至少应该回答几个问题： 是否具有持续传代能力？ 只能培养一代，并不能称为稳定类器官。 一般需要能够稳定连续传代，并保持基本形态。 是否来源于肿瘤，而不是正常组织？ 特别是在： 结直肠癌 胃癌 胰腺癌 等组织中，正常上皮细胞往往比癌细胞更容易生长。 如果没有进行病理学和分子水平验证，很容易培养出的其实是： 正常类器官。 因此通常需要结合： HE染色； 免疫组织化学； 驱动基因检测； STR鉴定（必要时）； 全外显子测序或靶向测序； 确认培养体系真正来源于患者肿瘤。 是否保持原始组织特征？ 真正高质量PDO，不只是"能长"。 更重要的是： 形态学； 病理学； 基因组； 转录组； 关键突变； 都应与患者原发组织具有较高一致性。 因此，一个真正成熟的PDO平台，建系只是开始。 质量控制（Quality Control，QC）才是整个平台持续稳定运行的核心。 七、细胞系与PDO，到底应该如何选择？ 每次讲到这里，总会有人问： 既然PDO这么接近患者，那以后是不是就不用细胞系了？ 答案非常明确： 不是。 事实上，目前国际主流药物研发体系，并不是"细胞系被PDO取代"，而是： 不同模型承担不同阶段的任务。 模型不是竞争关系，而是互补关系。 真正成熟的研发流程，通常遵循"由简单到复杂、由机制到转化"的思路。 第一阶段：机制研究——细胞系仍然是最佳工具 如果你的研究目标是： 某个基因到底有没有作用？ 某条信号通路如何调控？ 某个蛋白是否参与耐药？ 那么细胞系仍然具有不可替代的优势。 原因很简单。 它： 遗传背景稳定； 培养成本低； 重复性高； 操作成熟； 易于进行CRISPR编辑； 易于建立稳定株。 例如： 全基因组CRISPR Knockout筛选； RNAi筛选； 过表达文库； Reporter系统； 几乎全部建立在传统细胞系基础之上。 这是PDO目前还难以替代的。 第二阶段：药物筛选——两种模型各有优势 很多企业研发喜欢问： 做HTS（高通量筛选）到底用什么？ 答案取决于： 筛什么。 如果面对的是： 几十万化合物库。 答案几乎一定是： 细胞系。 因为： 成本； 自动化程度； 检测速度； 都远高于PDO。 但是，当筛选结束后，只剩下几个候选化合物时。 情况就变了。 真正进入PCC（Preclinical Candidate Compound，临床前候选化合物）阶段后，更需要回答的问题是： 这个药物对患者真的有效吗？ 此时，PDO的价值开始体现。 越来越多药企采用： Cell Line → PDO → PDX 逐级验证。 目的不是增加实验复杂度，而是在研发早期尽可能淘汰那些在真实患者组织中疗效不足的候选药物，提高后续临床成功率。 第三阶段：精准医疗——PDO开始发挥独特价值 近年来，PDO最受关注的应用方向之一，就是： 功能性精准医疗（Functional Precision Medicine）。 传统精准医疗主要依据： DNA测序。 例如： EGFR； ALK； BRAF； KRAS； HER2…… 患者有没有突变。 决定是否使用对应药物。 但是。 越来越多患者： 明明具有同样突变。 疗效却完全不同。 为什么？ 因为： 基因型（Genotype）并不总能决定最终药物反应（Phenotype）。 真正决定疗效的，还有： 克隆组成； 微环境； 代谢状态； 转录调控； 表观遗传改变。 而PDO提供了一种新的思路： 直接测试患者肿瘤对药物的真实反应。 因此，它不是预测。 而是一种功能验证。 当然，目前PDO用于临床药敏指导仍面临建模周期、标准化流程、证据等级和前瞻性临床验证等挑战，不同癌种的发展成熟度也存在明显差异。因此，它更适合作为精准医疗的重要补充工具，而不是完全替代现有的分子检测体系。 八、未来的发展方向，不是PDO，而是"PDO 2.0" 如果把2010年前后的PDO称为第一代技术。 那么今天，国际上真正关注的，已经不是： 如何培养类器官。 而是： 如何让类器官更接近真实人体。 因为研究人员逐渐发现： 即使PDO保留了癌细胞。 仍然缺少很多关键成员。 例如： 免疫细胞； 成纤维细胞； 血管； 神经； 淋巴； 动态血流； 机械刺激。 因此，一个新的方向正在快速发展。 1. PDO + 免疫细胞 例如： PDO + PBMC； PDO + TIL； PDO + CAR-T； PDO + NK细胞。 用于评价： 免疫检查点抑制剂； CAR-T； 双抗； ADC； 等新型治疗策略。 2. PDO + CAF 癌相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts，CAF）不仅提供结构支撑，更通过分泌细胞因子、重塑细胞外基质和调节免疫反应，深刻影响肿瘤进展及药物反应。 将PDO与CAF共培养，有助于更真实地模拟肿瘤间质环境，并研究肿瘤细胞与基质之间的双向调控。 3. PDO + Air-Liquid Interface（ALI） 空气-液面培养（ALI）能够在一定时间内保留更多原始组织成分，包括部分免疫细胞，因此常用于研究肿瘤微环境及免疫治疗相关问题。 不过，其维持时间和适用范围仍存在一定限制，目前更多作为特定研究场景下的重要补充。 4. PDO + Organ-on-a-Chip 这是近几年增长最快的方向之一。 通过微流控芯片建立： 持续灌流； 营养交换； 氧梯度； 机械刺激； 甚至多器官互联。 让PDO不再只是静态培养。 而是真正进入： 动态培养时代。 越来越多研究开始尝试将： 肿瘤类器官； 肝类器官； 肠类器官； 免疫细胞； 整合到同一芯片中。 研究： 药物代谢； 毒性； 免疫反应； 转移机制。 这也被认为是未来新药研发和精准医学的重要发展方向之一。 全文总结：模型没有高低，只有是否适合你的科学问题 过去几十年，肿瘤细胞系推动了现代肿瘤生物学的发展，没有它，就不会有今天大量成熟的分子机制研究，也不会有众多已上市的抗肿瘤药物。 而患者来源肿瘤类器官的出现，并不是为了宣告细胞系"过时"，而是为了弥补传统模型在肿瘤异质性、组织结构、药物渗透以及临床预测能力方面的不足。 对于科研工作者而言，真正值得思考的问题，从来不是： "哪一种模型更先进？" 而应该是： "我希望这个模型回答什么科学问题？" 如果目标是解析分子机制，细胞系仍然是效率最高、成本最低、标准化程度最高的工具。 如果目标是开展药物敏感性评价、耐药机制研究或功能性精准医疗，PDO能够提供更接近患者真实肿瘤的生物学信息。 如果研究进一步涉及免疫治疗、肿瘤微环境、器官间相互作用或临床转化，那么未来的发展方向将是PDO、免疫共培养、器官芯片、人工基质及多组学分析等技术的深度融合。 真正优秀的肿瘤研究，从来不是追求最复杂的模型，而是在合适的阶段，选择最能回答科学问题的模型。 这也正是当前国际肿瘤研究，从"模型驱动"逐步迈向"问题驱动"的核心趋势。 声明： 本公众号所发布的内容仅用于信息分享与学术交流，所有信息仅供参考，不构成实验操作指南、医学建议或专业意见。 我们不对因使用、引用或依赖本文内容而产生的任何后果承担责任。 请读者独立判断，并遵循所在机构的规范与相关法律法规。